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TXNIP在糖尿病肾小管细胞损伤中的作用及相关分子机制认领

被引量： 2

作者：

韦金英

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病的常见并发症，是引起终末期慢性肾功能衰竭（chronic kidney disease, CKD）的主要原因之一。肾小管间质纤维化和肾小管萎缩是糖尿病CKD进展过程中的重要病理变化，而肾小管上皮细胞的表型转化和凋亡与糖尿病肾脏肾小管间质纤维化和肾小管萎缩密切相关。大量研究已证实，在糖尿病时，肾脏存在大量活性氧簇（reactiveoxygen species, ROS）的蓄积，破坏了肾脏组织内氧化还原动态平衡，造成肾组织的氧化应激状态，参与肾损伤的发生与发展。在哺乳动物细胞内存在多种抗氧化系统来清除ROS，修复氧化的分子及其他氧化损伤。其中，硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）系统在对抗细胞的氧化应激上起着重要作用。硫氧还蛋白系统包括TRX、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase, TrxR）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，是一个有效的蛋白还原系统。TRX是细胞内最重要的二硫键还原酶，维持细胞内蛋白质的还原状态及细胞正常功能的发挥。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein，TXNIP）或硫氧还蛋白结合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2），又称维生素D3上调蛋白1（vitamin D3-upregulated protein1，VDUP-1）最初发现于1,25-（OH）2-维生素D3治疗过的HL-60白血病细胞。现已证实，TXNIP是TRX的一种内源性抑制蛋白，TXNIP能通过与TRX活性位点结合而抑制后者的活性。因此，通过调节TXNIP的表达，就能够间接调节TRX的活性，从而达到调控细胞内氧化应激状态的目的。前期的研究显示，TXNIP在糖尿病患者、糖尿病动物以及体外高糖培养的肾小管细胞表达明显升高。也有研究表明，敲低TXNIP的表达能够抑制糖尿病小鼠心肌细胞的凋亡。神经酰胺能够通过上调细胞TXNIP的表达，进一步激活ASK1, p38MAPK以及JNK信号通路，促进白血病细胞的凋亡。TXNIP能够介导葡萄糖对胰岛β细胞的凋亡作用，TXNIP低表达能够抑制糖尿病状态下胰岛β细胞的凋亡，保持胰岛β细胞的功能。本课题组的前期研究也提示：高糖能够诱导TXNIP蛋白和mRNA在体外培养的小鼠系膜细胞中表达明显升高，并且p38MAPK信号通路参与了此过程；高糖能够明显增加系膜细胞ROS的产生，降低TRX活性；敲低TXNIP表达能够增加高糖条件下细胞TRX活性、减少细胞内ROS含量，同时抑制p38MAPK信号激活以及TGF-1和fibronectin的分泌。以上研究提示：TXNIP可能在DN发病过程中发挥一定作用。目前，有关TXNIP在糖尿病肾损伤中作用的研究较少见。因此，本课题拟在我们原有工作基础上进一步观察TXNIP在糖尿病肾小管损伤中的作用，探讨其在糖尿病肾病发生、发展中的作用机制以及TXNIP能否作为糖尿病肾病的治疗靶点。我们的研究结果有望进一步阐明糖尿病肾病的发病机制以及寻找糖尿病肾病治疗的新靶点和开发具有潜在治疗作用的靶向药物提供科学依据。方法： 1糖尿病肾病患者肾组织TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2及Bax蛋白检测收集2011年10月2012年10月在河北医科大学第三医院经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为糖尿病肾病患者25例（diabeticnephropathy group），既往无其它肾脏病史，以10例肾肿瘤患者远离肿瘤的瘤旁组织做为对照组（control group）。留取血和尿标本检测血糖（Glu）、糖化血红蛋白（HbA1）、24小时尿蛋白定量（UPE）、肌酐（Scr）、估算肾小球滤过率（eGFR）；采用免疫组织化学检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2及Bax蛋白表达；TUNEL染色检测细胞凋亡；ELISA检测人尿8-OHdG含量。 2TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2和Bax在2型糖尿病db/db小鼠肾组织中的表达及葡萄籽原花青素对db/db小鼠肾脏上述指标表达的影响 6～8周龄雄性db/db小鼠随机分为2组：糖尿病组（db/db group, db/db）、糖尿病+葡萄籽原花青素组（diabetic+grape seed proanthocyanidin extractgroup, db/db+GSPE），相同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组（db/m）及原花青素灌胃治疗组（db/m+grape seed proanthocyanidin extract, db/m+GSPE）。db/db+GSPE和db/m+GSPE组以葡萄籽原花青素（5mg/kg）灌胃，每天灌胃一次。正常对照组和糖尿病组以等体积生理盐水灌胃，自实验开始持续12周。实验期间每2周一次检测血糖水平。分别于动物周龄的8、12、16、20周每组取6只小鼠，收集血液及24小时尿液，用于生化指标检测，于动物周龄的20周处死动物，切取肾脏4%中性甲醛固定用于组织化学、TUNEL及免疫组织化学染色；部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA，Western blot检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2、Bax、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达，Real-time PCR检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、Bcl-2及Bax mRNA表达，ELISA检测小鼠尿8-OhdG水平。 3敲低TXNIP对高糖诱导的HK-2细胞凋亡及转分化的影响 VDUP-1shRNA Plasmid（h）干扰质粒，使用Lipofectamine2000转染试剂将VDUP-1shRNA Plasmid（h）干扰质粒和对照质粒分别转染人肾小管上皮HK-2细胞，经嘌呤霉素筛选浓度（4μg/mL）筛选稳定的细胞系。HK-2细胞及筛选的敲低TXNIP稳定细胞系在5%CO2，37°C CO2培养箱中，以含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养液培养细胞使其增殖，将实验细胞分组：正常糖对照组（5.5mmol/L glucose, NG）、正常糖+高渗对照组（5.5mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol, M）、高糖组（30mmol/Lglucose，HG）、高糖+NAC组（30mmol/L glucose+N-Acety-L-Gysteine，HG+NAC），高糖+阴性质粒组（30mmol/L glucose+control shRNA plasmid，HG+C），高糖+VDUP-1shRNA质粒组（30mmol/L glucose+VDUP1shRNAplasmid，HG+shRNA），高糖+TGF-β1组（30mmol/L glucose+4ng/mLTGF-β1， HG+T），高糖+SB203580组（30mmol/L glucose+10μMSB203580，HG+SB），高糖+PD98059（30mmol/L glucose+50μM PD98059，HG+PD）。分别经细胞同步化、分组干预刺激0、6、12、24、48、72小时后收集细胞；Western blot检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达；Real-time PCR检测TXNIP、α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、Bcl-2及Bax mRNA表达；TUNEL和AnnexinⅤ/PI染色检测HK-2细胞凋亡率；流式细胞仪检测ROS；硫氧还蛋白二硫键还原酶活性分析法检测TRX活性。结果： 1糖尿病肾病患者临床病理表现及相关蛋白检测 ①光镜下观察，对照组肾小球、肾小管及肾间质未见明显异常；糖尿病肾病组肾小球体积增大，基底膜弥漫或不规则增厚，细胞外基质增多，K-W结节形成，部分肾小管上皮细胞出现空泡变性，间质纤维化。