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摘要： 目的研究不同链长的6A型肺炎球菌荚膜多糖(type 6A pneumococcal capsular poly-saccharide,Pn6A)稳定性差异及链长对结合物稳定性和免疫原性的影响.方法采用高压均质机获得不同链长的Pn6A,并在1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐作用下与破伤风类毒素-己二酰肼衍生物形成共轭结合物.通过比较原始多糖、多糖降解物及结合物的核磁共振氢谱验证结构的正确性,通过硫酸蒽酮法和速率比浊法定量比较抗原性;通过高效液相-分子尺寸排阻层析-多角度激光散射仪比较不同链长多糖的稳定性;分析结合物物理化学(理化)性质,并通过重均相对分子质量(weight-average relative molecular weight,Mw)变化及游离多糖变化比较结合物稳定性;用原始多糖和结合物分别皮下免疫NIH小鼠3次,ELISA检测抗多糖IgG水平.结果Pn6A经机械剪切3、8、20次后,Mw由14.01×10^(5)g/mol分别下降为1.55×10^(5)、0.92×10^(5)和0.58×10^(5)g/mol,其对应结合物理化数据相近;核磁共振结果表明,多糖降解物和结合物各特征质子的化学位移相比原始多糖未发生改变;硫酸蒽酮法和速率比浊法定量计算得到的不同多糖和结合物单位抗原值相近;在不同pH及温度条件下,长链多糖及其结合物的Mw和游离多糖变化均大于短链多糖.不同链长多糖结合物免疫小鼠后诱导的IgG抗体滴度均高于原始多糖(F=2.90,P=0.048),而不同结合物之间的免疫原性差异无统计学意义(F=1.39,P=0.267).结论机械剪切不会破坏Pn6A化学结构和抗原性;Pn6A链长越短,所获得的多糖及结合物越稳定;Pn6 A经机械剪切后制备的结合物在小鼠体内可诱导良好的免疫应答.
关键词: 6A型肺炎球菌荚膜多糖 ；核磁共振氢谱 ；破伤风类毒素 ；结合疫苗 ；免疫原性
摘要： 据 WHO 统计,下呼吸道感染(lower respiratory tract infections,LRTIs)是全球最致命的传染性疾病,在全世界每年约造成300万人的死亡。肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,Spn)作为最常见的可造成LRTIs的致病菌之一,受到人们的广泛重视。Spn主要感染儿童、老人和免疫力低下人群,可引起脑膜炎、肺炎和菌血症等致死性疾病。目前对Spn感染的治疗主要以抗生素为主,但越来越多的耐药Spn菌株的出现,使得抗生素治疗效果下降,而疫苗作为一种有效的预防Spn感染的手段再次受到人们的重视。目前,商业化的Spn疫苗分为多糖疫苗(PPV)和多糖结合疫苗(PCV)两类,这些疫苗的广泛使用有效地降低了Spn感染的发病率。尽管如此,疫苗本身仍有诸多不足,例如血清型受限、血清型3型Spus pneumoniae serotype 3,ST3)免疫应答较低,以及糖结合疫苗的广泛使用可能造成的载体介导的表位抑制(carrierinducedepitopic suppression,CIES)效应等等。为解决现有疫苗对ST3免疫应答较低的问题,PeterH.Seeberger等以ST3荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)的重复二糖单元为基础构建了二、三和四糖等寡糖片段,并以此进行了一系列构效关系评价。虽然这些研究取得了一定的成果,但并未找出ST3CPS的最优寡糖抗原表位。此外,前人还以Spn的特异性蛋白为抗原,构建了各种不同的蛋白疫苗,希望借此克服糖疫苗血清型受限和血清型转换等问题,但多数蛋白疫苗在人体实验中效用欠佳,蛋白疫苗候选物还需进一步探索。围绕上述现有ST3疫苗免疫应答较弱和血清型受限等问题,本论文主要进行了以下三方面研究。第一,为研究ST3 CPS的最佳寡糖抗原表位,本实验室前期工作中合成了基于ST3 CPS二糖重复单元的五糖1a、六糖1b、七糖1c和八糖1d片段,并以此构建了四种寡糖-TT缀合物2a-d。本论文研究首先对合成的寡糖缀合物2a-d进行了一系列免疫学评价。(1)以TT缀合物2a-d免疫小鼠后发现,缀合物2a-d均可引起较强的免疫应答,且五糖缀合物2a和六糖缀合物2b诱导的特异性IgG1 抗体滴度(2a:27,023.50±6,496.11,2b:37,831.10±6,254.27)要显著高于七糖缀合物 2c 和八糖缀合物 2d (2c:7,691.97±3,185.01,2d:5,367.44 ±1,001.55),这表明缀合物2a和2b的免疫原性要显著强于缀合物2c和2d。(2)对六糖缀合物2b进一步分析发现,免疫次数和佐剂对其免疫原性无显著影响,而连接臂对其免疫原性有一定影响。通过对这些影响因素的研究,可得出缀合物2a-d诱导的免疫应答为寡糖特异性的,免疫应答强度较高且受各种因素的影响较小。(3)通过分析缀合物2a-d免疫组抗血清对所有四个寡糖的交叉识别,我们发现各个缀合物诱导产生的抗体均可识别所有四个寡糖1a-d,且同一缀合物抗血清对各个寡糖半抗原的识别强度几乎无差别,这表明缀合物2a-d诱导产生的抗体极有可能识别一个类似的寡糖表位。(4)以流式细胞术进一步分析发现,六糖缀合物2b免疫组抗血清对ST3的识别要显著强于其它三个缀合物。此外,体外OPA实验同样表明缀合物2b免疫组介导的对ST3的调理吞噬作用最强。这些结果均表明六糖缀合物2b免疫组小鼠产生的功能抗体的水平要显著高于其它三个缀合物。(5) ST3攻毒实验表明,六糖缀合物2b免疫的小鼠对ST3的清除、肺组织炎症和存活率均有极其显著改善。这些结果均意味着六糖缀合物2b可非常有效地保护小鼠免受ST3的感染。(6)通过对CD4+T细胞早期活化的标志分子CD69的分析,我们发现TT缀合物2b可激活六糖特异性的CD4+T细胞。进一步对这些活化的CD4+T细胞分析发现,BSA缀合物3b刺激后其IL-4表达水平上调,而IL-4是Th2类细胞分泌的特征分子。由此我们推断,六糖缀合物2b可激活六糖特异性的CD4+T细胞,并诱导这些CD4+T细胞分化为Th2类细胞,从而促进特异性抗体亚型的转换和增强体液免疫应答。第二,本论文以Spn的抗原蛋白Ply、PspA和PsaA为基础,构建了具有广谱保护作用的融合蛋白YAPO和YAPL。(1)通过对PsaA和Ply蛋白晶体结构的分析,我们设计并纯化了 PsaA蛋白和无毒性的rsPly蛋白;通过对PspA蛋白保护性抗体识别位点的分析,我们设计并纯化了 rsPspA蛋白。免疫结果表明rsPly、rsPspA和PsaA均可诱导小鼠产生较强的特异性免疫应答,且小鼠产生的特异性抗体可识别血清型3、4、5、6B、15B、19A和23F Spn,从而表明rsPly、rsPspA和PsaA诱导小鼠产生的抗体可分别对Spn表面天然状态的Ply、PspA和PsaA蛋白有较好的识别。(2)为获得对各血清型Spn均有较好识别的抗原蛋白,我们设计并纯化了基于rsPly、rsPspA和PsaA的融合蛋白YAPO和YAPL。免疫小鼠后发现,YAPO和YAPL诱导小鼠产生的免疫应答要显著强于rsPly、rsPspA或PsaA蛋白单独免疫时,且产生的抗体对野生型Ply、PspA和PsaA蛋白有很好的识别。(3)进一步分析发现,YAPO和YAPL免疫后小鼠产生的抗体可识别血清型3、4、5、6B、15B、19A和23F Spn,这表明YAPO和YAPL诱导小鼠产生的抗体可很好的识别Spn表面天然状态的Ply、PspA和PsaA蛋白。