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摘要： 在生命科学研究中,随着人类对多肽生物作用研究的深入和现代医学及生化技术的不断发展,许多活性多肽类物质被开发,并广泛地应用于医疗、卫生、保健、食品、化妆品等领域。多肽类药物研究与开发己成为21世纪生物技术产业中最具活力的研究领域之一。活性多肽类似物的分子设计及化学合成已成为研究其结构与功能关系的强力手段,是多肽药物开发的重要环节之一。因此,为推进多肽药物的开发,迫切需要设计并高效合成多肽用于生物活性研究。而多肽合成的根本问题是氨基酸的保护。为了避免接肽反应的副反应,需要事先把不需反应的氨基以及其它活性基团进行保护,使它们在合成过程中不会参与反应,从而避免副产物的生成。
本论文对多肽药物、多肽化学合成以及氨基酸保护的研究进展进行了简要综述。从工业化角度出发,对Fmoc-L-lys（Boc）-OH、Fmoc-L-Val-OH和Fmoc-L-Asp（OtBu）-OH的合成进行了详细研究。
三种保护氨基酸的生产过程主要为:
1.Fmoc-L-Iys（Boc）-OH
以水-丙酮为反应溶剂,用五水硫酸铜对L-赖氨酸α-氨基和羧基进行络合保护,再在缚酸剂和催化剂碳酸氢钠作用下与二碳酸二叔丁酯（Boc酸酐）反应制得Nε-Boc保护的赖氨酸铜络合物。然后用脱铜试剂解释赖氨酸铜络合物α-氨基,以碳酸钠为催化剂、水-丙酮为反应溶剂,制备了Fmoc-L-Lys（Boc）-OH。考察了4种脱铜试剂对Fmoc-L-Lys（Boc）-OH制备的影响,结果表明硫化钠和8-羟基喹啉是良好的脱铜试剂。以8-羟基喹啉脱铜试剂,对Fmoc-L-Lys（Boc）-OH生产的工艺条件如投料比、反应时间和反应温度进行详细研究。研究得出Fmoc-L-Lys（Boc）-OH生产的优化工艺条件是:赖氨酸铜络合物/Fmoc-Osu的投料比为1.00:0.98,室温反应3 h,Fmoc-L-Lys（Boc）-OH的收率达91.7%,纯度达99.1%。
2.Fmoc-L-Val-OH
以水-丙酮为反应溶剂、碳酸钠为催化剂,采用Fmoc-Osu保护试剂对L-缬氨酸α-氨基进行保护,并对Fmoc保护缬氨酸制备工艺进行系统研究。对反应温度、反应时间、反应物投料比等制备Fmoc-L-Val-OH的反应条件进行了优化,并对粗产品结晶纯化条件进行了细致研究。研究结果表明制备Fmoc-L-Val-OH的最佳工艺条件为:当冰浴温度为-3℃,冰浴反应1.5 h,然后升至室温反应2.5 h,投料比为Fmoc:L-Val-OH=0.98:1,析出溶剂为石油醚（60～90℃）:乙酸乙酯=2:1时,产品收率达到94.5%,产品纯度达到99.4%。
3.Fmoc-L-Asp（OtBu）-OH
以浓硫酸为催化剂,L-天冬氨酸与异丁烯经区域选择性酯化,然后用20%氢氧化钠溶液调节反应混合液pH值至7,再用碳酸钠溶液调节pH值至9～10,在低温搅拌下加入9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的1,4-二氧六环溶液,反应数小时合成了Nα-9-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-β-叔丁酯。其合成工艺步骤包括L-天冬氨酸区域选择性酯化;α-氨基Fmoc保护;α-和β-叔丁酯的分离纯化。其中酯化反应温度为9℃,通异丁烯时间为72 h。α-氨基保护反应的温度为5℃,反应时间为45 h,原料配料比为:L-天冬氨酸:Fmoc-Osu=1:0.95,反应pH=9～10。将反应混合液过滤,弃去滤渣。滤液用乙醚洗涤,弃去有机相。无机相用2 mol/L稀盐酸调节pH=5.5,用乙酸乙酯萃取,有机相经浓缩冷却得固体粗产品。粗产品用二氯甲烷/石油醚重结晶,得β异构体收率达39.0%,纯度达到95.7%。
关键词: Fmoc-L-lys(Boc)-OH ；Fmoc-L-Val-OH ；Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH ；氨基酸保护
被引量
2
