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摘要： 目的合成聚乙二醇双抗癌药偶联体并进行结构表征。方法以小分子抗癌药帕布昔利布为原料药,以可生物降解的GLG肽链作为连接链,经过酰胺化反应,去Boc保护反应等反应,得到Fmoc-E(GLG-PCB)(OH);再以类似方法得到H2N-GLG-SB743921后,使其与Fmoc-E(GLGPCB)(OH)进行反应,得到E(GLG-SB743921)(GLG-PCB),再与Boc-Gly-OH进行反应,分离纯化后得到G-E(GLG-SB743921)(GLG-PCB),将其与PEG-10K在N,N-二甲基甲酰胺作溶剂的条件下,低速、避光在室温下搅拌反应一周,经分离纯化得到目标产物PEG-10K-G-E(GLGSB743921)(GLG-PCB)。结果与结论首次合成了聚乙二醇偶联双抗癌药PEG-10K-G-E(GLG-SB743921)(GLG-PCB),重要中间体和目标产物的结构经1H-NMR、MS谱确证,均为未见文献报道的新化合物。利用该方法可合成聚乙二醇偶联双抗癌药,为高分子偶联抗癌药提供新的合成路线。
关键词: 聚乙二醇 ；帕布昔利布 ；CDK4/6抑制剂 ；SB743921 ；KSP抑制剂 ；聚乙二醇偶联抗癌药
摘要： 目的 合成哑铃型树枝状多肽大分子。方法 通过引入小分子化合物Fmoc-Gly-OH作为连接臂,高产率得到双端氨基化聚乙二醇（NH_2-CH_2-COO-PEG_（2000）-OOC-CH_2-NH_2）;然后再分别以双芴甲氧羰基保护的赖氨酸〔Fmoc-Lys（Fmoc）-OH〕、芴甲氧羰基及叔丁氧羰基保护的赖氨酸〔Fmoc-Lys（Boc）-OH〕为支化单元,采用液相发散法合成了表面富含氨基的哑铃型PEG/赖氨酸树枝状大分子共聚物。结果和结论 利用~1H NMR和MS对中间产物及终产物的结构和相对分子质量进行表征,结果表明成功合成了哑铃型树状多肽大分子,为其在生物医学领域的应用打下基础。
关键词: 多聚赖氨酸 ；聚乙二醇 ；哑铃型 ；树状多肽 ；液相合成
摘要： 研究多肽对人体的生理作用,可以提供许多预防和治疗人类疾病的有效方法。由于合成多肽的原料昂贵,且产率低,不易提纯,因此有必要对多肽的合成方法进行不断的简化和改进。选择赖氨酸、甘氨酸为主要研究对象,用二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、9-芴甲氧羰基琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)分别保护赖氨酸的ε-氨基和α-氨基,以水-丙酮为反应体系,制得N-9-芴甲氧羰基-N-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(Fmoc-L-Lys(Boc)-OH)。然后采用HATU为缩合剂活化Fmoc-L-Lys(Boc)-OH结构中的羧基,生成活泼酯,以乙腈-水溶液为反应体系,50-60℃回流反应5h,与甘氨酸缩合制备Fmoc-L-Lys(Boc)-Gly-OH二肽。合成的Fmoc-L-Lys(Boc)-Gly-OH经红外光谱和质谱表征,结构得到验证,为氨基酸保护及多肽合成提供了实验依据和理论参考。
关键词: 多肽 ；L-赖氨酸 ；L-甘氨酸 ；氨基保护 ；缩合剂
被引量
1
摘要： 由苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和赖氨酸(K)组成的KLVFF五肽序列是阿尔茨海默β-淀粉样肽自聚集形成纳米纤维化结构的核心片段,合成该肽段及对其分子侧链和主链结构进行修饰对研究阿尔茨海默病发病机制具有重要意义。以Fmoc-保护基缬氨酸(Fmoc V-OH)和Fmoc-保护基苯丙氨酸(Fmoc F-OH)为原料,N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂,采用液相合成法合成了Fmoc基保护的二肽、三肽模块Fmoc FF-OH和Fmoc VLK(Boc)-OH,模块在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中与哌啶反应脱保护基后得到二肽、三肽NH2-FF-OH和NH2-VLK(Boc)-OH。Fmoc基保护的模块再与二肽、三肽组合、缩合及脱保护反应后,经反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化得到骨架中赖氨酸(K)的侧基由Boc保护的阿尔茨海默β-淀粉样肽核心片段肽H2N-VLK(Boc)FF-OH及H2N-FFVLK(Boc)-OH,并对目标五肽进行了核磁和质谱表征。
关键词: 阿尔茨海默β-淀粉样蛋白 ；VLK(Boc)FF五肽 ；FFVLK(Boc)五肽
被引量
1
摘要： 多肽一般指α-氨基酸以肽键连接形成的化合物,其作为药物具有生物功能明确、作用专一、毒性低等优点,临床上已被广泛用于刺激造血、抗肿瘤、免疫调节等。为克服其稳定性差、半衰期短等缺点,以聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等聚合物进行化学修饰被认为是简单、有效的策略。考虑到现有化学法修饰多肽药物尚存在反应位点选择性差、修饰率低及易导致活性损失等问题,我们尝试采用酶催化法对多肽药物进行PEG或透明质酸(hyaluronic acid,HA)定点修饰,所采用的工具酶是一种来源于茂源链霉菌(Streptomcyes mobaraensis)的微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,mTGase)。mTGase可以催化谷氨酰胺(glutamine,Gln)的γ-甲酰胺基和赖氨酸(lysine,Lys)的伯胺基之间形成新的酰胺键。据此,本研究以含Gln或Lys残基的胸腺五肽(thymopentin,TP5;氨基酸序列为RKDVY)、抗肿瘤多肽PCK3145(氨基酸序列为EWQTDNCETCTCYGT)以及设计的抗血管生成活性多肽ES2-TH(氨基酸序列为IVRRADRAAVPGGCGKRK)为研究对象,以末端功能化的PEG或HA为修饰剂,由mTGase催化进行位点特异性修饰;测定得到的PEG/HA-多肽缀合物的药代动力学特征和体外活性,并比较与未修饰多肽的差异。