体外OPA实验证实,YAPO和YAPL免疫后小鼠产生的特异性抗体能有效介导对ST3、ST6B、ST19A和ST23F的调理吞噬作用。(4) ST3和ST6B的攻毒实验表明,YAPO和YAPL能在Spn感染小鼠时有效提高小鼠的存活率。上述一系列的结果均表明YAPO和YAPL对小鼠具有很好的保护作用,初步符合我们所期望的糖蛋白疫苗的载体的要求。第三,为获得血清型覆盖更广的PCV疫苗以及减少CIES效应发生的可能性,本论文对YAPO和YAPL蛋白作为PCV的同种属来源蛋白载体的潜能进行了评价。(1)将YAPO和YAPL重组蛋白与五糖1a进行缀合,构建了五糖-YAPO缀合物5a和五糖-YAPL缀合物5b。(2)缀合物5a-b免疫后,小鼠产生的特异性识别五糖半抗原的 IgG 抗体水平(5a:28,175.68±17,281.63,5b:11,585.53±3,378.47)与五糖-TT缀合物2a (20,208.39±5,253.82)无显著差异,且小鼠对载体蛋白YAPO和YAPL的免疫应答并未受到寡糖缀合的影响。此外,与缀合物2a诱导的特异性识别五糖的抗体主要为IgG1亚型不同,缀合物5a-b诱导的特异性识别五糖的抗体主要为IgG1和IgG2b以及少量的IgG2a。与IgG1抗体相比,IgG2b和IgG2a具有更高的Fc受体亲和力,能够更高效的介导调理吞噬作用。上述结果表明YAPO和YAPL蛋白作为糖缀合物蛋白载体是切实可行的,它们可高效的增强寡糖特异性的免疫应答,且对寡糖免疫应答的促进作用要优于TT蛋白。(3)进一步分析发现,缀合物5a-b免疫组抗血清不仅对ST3的识别能力远高于缀合物2b,还对血清型4、5、6B、15B、19A和23F Spn有较好的识别。此外,OPA实验同样证实缀合物5a-b不仅能保护小鼠免受ST3的感染,还能保护小鼠在一定程度上不受血清型6B、19A和23F Spn的感染。这表明缀合物5a-b不仅可预防缀合物血清型Spn的感染,还可预防非缀合物血清型Spn的感染。(4) ST3和ST6B攻毒实验表明,缀合物5a免疫的小鼠对ST3和ST6B的清除、肺组织炎症和存活率均有极显著改善,而TT缀合物2a仅在ST3感染时对小鼠有保护作用。这表明YAPO载体可使寡糖缀合物的保护作用覆盖非缀合物血清型Spn。由上述结果我们可以得出,YAPO或YAPL蛋白作为Spn糖结合疫苗载体蛋白要优于TT蛋白,且以这两种蛋白为载体的糖缀合物能为小鼠提供缀合物血清型之外的保护作用。综上所述,本论文围绕PCV13中ST3免疫应答较弱、血清型受限和CIES效应等问题,开展了对ST3 CPS的寡糖片段免疫保护作用以及对源自Spn的重组蛋白作为糖结合疫苗的载体蛋白的研究。本论文研究的意义在于:(1)评价了ST3荚膜寡糖片段缀合物2a-d的免疫活性,丰富了对ST3荚膜寡糖片段的免疫构效关系的研究;(2)鉴定了六糖1b可能为ST3 CPS免疫保护作用最好的寡糖表位,并确证了其六糖缀合物可诱导T细胞依赖的体液免疫应答,这为后续新型ST3的糖疫苗的研发提供了理论基础;(3)构建了融合重组蛋白YAPO和YAPL,并证实了 YAPO和YAPL作为Spn糖结合疫苗的载体蛋白要优于TT,为PCV的研发提供了一种新型载体;(4)构建了一种新型的ST3寡糖疫苗,推进了后续PCV新型多组分疫苗的研发。
关键词: 血清型3肺炎链球菌 ；荚膜多糖 ；寡糖缀合物 ；Ply ；PspA ；PsaA ；YAPO ；YAPL ；结合疫苗蛋白载体 ；疫苗 ；免疫保护作用
摘要： 细菌感染一直威胁着人类的身心健康,为了预防和治疗细菌感染所引起的疾病,人们采取了多种有效措施,但目前主要是使用抗生素类等抗菌药物来杀灭病原体。随着抗生素的不合理使用,出现了越来越多的耐药菌株。为了应对新出现的感染危机,人们需要研发更多、更有效的治疗方式。糖类化合物可以说是自然界中最丰富、结构最多样性的有机物。细胞糖萼是一层覆盖在细胞表面的糖质,它参与细胞分化、识别、粘附,甚至包括病理发展等多种生物过程。细菌荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)就是一类细胞糖萼,很多细菌的荚膜多糖不仅是其主要的毒力因子,荚膜多糖糖链结构的差异还是细菌分型的重要依据,而且很多荚膜多糖具有免疫原性、结构高度保守性,这些特点使其成为研制疫苗的理想靶标抗原。人们通过接种糖类疫苗来预防一些细菌的感染,例如肺炎链球菌疫苗、B型流感嗜血杆菌疫苗、C群脑膜炎球菌疫苗等都已上市应用,相比于抗生素,这些细菌糖类疫苗疫苗可以大规模接种,且接种后可长效防护。其中肺炎链球菌第一代疫苗是荚膜多糖疫苗,但是,单纯的荚膜多糖免疫原性较差,不能产生依赖于T细胞的免疫应答。为了解决该问题,人们将荚膜多糖与免疫原性较强的载体蛋白进行共价连接制备多糖蛋白缀合物,发展了第二代多糖结合疫苗。但上述两代细菌疫苗的多糖来源均为细菌提取,获得的荚膜多糖存在微观不均一、制备的糖蛋白缀合物存在质量不易控制等缺点,为了克服这些缺点,人们通过化学手段合成结构明确、糖链长短不一的荚膜多糖寡糖抗原,进而与载体蛋白相连制备糖蛋白缀合物,发展了第三代半合成疫苗,并且通过构效关系的研究,可确定出最佳的寡糖抗原结构。肺炎链球菌3型(SP3)是强致病性的亚型之一,它可引起成人侵袭性肺炎球菌病、坏死性肺炎和急性中耳炎。尽管SP3 CPS已经在肺炎十三价多糖结合疫苗(PCV13)中存在,但其CPS缀合物表现出较低的免疫球蛋白G(IgG)响应,影响了整个PCV13的保护功效。因此,本论文一个主要研究内容是以肺炎链球菌3型荚膜多糖为研究对象,制备系列具有明确抗原结构特征的SP3寡糖蛋白缀合物用于免疫活性评价:设计与合成了四个含有肺炎链球菌3型荚膜多糖重复片段的寡糖抗原(五、六、七、八糖);并将寡糖抗原与破伤风类毒素(TT)缀合得到寡糖蛋白缀合物候选疫苗;最后对制备缀合物的免疫活性和构效关系进行了初步的研究。研究还发现,许多细菌之所以致病,是由其分泌的成孔毒素引起的。这些成孔毒素是由细菌分泌产生的毒蛋白,它不仅仅是细菌的主要毒力和致病因子,还参与了细菌的生长和发育等过程。包括气单胞菌溶素和CAMP因子在内的成孔毒素能在宿主细胞表面形成孔状聚合物,并嵌入细胞膜内形成小孔,从而破坏细胞渗透屏障,导致反向离子交换和其他致命反应,最终杀死宿主细胞并导致疾病。但大多数的成孔毒素是亲水性的蛋白,并不含有明显的成孔结构,为了建立跨膜孔,成孔毒素通常与宿主细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合,从而形成孔状聚合物,并将聚合物插入至细胞膜中形成小孔。而GPI锚是一类天然糖脂,普遍存在于真核生物中,它通过将自身的脂质部分插入细胞膜的方式将蛋白质或糖蛋白固定在细胞表面。前期的研究结果表明,成孔毒素CAMP因子既能与GPI结合,又能与GPI结构片段结合,并且不含磷酸甘油脂的GPI衍生物能够抑制由CAMP因子导致的绵羊红细胞溶血现象。鉴于此,本论文另一个主要研究内容是筛选有效的基于GPI结构的成孔毒素抑制剂,主要包括:设计与合成一系列基于GPI结构的不同大小结构特征的衍生物;设计合成了基于氟硼二吡咯(BODIPY)荧光染料为标记探针的GPI衍生物,用于成孔毒素抑制剂的筛选。本论文主要包括以下三个部分:一、对肺炎链球菌3型荚膜多糖寡糖衍生物以及荧光或生物素标记的GPI锚衍生物的合成研究做了详细综述。肺炎链球菌3型荚膜多糖重复片段是由一分子糖醛酸和一分子葡萄糖以β-(1→4)键相连组成的二糖,由于分子中含有糖醛酸,其寡糖合成分为两种方式.