摘要： 为揭示云南西双版纳野生稻原生境下根际土壤细菌的群落结构及物种多样性,本研究以云南省西双版纳采集的三种野生稻(疣粒野生稻、药用野生稻和普通野生稻)为研究对象,借助高通量测序技术,结合土壤理化性质探讨影响不同野生稻根际细菌群落组成差异的因素,并对细菌群落进行功能预测分析。结果显示,疣粒野生稻土壤有机质(SOM)、全氮(TN)、速效钾(AK)和碱解氮(AN)含量显著高于药用野生稻(P<0.05),土壤养分状况最佳。野生稻根际细菌隶属于6门3属,变形菌门(Proteobacteria)在三种野生稻中为优势菌门,相对丰度均大于70%;属水平上疣粒野生稻最大丰度的菌属为雷尔氏菌属(Ralstonia,34.53%),药用野生稻和普通野生稻为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,25.86%和29.74%)。AK、SOM含量和pH与鞘氨醇单胞菌属丰度呈正相关,全磷(TP)和AK含量与雷尔氏菌属和新鞘脂菌属丰度呈正相关(P<0.05)。碳水化合物代谢和氨基酸代谢通路是主要的功能组成,尤其是在酮体的合成与降解、细菌趋化方面较为突出。总的来说,三种野生稻根际菌群丰富度、群落结构组成及功能多样性上差异显著。研究结果丰富了云南野生稻根际细菌群落结构与功能的生物学信息,可为该物种资源保护与合理利用提供理论依据。
关键词: 野生稻 ；根际细菌 ；土壤理化性质 ；群落结构 ；功能预测
摘要： 提出了一种新型脂溶性硅基载体4,4-二(叔丁基二苯基硅氧基)二苯甲胺(BPPM),可在微反应器中连续流动条件下快速液相合成多肽.所设计的连续流动装置由偶联单元(微通道反应器)、脱保护单元(填充床反应器)和水洗单元(微通道混合器)组成.该过程中使用绿色溶剂(以乙酸乙酯代替N,N-二甲基甲酰胺)和Cbz保护氨基酸(清洁的脱保护代替哌啶脱Fmoc保护),以环境友好的方式合成了高纯度(粗品>95%)的维洛斯肽,合成效率高(每偶联一个氨基酸<5 min).该研究成果易于工业化放大生产,为大规模绿色高效合成多肽提供了新方案.
关键词: 脂溶性硅基载体 ；连续流动 ；液相多肽合成
被引量
3
摘要： 以L-酪氨酸、乙酰氯为主要原料合成了N-乙酰-L-酪氨酸,再和乙醇与氯化亚砜反应得到的氯化亚硫酸乙酯反应得到N-乙酰-L-酪氨酸乙酯,产物结构经IR、1H NMR确证.单因素试验和正交试验结果表明,N-乙酰-L-酪氨酸乙酯合成的最佳工艺条件为:n(L-酪氨酸)∶n(氯化亚砜)∶n(乙醇)=1∶1.3∶10,加热温度75℃,加热时间2 h.该工艺具有原料价廉易得、反应周期短、产物易分离的特点,适于工业化大规模生产.
关键词: N-乙酰-L-酪氨酸乙酯 ；L-酪氨酸 ；N-乙酰-L-酪氨酸 ；氯化亚砜 ；合成
被引量
3
摘要： 甘氨酸二肽是一分子甘氨酸的α-羧基和另一分子甘氨酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键(即-CO-NH-)组成的蛋白质片段或物质。其结构比蛋白质简单,相对分子质量小,在人体内具有生物活性,可以调节人体的各项机能,因此被更多地应用于食品、药物、组织工程材料等不同的领域。以甘氨酸为研究对象,用二碳酸二叔丁酯(Boc_2O)保护甘氨酸的α-氨基,分别采用N,N′-二环已基碳二亚胺(DCC),2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)三种缩合剂活化甘氨酸的羧基形成活泼酯,再与甘氨酸缩合形成含有两个甘氨酸的小分子肽。通过对三种缩合方法的对比和结果分析,活化试剂对小分子肽的合成影响显著;甘氨酸二肽(Boc-G1y-Gly-OH)合成的最佳反应条件为:以BOP为缩合剂,乙腈水溶液为反应体系,生成活泼酯的反应温度为45℃,小分子肽的产率为78.2%。合成的Boc-G1y-G1y-OH二肽经红外光谱、质谱等袁征,结构得到验证,为氨基酸活泼酯的合成及小分子多肽液相合成提供了实验依据和理论参考。
关键词: 甘氨酸 ；缩合剂 ；二肽
被引量
6
摘要： 针对菜豆凝集素二聚体复合物的结构特征,利用计算机辅助药物设计的方法设计抑制剂以破坏复合物结构;进一步采用标准的Fomc保护氨基酸NT氨基的固相法合成纯化了小肽抑制剂.体外兔血红细胞凝集实验结果表明,该小肽对菜豆凝集素的凝血能力有一定的抑制效果.该方法为植物凝集素凝血研究及菜豆相关的食品安全问题提供了一个新思路.