本研究旨在利用mTGase酶催化实现多肽药物的PEG/HA高效、定点修饰。本学位论文的研究内容和取得的主要成果如下:1.PEG-多肽缀合物的酶法合成与表征(1)PEG-ZQG的合成与表征mTGase的二肽底物苄氧羰基-L-谷氨酰胺-甘氨酸(benzyloxycarbonyl-L-glutamine-glycine,ZQG)的羧基经EDC/NHS活化后,与叔丁基胺聚乙二醇胺(BOC-PEG-NH2)的氨基反应得到PEG-ZQG,反应产率为75.3%。紫外-可见扫描谱图显示,PEG-ZQG与ZQG均在255 nm处具有特征吸收峰;PEG-ZQG的1H NMR谱图在δ=7.47-7.17 ppm处新增ZQG苯环的特征信号峰,因此含单一Gln残基的PEG-ZQG的合成成功。(2)PEG-TP5的制备与表征由于TP5含单一 Lys残基,故尝试在mTGase的催化下,使之与PEG-ZQG的Gln残基共价相连。反应液经Superdex30凝胶柱纯化得到产物(命名为PEG-TP5),反应产率为78.5%;HPLC分析表明PEG-TP5的纯度为96.6%。与TP5类似,PEG-TP5的紫外-可见扫描谱图显示其于220 nm和275 nm处具特征吸收峰。其1H NMR谱图在δ=7.02 ppm和δ=6.73 ppm处增加TP5酪氨酸残基中苯环的特征信号峰;在δ = 6.73 ppm处增加了 TP5缬氨酸残基中两个甲基的特征信号峰;与TP5的赖氨酸残基侧链C4-H的信号峰(δ=2.53 ppm)相比,PEG-TP5对应的信号峰向低场移动(δ= 3.18 ppm),表明PEG-ZQG对TP5赖氨酸残基的侧链氨基实现定点修饰。缀合物中TP5的苯环氢信号峰和BOC-PEG-NH2的叔丁基氢信号峰(δ= 1.32 ppm)的积分比为0.41:1,由于每个TP5分子中含有4个芳香氢,每个BOC-PEG-NH2分子中含有9个叔丁基氢,可计算得缀合物的TP5与PEG分子数比为1:1。2.HA-多肽的酶法合成与表征(1)6-O-硫酸化HA的制备与表征HA先以离子交换法转化为四丁基铵盐,再以不同浓度的三氧化硫吡啶络合物对其进行硫酸化修饰,得到不同硫酸化程度的硫酸化HA(sulfated HA,SHA)。元素分析结果显示SHA-1、SHA-2、SHA-3和SHA-4的硫氮原子比分别为0.0500、0.9333、1.453和2.888。其中SHA-2的1H NMR谱图显示位于δ=3.4 ppm的C6-H的信号峰向低场移动,而C2-H、C3-H和C4-H的信号峰未发生明显改变。因此,SHA-2为C6-OH定点硫酸化的HA衍生物。(2)HA-HMD的制备与表征由于HA结构中无游离氨基,采用还原胺化反应于HA末端连接1,6-己二胺(hexamethylene diamine,HMD)。HA-HMD的1H NMR谱图在 δ=1.35 ppm、δ= 1.60 ppm和δ=2.90 ppm处出现三个积分值相近的信号峰,分别为HMD的α-H、β-H和γ-H的信号峰,表明HA-HMD的结构与预期相符。(3)HA-ZQG的制备与表征采用合成PEG-ZQG类似的方法,使HA-HMD的末端氨基与ZQG的羧基共价相连制备HA-ZQG,反应产率为86.9%。HA-ZQG的1H NMR谱图在δ=7.45-7.25 ppm处新增苯环的特征信号峰,表明含Gln的HA-ZQG合成成功。(4)HA-TP5的制备与表征经mTGase酶催化,TP5与HA-ZQG发生修饰反应,纯化得到产物(HA-TP5),反应产率为82.7%,HA-TP5的纯度为95.1%。HA-TP5的1H NMR谱图在δ= 7.02 ppm和δ=6.73 ppm处新增TP5酪氨酸残基中苯环的特征吸收峰;在δ= 3.78 ppm处出现TP5氨基酸的α-H信号峰;在δ=0.99 ppm处出现TP5缬氨酸的甲基信号峰,故TP5被HA共价修饰。缀合物中HA的异头氢信号峰与氨基酸α-H信号峰积分值比例为1:0.29,由于每个TP5分子中含有5个α-H,每个HA分子中平均含18个异头氢,计算得平均一分子HA连接1个TP5。(5)HA-PCK3145的制备与表征在mTGase催化下,尝试以含伯氨基的HA-HMD修饰PCK3145的单一 Gin残基,纯化得到新产物(HA-PCK3145),反应产率为81.7%,纯度为88.3%。HA-PCK3145的1H NMR谱图显示在δ=8.32 ppm处出现PCK3145酪氨酸和色氨酸的苯环特征吸收峰;δ =3.88-3.77 ppm处出现PCK3145各个氨基酸的α-H信号峰,δ= 2.51 ppm处出现谷氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬氨酸残基的特征信号峰,表明PCK3145的Gln残基被HA定点修饰。缀合物中HA的异头氢与氨基酸α-H的氢信号峰积分比例为1:0.8,由于每个PCK3145分子中含有15个α-H,每个HA分子平均含有18个异头氢,可计算得平均一个HA上连接1个PCK3145多肽。(6)HA-ES2-TH的制备与表征以HA-HMD对ES2-TH的Lys进行修饰,纯化得到新产物(HA-ES2-TH),反应产率为85.0%,纯度为92.1%。HA-ES2-TH的1H NMR谱图显示的δ=3.76-3.94 ppm的信号峰归属ES2-TH各个氨基酸α-H;在δ=2.56 ppm处出现峰归属赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的与N或S原子直接相连的亚甲基;在δ= 1.21 ppm处出现的峰为异亮氨酸与缬氨酸中甲基的信号峰,表明ES2-TH被HA修饰成功。缀合物中HA的异头氢与ES2-TH氨基酸的α-H信号峰的积分比例为1:1.24,由于每个ES2-TH含有18个α-H,每个HA分子中平均含有18个异头氢,可计算得平均一个HA上连接1个ES2-TH多肽。