①通过合理的保护基操作和组装策略,直接使用糖醛酸模块来构建糖链,最后脱除全部保护基得到目标化合物;②全部使用葡萄糖模块来构建糖链,然后选择性地裸露出需要转化为糖醛酸的葡萄糖模块6-OH,最后一步将所有的羟亚甲基(CH2OH)氧化为羧基(COOH)来实现糖醛酸的引入。而对于荧光或生物素标记的GPI锚衍生物的合成,主要是荧光分子或生物素衍生物中含有竣基,与GPI锚结构中额外的氨基以酰胺键相连,由于GPI锚结构中含有一分子氨基葡萄糖,在荧光分子或生物素与GPI锚缩合之前,氨基葡萄糖上自由的2-氨基先采用Boc保护基团保护,最后Boc保护基在缩合反应后用强酸脱除得到目标化合物。二、肺炎链球菌3型荚膜多糖相关寡糖及其蛋白缀合物的合成和免疫活性评价。我们以D-葡萄糖为起始原料,利用预活化糖苷化方法,首先构建了关键中间体二糖SP-10,利用SP-10来获得其他二糖和三糖模块,同时SP-10还起到延伸糖链的作用。通过[3+2]、[4+2]、[3+4]、[4+4]的组装策略成功构建了全保护五、六、七、八糖糖链,合成过程中充分利用苯甲酰基的邻基参与作用立体专一性地生成β糖苷键。选择性地裸露出葡萄糖基6-OH,一步将葡萄糖残基氧化成葡萄糖醛酸残基,最后脱除保护基得到目标化合物SP-(1-4)。通过交联剂琥珀酰亚胺戊二酸醋,SP-(1-4)分别与载体蛋白BSA和TT共价缀合得到一系列寡糖蛋白缀合物,其载糖量是通过基质辅助激光解吸飞行时间(MALDF-TOF)质谱仪测定载体蛋白缀合前后分子量的差值计算得来。SP3寡糖蛋白缀合物的初步免疫活性结果表明,它们都能引起依赖于T细胞的免疫应答,产生IgG抗体,并且五、六糖蛋白缀合物的免疫效果要显著强于七、八糖蛋白缀合物的免疫效果。三、GPI荧光标记物和基于GPI结构的成孔毒素抑制剂合成。我们分别以D-氨基葡萄糖和α-甲苷葡萄糖为起始原料,制得氨基葡萄糖供体GI-24和光学纯肌醇受体GI-38,进而偶联得到底座伪二糖GI-40。与此同时,以D-甘露糖为起始原料制备了甘露三糖供体GI-56。随后,采用[3+2]组装策略构建了全保护GPI核心伪五糖GI-57,紧接着在其Man-Ⅲ的6-O位引入磷酸乙醇胺、将氨基葡萄糖2-氨基以Boc保护基保护,催化氢化后的产物GI-62与含有羧酸长链的BODIPY衍生物GI-66在HATU[2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N',-四甲基脲六氟磷酸盐]作用下缩合。可惜的是,用酸性选择脱除Boc保护基的同时终产物失去了荧光性。我们又将Boc保护基替换成碱性脱除的Fmoc保护基,成功制得GPI荧光标记物GI-14和15。另一方面,以D-甘露糖为起始原料制备了Man-I的2-O位含有乙酰基的甘露单、二、三糖硫苷供体(GI-46、86、89),然后采用[1+2]、[2+2]、[3+2]组装策略构建了伪三、四、五糖(GI-90、95、100),脱除Man-1 2-O位乙酰基或肌醇1-O位对甲氧基苄基,紧接着磷酸乙醇胺化或单磷酸化。与此同时,将光学纯肌醇模块和伪二糖模块结构中肌醇1-OH单磷酸化,最后脱除保护基得到了一系列含有不同官能团、糖链长短不一的GPI衍生物GI-(1-13)。上述制备系列GPI化合物GI-(1-13)和两种GPI荧光探针GI-14、15为筛选有效的成孔毒素的抑制剂奠定物质基础。
关键词: 肺炎链球菌 ；寡糖缀合物 ；糖疫苗 ；成孔毒素 ；GPI ；抑制剂
摘要： 链球菌(Streptococcus)是一类球形的革兰氏阳性细菌,隶属于厚壁菌门,杆菌纲,乳杆菌目,链球菌科,链球菌属。这些细菌细胞分裂时总是沿一个轴,所以通常成对或者链状的。因为这些特征,他们被称作“链球菌”,区别于可以沿多个轴分裂而形成一团细胞的“葡萄球菌”(Staphylococcus)。其广泛存在于环境和人体。链球菌属包含了很多个种,既有对人类有益的菌种也有许多致病菌种。有一些链球菌能够引起众多疾病如红眼、脑膜炎、细菌性肺炎、心内膜炎、丹毒、坏死性筋膜炎等,但多数链球菌并非致病菌,而是人体皮肤、口腔、肠道上呼吸道等部位共生菌群的重要组成部分。根据链球菌溶血类型进行分类划分,可以将其分为α、β、γ等溶血性链球菌。α溶血性链球菌能够产生过氧化氢,氧化红细胞内血红蛋白分子生成氧化衍生物高铁血红蛋白,在血平板呈现草绿色溶血环;β溶血性链球菌又称完全溶血性链球菌,能够分泌外毒素链球菌溶血素,能够完全裂解红细胞,从而使血平板上呈现浅黄透明溶血环;γ型链球菌不会引起溶血。β溶血性链球菌根据Lancefield分类,即根据细菌细胞壁外荚膜多糖的种类分为不同A-V族(不含I和J型)多个血清型。医学上非常重要的致病菌主要是α溶血性链球菌中的肺炎链球菌和草绿色链球菌,以及β溶血性链球菌中的A族和B族链球菌。本论文主要针对A、B族链球菌进行相关研究。A族链球菌(Group A Streptococcus,GAS)又称化脓性链球菌,是一种引起人类高感染率和高死亡率的常见致病菌,主要引起四种类型的疾病:浅表感染如咽扁桃体炎、脓包等;深部感染如坏死性筋膜炎、化脓性关节炎等;毒素介导的疾病如猩红热、毒性休克综合征;免疫介导的疾病如风湿热等。据估算,每年有超过七亿人遭受GAS的感染,导致超过五十万人死亡。在美国每年仅GAS感染造成的儿童咽炎一项就花费约22-54亿美元。到目前为止,治疗GAS感染的唯一策略仍然是使用抗生素,但随着抗生素的普遍使用,所引起的细菌耐药性问题愈加严重。细菌不断增强的耐药以及治疗感染所需的高昂花费,使得寻找新的治疗和预防策略,如研发疫苗等,更加迫在眉睫。近年来,在抗GAS的新型疫苗研发中,人们发现源自A族链球菌的C5a肽酶(ScpA)是一种比较理想且有良好应用前景的靶标抗原,因为该蛋白不仅存在于多个不同族的链球菌中而且序列保守。据相关文献报道,ScpA是一种多肽酶,其氨基酸Asp130、His193、Ser512以及辅助形成氧离子口袋的Asn295是影响ScpA催化活性的重要氨基酸残基。与野生型相比,这些位点的点突变体蛋白活性有显著降低。研究表明突变体△ScpAD130A,S512A能够激发免疫反应,抑制GAS的侵染。然而,目前对该蛋白突变体的催化活性及其免疫原性的系统性研究尚不完善。蛋白载体能够有效提高多糖特异性免疫原性,激发T细胞依赖的免疫应答。目前,被批准应用于多糖-蛋白结合疫苗中的蛋白载体主要包括破伤风毒素(DT)、结核杆菌毒素(TT)、变体破伤风毒素(CRM197)等。蛋白载体既要能激起多糖特异性免疫,又要能有合适的Lys等氨基酸的数量以保证合适载糖量,而且还不能与机体组织交叉反应以免引起自身免疫性疾病,种种限制使得安全有效的蛋白载体种类非常有限。同时,不同疫苗长时间使用相同的蛋白载体,也会引起载体特异性T细胞免疫增强、载体诱导的抗原表位抑制(CIES)等。因此,开发新型蛋白载体具有重要应用价值和现实意义。本文中将对ScpA作为疫苗的靶标抗原和糖缀合疫苗的蛋白载体进行相关的实验研究,为其在疫苗研发方面的应用提供理论支持。本实验首先对ScpA的四个单点突变体H193A、D130A、S512A、N295A和一个双点突变体D130A/S512A进行表达和纯化,然后对ScpA及其各突变体的催化活性进行了评估。为此,以未修饰的天然C5a肽作为酶活反应底物,建立了一个简便、高灵敏度的MALDI-TOF质谱检测法来测定酶活的方法。实验结果显示,D130、N295位点突变对酶活的影响不是关键性的;S512位点对酶活比较重要但也并不起决定性的作用;S512单点突变和D130、S512双点突变酶活明显降低,但仍保留部分活性;但是,我们发现H193A单点突变体则完全丧失了催化活性,使该蛋白失去毒力。