关键词: 菜豆凝集素 ；分子动力学 ；药物设计 ；抑制剂设计 ；凝血活性
被引量
4
摘要： 近年来糖尿病患病人数日益增多,鉴于此,糖尿病类药物发展很快,尤其以多肽类药物发展最快,但大多数多肽药物在体内半衰期短,生物利用度低,因此寻找长效的降糖药物势在必行。目前多肽药物主要通过动植物中提取、化学合成和基因重组三种方式来制备,多肽药物化学合成方法是主要制备工艺之一,但化学合成过程中产生的有关物质会对产品质量有一定的影响。目前多肽药物主要采用固相多肽合成技术,该方法反应容器单一,容易实现自动化,但是该过程容易产生有关物质,并且多肽药物在合成、储存过程中,容易形成相关结构杂质,例如氨基酸丢失、氨基酸插入、保护基残留、氧化/还原等。本文主要介绍多肽药物有关物质,重点从固相合成工艺杂质方面展开综述,调研了国内外目前的研究现状,以期能探索出多肽药物其他的开发关键点,为这类药物的产业开发奠定基础。
关键词: 多肽药物 ；固相合成 ；有关物质
被引量
2
【会议论文】 • 曹美文
+2位作者
会议时间： 2019-07-28
摘要： 多肽自组装体系在生物医药领域有巨大的应用潜力,这主要得益于其多方面优点,比如:分子由天然氨基酸组成,具有高的生物相容性和低毒性;分子可设计性强,可以自组装形成各种形貌和尺寸的丰富的纳/微米结构;自组装结构易于修饰,可以方便地引入特定功能基团和活性物质;自组装体具有刺激响应性,有利于通过外界条件变化调控自组装过程及功能组分的负载和释放等（Fig.1）。我们致力于多肽分子设计、合成及自组装调控,并开发其作为药物和基因载体的应用,近期主要工作包括:（1）设计合成了一系列氨基酸组成完全相同,但是序列不同的三种类型的短肽分子,分别为锥形结构分子GAVIK和KIVAG、哑铃结构分子IVAGK和KGAVI、无序结构分子VGIAK和KAIGV。它们皆形成β-折叠二级结构,通过氨基酸序列变化可以调控β-strand之间的作用方式,从而有效调控分子的自组装结构。其中,锥形结构分子形成短棒状结构,哑铃结构分子形成片层状结构,而无序结构分子形成长的纤维。这些自组装结构具有较低的细胞毒性,并对疏水性药物表现出不同的负载、释放及胞内转运能力。进一步研究发现,除KAIGV之外,其它5个肽分子都可以有效凝聚DNA并保护其不被DNA酶降解,有作为基因载体应用的潜力。其中,IVAGK可以诱导DNA凝聚形成类病毒结构,实现DNA链的高度压缩和规整折叠。（2）设计合成了功能性多肽分子Nap-FF-GPLGLA（RK）_n （n=1-3）,主要含有3个功能片段,分别是自组装基元Nap-FF-,可被基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase 7,MMP7）降解的-PLGLA-片段和亲水性片段（RK）_n。其中,Nap-FF-GPLGLA（RK）表现出良好的药物载体应用潜力。其自身组装为直径6 nm左右的纤维结构,而在MMP7酶存在下分子水解导致自组装结构解体或转变为直径3 nm左右的纤维。体外及活体动物实验皆表明这种酶响应的多肽自组装过程可以用于阿霉素（DOX）的靶向输运,实现对肿瘤的高效抑制并降低DOX的副作用。（3）设计合成了功能性多肽分子RR-22,该分子含有4个功能片段,分别是能与肿瘤细胞表面整合素受体αβ和αβ靶向结合的RGD-序列,MMP7可酶解片段-PLGLA-,疏水性片段-III-以及穿膜肽片段-R。此分子不仅表现出对肿瘤细胞的选择性杀伤,而且可以诱导DNA分子的高效凝聚,实现较高效率的基因转染。
关键词: 肽 ；自组装 ；药物载体 ；基因载体
摘要： 以中枢兴奋性氨基酸NMDA受体多胺调节位点为靶点,设计合成芳烷酮哌嗪类全新化合物并研究它们的镇痛活性。哌嗪经甲酰基保护后,与相应的卤代芳烃进行烷基化反应,制备目标化合物。以小鼠扭体法、大鼠热板法、大鼠光热甩尾法等动物体内镇痛模型测试目标化合物的镇痛活性。共合成64个未见文献报道的新化合物,其结构经质谱、核磁共振谱及元素分析确证。镇痛药理试验显示:该类化合物具有较好的镇痛作用及作为新型非阿片类镇痛药开发的潜在价值。化合物I12,I14,I21和I37在三种镇痛模型上均显示很强的镇痛活性,具有深入研究的价值。
关键词: 芳烷酮哌嗪类化合物 ；合成 ；镇痛活性
被引量
11
摘要： 以伐普肽为研究对象,用固相合成方法,并对偶合反应进行微波强化.利用正交实验研究了微波强化对偶合反应的促进作用.正交实验结果用多元非线性回归分析和响应面法优化,确定优化条件为:反应时间5 min,包括1 min升温、4 min维持,最高反应温度60 ℃.与常规偶合反应相比,提高反应效率12～36倍.常规接肽反应保护氨基酸用量与固相合成树脂摩尔数之比为3倍,在优化的微波强化反应条件下,保护氨基酸用量减少为过量1倍;保护氨基酸与树脂的偶合效率明显提高,伐普肽得率从常规合成的48%提高到76%.其结构经质谱、高分辨质谱、红外光谱、核磁共振氢谱证实,与目标化合物的结构一致.