(7)SHA-ES2-TH的制备与表征最后,以SHA-HMD修饰ES2-TH得到SHA-ES2-TH,反应产率为80.0%,纯度为96.4%。SHA-ES2-TH的1H NMR谱图显示的δ=3.76-3.94 ppm的多个小峰为ES2-TH各个氨基酸α-H的特征信号峰;在δ = 2.56 ppm处出现峰为赖氨酸、精氨酸和半胱氨酸上的与N或S原子直接相连的亚甲基的信号峰;在δ =1.21 ppm处出现的峰为异亮氨酸与缬氨酸中甲基的信号峰。缀合物中SHA的异头氢与ES2-TH氨基酸α-H信号峰的积分比例为1:1.18,由于每个ES2-TH分子中含有18个α-H,每个SHA分子中平均含有18个异头氢,可计算得平均一个SHA上连接1个ES2-TH多肽。3.多肽缀合物药代动力学研究选用BALB/c小鼠作为动物模型,以尾静脉单次给药后,测定不同时间点的血清药物含量以评价不同多肽缀合物的药代动力学特征。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在小鼠体内的药代动力学行为均符合二室模型,根据其血药浓度-时间曲线可知三者体内分布半衰期t1/2q分别为0.5032 min、4.257min和4.01 1min;消除半衰期t1/2β分别为29.45 min、173.9 min和224.5 min,因此TP5经PEG或HA修饰后,其半衰期均显著延长。TP5、PEG-TP5和HA-TP5在药时曲线下面积AU Co-z分别为 193.5μg·mL-1·min、924.2 μg·mL-1·min和2382 μg·mL-1·min,显示PEG/HA-TP5的生物利用度较TP5显著提高。与PCK3145相比,HA-PCK3145在小鼠体内的t1/2α从22.37 min延长至57.58 min,t1/2β从219.5 min延长至3032 min,表明HA修饰的PCK3145半衰期显著延长;与未修饰的PCK3145相比,HA-PCK3145 的AUC0-z从1888μg·mL-1·min延长到6717 μg·mL-1·min,表明修饰后的缀合物具有更高的生物利用度。与ES2-TH相比,HA-ES2-TH在小鼠体内的t1/2α从17.46 min延长至34.99 min,t1/2β从243.3 min延长至1703 min,表明HA修饰的ES2-TH半衰期显著延长;与未修饰的ES2-TH相比,HA-ES2-TH的AUC0-z从510.5μg·mL-·min延长到2958 μg·mL-1·min,表明修饰后的缀合物具有更高的生物利用度。4.多肽缀合物体外活性的表征(1)PEG-TP5和HA-TP5的体外促淋巴细胞增殖活性采用MTT法测定TP5及PEG/HA-TP5体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明,浓度分别为18.4μmol·L-1、36.8μmol·L-1、73.5μmol·L-1和147.1μmol·lL-1的TP5、PEG-TP5和HA-TP5在体外均具有显著的刺激淋巴细胞增殖的活性(P<0.05);PEG-TP5、HA-TP5的促淋巴细胞增殖率与相同浓度的TP5相比无显著差异(P>0.05),因此IP5由mTGase催化进行PEG或HA修饰,对其体外免疫活性影响不大。(2)HA-PCK3145的体外抗肿瘤细胞增殖活性采用MTT法评价HA-PCK3145体外抗人乳腺癌细胞增殖作用。结果表明,浓度分别为14.26 μmol·L-1、28.52μmol·L-1、57.04 μmol· L-1和114.09 μmol ·L-1的PCK3145和HA-PCK3145体外均具有极显著的抗人乳腺癌细胞增殖作用(P<0.01);相同浓度的HA-PCK3145与PCK3145的抗肿瘤细胞增殖活性相当(P>0.05),因此PCK3145由mTGase催化进行HA修饰对其体外抗肿瘤活性影响不大。(3)HA-ES2-TH的体外抗血管内皮细胞增殖活性采用MTT法评价HA-ES2-TH体外抗血管内皮细胞增殖作用。结果表明,浓度分别为26.18 μmol·L-1、52.36μmol·L-1和104.71 μmol·L-1时,ES2、ES2-TH和HA-ES2-TH在体外均具有极显著的抗血管内皮细胞增殖作用(P<0.01)。相同浓度的HA-ES2-TH与ES2-TH、ES2的抗肿瘤细胞增殖活性相当(P>0.05),因此ES2与归巢肽串联以及由mTGase催化进行HA修饰对其体外抗血管生成活性影响不大。总之,利用mTGase酶催化对TP5、PCK3145及ES2-TH进行PEG/HA定点修饰能够得到一系列纯度高的多肽缀合物;与未修饰的多肽相比,各多肽缀合物的体内半衰期显著延长、生物利用度显著提高,且体外生物活性变化不大。
关键词: 多肽 ；酶法修饰 ；微生物转谷氨酰胺酶 ；半衰期 ；透明质酸 ；聚乙二醇
被引量
1
摘要： 糖尿病是一种广泛分布于全球的以高血糖为特征的复杂慢性代谢性疾病,其发病时的高血糖症状会导致患者的糖、脂代谢紊乱,从而引起一系列慢性并发症。随着人类文明的持续进步和生活水平的不断提高,糖尿病患病率逐年上升。其中2型糖尿病患者明显增多,目前约占糖尿病总患病人群的90%以上。2型糖尿病的特征主要表现为胰岛素抵抗,即由胰岛素调节的细胞糖代谢能力下降或胰岛β细胞功能受损引起的胰岛素分泌减少,或两者兼而有之。这种疾病的存在愈发威胁着人类的生命健康。目前2型糖尿病的治疗方法及药物多种多样,但寻找一种安全有效的2型糖尿病的治疗药物仍然是一个巨大的挑战。因此,寻找一种更安全、更有效的2型糖尿病治疗药物是眼下迫在眉睫的任务。2017年12月5日,美国FDA批准了由丹麦Novo Nordisk公司研发的一种新型治疗2型糖尿病新药索马鲁肽(又名:Semaglutide或Ozempic)上市。索马鲁肽是GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体激动剂,通过刺激胰岛素的分泌来降低患者体内的血糖水平,同时亦能降低患者的血压与体重。索马鲁肽在人体内具有长达165小时的半衰期,是目前最新研发出来的一种一周给药一次的GLP-1受体激动剂。索马鲁肽还具有极高的安全性,它引起胰腺炎或由于重复给药引起低血糖症状的风险极低。