故而,我们在后续实验中以△ScpAH193A作为疫苗和蛋白载体的研究对象。初步的小鼠免疫学实验结果显示,△ScpAH193A具有较高免疫活性,能够引发小鼠免疫应答,激发特异性IgG抗体的产生,这说明该蛋白可以激发T细胞辅助的免疫应答。因此,该蛋白具有发展成为疫苗的潜力。此外,为了研究该蛋白作为一种新型疫苗载体蛋白的潜力,我们将GAS细胞表面多糖抗原的三糖重复单元衍生物共价连接到△ScpAH193A上,并对缀合物进行小鼠免疫实验。试验结果表明,GAS三糖-△ScpAH193A缀合物可以诱导高滴度的三糖特异性抗体IgG1的产生,这揭示了△ScpAH193A作为载体蛋白能够提高寡糖的特异性免疫原性,并激发T细胞依赖的免疫应答。因此,本研究的免疫学实验结果证明△ScpAH193A在设计和开发新型抗GAS疫苗和糖缀合疫苗蛋白载体中具有巨大的发展潜力,并为其提供了一定的实验依据。B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)属于β溶血性革兰氏阳性菌。其表面荚膜多糖(CPs)具有多样的重复单元,并在其黏附、耐干燥、抵抗宿主非特异性和特异性免疫等方面发挥至关重要的作用。根据这些荚膜多糖结构的不同,可以将GBS分为Ia、Ib、Ⅱ～Ⅸ等十种不同血清型。荚膜多糖位于细菌细胞外表面、具有免疫原性,结构相对保守、变化少、特异性强,具有开发为疫苗的潜力。此外,与传统疫苗相比,荚膜多糖疫苗的成分相对单一,不易引起免疫副反应,更加安全、和便于质量控制。连接蛋白载体后还可以获得多糖-蛋白结合疫苗,增强免疫原性和T细胞介导特异性免疫应答。GBS荚膜多糖的合成主要靠一系列合成酶和糖基转移酶催化合成寡糖重复单元,然后外排到细胞膜外,并聚合为多糖大分子。编码这些酶的基因聚集在一起形成基因簇。在多个血清型中,β-1,4-半乳糖基转移酶均催化UDP-Gal+Glcα-PP-Und→Galβ-1,4-Glc-PP-Und反应,该反应在催化荚膜多糖结构单元合成初始步骤中起非常重要的作用。因此,该酶具有重要的应用前景。比如,对其结构的深入研究可以帮助发展酶抑制剂和新型抗菌药物,而该酶也可以作为工具酶运用于相关寡糖和多糖的合成,有助于研究相关多糖的功能和糖疫苗的研发。根据序列比对,我们对该酶进行了全基因合成,最终合成的DNA序列共542bp,预期表达产物应当含有177个氨基酸残基。ExPASy预测理论pI和Mw为5.64和20548.17。我们将其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,纯化得到了高纯度的Cps4G蛋白,经SDS-PAGE电泳发现其分子量为20 kDa和40 kDa的两条带,进一步经过MALDI-TOF-MS,Western Blot以及蛋白N末端测序,确定这两条带分别是目的蛋白的单体和二聚体,二者无法完全分离,可以相互转化,且放置随着时间的延长,而二聚体有增多趋势。我们分别以D-葡萄糖、4-氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷以及N-乙酰-D-氨基葡萄糖等为受体,测定了该酶活性,以期能用做为寡糖和多糖酶法合成的工具酶。然而,实验结果表明该酶具有高度底物特异性,受体Glc-PP-Und的PP-Und的对底物的识别可能起到关键作用。同时,我们还对蛋白进行结晶筛选,发现了适宜蛋白结晶条件,据此条件进行蛋白结晶条件优化,已获得X-ray衍射3A结晶,还需要进一步优化,以期获得高分辨率结晶解析该酶的空间结构,从而解释其酶活特性活性关键位点,进一步优化催化活性、底物识别特异性用于开发CPS合成工具酶,并设计酶抑制物进而开发细菌抑制剂。
关键词: A族链球菌 ；C5a肽酶 ；多糖蛋白结合疫苗 ；蛋白载体 ；B族链球菌 ；糖基转移酶
摘要： 肺炎球菌感染作为呼吸系统疾病的主要致病因素之一,水牛、猪、山羊、狗和鸡等动物易感,对人类健康也造成严重威胁。动物感染常表现为肺炎、器官衰竭,致死率较高。人类感染表现主要包括侵袭性和非侵袭性两种类型,前者可引起菌血症、脑膜炎和肺炎等,后者则包括非菌血症性肺炎和中耳炎等。为应对此类疾病的威胁,全球范围内已推出多种肺炎球菌疫苗,如肺炎球菌结合疫苗和肺炎球菌多糖疫苗。这些疫苗的广泛应用大大减少了由肺炎球菌感染引起的呼吸系统疾病的发病率和死亡率。本论文旨在评估新研发的肺炎球菌疫苗的免疫效果。为此,本文建立了肺炎球菌间接酶联免疫吸附试验方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),并结合了多重调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assay,MOPA)和MTT法,作为对肺炎球菌结合疫苗免疫原性进行评价的手段。此外,我们探究了不同的小鼠品系、免疫剂量、免疫佐剂及免疫途径对肺炎球菌结合疫苗免疫原性的影响。论文的研究内容与结果如下:1.间接ELISA法检测肺炎球菌免疫抗体方法的建立:分别对酶标板、抗原包被浓度、血清稀释倍数和反应时间等条件优化,并且开展特异性和重复性试验。使用Corning 9017酶标板进行ELISA试验,无封闭液封闭程序,以1μg/mL1型肺炎球菌多糖的最佳抗原包被浓度包被抗原,抗原包被条件为在37℃包被5 h后4℃过夜,小鼠阳性血清起始稀释倍数为1600倍起,血清反应时间为120 min,酶标二抗反应时间为120 min,酶标二抗起始稀释倍数为3000倍起,最终显色时间为120 min。特异性试验、线性试验及重复性试验结果也显示:该方法特异性强,本实验室的载体蛋白破伤风类毒素和其他型肺炎多糖对ELISA检测多糖1型特异性抗体没有干扰;样品浓度与样品ELISA单位间有良好的线性关系;批间、批内重复试验的变异系数均小于20%,说明该方法重复性良好。结果显示,该方法具有良好的特异性、线性关系和重复性,为后续免疫效果评估提供了可靠的技术支持。2.运用建立的肺炎球菌间接ELISA法、肺炎球菌荚膜多糖特异性抗体多重调理吞噬试验(MOPA)以及MTT法来评价肺炎球菌结合疫苗免疫原性,以此比较分析免疫后肺炎球菌1型血清型特异性免疫球蛋白(Immunoglobulin G,IgG)抗体水平、杀菌滴度及其对T细胞增殖能力的影响。结果显示,在使用NIH小鼠为实验小鼠,磷酸铝佐剂为免疫佐剂、腹腔注射途径和0.05 mL(其中肺炎球菌1型多糖含量为0.22μg)免疫剂量的条件下,该疫苗的免疫效果更为显著。肺炎球菌结合疫苗不仅能激发机体的体液免疫,抗体水平可维持到第3次免疫14 d后达到峰值,几何平均ELISA单位值可达到7121.54,抗体几何平均滴度值可达到694;也能激发细胞免疫应答,T细胞增殖率可达到74.91±0.23,从而发挥更持久的免疫效果。综上所述,所建立的间接ELISA方法为评估肺炎球菌结合疫苗的免疫效果提供了可靠的技术手段;结合MOPA法对免疫小鼠血清中肺炎球菌抗体的杀菌能力进行检测,可评估肺炎球菌结合疫苗在不同的小鼠品系、免疫剂量、免疫佐剂及免疫途径下对机体的保护效力;并运用MTT法证明了肺炎球菌结合疫苗不仅能使机体产生体液免疫,也能产生细胞免疫,从而评估新疫苗的有效性也为肺炎球菌结合疫苗的研发和临床前实验提供了重要参考。
关键词: 肺炎球菌 ；结合疫苗 ；免疫原性 ；间接酶联免疫吸附试验