关键词: 伐普肽 ；固相多肽合成 ；微波 ；响应面优化
被引量
5
摘要： 以保护性氨基酸Boc-Lys-(Boc)-OH、Fmoc-His-(Trt)-OH和Gly-NH2-HCl为原料,N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂,按照由C端向N端依次接肽的合成策略,采用液相法完成了法氏囊素(L-Lys-His-Gly-NH2)的合成,总产率≥62.7%,其纯度≥90%。对DCC缩合反应中,羧基的活化、反应溶剂的选择、反应物投料比及顺序、反应温度及时间对反应结果的影响以及Boc、Fmoc、Trt三种保护基团的脱除条件也进行了研究和优化。
关键词: 活性三肽 ；法氏囊素 ；碳二亚胺法(DCC法) ；液相合成 ；L-Lys-His-Gly-NH2
被引量
9
【专利/发明】 • CN202011237279.7 • •
申请日：2020-11-09,
公开日：2022-05-10
申请人： 深圳市健翔生物制药有限公司
公开（公告）号： CN114456236A
摘要： 本发明提供了一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法，属于多肽药物制备领域。该方法包括以下步骤：1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第n位至第10位的地加瑞克肽片段树脂或地加瑞克肽树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc‑Ser‑OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；若步骤1)中合成地加瑞克肽树脂时，此步骤可省略；4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix；其中，n＝1、2或3。该方法纯度高，收率高，为地加瑞克原料药及其制剂的杂质分析及研究提供合格的杂质对照品，进一步提高了地加瑞克的生产和用药安全。
【专利/发明】 • CN202410094847.4 • •
申请日：2024-01-23,
公开日：2024-08-06
申请人： 拜西欧斯(北京)生物技术有限公司
公开（公告）号： CN118440150A
摘要： 本发明涉及生物制药领域，尤其涉及多肽的制备方法。本发明提供了多肽的制备方法，取起始氨基酸偶联的树脂依次偶联预活化的Fmoc‑保护氨基酸，获得多肽树脂；取所述多肽树脂裂解、纯化、冻干后获得所述多肽。本发明在对PMZ‑1620进行合成研究中发现，反应溶剂DMF的含水量对其粗肽纯度有显著影响，采用含水量低的DMF所得到粗肽纯度可以提高10～20％。此外，与树脂相连的第一个氨基酸的选择也很重要，采用Fmoc‑Trp‑OH比侧链带有Boc保护基的Fmoc‑Trp(Boc)‑OH，合成得到的粗肽纯度要提高20～30％。
【会议论文】 •
+1位作者
会议时间： 2014-10-18
摘要： 急性时相反应是机体对于病原微生物入侵和创伤等产生的一种保护性反应,具体表现为急性时相蛋白的大量合成和释放。血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种主要的急性时相蛋白,由肝细胞产生并释放至血液循环。血清中SAA的浓度在急性时相反应中可增高至本底的1000倍,但其对于天然免疫系统的调控作用直到近年来才有所了解。目前大部分实验所用的SAA是基因重组人SAA1与SAA2的混合体,在自然界并不存在。据人类基因组测序,SAA1包含多个不同的等位基因编码,在正常人群中SAA1.1,SAA1.3和SAA1.5是三个主要的等位基因,其差别在于52位和57位氨基酸的编码不同。通过对上述单核苷酸多态性(SNP)进行差异性分析,发现个别等位基因与一些炎症疾病、自身免疫疾病和癌症的发病率有关。为深入了解不同SAA1亚型对天然免疫细胞的调控作用,我们采用大肠杆菌表达了SAA1.1,SAA1.3和SAA1.5三个亚型的蛋白,对比其通过TLR2和甲酰肽受体2(FPR2)两个受体产生的生物学效应。这三种SAA1亚型的蛋白在大肠杆菌中均顺利表达。功能实验表明,SAA1.1对FPR2介导的细胞迁移、钙流产生和ERK磷酸化明显强于SAA1.3和SAA1.5。相比之下,SAA1.3则对于TLR2介导的一些功能包括TNF-alpha和IL-1rn的产生以及NF-kB报道基因的表达有较为显著的提升作用。SAA1.5对于IL-10的产生最为有效,但其对两个受体的选择性尚不明确。为避免大肠杆菌内毒素对于重组蛋白功能测定的影响,所有细胞因子的测试均采用来自C57BL/10ScN(Tlr41ps-del)背景的骨髓巨噬细胞。以上实验结果表明,SAA1的不同等位基因可转录并产生不同功能的SAA1蛋白,通过对SAA受体的选择性激活,产生不同的生理学效应,进而影响对某些疾病的易感性或病理过程。本实验打破了既往将SAA1认定为一种蛋白的传统做法,有助于今后从蛋白结构的角度对其功能进一步开展研究,对阐明SAA在天然免疫和其它生理过程中的调控机理提供了有用的工具和方法。