鉴于索马鲁肽的上述优势,目前索马鲁肽在欧美等国家正在成为治疗2型糖尿病的一线药物。索马鲁肽是一个含有一条长脂肪侧链的三十一肽,通过将GLP-1受体激动剂利拉鲁肽(Liraglutide)结构上的8位谷氨酸残基(Glu)替换成了 2-氨基异丁酸残基(Aib)以及将27位赖氨酸残基上的6位氨基连接的软脂酰谷氨酸替换成了由两个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(AEEA)、谷氨酸(Glu)和十八烷二酸偶联而成的长脂肪链而制得。作为一种多肽类药物,索马鲁肽的合成方法与其他多肽类药物类似,主要通过固相合成法制备。考虑到固相合成法存在的一些缺点以及索马鲁肽结构的特点(它含有一条长脂肪侧链,其合成原料价格昂贵),我们尝试将一种新型基于疏水载体辅助的液相肽合成法用于索马鲁肽的合成,并在此基础上进行工艺优化。这种新方法的原理类似于传统固相合成法,也是将多肽C末端的氨基酸与载体偶联,然后通过逐个偶联的方式得到所需片段,最后通过裂解得到产物。然而,该方法与固相合成法具有明显本质区别:其所使用的载体在非极性溶剂中高度易溶,而在极性溶剂中难溶;偶联和脱保护反应为均相反应,可在溶液中进行,能通过TLC法进行简单直观的监测,有效减少了杂质的产生;当反应完成后,只需向反应液中加入不良溶剂即可析出产物结晶,分离纯化步骤像固相合成法一样易于处理;由于是均相反应,其氨基酸以及催化剂的投料量更加合理,无须像固相合成法那样大幅过量,这在很大程度上降低了制备成本。基于该方法的特点和索马鲁肽结构性质,我们将索马鲁肽分为以下六个片段:Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(片段 1)、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH(片段 2)、Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH(片段 3)、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[-AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Oct(OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-OH(片段 4)、Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH(片段 5)、Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH(片段6)。我们选择2,4-二(二十二烷氧基)苯甲醇作为可溶性疏水载体,将氨基酸的羧基通过酯化反应偶联到载体的醇羟基上,并通过Fmoc保护法依次偶联氨基酸得到六个Fmoc保护的连有载体的片段:Tag-片段1-6。然后分别脱去Tag-片段1-5的载体,并在Tag-片段6的基础上依次按片段5-1的顺序(即索马鲁肽主链C末端到N末端的顺序)偶联得到Tag-全保护索马鲁肽,最终通过裂解和制备液相纯化得到索马鲁肽。在索马鲁肽的合成研究中,由于片段4结构中赖氨酸残基(Lys)的氨基上连有长脂肪侧链,我们选用Alloc-Lys(Fmoc)-OH作为片段上赖氨酸残基的原料。当偶联至此氨基酸残基时,首先脱去Fmoc保护基并使用侧链所需要的三种原料依次偶联合成侧链,然后脱去Alloc保护基并偶联主链上剩余的氨基酸残基得到片段4。这也是Alloc保护基法在此种多肽液相合成法中的首次应用。然后本文对此方法合成索马鲁肽的工艺进行了优化。我们考察了各种影响因素如催化剂、反应温度、投料比以及后处理方法等对反应的影响,建立了一条成本低、收率高、产品纯度高且操作简便的合成路线。其主要研究成果体现在以下几个方面:①在片段C末端氨基酸与载体的偶联反应中,当载体、氨基酸和DIC的投料比为1:1.2:1.5时,在40℃反应条件下,合成了四种高纯度Fmoc保护的片段:Fmoc-Gly-O-Tag、Fmoc-Phe-O-Tag、Fmoc-Asp(OtBu)-O-Tag 和 Fmoc-Leu-O-Tag,极大的降低了后续分离纯化的难度;②在片段C末端氨基酸与载体的偶联反应中,由于偶联产物颗粒细小且粘稠,导致过滤极其困难。在过滤前将硅藻土加入到不良溶剂的结晶液中充分混合后再抽滤,巧妙解决了过滤困难的技术难题。然后用产物的良溶剂(例如四氢呋喃)提取滤饼(硅藻土与产物的混合颗粒)达到了高效分离纯化的目的;③在脱除Tag-片段1载体的反应中,通过调整三氟乙酸的用量,可以减少组氨酸残基上的三苯甲基保护基的脱落,使得此步反应收率由73.28%提高到93.02%,产品纯度由81.95%提高到92.86%;④在片段4的合成中,我们使用四(三苯基膦)钯和苯硅烷催化体系将Alloc化学应用到了这种液相合成法中,这使片段4的纯度达到98%以上;⑤在脱Fmoc保护反应中,当pH调至6时,能有效克服Tag-片段6难以结晶的难题,使得此片段收率达到76.73%,纯度达到96.73%;⑥在依次偶联各片段合成Tag-全保护索马鲁肽的反应中,我们采用DMT-MM作为偶联剂,通过筛选和优化得到合理的投料比反应体系,使裂解后的索马鲁肽粗肽总收率和纯度显著提高,分别达到51.82%和62.25%。而最新的索马鲁肽固相合成专利文献报道的粗肽总收率和纯度分别为39.22%和53.51%,极大提高了索马鲁肽的合成效率。综上所述,疏水载体辅助的液相多肽合成法合成索马鲁肽相较于固相多肽合成法而言,投料比更合理、产品收率和纯度更高,这些都可以直观地体现到成本的降低上。此外,本文建立的索马鲁肽疏水载体辅助液相多肽合成法的工艺路线,操作简便、反应条件温和,具有潜在的工业应用价值。
关键词: 2型糖尿病 ；GLP-1受体激动剂 ；索马鲁肽 ；多肽液相合成法 ；合成工艺
被引量