②糖尿病肾病组空腹血糖、糖化血红蛋白、尿蛋白量、尿8-OHdG及肌酐较对照组均明显增多，而肾小球滤过率糖尿病肾病组患者比对照组下降（P<0.05）。③免疫组化显示TXNIP、α-SMA及Bax主要在肾小管表达，糖尿病肾病组较对照组表达增多（P<0.05），E-cadherin、Bcl-2较对照组表达减少（P<0.05）。④TUNEL染色显示在DN组织中观察到凋亡细胞增加，高于对照组（P<0.05）。 2糖尿病db/db小鼠肾组织相关蛋白的表达及葡萄籽原花青素对相关蛋白的影响 ①光镜下观察，糖尿病组小鼠轻微肾小球体积增大，系膜基质增多，基底膜不规则增厚，肾小管上皮细胞出现空泡变性。②与对照组相比，糖尿病组小鼠尿蛋白（Upro）明显升高；糖尿病db/db小鼠空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、尿8-OHdG、肌酐（Scr）及甘油三酯（TG）比对照组db/m小鼠增加（P<0.05）。给予葡萄籽原花青素治疗后血糖、尿素氮、尿8-OHdG、肌酐、甘油三酯（TG）及尿蛋白与db/db组比较含量明显降低（P<0.05）。③TXNIP、α-SMA、p-p38、p-ERK1/2、Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表达，与对照组比较，在糖尿病组表达明显增加（P<0.05），与db/db组比较，db/db+GSPE组降低，但仍高于对照组（P<0.05）；E-cadherin、Bcl-2在对照组大量表达，在db/db组表达明显减少，给予GSPE后表达升高（P<0.05）。④TUNEL染色显示在db/db组小鼠肾组织中观察到凋亡细胞增加，db/db+GSPE组降低，但仍高于对照组（P<0.05）。 3敲低TXNIP对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响 ①TUNEL和流式细胞术凋亡检测结果显示，与NG组相比，HG组HK-2细胞的凋亡率明显增高（P<0.05），敲低TXNIP及NAC组，高糖诱导的HK-2细胞凋亡比例显著低于HG组（P<0.05）。②与对照组相比，HG组Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比值、Cleaved Caspase-3、p-p38蛋白明显升高（P<0.05），NAC及VDUP-1shRNA质粒组能够下调Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比值、Cleaved Caspase-3、p-p38蛋白表达，从而抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡。③与对照组相比，HG组ROS水平明显提高，TRX活性抑制（P<0.05）；与HG组相比，NAC及VDUP-1shRNA质粒组能够降低高糖诱导的TRX活性抑制，能够下调高糖诱导的ROS产生（P<0.05），甘露醇及阴性质粒无影响。 4敲低TXNIP对高糖诱导的HK-2细胞转分化的影响 ①与对照组相比，HG组HK-2细胞中TXNIP、α-SMA表达增高，E-cadherin表达减少，ROS水平明显提高（P<0.05）。②与HG组相比，敲低TXNIP及NAC，能够下调TXNIP、α-SMA表达，增加E-cadherin表达，能够抑制高糖诱导的p38蛋白和ERK1/2活化，能够降低高糖诱导的TRX活性抑制，下调高糖诱导的ROS产生（P<0.05）。③HK-2细胞上清TGF-β1浓度明显高于正常对照组，高糖组TGF-β1mRNA明显高于对照组（P<0.05），VDUP-1shRNA组及NAC组HK-2细胞分泌TGF-β1及TGF-β1mRNA明显低于HG组（P<0.05）。④TGF-β1刺激HK-2细胞后，TXNIP蛋白及mRNA表达明显高于正常对照组，ROS明显高于对照组，VDUP-1shRNA组及NAC组HK-2细胞TXNIP、ROS的生成明显低于TGF-β1组（P<0.05）。⑤与NG相比，TGF-β1组E-cadherin表达显著降低，α-SMA表达显著增加，敲低TXNIP与NAC能够降低TGF-β1诱导的α-SMA表达及增加E-cadherin表达（P<0.

摘要译文

关键词：

糖尿病肾病; db/db小鼠; 肾小管上皮细胞损伤; 活性氧簇; 硫氧还蛋白相互作用蛋白; 葡萄籽原花青素

学位年度：

2014

学位类型：

博士

学科专业：

病理学与病理生理学

导师：

段惠军史永红

中图分类号：

R587.2[糖尿病性昏迷及其他并发症⑨]

学科分类号：

100201[内科学]