关键词: 急性时相反应 ；血清淀粉样蛋白A ；重组蛋白 ；巨噬细胞 ；单核苷酸多态性
被引量
5
会议时间： 2013-09-07
摘要： Wlds蛋白是一种嵌合蛋白,它由N-端包括泛素化因子E4b在内的70个氨基酸和NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)合成酶NMNATI(烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1)的全部序列共同组成,而许多研究证明后者单独存在即可很大程度地延缓轴索损伤,但是具体的机制如何尚未完全清楚。MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)经常被用来研究多巴胺能神经元的损伤机制,是一种研究的最多的神经毒素。在我们的研究中,我们利用MPP+损伤MES23.5细胞-一种类似多巴胺能神经元的细胞来制造帕金森模型,同时我们利用质粒转染技术来改变我们的感兴趣基因NMNAT1的量并利用免疫印迹的方法检验其表达量,通过上述实验过程,我们发现了NMNAT1高表达或基因敲除之后对MPP+作用于MES23.5细胞所制造的帕金森模型所带来的不同影响。MPP+作用于MES23.5细胞,产生了严重的轴索损伤,而这种损伤在NMNAT1高表达组则被明显抑制,相反地,在NMNAT1基因敲除组则变得更加严重。我们发现在NMNAT1高表达组,出现了SOD1表达量上升而Caspase3表达量下降的情况,而NMNAT1基因敲除组出现了相反的变化,与此同时,另一种机制-NAD机制也同样出现在我们的实验中,证实了其在NMNAT1延缓轴索损伤的过程中起到了一定的保护作用。所有上述发现表明,NMNAT1对MPP+所致轴索损伤的保护作用是通过三种可能的机制共同完成的-它增加了轴索的长度并且调节了SOD1和Caspase3的表达。
关键词: NMNAT1 ；MES23.5细胞 ；帕金森病轴索损伤
会议时间： 2016-07-01
摘要： 蛋白糖基化修饰是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰。O-糖基化修饰作为生物体内主要糖基化修饰结构之一,结构复杂,来源单一,急需研究一种化学合成方法,来弥补样品来源的不足。本实验室早期研究发现,高配位磷试剂可以活化单糖的异头碳原子,从而诱导单糖的寡聚。本研究工作在此基础上,使用高配位磷试剂活化单糖（葡萄糖）异头碳原子,实现未保护的丝组二肽分子中丝氨酸残基侧链羟基的化学O-糖基化修饰（Fig.1）。通过LC-MS对反应结果进行跟踪检测与评价分析,确定了化学O-糖基化修饰有效方法。结合高分辨多级质谱,对产物进行元素组成计算及结构鉴定,进一步确认所得产物为O-糖基化修饰产物。相关实验结果表明,高配位磷试剂可以诱导未保护氨基酸的体外化学O-糖基化修饰。
关键词: 高配位磷 ；异头碳活化 ；化学O-糖基化修饰 ；LC-MS
【会议论文】 •
+1位作者
会议名称： 第十一届中国植物病害化学防治学术研讨会
会议时间： 2018-10-12
摘要： 在当前发展绿色生态农业、提倡环境保护和粮食安全的可持续发展理念引领下,天然源绿色农药符合人类自身健康要求和产业发展需求.我国沈阳化工研究院研究从天然产物香豆素结构出发,先后设计合成2 000多个新化合物,经多轮DSTA“设计-合成-测试-分析”,发明了结构新颖、对环境及非靶标生物安全的丁香菌酯(SYP-3375,coumoxystrobin).该化合物具有高度的环境相融性,比较广谱的杀菌活性,同时兼有抗病毒活性和促进植物生长作用.在我国水稻纹枯病、稻瘟病、苹果腐烂病等重要病害防治中表现出明显的防治效果,具有良好的市场开发前景.迄今为止,有关重要病原菌对丁香菌酯的抗性风险和抗性机制还未见报道.已有研究表明,QoI类杀菌剂抗性机制,主要是由于靶标位点线粒体细胞色素Cytb的突变,导致药剂结合部位氨基酸的变化,阻止药剂与病原菌的结合,从而表现出病原菌对药剂产生抗性.本研究采用紫外诱变、药剂驯化和自然筛选三种方式进行了水稻稻瘟病菌对丁香菌酯的抗性突变体筛选,仅通过药剂驯化的方法获得了对丁香菌酯产生抗性的系列突变体,其抗性频率和抗性倍数均明显低于对嘧菌酯产生抗性的突变体;丁香菌酯抗性突变体在无药平板上连续转接10代后,大多数突变体的抗药性水平明显下降;除2株突变体之外,丁香菌酯抗性突变体的生存适合度均低于亲本敏感菌株.进一步克隆了抗药性突变体和敏感菌株的Cyt b,全长为1 182bp.根据抗、感菌株的Cyt b氨基酸序列比对分析结果,并结合计算机模拟分子对接的方法进一步明确了水稻稻瘟病菌对丁香菌酯的抗性机制主要为A86 V和G143 A的连锁性突变.根据稻瘟病菌抗药性突变体的Cyt b突变特点,本研究建立了抗药性突变体的AS-PCR快速分子检测方法,该方法可获得与传统生物测定方法相同的检测结果,且其检测效率提高93％,检测准确度95％以上,有助于适时准确地预警田间抗药性的发生发展,为延缓或避免抗药性的产生和发展提供指导.