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摘要： 抗肿瘤多肽类药物具有分子量小、特异性强、毒性低等优点,被广泛应用于新型抗肿瘤药物的研发。本课题是基于从海洋束藻属藻青菌中天然提取的一种具有良好的肿瘤细胞毒性环八肽[-(Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-Val)-](SamoamideA)进行亲水性与结构修饰,以期提高Samoamide A的亲水性和抗肿瘤活性。鉴于Samoamide A所组成的氨基酸均为疏水性氨基酸,具有很强的疏水性,限制了其在临床上的应用。因此,本课题采用自组装多肽 P 12(NH-Phe-Phe-His-Phe-Phe-His-Lys-Lys-Gly-Arg-Gly-Asp-OH)对SamoamideA进行修饰,以提高SamoamideA的亲水性。研究结果表明:在水溶液中P12肽自组装为具有包载Samoamide A能力的纳米体系,经过P12肽包载之后的SamoamideA的油水系数为lg P=-2.89,属于亲水化合物的范畴内,表明Samoamide A被P12肽包载之后从疏水性化合物转变成了亲水性化合物。本课题在多肽Fmoc固相合成法的基础上,分别利用对溴苯丙氨酸、D-苯丙氨酸将SamoamideA序列中的两个苯丙氨酸进行替换,得到衍生物A、B。通过DPP-4酶活抑制实验,验证Samoamide A和其衍生物A、B的生物活性;采用4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)和MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)做细胞毒性实验分析SamoamideA和其衍生物A、B的细胞毒性。实验结果表明:在样品浓度为100 μg/mL时,Samoamide A及其衍生物A,B对DPP-4酶的酶活抑制率分别为66.71%,92.21%和84.70%,且两种衍生物的酶活抑制率随浓度提高而升高,当样品浓度为100 μg/mL时达到最大效果。当样品浓度为50μg/mL时,Samoamide A的细胞存活率分别为45.90%和48.07%;衍生物A的细胞存活率分别为25.32%和28.46%;衍生物B的细胞存活率分别为36.04%和33.97%。且细胞存活率随着样品浓度升高而降低。在样品浓度为100 μg/mL时达到最大效果。本课题在前期研究基础上,基于Samoamide A结构上的非活性位点脯氨酸,分别利用精氨酸进行氨基化修饰、天冬氨酸进行羧基化修饰和络氨酸进行羟基化修饰得到衍生物C、D、E。并利用DPP-4酶活抑制实验以及4T1和MCF-7细胞毒性实验进行表征。研究结果表明:在样品浓度为100μg/mL的时候,C、D、E三种衍生物的酶活抑制率分别为73.41%,68.48%和63.62%。在4T1细胞和MCF-7细胞的细胞毒性实验中,当样品浓度为50 μg/mL时,衍生物C的细胞存活率分别为44.52%和47.28%;衍生物D的细胞存活率分别为56.09%和57.45%;衍生物E的细胞存活率分别为51.71%和49.51%。综上所述,本课题基于环八肽Samoamide A的基础上对其进行包载修饰,提高了其稳定性和亲水性;对其结构进行改造,提高了其抗肿瘤活性;对非活性位点进行修饰,引入了几种不同种类的活性基团,为Samoamide A的后续研究提供前提条件。
关键词: 抗肿瘤 ；多肽药物 ；包载 ；活性改造 ；修饰
被引量
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摘要： 近年来,由于抗生素滥用和缺乏新型抗菌药物,细菌耐药性急剧上升,严重危害公众健康。据估计,每年有7万患者死于耐药菌感染,细菌耐药性已成为全世界最大的公共卫生问题之一。抗菌肽(AMPs)是针对多种病原体(包括细菌,真菌和病毒)的非特异性防御系统的第一道防线,几乎存在于所有生物中。与传统抗生素相比,抗菌肽靶向细菌细胞膜,作用机制独特,被认为是最有前途的传统抗生素替代品。天然抗菌肽Oreoch-2是从罗非鱼中分离出的含有25个氨基酸残基的两亲性阳离子抗菌肽,具有突出的 α-螺旋结构,多肽序列为FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR。Oreoch-2具有抗菌、抗癌、参与免疫调节和促进伤口愈合等多种生物活性,商业应用前景广阔。本论文主要包含两部分内容:抗菌肽Oreoch-2的合成及工艺研究;Oreoch-2类似物的设计、合成与生物活性评价。第一部分:Oreoch-2作为被广泛研究的多肽,其化学合成均是基于固相合成仪完成,到目前为止,还未有专利或文献对其方法进行报道。而固相合成法投料比高,产品纯度低,纯化困难,生产成本高。因此,我们借鉴了一种新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法合成Oreoch-2。该方法结合了固相与液相合成法的最佳性能,其优点是所有反应都是均相反应,可通过TLC法进行实时监测;所有反应操作方法简便,仅通过简单结晶即可达到纯化目的,避免了杂质对接下来反应的干扰。我们根据Oreoch-2序列的结构特点,将长肽链分成4个片段,分别为 T-F1:Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag;F2-Fmoc:Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-OH;F3-Fmoc:Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-OH;F4-Boc:Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-OH。以2,4-二(二十二烷氧基)苯甲醇作为载体,使用Fmoc化学法分别合成这4个片段,然后将F2-Fmoc、F3-Fmoc和F4-Boc依次偶联至T-F1上,得到C末端带有载体的全保护多肽,最后通过裂解多肽链上的保护基和载体,并经制备液相纯化得到Oreoch-2产品,总共经历了 58步反应。然后,我们对Oreoch-2的合成工艺进行了优化研究,主要考察了反应条件、投料比和催化剂种类等对反应收率和产品纯度的影响,得到了 Oreoch-2的最佳合成工艺路线。