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盐节木耐盐的生理生化特性及BADH基因克隆研究认领

被引量： 12

作者：

苏丹

学位授予单位：

甘肃农业大学

摘要：

盐碱地是一种广泛分布且影响植物正常生长发育的土壤。随着全球环境的不断恶化，土壤盐碱化已严重威胁着人类赖以生存的有限的土壤资源。土壤盐分是由多种离子组成的混合物，不同盐离子对植物种子萌发及生长发育的影响很大。目前关于植物耐盐性的研究，多数研究人员以单一的NaCl代替土壤中的盐分进行胁迫处理，以说明土壤盐分对植物的影响，这可能会限制研究结论的准确性。因此，本实验以典型耐盐性植物盐节木(Halocnermumstrobilaceum（Pall.）Bieb.)为材料，比较NaCl和土壤盐分胁迫时，盐节木种子萌发、幼苗生长及其生理生化特性反应的差异性，同时对盐节木耐盐的分子机制进行探讨。首先，采用双因素交叉设计，在三个昼-夜温度（5～15℃、15～25℃、25～35℃）和十个盐溶液浓度水平下（0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）研究了复合盐和NaCl对其种子萌发及幼苗生长发育影响的差异性。其次，在0%、0.9%、2.7%和5.4%四种浓度下，研究了生长20d，60d时复合盐和NaCl对其整株幼苗生物量、Na+、K+离子含量、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）、脯氨酸（Prolin,Pro）、甜菜碱（GlycineBetaine,GB）含量以及超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性的影响。最后，根据辽宁碱蓬（Suaedaliaotungensis,AF359282）、菠菜（Spinaciaoleracea,AY156694）、中亚滨藜（Atriplexcentralasiatica,AY093682）、甜菜（Betavulgaris,X58463）的BADH基因完整读码框设计引物，以cDNA为模板，扩增盐节木BADH基因开放阅读框（openreadingframe,ORF），将目的DNA片段克隆到PMD182T测序载体上测序，得到盐节木BADH全序列，然后利用网上数据库（http://www.ncbi.Nlm.nih.gov/）进行BLAST分析，用在线工具SOPMA进行蛋白等电点及分子量相关分析，以DNAMAN软件对HsBADH基因进行蛋白序列聚类分析。获得主要研究结果如下： 1.温度及盐浓度对盐节木种子萌发和幼苗生长的影响在15～25℃，盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度及鲜重显著高于5～15℃和25～35℃两个处理（P<0.05）。15～25℃为种子萌发及幼苗生长的最适温度范围。在5～15℃范围内，当NaCl和复盐浓度分别低于0.6%和1.2%时盐节木种子萌发率、幼苗胚根和鲜重显著高于对照（P<0.05）；在15～25℃范围内，NaCl与复盐浓度分别低于0.6%和1.5%时，种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重显著高于对照（P<0.05）。在25～35℃范围内，当NaCl和复盐分别低于0.6%和0.9%时盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重显著高于对照（P<0.05）。在试验的三个温度下，随着NaCl和复盐浓度的升高，盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重均呈先升后降的趋势，当NaCl和复盐浓度小于0.6%时，盐溶液对种子萌发和幼苗生长具有显著促进作用（P<0.05）。在15～25℃，复盐胁迫后的种子萌发、幼苗胚根长度和鲜重分别是NaCl胁迫的1.23、1.27和1.28倍。同一温度相同浓度下，NaCl胁迫的盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重均显著小于复盐胁迫，NaCl对种子萌发及幼苗生长的抑制作用显著高于复盐（P<0.05）。在试验的三个温度下，当NaCl和复盐浓度分别大于0.9%、1.2%时种子萌发均有延迟现象。随着盐浓度的增加种子萌发逐渐延迟，盐浓度是影响种子萌发的关键因素之一。以上结果表明，应用NaCl进行单盐胁迫不能完全反映自然状态下植物对土壤盐分的适应规律，复合盐含有的钾、钙、硅等复合离子可能有助于提高种子的萌发及幼苗生长能力。 2.盐胁迫对盐节木生理生化特性的影响盐节木被处理20d和60d后随着NaCl和复盐浓度增加，其整株幼苗的K+/Na+、K+含量、MDA和PRO含量以及SOD、POD、CAT活性均呈现先升后降的变化趋势，且显著高于对照，当NaCl和复盐浓度为2.7%，其K+、渗透调节物质含量和酶活性达到最大值。当NaCl和复盐为同一浓度时，随处理时间的延长，Na+、K+、Pro、GB含量逐渐升高，但MDA含量、抗氧化酶活性显著降低（P<0.05）；在同一盐浓度下，NaCl处理的幼苗K+、PRO、GB含量及SOD、POD、CAT活性显著低于复盐处理，但MDA含量显著高于复盐处理（P<0.05）。上述结果表明，在盐节木处理20d时，膜质过氧化反应强烈，氧化伤害严重，抗氧化酶活性增强。随着盐胁迫时间的延长，植物表现出一定的适应性；在复盐不同浓度处理下，复盐所含的钾、硅、钙等复合离子，促进了盐节木对K+的吸收速率，提高K+/Na+、PRO和GB含量，同时也增强了抗氧化酶活性，降低细胞膜过氧化程度，提高盐节木的耐盐能力。 3.HsBADH基因的克隆、序列分析及同源性比较采用race技术克隆了盐节木的甜菜碱醛脱氢酶基因，命名为HsBADH。该基因读码框序列全长为1848bp，编码559个氨基酸，预测HsBADH蛋白分子量为6.46KD，等电点为9.26。氨基酸分析表明，该蛋白富含丙氨酸（Alanine，3.75%）、谷氨酸（Glutamic，3.03%）、甘氨酸（Glycine，5.89%）、亮氨酸（Leucine，7.14%）和缬氨酸（Valine，4.82%）；对HsBADH蛋白二级结构的分析结果表明，推测的HsBADH蛋白多肽含有26.12%的α-螺旋结构、27.01%的延伸链、36.14%的无规则卷曲。同源性分析表明，HsBADH与藜科植物BADH同源性高达90%以上，与水稻BADH的同源性达到53%。本研究对盐节木在复盐条件下的耐盐机理进行了初步的探讨，为能够克服自然条件下的盐害，寻找提高植物耐盐性的途径和方法提供理论依据。同时丰富了植物的耐盐基因库，为进一步利用盐节木BADH基因资源开展作物和林木的遗传改良，提高非耐盐生物的耐盐性奠定了基础。

摘要译文

关键词：

盐节木; 盐胁迫; 耐盐机理; BADH克隆

学位年度：

2012

学位类型：

博士

学科专业：

生态学

导师：

陈年来高天鹏

中图分类号：

Q945.78[胁迫生理学]

学科分类号：

071002[植物学];0903[农业资源与环境]