关键词: 丁香菌酯 ；抗性风险 ；抗性机制 ；分子检测
摘要： 黄河河南段是河南省最大的过境河流,沉积物质量直接关系到黄河及其流域的水质安全和生态健康。长期重金属复合污染情况下,沉积物中独特微生物群落的形成机制,以及微生物群落对重金属形态和价态转化、植物富集重金属的作用机制等尚不清楚。本研究在全面调查和评估黄河河南段干流及支流沉积物重金属浓度、形态等污染现状的基础上,将重金属高污染的黄河支流——蟒河作为主要对象,研究了蟒河沉积物中微生物响应重金属污染的群落形成机制,全面调查了黄河干流及支流植被覆盖情况,筛选出高富集植物——苍耳(Xanthium strumarium),研究其根际和非根际微生物群落特征以及根际微生物在苍耳富集重金属过程中的作用。主要研究结果如下。 (1)系统调查了黄河河南段干流和主要支流沉积物中的重金属含量以及重金属的铁锰氧化态、残渣态、有机结合态等形态特征。为更准确的评价重金属的污染风险,本研究创新性的将重金属的生物可利用性纳入评价体系,更新了毒性评价系数,改进重金属风险评估方法。结果表明,沉积物中大部分重金属的平均浓度高于历史数据以及土壤背景值,黄河干流金属汞的浓度偏高,使得该河段汞含量达到中等污染水平,主要支流蟒河的金属复合污染水平最为严重,达到重度污染水平。绝大多数重金属的赋存状态以铁锰氧化态为主,Cr、Mn、Zn等从上游到下游,随着复合重金属浓度梯度下降,逐渐转向更稳定的残渣态,其中Cr从上游的3%升高到下游的40%。同时,随着沉积深度的增加,铁锰氧化态逐渐转向残渣态。 (2)长期重金属复合污染形成了独特的微生物群落和重金属抗性基因组,这些微生物在重金属形态、价态转化、抗性基因水平转移等方面具有重要作用。在污染更为严重的上游,阿拉伯半乳聚糖、肽聚糖、脂阿拉伯甘露聚糖等的生物合成以及半乳糖、磷酸戊糖、淀粉和蔗糖的代谢等与微生物能量供应相关的途径得到富集,相比之下,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、d-氨基酸代谢、β-丙氨酸代谢和色氨酸代谢等氨基酸和其他氨基酸的代谢在污染较轻的下游样品中富集。蟒河沉积物中存在丰富的重金属抗性基因,这些重金属抗性基因在群落间的传播是蟒河微生物群落能够适应复合重金属污染的独特机制,携带重金属抗性基因的质粒从上游到下游减少,而与重金属抗性基因相连的插入序列种类沿河从上游到下游逐渐增加,质粒和插入序列上的Cr抗性基因数量较少,而Cu、Zn和As抗性基因较多,表明Cr抗性基因的主要传播途径可能不是通过质粒和插入序列进行传播,而是另有途径。 (3)全面调查了黄河嫩滩植被的分布特征,从优势植物中筛选到可高效富集底泥高污染重金属的优势植物。黄河嫩滩植被以被子植物为主,绝大多数都是耐水淹植物。在三条支流中,蟒河的重金属污染最为严重,蟒河流域植被构成单一,其中苍耳占据绝对优势地位,这可能与该流域重金属污染程度较为严重有关。在蟒河河滩优势植物中,筛选到苍耳、葎草、稗草三种富集重金属的植物,其中苍耳对Cr、稗对Cd具有高富集积累的特性。 (4)研究了重金属高富集植物苍耳根际和非根际土壤微生物的群落特征,揭示了根际微生物在植物富集重金属过程中的功能。苍耳根际土壤中大部分重金属的生物可利用性降低,表明苍耳可有效减轻土壤中的重金属毒性。在长期重金属复合污染下,微生物的多样性和丰度整体下降,但苍耳的根系分泌物促进了特定根际微生物群落的形成,微生物之间的网络关系紧密,抗干扰能力增强,这些微生物通过铬酸盐还原酶、氨基酸代谢富集等途径提升了苍耳应对重金属胁迫的能力,促进植物对重金属的富集。 (5)系统研究了重金属长期复合污染环境中苍耳根际、非根际土壤微生物转化六价铬的能力及转化机制。在自养微生物体系中,非根际粘附型菌的转化能力最强,而异养微生物体系中,根际粘附型菌的转化能力最强。yie F和chr R基因在微生物转化六价铬的过程中起重要作用,在所有样品中均有较高浓度,尤其是根际土壤。 综上所述,本文研究了黄河河南段沉积物重金属浓度和形态分布特征和潜在风险程度,对深入理解长期复合重金属污染下微生物群落自然构建机制及群落适应机制提供科学参考,通过对高富集植物苍耳根际群落的研究,发现了根际群落对六价铬转化的机制,对黄河流域重金属污染防治提供理论支撑,对黄河水资源和生态环境保护提供科学依据。
关键词: 黄河河南段 ；重金属污染 ；植被分布 ；微生物群落 ；六价铬