(1)投料比、有机碱以及反应温度对C末端氨基酸与载体间酯化反应的影响:对于T-F1,反应温度40℃,有机碱为DMAP、氨基酸和DIC的投料比分别为1.5 eq和3 eq为最佳;对于F2-Fmoc,反应温度为室温,有机碱为DMAP,氨基酸投料比为1.2 eq为最佳。(2)后处理方式:将原结晶溶剂乙腈调整为含20%水的乙腈,减少了乙腈用量,降低了合成成本;在合成T-F1的每步脱保护反应后处理时,将反应液pH值由7调为6,改变了产物结晶状态,使收率大幅度提高;针对F3-Fmoc和F4-Boc中黏度较大的中间体,将产物与硅藻土不分离,使混合物直接投下一步反应,不但提高了收率还节省了 THF用量,减少了“三废”的产生。(3)含组氨酸的F2-Fmoc和F4-Boc:裂解载体时,TFA用量由1%分别减少为0.8%和0.7%,减弱溶液的酸性环境,有效避免了组氨酸侧链保护基三苯甲基的脱落,使收率分别由86.5%和81.3%提高到95.3%和91.6%,产品纯度分别由 78.45%和 67.35%提高到 98.25%和 97.51%。(4)片段间的偶联体系:使用HATU和HOAt偶联F2-Fmoc,DMT-MM偶联F3-Fmoc和F4-Boc,得到的Oreoch-2粗品总收率和纯度最佳,分别达到47.3%和 43.46%。我们将优化后的路线应用于抗菌肽Oreoch-2的全合成,得到的粗品经制备液相纯化后,Oreoch-2的纯度高达97.29%,纯化收率为41.7%。我们首次将新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法应用于Oreoch-2的合成,并成功建立了一条简捷的合成工艺路线。该方法操作简单、产品纯度高、成本低廉。另外,我们还根据多肽合成中遇到的中间体黏度大和氨基酸侧链保护基不稳定等技术难题进行了改进和优化,使该方法的应用范围更加广泛,这也为Oreoch-2类似物的研究奠定了良好基础。第二部分:针对Oreoch-2溶血性大以及肽链过长等缺点,我们以Oreoch-2为先导化合物,通过生物信息预测软件,采取截断策略设计、合成了 6个Oreoch-2类似物(ZN-1～ZN-6),并对其结构进行了表征。在此基础上,对Oreoch-2类似物进行了系统的生物活性评价。该项研究旨在缩短肽链,寻找活性片段,提高抗菌活性或降低溶血性,得到更具潜力的新抗菌肽。体外抗菌活性研究表明,ZN-5(22肽)和ZN-6(18肽)抗敏感革兰氏阳性菌活性最好,均表现出了与母体肽Oreoch-2相当,甚至更好的抗菌活性。例如,ZN-5抗敏感金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的活性十分显著(MIC值均为1.5μM),抗敏感化脓性链球菌活性良好(MIC=6.2μM),均比Oreoch-2提高了一倍;ZN-5抗短小芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的活性与Oreoch-2相当。ZN-6抗敏感金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的活性优异,MIC值均为1.8μM,比Oreoch-2提高了一倍;抗枯草芽孢杆菌(MIC=3.5 μM)、短小芽孢杆菌(MIC=1.8 μM)和敏感化脓性链球菌(MIC=14.2μM)的活性与Oreoch-2相当。ZN-5和ZN-6抗表皮葡萄球菌的活性均显著高于环丙沙星。另外,ZN-4抗枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、表皮葡萄球菌和敏感化脓性链球菌的活性与Oreoch-2相当,尤其抗短小芽孢杆菌的活性最好,MIC值为1.5 μM。另一方面,ZN-5具有最好的抗耐甲氧西林(MIC=3.1μM)和耐青霉素(MIC=6.2 μM)金黄色葡萄球菌的活性,并与Oreoch-2相当。令人惊讶的是,ZN-5和ZN-6抗耐药化脓性链球菌的活性显著,MIC值分别为12.3 μM和28.4 μM,而Oreoch-2则无抗菌活性。从上述结果中不难发现,Oreoch-2序列中过多的阳离子氨基酸以及其高疏水性影响了其抗菌效力。体外杀菌活性研究表明,ZN-5和ZN-6呈现杀菌模式,是典型的杀菌剂,与Oreoch-2相同。杀菌动力学研究表明,ZN-5的杀菌效果呈浓度和时间依赖性,在4× MIC浓度下,6h内即可将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全部杀死。稳定性研究表明,ZN-5和ZN-6对酸、碱、热和生理盐稳定且略优于Oreoch-2。另外,ZN-5和ZN-6对小鼠红细胞的溶血性远低于Oreoch-2,在16 × MIC浓度下,最高溶血率仅为4.84%,比Oreoch-2降低了 88%,是类似物的一大突破。这也提示在一定程度上高溶血性是高疏水性所致。细菌的生物膜形成抑制研究表明,ZN-5和ZN-6对敏感金黄色葡萄球菌生物膜的形成表现出显著的抑制作用,尤其ZN-5,在亚浓度2 μg/mL时其抑制率就达到了 46.0%。经其处理过的敏感金黄色葡萄球菌,通过TEM可直接观察到细胞膜完整性遭到破坏,细胞内容物释放,出现了明显的离散。这说明ZN-5和ZN-6是通过破坏细菌细胞膜而发挥抗菌作用的。总之,我们首次将新型可溶性疏水载体辅助的液相多肽合成法用于Oreoch-2的合成,并成功建立了一条简捷的合成工艺路线。该方法操作简便、产品纯度高、成本低廉。在此基础上,我们以Oreoch-2为先导化合物,采取截断策略设计、合成了 6个Oreoch-2类似物,并对其体外抗菌活性、杀菌活性、杀菌动力学、稳定性、溶血性和细菌生物膜形成抑制进行了系统评价。研究结果表明,ZN-5和ZN-6是较为理想的新型抗菌肽,完全符合本论文缩短肽链,提高抗菌活性并降低溶血性的设计思想,可对其进行系统的成药性评价。
关键词: 抗菌肽 ；Oreoch-2 ；工艺优化 ；类似物 ；生物活性评价