摘要： 研究发现,细菌表面普遍表达大量多糖分子,如荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等,它们不仅参与细胞分化、繁殖、衰老等过程,还是细菌攻击宿主的基础物质,并与毒性和侵染性密不可分,因而具有重要的生物学意义。细菌多糖一般在结构上高度保守且具有一定的免疫原性,这些特性使其成为研制亚单位疫苗的理想靶标抗原之一。然而,多糖只能诱导B细胞参与的免疫反应,并没有免疫记忆;但它与载体蛋白共价链接形成糖缀合物后,可激发T细胞依赖的免疫应答,接种后可长效保护机体。目前,市场上已有多种基于多糖、寡糖设计的细菌糖缀合物疫苗,如B型流感嗜血杆菌疫苗、A+C群脑膜炎球菌疫苗和肺炎链球菌疫苗等。这些糖缀合疫苗的成功研制激发了科研工作者对细菌多糖的研究热情。近年来,随着检测技术和生物学科的飞速发展,人们对多种人类致病菌的CPS或LPS的结构解析和免疫学活性研究也逐步深入。科学家们发现细菌细胞表面多糖的重复单元中,除含有常见六个碳及以下的低碳糖外,还有多种以7～9个碳原子为骨架的高碳糖,其中庚糖就是含有七个碳原子的高碳单糖。细菌庚糖一般以庚醛糖为主,分为6-位脱氧或甘油(非脱氧)两种类型,并有吡喃和呋喃两种环状结构。研究发现多种庚糖相关的寡糖抗原在动物实验中表现出强烈的免疫原性和保护作用,有的已经进入临床试验阶段。这些研究结果都证明含有庚糖结构的多糖和寡糖的蛋白缀合物可作为候选疫苗,具有很好的发展前景。那些在细胞表层多糖中检测到各种庚糖的细菌多数是人类致病菌,例如曾用作细菌武器的类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)和鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)以及表面CPS中分布多种罕见的庚糖变体的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)等。类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌是一类革兰氏阴性菌,具有易获取、易扩散、对抗生素天然耐药等特性,而且对人体各个器官都会攻击,临床诊断困难且致死率较高,这些条件使其具备用作细菌武器的潜在危险。美国疾病控制预防中心(CDC)将这两种细菌列为B类生物恐怖制剂和Ⅰ级病原微生物。而空肠弯曲菌是引起肠炎性腹泻最常见的食源性致病菌之一,在发展中国家传播率较高,患者除呕吐、肠胃炎等消化道疾病外还有患神经肌肉麻痹疾病格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome,GBS)等后遗症的可能,导致面神经麻痹和运动神经瘫痪等,疾病负担严重。然而,目前市场上并没有控制和预防这两类细菌的有效疫苗。研究发现类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌的CPS都以β-2-O-乙酰-6-脱氧-甘露庚糖结构作为重复单元,不仅是其毒力的决定性因素,还是一种保护性抗原。而分布多种庚糖变体的空肠弯曲菌的CPS不仅是血清抗性和侵染肠上皮细胞的物质基础,其结构差异还是细菌Penner血清系统的分型依据。基于以上研究,科研工作者利用CPS的免疫原性设计疫苗,以便有效地控制这两类细菌的感染问题。目前,获得多糖抗原的一般方法是从破碎细菌中直接分离提取,但这种途径得到的多糖存在结构不均一且混杂类毒素等有害物质等缺点。化学合成法可以制备结构明确均一的寡糖抗原,不仅可有效地解决疫苗的质量和安全问题,糖链长度和特殊修饰的自由合成,还可以用以构效关系的深入研究。基于此,我们选择以6-脱氧-甘露庚糖为基础的类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌CPS以及空肠弯曲菌HS53血清型RM1221毒株CPS为研究对象,开展相关寡糖类似物的合成和免疫学研究工作。根据两种CPS的结构特征,我们设计了以6-脱氧-甘露庚糖为单糖模块的多个寡糖片段,这些结构中有的存在多个难制备的β-(1→3)键,有的还含有α-(1→3)键和α-(1→3)连接的磷酸二酯键。通过文献调研和多种不同策略或路线的尝试,最终以较短的路线和较高的收率立体选择性地完成了一系列寡糖半抗原的化学合成工作。其中,类鼻疽或鼻疽伯克霍尔德菌CPS寡糖片段还与载体蛋白无毒性白喉毒素变异体(CRM197)缀合得到寡糖蛋白缀合物候选疫苗,并对其活性进行了初步测试。本论文主要包括以下三个部分:一、对细菌中常见庚醛糖的种类、来源和一般合成方法做了详细的综述;此外,还介绍了类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌及空肠弯曲菌CPS的结构和研究现状。最为常见的庚糖是C-6位非脱氧的一对差向异构体,常以α吡喃构型的支链三糖形式分布于多种高致病性革兰氏阴性菌的脂多糖内核心区域。此外,外核心区域和O-抗原重复单元也偶有发现。第二处聚集多种C-6-脱氧/非脱氧庚糖的区域是空肠弯曲菌表面CPS。合成庚醛糖的一般策略有己糖的一碳延伸法、戊糖的二碳延伸法、从头合成法和几种其它方式。以常见低碳糖为手性源的碳链延伸包括亲核加成、亲核取代、烷基锂盐、格氏加成、Wittig反应、金属参与等方法。另外,也有将从头合成普通葡萄糖法应用到合成庚糖上的途径,但这类研究报道较少。二、类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌CPS相关寡聚体类似物及蛋白缀合物的合成和免疫活性初步评价。该CPS仅以β-(1→3)连接的顺式6-脱氧-甘露庚糖作为重复单元,且2-O-位被乙酰基(Ac)修饰。据此,我们设计了八个目标分子,分别是含有Ac和不含Ac的单糖、二糖、三糖和四糖,用于免疫原性的构效关系研究。庚糖的合成直接从D-甘露糖出发,选择一碳延伸策略中简便的Wittig反应一步构建出6,7-庚糖烯,再对双键反马氏加成完成6-脱氧-甘露庚糖单体的制备。在单糖模块的组装过程中,我们尝试了三种方式:分子内糖苷配基转移策略(IAD)、直接偶联和氢键诱导糖苷配基转移策略(HAD)。IAD策略对实验无水条件要求较高,并不适合本研究中存在多个顺式构型甘露庚糖寡聚体的大量合成。而直接糖苷化虽然可以以41%的收率得到β产物,但是后续的分离纯化却耗时费力。最后,3-O-位Pico(吡啶-2-甲酰基)介导的糖基受体定向转移的HAD策略,可以成功实现β-(1→3)顺式甘露糖寡聚体单糖、二糖、三糖和四糖的高效构建。HAD途径操作简单且立体选择好,更重要的是Pico脱除后不仅可以作为受体,催化氢化又能直接生成目标分子中四个无Ac的寡糖。我们以双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)为交联剂实现了八个寡糖与无毒性白喉毒素变异体CRM197和牛血清蛋白(BSA)之间的缀合。并采用基质辅助激光解吸飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪确定了缀合前后的蛋白分子量,利用其差值计算出载糖量。初步免疫结果表明,八个寡糖CRM197缀合物都可以诱导较高水平的kappa和IgG抗体,其中IgG代表了抗体类型的转变和T细胞依赖免疫应答的发生;而两组有无Ac修饰的寡糖缀合物所诱导的抗体水平并没有显著性差异,这表明Ac基团对免疫结果和趋势影响较小。此外,对比不同聚合度的寡糖抗原,两个三糖缀合物表现出最强的免疫原性,说明较长糖链并不一定具有更好的抗原性。三、空肠弯曲菌HS53血清型RM1221菌株CPS三糖片段及其二聚体类似物的合成。与类鼻疽菌CPS相似,空肠弯曲菌CPS也以相同的6-脱氧-甘露庚糖作为唯一糖残基;不同的是,除了 β-(1→3)顺式糖苷键外,其重复三糖片段中还存在一个α-(1→3)键和α-(1→3)磷酸二酯键。