摘要： 随着工业化以及现代农业化的飞速发展,人类的生产活动导致了许多有毒重金属对环境造成污染,进而危害了人类和动植物的生存空间。其中,重金属镉对土壤的污染问题尤为突出。因此,在农业生产中,如何治理土壤重金属镉污染,增强作物对重金属镉的耐受性,是促进农业绿色发展保护粮食安全的一项重要课题。目前,丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi,AMF)和生物炭(Biochar)是治理土壤重金属污染、提高植物对重金属耐受性的两大前沿热点。前人的研究表明AMF能利用根外菌丝和分泌的特异性蛋白如球囊霉素等直接将重金属镉固定,减轻重金属对植物的危害,而生物炭能改善土壤pH,为富集的耐镉微生物提供栖息环境,提高植物对重金属镉镉的耐受性。但同时将生物炭与AMF联合使用促进玉米生长并提高玉米对重金属镉耐受性的联合效果还鲜有报道。本研究通过盆栽实验(实验组:AMF处理,Biochar处理,AMF+Biochar处理;对照组:不施加AMF和Biochar)探究了AMF联合生物炭处理是否会对提高玉米镉耐受性产生积极影响,同时通过多组学联合分析探究了AMF联合生物炭增强玉米镉耐受性的作用机制。得到的研究结果如下: 1.镉胁迫下,AMF处理、Biochar处理、AMF+Biochar处理均能提高玉米株高、叶绿素含量和玉米生物量,其中AMF+Biochar处理对玉米株高、叶绿素、生物量的提高效果最优。在10 mg/kg镉浓度下,相较于对照组(CK,不施加AMF和Biochar),AMF+Biochar处理的玉米植株株高增加了3 1.74%,叶绿素含量增加了9.53%,地上部干重增加了60.86%,地下部干重增加了60.28%。 2.镉胁迫下,AMF处理、Biochar处理以及AMF+Biochar处理均能有效提高玉米抗逆酶活性、叶片脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量,并减少叶片丙二醛含量。其中,AMF+Biochar处理在10 mg/kg镉浓度下提高玉米抗逆酶活、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及降低丙二醛含量的能力显著高于Biochar处理和AMF处理。与对照相比,10 mg/kg镉浓度下,AMF+Biochar 处理分别增加了27.10%,11.8%和 30.11%的 SOD、POD 和 CAT活性和29.29%,10.07%的可溶性糖与可溶性蛋白含量。 3.镉胁迫下,添加Biochar能促进AMF与玉米共生;接种AMF能有效促进Biochar吸附重金属镉。 4.镉胁迫下,对AMF处理、Biochar处理以及AMF+Biochar处理的TI(耐性指数)、TF(转移系数)和BCF(富集系数)进行分析,结果显示三种处理均为TI>0.5,TF<1,BCF>0.5。因此,与对照组相比,三个处理均能减弱镉从地下部向地上部的转运能力,其中AMF+Biochar处理的玉米植株对重金属镉的富集能力更强。 5.镉胁迫下,通过对根际细菌16S rRNA发现,AMF+Biochar处理显著提高了玉米根际土壤细菌群落的丰富度和多样性;通过根际细菌宏基因组测序发现,AMF+Biochar处理显著改变了玉米根际微生物重金属抗性和抗氧化活性;通过玉米根部转录组发现,AMF+Biochar与对照相比的DEGs通过提高镉胁迫下玉米的膜转运、次生代谢物的生物合成、光合作用、苯丙类生物合成、各种植物次生代谢如核苷酸代谢、氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢等功能,增强玉米对重金属镉的耐受性。 综上所述,AMF联合生物炭处理能够提高玉米镉耐受性,改变玉米根际土壤细菌群落结构,丰富根际土壤细菌群落的功能。
关键词: AMF ；生物炭 ；根际微生物 ；镉胁迫 ；耐受性
摘要： 滨藜属隶属苋科,包含多种能在盐碱地、沙漠、荒地等极端生境中生存的植物。在系统学研究中,藜亚科下各族的系统发育关系和滨藜属下种间关系一直存在一定的争议。中亚滨藜是典型的盐生植物代表种。虽然目前很多基于表型和生理学的研究已探明中亚滨藜叶表皮的囊泡与其耐盐能力有关,但其耐盐的分子调控机制仍不明确。因此,基于表型观察、生理指标和转录组测序挖掘中亚滨藜响应盐胁迫的分子机制对了解和利用盐生植物有重要意义。本文研究结果如下,主要分为三个部分。 1.滨藜属的比较叶绿体基因组学及系统发育研究 对滨藜属及其近缘属共8属18个物种进行了叶绿体基因组比较分析,结果发现滨藜属和其近缘属物种的叶绿体基因组均注释到了132个基因,包括37个t RNA基因,8个r RNA基因和87个蛋白编码基因,共鉴定出三种类型SSR,其中单核苷酸重复数目最多,且以A/T重复类型为主。