摘要： 多肽自组装作为自然界普遍存在的分子自组装现象之一,其自组装行为的研究对理解生命现象、仿生制备、构建功能材料以及解决疑难疾病等都具有十分重要的意义。通过合理调控多肽分子结构以及给予合适的外界的刺激,多肽分子可以通过多重非共价键作用自发或触发地组装形成特异形态和功能的组装体。作为生物同源的新一代生物材料,多肽优越的生物、化学性能展现了其自组装体的巨大优势,在药物/基因控制释放、细胞培养、组织工程支架材料以及生物矿化等领域有着巨大的应用前景。本论文在大量前期工作基础上,设计和制备了一系列直链肽和环肽,系统研究了这些多肽的自组装行为及其在生物医学领域内的潜在应用。
论文第一章概述了近年来有关多肽自组装的研究进展,包括直链多肽的分子结构设计、自组装体形貌及其组装机理、组装体在材料学和生物医学等领域的应用；同时简要介绍了环肽的合成方法及多肽纳米管在生物相关领域的具体应用。
阿尔茨海默病俗名老年痴呆,这类神经性疾病的出现严重影响患者的身体健康。阿尔茨海默病可能的致病机理之一主要是一定的外界刺激导致p样纤维在p细胞内或细胞周围发生聚集,从而引发相关疾病。因此,第二章中,我们设计了含阿尔茨海默病核心单元Phe-Phe二肽的多肽衍生物Ne-Arg-Gly-Asp-Phe-Phe-OH,该肽在水溶液中组装形成纳米纤维。我们通过温度、压力等外界条件和浓度来调控纳米纤维进一步发生等级组装,最终形成了多种规整的微、纳米结构,这类组装体与神经性疾病病变过程中形成的聚集体的形态相似。因此该肽自组装过程可以用于模拟β-淀粉样蛋白由于外界刺激在体内聚集形成纤维和其他聚集体的过程,为蛋白类疾病发病机理的研究提供了一定价值。
由于常规的多肽组装体系较难从多肽分子结构上预测其自组装形貌在外界刺激下能否发生转变,我们设想在不同pH值的环境中,带电的U-型多肽由于分子间可能发生分子构象的改变,转变成Z-型或是线型结构,导致多肽分子重排,引起其自组装纳米形态发生相应的转变。第三章中,我们利用固相合成技术制备
-系列U型多肽(P1:(C17H35CO-NHGRGDG)2KG; P2:(Fmoc-GRGDG)2KG; P3:(CH3CO-NHGRGDG)2KG)。通过调控pH值来调节多肽自组装单元的分子形态,成功实现了P1由自组装的纳米纤维逐渐聚集成纳米球,由于分子构象变化最后转变成片层纳米结构的多重形貌的变化；而P2在不同pH下经历了无规聚集体到球形胶束,再到片层纳米结构最后到囊泡的形貌转变；P3则由于亲疏水不匹配而不能自组装成规整的纳米形态。这些组装体的转变可能是由于pH刺激导致多肽分子结构发生异构化,最终引起分子重排所致。这种pH调控的多肽自组装体形貌转变可用于药物载体和多重形貌的构建。
小分子多肽基于规整的二级结构(如a-helix, β-sheet)能形成有序的自组装体。然而,自然界中具有生物功能的组装体并非都能通过规整的二级结构组装获得。此外,多肽纳米材料组成的单一性严重影响其生物性能。前面两章中,我们得到了多种不同的纳米组装体。然而,自组装体形态的取向性(朝同一方向排列)也会影响其功能。第四章中,我们构建一种不对称的U-型多肽分子,它能通过无规的二级结构发生组装过程。通过pH调控其自组装行为,多肽在pH6.0时组装成树枝状纳米纤维结构。由于纤维表面富含羧基,能有效导致无机盐的富集,因此纳米纤维通过与NaCl共培养,最后形成了孔雀羽毛状纤维结构。此外,通过调节pH至5.5,我们可以得到有取向性的纳米纤维矩阵。这些有序的自组装体在细胞培养,光刻胶模板以及新型纳米材料的构建方面有着优越的应用前景。直链肽分子表现出明显的柔韧性,造成构象易变从而影响自组装体的生物活性。此外,机体内的羧肽酶和氨肽酶能快速的从直链肽两端逐步切割肽链而导致多肽自组装体不稳定。第五章中,为了提高自组装体的生物稳定性,我们利用在树脂上成环的方法合成了一系列环肽。调控多肽组成,将亲水和疏水残基合理嵌入环肽骨架,通过疏水作用和D/L型相间多肽特有的氢键作用,环肽c-[D-Leu-L-Lys-D-Ala-L-Lys-D-Leu-L-Gln]能够自组装成高长径比的纳米管。该自组装体可广泛用于物质通道和生物传感器等方面。同时,我们还考察了环肽构建多肽纳米管的组装条件,以及环肽与直链肽自组装的差异,为多肽自组装单元的设计提供了参考。
第六章中,我们将点击化学应用到环肽c-[-Arg-Gly-Asp-ψ(triazole)-Gly-XX-]的合成,构建自组装单元。点击化学的优势在于该方法反应条件温和,成环效率高,无需纯化；此外,1,2,3-三唑特殊的结构的引入,能进一步提高环肽稳定性。由于1,2,3-三唑杂环是反式酰胺键的等电子排列体,因此可以代替酰胺键构建环肽而不影响多肽骨架性质。我们考察了含1,2,3-三唑特殊的结构的不对称杂肽的自组装行为。区别于传统的对称型环肽自组装形成多肽纳米管,本章中设计合成的多肽在特定pH下形成纳米纤维以及多肽纳米棒结构。
在上一章,我们将改性的氨基酸嫁接到树脂上,然后通过点击化学进行闭环。在第七章中,我们虽然继续利用点击化学合成环肽,但进一步优化了合成环肽的方法,采用耐酸性的MBHA树脂,将侧基修饰直接在树脂上完成,简化了合成方法。此外,在上一章的基础上,我们通过在环肽侧链上引入适当的疏水基团,构建了一种新型的由亲水的环肽和疏水烷基链或芳香基团所构成的两亲性多肽分子,它不仅提高了传统线型两亲性多肽的稳定性,同时对环肽进行了合理的功能化。通过引入不同疏水基团,我们进一步考察疏水片段对杂环肽的自组装行为的影响。这类新型的两亲性多肽分子能自组装形成纳米管和纳米球等结构。
关键词: 多肽 ；自组装 ；纳米材料 ；生物医用
