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菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）在苯并（a）芘胁迫下差异基因的筛选与分子生物标志物的研究认领

被引量： 15

作者：

刘娜

学位授予单位：

中国海洋大学

摘要：

本文根据目前我国近海多环芳烃污染现状，以近海养殖重要经济贝类菲律宾蛤仔（Venerupis philippinarum）为研究对象，克隆了菲律宾蛤仔芳烃受体介导的解毒代谢途径几种关键基因，包括芳烃受体蛋白（AhR）、芳烃受体核转位因子（ARNT）、热休克蛋白90（HSP90）。研究了毒性最强的多环芳烃（PAHs）——苯并（a）芘（BaP）对菲律宾蛤仔组织解毒代谢相关基因的表达调控规律，通过对在BaP胁迫下菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因的克隆及基因表达分析，探究双壳贝类PAHs解毒代谢机制；构建了菲律宾蛤仔PAHs消减cDNA文库，筛选、鉴定了差异表达基因，结合室内实验和海区现场验证，初步建立了基于菲律宾蛤仔的PAHs分子生物标志物监测技术，为海洋环境污染监测和水产品安全评价提供基础数据和技术支持。 1菲律宾蛤仔芳烃受体（AhR）介导的关键基因克隆与表达分析菲律宾蛤仔芳烃受体蛋白（VpAhR）的cDNA全序列长2870bp，开放阅读框（ORF）长为2391bp，共编码796个氨基酸残基，不具备信号肽，属于胞内蛋白，含有2个核定位序列（NLS）：K45RRRR49和P67SKRHRE73。BLAST分析表明VpAhR与其它物种AhR基因具有较高的同源性。VpAhR含有1个碱性螺旋-环-螺旋结构（bHLH domain）和2个配体结合区（PAS domain），属于bHLH-PAS转录因子家族。序列分析显示，VpAhR的配体结合区（a.a.220–383）与砂海螂（M. arenaria）和斑马纹贻贝（D. polymorpha）AhR的配体结合区相似性很高。实时定量PCR分析表明VpAhR在菲律宾蛤仔的鳃、消化盲囊、外套膜和闭壳肌中均有表达，鳃组织中表达量最高。菲律宾蛤仔ARNT片段长485bp，编码161个氨基酸残基，该序列含一个由44个氨基酸构成的PAS结构域（a.a.7-50），该区域与其他物种ARNT的PAS结构域相似性较高；VpARNT在菲律宾蛤仔消化盲囊中表达最高，在鳃、外套膜和闭壳肌中也均有分布。HSP90是分子伴侣家族的重要一员，菲律宾蛤仔的HSP90基因片段cDNA长687bp，编码299个氨基酸，具有HSP90家族保守信号区（GVVDSEDLPLNISRE），与其他物种HSP90氨基酸序列具有很高相似性，与栉孔扇贝（C. farreri）和海湾扇贝（A. irradians）的相似性均为99%，菲律宾蛤仔HSP90在鳃组织中表达量最高；不同浓度BaP（0.01、0.2μg/L）染毒处理3d、10d，菲律宾蛤仔鳃组织中AhR、ARNT、HSP90和谷胱甘肽硫转移酶（GSTpi）的基因表达水平随染毒浓度增大和处理时间延长而逐渐升高；除10d时0.2μg/L组细胞色素P4504（CYP4）基因表达被极显著（P＜0.01）上调外，其余处理组CYP4mRNA表达水平在染毒期间与对照组差异不显著（P＞0.05）。实验结果表明，BaP与AhR介导的菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因AhR、ARNT、HSP90和GSTpi的mRNA表达具有明显的剂量—效应关系，符合生物标志物筛选原则，适于进行进一步的分析和现场验证。 2菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下cDNA消减文库的构建与分析利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了BaP（1μg/L）胁迫下菲律宾蛤仔正、反向cDNA消减文库，分别获得194个和93个重组克隆，测序分析显示，正、反向文库分别得到168个和83个EST序列，经同源序列相似性比对，正向cDNA文库中有31种基因与已知功能基因具有较高同源性，12种为假定蛋白，2种为未知蛋白；反向文库中已知功能基因10种，假定蛋白4种。所有ESTs序列信息均已提交Genbank数据库，cDNA消减文库编号为LIBEST027169。进一步序列比对、功能注释及分类显示，通过SSH筛选到的菲律宾蛤仔差异表达基因主要为药物代谢、杂环化合物代谢、细胞分解代谢、抗生素响应等代谢过程相关基因。 3菲律宾蛤仔在苯并（a）芘胁迫下分子生物标志物的筛选与验证设置一系列BaP染毒浓度（0.25、1和4μg/L），利用实时定量PCR检测染毒处理10d时菲律宾蛤仔解毒代谢相关基因、SSH-selected差异表达基因及几种其他功能基因的mRNA表达。结果显示，测定的28种基因中Defensin、Serine protease、Thioesterprotein、GST C、Mn-SOD、ARNT等12种基因被BaP诱导表达上调，且与染毒浓度呈线性正相关关系，因此适于作为潜在的分子生物标志物进行进一步研究与验证。在胶州湾和胶南附近海域各选择一个实验站点（S1和S2），于2011年12月采集各站点表层海水及菲律宾蛤仔样品。高效液相色谱法（HPLC）测定海水中PAHs含量和菲律宾蛤仔软体部中PAHs的累积量。结果显示，S1站点海水和菲律宾蛤仔组织中的总PAHs和BaP含量均高于S2站点；实时定量PCR分析表明，除HSP90和AhR外，PAHs含量较高的S1站点的其余10种分子生物标志物基因表达水平明显高于S2站点，表现出一定的剂量—效应关系。由此表明，菲律宾蛤仔12种基因基本符合生物标志物筛选原则，适于作为分子生物标志物用于海洋环境PAHs污染监测及毒性效应评估。

摘要译文

关键词：

菲律宾蛤仔; 苯并(a)芘; 基因克隆; 抑制性消减杂交; 分子生物标志物

学位年度：

2012

学位类型：

博士

学科专业：

水产养殖

导师：

潘鲁青

中图分类号：

X174[环境动物学]

学科分类号：

0713[生态学];083001[环境科学];083610[环境生物工程]

D O I：

10.7666/d.y2159731