最初我们计划收敛的[2+1]和[3+3]方式合成糖链;α、β和磷酸二酯键的构建分别利用邻基效应、HAD和H-膦酸酯策略完成,而庚糖依旧通过Wittig联合反马氏加成法制备。但在HAD策略介导的偶联反应中,我们意外发现Pico与3-OH受体之间的氢键受邻位2-O-Bz的影响,与其呈竞争关系,这大大降低Pico的诱导顺式糖苷键的功能。经多个糖苷反应探索,我们发现受体2-O-位引入酰类的保护基对选择性影响很大,且Bz>Ac,这可能是2-O-酯羰基与3-OH形成了环内氢键,使Pico诱导效应丧失所致。之后我们应用醚类的Nap和Bn保护基团可获得较高选择性,侧面印证了我们的结论。为了解决以上2-O-酯羰基导致的氢键竞争问题,我们重新设计了糖链的组装路线,将[2+1]调整为[1+2],先利用2-O-酰基的邻基效应构建反式α键,再将2-O-酰基替换为无效应的醚类保护基,高效且立体选择地完成目标三糖的合成。最后,经H-膦酸酯法完成[3+3]的汇聚组装,成功合成目标六糖中的α-(1→3)磷酸二酯键。两个目标化合物的还原端都引入了游离氨基,为后续糖缀合物的制备和生物学实验研究提供了便利。
关键词: 鼻疽伯克霍尔德菌 ；类鼻疽伯克霍尔德菌 ；空肠弯曲菌 ；庚糖 ；荚膜多糖 ；化学合成 ；碳水化合物 ；糖缀合疫苗
被引量
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摘要： 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引起的细菌性肺炎是一种危害人类健康的全球性传染病。肺炎链球菌以侵入性或非侵入性感染引起全人群,尤其在儿童和老年人中的肺炎、脑膜炎、鼻窦炎、中耳炎和菌血症等多种疾病。肺炎多糖蛋白结合疫苗在对肺炎链球菌引起的感染和疾病的预防和控制中取得了巨大的成功。由于其优于单纯多糖的抗体增强效应,以及可以产生免疫记忆和群体保护的优势,已成为肺炎疫苗的主要开发和应用方向。多糖与有效载体蛋白的结合是研制高效肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的关键。目前已开发上市的肺炎多糖结合疫苗所用的载体局限在破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(PT)、白喉毒素突变体(CRM197),不可分型流感嗜血杆菌蛋白(PD)少数的几种。这些载体蛋白也被用于其它多种结合疫苗中。重复接种含相同载体蛋白抗原的疫苗会导致免疫抑制效应(CIES)的产生,而使得机体对多糖的免疫反应减弱。另一方面,用作载体的蛋白经过脱毒、结合等化学过程可能改变载体蛋白原有抗原表位从而影响其免疫原性,还没有结合疫苗的产品说明书将其载体部分的免疫效果明确列入说明书中。因此,迫切需要开发安全、有效的新载体蛋白偶联疫苗来控制这种免疫抑制风险,并诱导产生针对多糖和蛋白载体的有效免疫应答,实现一针双效的目标,这对多糖蛋白结合疫苗尤其是肺炎多糖蛋白结合疫苗的开发十分必要和重要。本研究利用一种病原相关蛋白乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作为新的载体蛋白偶联新型肺炎球菌多糖结合疫苗及其对应的蛋白抗原和多糖抗原分别免疫小鼠后,比较研究免疫后不同时间点诱导产生的荚膜多糖和乙肝表面抗原蛋白的特异性抗体水平、细胞免疫应答和早期基因表达谱的情况。对这种新载体的肺炎结合疫苗的综合免疫效果研究结果表明,这种以乙肝表面蛋白(HBs)为载体偶联33F型肺炎荚膜多糖(PN33Fps)的新型肺炎结合疫苗能刺激免疫小鼠产生分别针对两种抗原的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应。与两种单抗原免疫的小鼠相比,这种新的结合疫苗可同时产生更强的针对多糖(PN33Fps)和蛋白(HBs)的体液免疫和细胞免疫,达到一针双效的免疫效果,且随免疫针次的增加而增强。然而,同等剂量的多糖免疫组即使加强免疫也不能产生抗体阳转。此外,采集免疫后小鼠脾脏组织,分析疫苗免疫早期基因表达谱的差异特征发现:这种以乙肝表面蛋白为载体的新型肺炎结合疫苗诱导了更多的免疫相关基因的表达,并呈现出与单抗原不同的变化规律,特别是在免疫细胞的分化和发育中呈现出与单抗原不同的变化规律。这种差异变化规律可能是不同抗原刺激后的先天和适应性免疫细胞中某些免疫信号分子的特征性表达,与多糖和蛋白结合后更强抗体水平的产生以及细胞免疫反应有关。此外,通过细胞融合技术从这种乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中,分离到了分别针对肺炎33F型多糖抗原和乙肝表面蛋白抗原的特异性B淋巴细胞的单克隆抗体细胞株。对分离的特异性B淋巴细胞单克隆细胞株进行抗体分泌能力和特性的鉴定显示出所筛选的细胞株具有持续分泌特异性IgG1抗体的能力。进一步验证了这种以乙型肝炎病毒表面蛋白作为载体蛋白的新型肺炎结合疫苗诱导了小鼠脾细胞中特异性B淋巴细胞的分化和发育以及血清中抗体的产生。简而言之,从体液免疫、细胞免疫到分子水平的研究提示了这种新载体结合疫苗在小鼠上良好的免疫效果。在这种以乙肝表面蛋白为载体的新型肺炎结合疫苗免疫效果研究的基础上,我们也对免疫后小鼠的初步安全性进行了评估,通过对免后小鼠不同时间体重观察以及主要器官的组织病理学进行观察和研究。结果表明,该结合物免疫后的小鼠与对照组相比,未出现明显的病理改变,且体重在免疫期内持续增长,显示出了这种结合疫苗的初步安全性是可预期的。总之,本论文研究结果表明出这种以乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠中具有良好的免疫效果和安全性。提示了以乙肝表面抗原为载体可以促进对多糖免疫效果的提升,同时也能诱导小鼠产生针对乙肝表面蛋白的免疫反应,在小鼠上验证了这种乙肝表面抗原蛋白可以作为肺炎结合疫苗新的载体,并能实现一针双效的免疫效果。对这种结合疫苗免疫小鼠后的早期体液、细胞和分子水平的免疫机理研究为结合疫苗的研究和开发提供了一种新的路径。而用这种结合疫苗免疫小鼠后分离到的肺炎33F型多糖和乙肝表面蛋白的特异性B淋巴细胞单克隆抗体细胞株及其分泌的抗体应用的初步研究为后期该结合疫苗的开发的质量评价奠定了基础。
关键词: 结合疫苗 ；肺炎多糖 ；乙肝表面蛋白 ；载体蛋白 ；基因表达谱
被引量
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摘要： 类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）简称类鼻疽菌,属兼性胞内革兰氏阴性菌,主要存在于水源和土壤中,可通过多种途径（如呼吸道、消化道等）感染人和动物,引起一种称为类鼻疽（Melioidosis）的人兽共患病。类鼻疽的临床症状多样,包括难治性肺炎、坏疽以及致死性败血症等,治疗周期长,费用高,且存在较高的复发率。鉴于类鼻疽菌极易传播、致死率高、耐药性强,且目前尚无有效的疫苗,已被WHO列为B类生物恐怖剂,严重危害人类健康。调查结果显示在全球范围内,类鼻疽病的诊断严重不足。目前,针对类鼻疽菌的实验室诊断方法（如细菌学培养、分子生物学方法和蛋白组学方法等）均存在一定的局限性,且没有商业化、可靠的类鼻疽菌快速诊断方法应用于临床,因此,建立一种简便快速的诊断方法迫在眉睫。ELISA是一种标准的血清学检测方法,也是进一步发展快速检测方法的基础。