滨藜属与其近缘属物种叶绿体基因组密码子的使用情况相似,编码20个氨基酸的密码子数相同,编码区序列比非编码区保守,反向重复区比大、小单拷贝区更保守。为进一步研究各属的系统发育位置,本研究基于全叶绿体基因组序列信息构建的最大似然（ML）树显示,所研究的物种可以分为两个亚科,分别为甜菜亚科和藜亚科,藜亚科包括轴藜族、藜族、球花藜族、腺毛藜四个族,其中滨藜属归入藜族,并与藜属互为姐妹群关系。同时,基于mat K+atp B-rbc L+rbc L序列采用邻接法构建的系统发育树结果表明中亚滨藜与鞑靼滨藜互为姐妹群关系,支持形态性状（植株形态、盐囊泡分布、苞片形态、种子形态、胚根位置）的观察结果,表明中亚滨藜和鞑靼滨藜具有较近的亲缘关系。 2.盐处理后中亚滨藜形态观察和生理研究 中亚滨藜叶背的盐囊泡呈现出囊泡细胞-柄细胞-表皮细胞复合体结构,在400m M Na Cl的诱导下,盐囊泡逐渐随着处理时间的增长而膨大破裂。同时,刷除中亚滨藜叶片背面盐囊泡后,观察400m M Na Cl处理不同时间点（0h、4h、8h、12h、24h、48h）下的中亚滨藜叶片盐囊泡的再生情况发现Na Cl处理能够诱导盐囊泡加速再生。随着盐处理时间的增加,中亚滨藜Na+/K+显著上升,可溶性蛋白、MDA和脯氨酸的含量增加;可溶性糖含量和CAT、SOD、POD等酶的活性在短时间内升高,随后略有下降,整体呈现升高的趋势。此外,盐处理后中亚滨藜叶片中的叶绿素含量先下降后缓慢上升,但与对照相比,整体呈降低趋势。 3.盐胁迫下中亚滨藜叶片转录组研究 对400m M Na Cl处理6个时间点（0h、4h、8h、12h、24h、48h）下的中亚滨藜叶片进行高通量测序,N50=2,387nt,共拼装了40,507个unigenes。根据|log2fold change|（[L2fc]）≥1和p＿value<0.05在Salt4hvs CK组筛选出3,033个差异基因。在Salt8hvs CK组得到2,328个差异表达基因。在Salt12hvs CK组得到3,194个差异基因。在Salt24hvs CK组得到4,411个差异基因。在Salt48hvs CK组得到3,512个差异基因。 进一步的表达聚类分析将6个盐处理时间点的差异表达基因分成8个组（cluster）,其中cluster8包含的557个基因在4h显著上调表达,功能富集分析发现这些基因主要参与“光合作用”“油菜甾醇生物合成过程”等过程。其中“光合作用”过程中包含FIB、PGR5等与光合作用保护相关的基因。Cluster5包含的1,284个基因在12h显著上调表达,这些基因主要参与“黄酮类生物合成过程”和“DNA修复”等过程,其中“黄酮类生物合成过程”中包含PAL、C4H和4CL等与苯丙氨酸代谢相关的核心生物合成基因。Cluster2包含的1,468个基因在24-48h显著上调表达,功能富集分析发现Cluster2的基因主要参与“转运”“钾离子跨膜转运”和“氢离子跨膜转运”等过程,其中“转运”过程中包含SOS1、NHX2和KT2等编码Na+和K+转运蛋白的基因。 总而言之,盐处理早期（4-8h）,中亚滨藜叶片主要发生离子转运、增强光合作用等响应过程;盐处理中期（8-12h）,中亚滨藜启动黄酮类化合物生物合成过程,通过非酶途径降低植物体内活性氧含量;盐处理后期（12-48h）,中亚滨藜水转运能力增强,Na+、K+等盐离子被大量运输至盐囊泡,同时光保护能力增强。其中,盐处理早期,中亚滨藜启动叶绿素合成途径,大量形成捕光蛋白复合体,增强光合电子传递链和氧化磷酸化;而在盐处理8h之后,以上过程被抑制,但光保护相关基因开始上调,叶绿素含量随后也盐逐渐升高;同时在盐处理早期,植物体内开始逐渐积累Na+、K+等盐离子,中亚滨藜启动部分Na+、K+等离子转运通道调节离子平衡,中期盐离子积累逐渐增多,中亚滨藜启动大量钠离子和钾离子转运通道,来防止离子毒害,盐处理后期中亚滨藜为维持细胞膨压,启动水分的跨细胞转运和向液泡的区域化积累,盐囊泡逐渐膨大,最终破裂,将离子排出体外。中亚滨藜在遭受盐胁迫后的不同时间点能够通过植物激素的调控、光保护、离子调节、渗透调节、抗氧化调节等机制来适应盐胁迫环境,呈现出动态调控机制。
关键词: 中亚滨藜 ；叶绿体基因组 ；系统发育 ；盐胁迫 ；转录组分析
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