已有研究报道显示类鼻疽菌溶血素共调节蛋白1（hemolysin coregulated protein 1,Hcp1）的表达水平在其感染宿主的过程中会显著升高,并且能够与类鼻疽患者血清发生强烈的抗原抗体反应,这提示我们该蛋白可诱导机体产生特异性抗体,具有作为血清学诊断抗原的潜在应用价值。基于此,本研究采用DNA重组技术,通过原核表达的方式获得了分子量大小为18 k Da左右的高纯度重组Hcp1（recombinant Hcp1,r Hcp1）蛋白。进一步,我们对r Hcp1蛋白的免疫学性质进行了初步的研究:首先以r Hcp1蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA实验检测抗血清效价,结果显示r Hcp1蛋白表现出较强的免疫原性,刺激动物产生的抗体效价可达1:512 000。接着利用免疫印迹实验、免疫荧光实验对r Hcp1蛋白及其抗血清的特异性进行研究,结果显示r Hcp1蛋白能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合,而与来自疫区阴性血清（未感染类鼻疽菌体检者的血清）不发生结合,二者差异极显著;r Hcp1抗血清仅与类鼻疽不同临床菌株发生特异性结合反应,而与其他病原菌不发生反应,说明r Hcp1蛋白具有较强的特异性。据此,我们初步认为r Hcp1可以作为类鼻疽血清学诊断的候选抗原靶标。类鼻疽菌表面含有丰富的多糖,包括脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、荚膜多糖（capsular polysaccharides,CPS）和胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）等,这些外膜多糖作为重要的毒力因子,在类鼻疽菌的致病机制和免疫调节中发挥着重要的作用,具有作为诊断抗原和疫苗候选抗原的潜能。由于类鼻疽菌可以表达多种LPS和CPS,而截至目前,尚无关于我国类鼻疽菌临床分离株表面多糖的相关报道,对其外膜多糖抗原类型及其生物学功能尚不清楚。基于此,本研究对不同临床菌株进行了外膜多糖的纯化、结构表征和免疫原性研究。首先采用分步提取的方式获得了不同类鼻疽菌临床菌株的胞外多糖,并利用离子交换层析和分子筛层析进行分离纯化,高效凝胶渗透色谱鉴定结果显示纯化后的三种抗原成分BPC004-BPPI-b1、BPC006-BPPI-b1和BPC010-BPPI-b1组成相对均一,分子量大小均分别为931 k Da,640 k Da和546 k Da。进而利用GC-MS、甲基化分析、FT-IR和1D/2D NMR进行精细结构的表征,结果显示BPC004-BPPI-b1的结构为[3)-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→3）-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→]重复单元组成的线性多糖链;BPC006-BPPI-b1主要由[3-（a-D-Manp-1→3-a-D-Manp）4-2Me-a-L-6d Talp-1→]构成;BPC010-BPPI-b1的结构与BPC006-BPPI-b1基本相同。进一步,对这三种多糖抗原的免疫学性质以及抗原结构对其免疫活性的影响进行了初步研究:首先采用间接ELISA法对多糖抗原的免疫原性和免疫反应性进行了研究,结果显示三种糖抗原均具有较好的免疫原性,且能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合反应,而与疫区阴性血清不发生结合反应。接着采用间接ELISA法对多糖抗原的抗血清与不同临床菌株的交叉反应情况进行了研究,结果显示抗血清可与本研究中所选取的80%临床菌株发生交叉反应,推测本文所表征的[3)-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→3）-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→]和[3-（a-D-Manp-1→3-a-D-Manp）4-2Me-a-L-6d Talp-1→]两种抗原可能在类鼻疽菌的血清学诊断和疫苗开发方面都具有较大的应用价值。最后利用FT-IR、免疫印迹及竞争性ELISA法对多糖抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫原性的影响进行了研究,结果显示抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫活性十分重要,脱去乙酰基的抗原丧失了与抗体的结合能力。综上所述,本文的研究结果将为类鼻疽菌诊断抗原和疫苗候选抗原的筛选提供新的理论依据和数据支撑。
关键词: 类鼻疽菌 ；rHcp1蛋白 ；外膜多糖 ；结构鉴定 ；免疫原性
被引量
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摘要： 脓毒症是ICU病人最常见的死亡原因,尽管其医疗投入巨大,严重脓毒症的死亡率还是居高不下,可达25%-30%,而脓毒症休克的死亡率则更高,达到了40%-70%。
脓毒症可由多种病原微生物感染引起,包括革兰氏阳性（G+）菌、革兰氏阴性（G-）菌和真菌等等,而其中G-菌感染是最重要的一种,占总发病人数的40%以上。脂多糖（LPS）是G-菌细胞壁的重要组成成分,也是G-菌感染脓毒症中最主要的毒力因子和抗原成分。所以在G-菌感染引起的脓毒症的诊断与治疗中,LPS是一个重要的靶点。目前尚无LPS拮抗剂用于临床应用或进入临床观察,但有证据显示,预存抗LPS抗体与败血症的发生、大样本住院肿瘤患者、烧伤、外科手术等因感染死亡的病人数呈负相关,即对LPS诱发的病理进程有明确的保护作用。动物实验显示针对LPS的单克隆抗体（mAb）对实验性脓毒症动物模型具有良好的保护作用。所以,抗LPS的mAb有可能成为治疗G-菌感染诱发的脓毒症的一种新制剂。
LPS由三部分组成:O特异性抗原,也叫O抗原或体抗原,位于G-菌细胞壁的最外面,由一长链多糖构成;核心寡糖,是一由大约10个左右的单糖组成的寡糖;类脂A。所以,脂多糖是一结构十分复杂、具有多种异质性的生物大分子,而且属于胸腺非依赖抗原（TI）抗原。与蛋白质等胸腺依赖（TD）抗原不同,TI抗原不能诱导抗体亲和成熟,也不能诱导免疫记忆,所以按常规的免疫方法很难产生高亲和力、交叉反应性抗LPS的mAb。为解决此难题,一个可行的方法就是用分子模拟技术,即用蛋白质、多肽来模拟LPS的抗原结构,从而将多糖类TI抗原转变为多肽类TD抗原,提高抗原的免疫原性。那么,筛选出能够模拟LPS抗原结构的多肽就成为其中关键的一步。
噬菌体展示技术是一种用于筛选和改造功能性短肽和蛋白质强有力的生物技术,广泛应用于免疫学和分子生物学领域。事实上,噬菌体展示技术早已成功的应用于多糖表位的模拟肽筛选,如对脑膜炎奈瑟球菌A、B、C三种血清型的荚膜多糖的模拟肽筛选。这些结果说明,用噬菌体展示技术可以筛选出模拟多糖抗原表位的模拟肽,从而将TI抗原转变为TD抗原,诱导强而有力的记忆性免疫应答,制备出高亲和力、交叉反应性抗LPS的mAb。
所以,本课题的主要研究思路是:利用噬菌体展示技术筛选并合成模拟LPS保守抗原表位的多肽,将其抗原表位的化学性质由脂多糖改变为短肽,由此使TI抗原改变为TD抗原;然后将多肽与适当的载体进行交联,用交联物作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备具有高亲和力、广泛交叉反应性的抗LPS的mAb。最后对其在动物体内、外的保护活性进行初步探讨。
本课题组在前期工作中,以具有交叉保护活性的抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体为配基成功的从噬菌体环七肽库中筛选到四个可模拟LPS表位的保守序列,其免疫原性和抗原性已通过一系列实验得以证实。其中一个模拟肽经加入延长序列被命名为13L,我们的前期实验显示,用13L交联蓝载体（BC）作为免疫原免疫BALB/c小鼠后,可以诱导小鼠产生针对G-菌感染和内毒素休克的保护作用。以这些实验结果为依据,本实验选择13L作为候选模拟肽,交联BC后免疫BALB/c小鼠,制备抗LPS的单克隆抗体。本研究包括以下两个部分:
一、抗脂多糖单克隆抗体的制备及鉴定
模拟肽13L的筛选与合成按照本课题组以前建立的方法进行,现简述如下:以大肠杆菌LPS L2630为配体用亲和层析法从抗鼠伤寒沙门氏菌兔血清中纯化出抗LPS的多克隆抗体;以纯化的多克隆抗体为配体从环七肽库中筛选出模拟LPS抗原表位的多肽,其中的一个亲和力较强的多肽被命名为L7;为了增加L7的结构稳定性,我们在其氨基酸序列两侧各加入两个额外的氨基酸,并命名为13L,然后交由生物公司进行合成。
由于短肽分子量过低而不具备免疫原性,遂将其与蓝载体通过交联剂EDC的作用而进行交联,将交联物13L-BC作为本次实验的免疫原。
用13L-BC免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,共免疫7次,免疫程序如下:第1次免疫,将13L-BC与福氏完全佐剂（CFA）充分乳化后,小鼠足垫、皮下多点注射,1mg/ml,100μl/只,3周后进行第二次免疫;第2-5次免疫,将13L-BC与福氏不完全佐剂（IFA）充分乳化后,小鼠足垫、皮下多点注射,1mg/ml,100μl/只,每次间隔2周;第6次免疫,将煮沸处理过的大肠杆菌O111:B4和鼠伤寒杆菌直接行小鼠腹腔注射,5×10～6CFU/只;第七次免疫,2周后,小鼠眼眶静脉采血并包被L2630和L7261用间接ELISA检测血清中抗LPS抗体的滴度,抗体滴度高的小鼠再尾静脉注射10μg L2630加强免疫一次。
3天后,处死小鼠,取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤,用L2630和L7261进行复合筛选,对双阳性孔进行克隆化。连续三次克隆化100%阳性后,扩大培养杂交瘤细胞,收集杂交瘤细胞行小鼠腹腔注射制备腹水,用亲和层析法从制备的腹水中纯化单克隆抗体。
共融合3次,融合率在60%-100%之间,阳性率在1%-5%之间。通过筛选、克隆化最后获得一株能稳定分泌抗LPS抗体的杂交瘤细胞,命名为SMU-3A8。包被L2630检测SMU-3A8的腹水效价和纯化抗体效价,结果分别为1:1×10～6和8ng/ml。经IgG亚类鉴定试剂盒鉴定,SMU-3A8的亚类为IgG2a。用间接ELISA、WesternBlot、Dot-ElISA、免疫荧光和流式细胞术显示SMU-3A8可以和四种商品化的LPS反应,即大肠杆菌O111∶B4型LPS（L2630）、大肠杆菌O127∶B8型LPS（L3880）、鼠伤寒沙门氏菌LPS（L7261）和肠炎沙门氏菌LPS（L6761）,其亲和力分为4.9×10～8L/mol、1.6×10～7L/mol、4.2×10～8L/mol和1.5×10～7L/mol。并可以和七种G-菌（大肠杆菌O111∶B4,大肠杆菌O127∶B8,鼠伤寒沙门氏菌,福氏痢疾杆菌,绿脓假单胞菌,结肠炎耶尔森菌,鼠疫耶尔森菌）的超声上清及细菌全菌反应,但不能和金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、变形杆菌等G+菌反应。说明SMU-3A8是具有广泛交叉反应活性的抗LPS单克隆抗体。
二、抗脂多糖单克隆抗体的体内、外保护活性
在第一部分实验中,我们已成功的制备了一株能与多种商品化LPS和G-菌具有交叉反应性的单克隆抗体SMU-3A8。我们用补体依赖细胞毒试验和SMU-3A8对LPS刺激单核细胞产生NO的影响来检测其体外活性;用SMU-3A8对致死量G-菌感染小鼠存活率的影响以及对内毒素休克小鼠存活率的影响来检测其体内活性,具体过程如下:
1.补体介导的细胞毒试验细菌37℃振荡培养5小时后,室温8000rpm,离心10分钟,用无菌PBS洗涤三次并调整细菌浓度为10～4CFU/ml。然后按体积1∶1的比例加入倍比稀释的SMU-3A8（初始浓度10μg/ml）,转入到96孔培养板中,180μl/孔,加入豚鼠血清,20μl/孔,设不加抗体及不加补体的空白对照组。37℃反应1小时后,每孔取出10μl用无菌PBS稀释20倍至终体积200μl,然后均匀涂布于LB平板上,37℃过夜培养,计数形成的细菌集落。
结果显示,在补体存在的情况下,SMU-3A8并不能对金葡菌、大肠杆菌、鼠伤寒菌和痢疾杆菌构成杀伤作用。
2.SMU-3A8对LPS刺激单核巨噬细胞产生NO的影响小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为本实验的靶细胞。用完全培养基调整细胞浓度为10～6个/ml,加入到24孔培养板中,500μl/孔。然后同时加入终浓度为10μg/ml的L2630和倍比稀释的SMU-3A8,设同型对照和空白对照。37℃培养24小时后,收集上清,用NO检测试剂盒检测上清中NO的浓度。
结果显示,在较高浓度下（≥10μg/ml）SMU-3A8对L2630刺激RAW264.7产生NO有一定的抑制作用,如在10μg/ml时,其抑制率为20%左右。
3.SMU-3A8对细菌感染和内毒素休克小鼠模型的保护作用参照本课题组以前建立的G-菌感染和内毒素休克动物模型,并做了适当调整,作为本次实验的动物模型。G-菌过夜培养后用无菌PBS调整浓度,BABL/c小鼠腹腔注射,使其在4-7天时,死亡率为100%。BALB/c小鼠尾静脉直接注射LPS来制备内毒素休克模型,200μg/只,使其在12-36小时死亡率为100%。细菌或LPS注射2小时前,于小鼠尾静脉注射不同浓度的SMU-3A8,设同型对照和空白对照。观察并记录小鼠的存活情况。
结果显示,SMU-3A8在高浓度时能将鼠伤寒感染小鼠的死亡率从100%降低到75%左右,对大肠杆菌,痢疾杆菌感染小鼠则没有保护作用。对本实验中的内毒素休克模型也没有保护作用。
结论
在本实验中,我们用模拟肽模拟LPS的抗原表位并将模拟肽与蓝载体交联作为免疫原,成功制备了一株具有交叉反应活性的抗LPS mAb SMU-3A8。ELISA,Dot-ELISA,Western Blotting,免疫荧光,流式细胞检测结果显示,SMU-3A8可以和四种商品化的LPS以及七种G-菌反应,但不和G+菌反应。体内、外保护实验显示,SMU-3A8可以减少L2630刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7产生NO的量,并可以提高鼠伤寒菌感染小鼠的存活率,具有一定的保护作用。
据我们所知,还未有用模拟肽制备抗LPS mAb的报道,我们的实验为多糖等TI抗原的mAb制备提供了一个新策略。SMU-3A8具有交叉反应性和一定的保护活性,有可能成为LPS研究的一个重要的工具,在临床G-菌感染的诊断和治疗中也可能会发挥一定作用。
关键词: 单克隆抗体 ；脂多糖 ；模拟肽 ；交叉反应性
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