摘要： 肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤最本质特征之一,也是导致肿瘤患者死亡的主导因素。目前抑制肿瘤细胞的粘附是抑制肿瘤细胞侵袭与转移的较好方法之一。抑制肿瘤细胞侵入和转移的合成多肽具有较好的抗肿瘤粘附的作用。这类多肽包括来自基质蛋白的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽;来自基底膜层粘蛋白的酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸五肽;与来自纤连蛋白核心序列的谷氨酸-异亮氨酸-白氨酸-天冬氨酸-缬氨酸五肽等。本文主要内容如下:1.简明阐述氨基酸与多肽的发展与应用、详细介绍氨基酸保护基的种类与选择、以及多肽的主要作用和人工合成的方法。2.用以叔丁氧羰基保护氨基的甘氨酸和以苄基保护羧基的天冬氨酸进行反应合成全保护的二肽化合物（GD）,再与氮基和侧链胍基双保护的精氨酸进行反应,从而合成为三肽化合物（RGD）。并对所合成的中间体与产物进行了氢核磁共振、红外光谱、紫外光谱和质谱等结构表征。实验结果表明,成功合成了Arg-Gly-Asp三肽化合物。3.用经过侧链羟基与氨基双保护的丝氨酸(Boc-Ser（Bzl）-OH)和侧链胍基与羧基双保护的精氨酸(HCl·Arg（NO2）-OBzl)进行反应,合成全保护的二肽化合物（SR）。接着以氨基保护的异亮氨酸（Boc-Ile-OH）、羧基保护的甘氨酸(H-Gly（OBzl）·TosOH)、氨基保护的酪氨酸（Boc-Tyr-OH）为原料,逐步合成全保护的三肽化合物（YIG）。再将全保护的YIG作为羧基反应物、全保护的SR作为氨基反应物进行反应,从而合成化合物五肽（YIGSR）。对合成的中间体与产物进行了氢核磁共振、红外光谱、紫外光谱和质谱等结构表征。实验结果表明,成功合成了YIGSR五肽。
关键词: 肿瘤侵袭 ；抗粘附 ；三肽 ；五肽 ；氨基酸 ；保护基
被引量
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摘要： 小分子凝胶是借助凝胶因子分子间的超分子相互作用,通过自组装形成三维网络结构而固定大量溶剂分子所得到的一种软物质。与大分子凝胶相比,小分子凝胶的突出特点是对环境刺激的响应性更敏感,因此小分子凝胶以其特有的凝胶性能、纳米自组装结构以及小分子特性,在太阳能电池、化学传感器、三维细胞培养与组织修复材料、废水中有机染料及泄露石油回收处理等领域的应用近来受到人们的高度重视。自然界中广泛存在的环二肽及其衍生物利用其结构组成的多样性和生物药理活性,以及环二肽分子骨架环中两个酰胺键易于形成一维定向氢键排列的特性,是设计与合成小分子凝胶因子的理想“因子”。因此,本文设计合成了以赖氨酸环二肽为母体的系列小分子凝胶因子,研究了它们的凝胶化性能和可能的自组装聚集体中分子堆砌模型。首先,以Boc-Lys（Cbz）-OH为原料,经双分子偶合生成Cbz保护的赖氨酸环二肽,脱除Cbz保护基后便可得到赖氨酸环二肽(cyclo（L-Lys-L-Lys）)。然后再分别利用两侧链上的氨基进一步与Fmoc-OSu和（Boc）2O反应,得到对称结构的Fmoc和Boc双取代赖氨酸环二肽。整个合成反应产率高、后处理容易、不消旋。凝胶化测试表明,Fmoc和Boc双取代赖氨酸环二肽皆为良好的有机凝胶因子,在醇类溶剂,苯类溶剂和氯代有机溶剂中能形成稳定的有机凝胶。透射和扫描电镜观察发现,凝胶因子在不同溶剂中形成的微纳结构有纤维状、树枝状、绳状等不同形态,而且聚集体的尺寸越小、越纤细,所形成的凝胶越透明。采用荧光发射光谱、红外光谱和变温核磁三种测试手段对不同保护基团的凝胶因子在凝胶化过程中的驱动力进行了研究。观察到凝胶因子中Fmoc基团的π-π堆积作用在醇类溶剂中形成凝胶的过程中发挥了重要作用,而Boc双取代凝胶因子中骨架上的酰胺键和侧链上的氨酯基之间氢键作用共同参与了其凝胶化过程。为调整亲疏水平衡,在赖氨酸环二肽的基础上得到不对称的Fmoc和Boc单取代赖氨酸环二肽,它们均可凝胶大部分脂肪族醇类、苯类试剂和氯代有机试剂。Fmoc单取代赖氨酸环二肽在水中能产生部分凝胶,可作为水凝胶“前因子”。同时观察到Boc单取代赖氨酸环二肽依靠分子间氢键作用自组装形成纳米管状结构,通过XRD分析可知该结构系由多层双分子层而成,具有良好的空心圆柱型形态,预计在蛋白及多肽药物的微胶囊包覆及控释等领域具有潜在的用途。最后,选择酸酐对水凝胶“前因子”—Fmoc单取代赖氨酸环二肽的端氨基进行酰化,使原来的氨基转化为亲水性更强的羧基,研究了烷基链长度对赖氨酸环二肽衍生物作为水凝胶因子的影响。观察到戊二酸酐酰化得到的小分子（FL-Ga）在水中凝胶化性能最好,氢键作用与π-π堆积作用在自组装过程中发挥了协同作用。同时还利用Rietveld法对FL-Ga水凝胶干胶的X射线粉末衍射谱图进行了全谱拟合和精修,推导出可能的分子堆砌模型,发现其以单分子层方式进行自组装聚集。
关键词: 赖氨酸环二肽 ；小分子凝胶因子 ；超分子自组装 ；纳米管 ；水凝胶
摘要： 全文分为二部分:
第一部分海洋天然产物xyloalleiloide A全合成及相关连烯化合物抗肿瘤活性研究
海洋天然产物XyloallenoideA是从海洋真菌2508<'＃>分离出来的一种结构异常新颖的化合物，分子中含有环三肽、连烯基、肉桂酰胺。环三肽及含连烯基化合物在天然产物中很罕见，XyloallenoideA中的环三肽是首次发现的新环肽，这一物质在真菌生物体内估计会有独特的作用，其药理活性值得深入研究。本论文首次报道该化合物全合成的研究，并进一步做药理活性研究。
XyloaIlenoide A的逆合成分析表明，它是由环三肽1和连烯肉桂酸2缩合而成。环三肽1含有三种氨基酸(L-Lys，N-Me-D-Val，N-Me-D-Ala)，它有三个缩合点(A，B，C)，考虑到N甲基的位阻，我们选择A为缩合点。直链三肽3的合成采用化合物Boc-L-Lys(Cbz)-OH(4)和Boc-Val-OH(8)为原料。4和N-Me-D-Val-OMe(14)合成出二肽15，然后水解得到16，16与N-Me-D-Ala-OMe缩合即得到直链三肽3。3经皂化，脱Cbz保护基得到17，17在高度稀释的溶液中，以不同的缩合剂缩合得到环三肽18，18脱去Boc保护基即得到环三肽1。当缩合剂采用BOP-C1或EDCI/HOAt时，18环化的产率可分别达到42﹪和56﹪，但用Bop时，产率仅为7﹪。
连烯肉桂酸2的合成关键是连烯醇19的合成，通过实验，作者选择以丙炔醇为原料，经三步反应合成。连烯醇19经溴代，Williamson等反应合成出连烯肉桂酸2。2与环三肽1缩合即得到Xyloallenoide Al.
比较合成品与天然产物的各种波谱数据，它们的熔点，红外，和HRMS都相同，但是丙氨酸部分的H-9(△δ 0.42)，H-17(△δ 0.23)，C-9(△δ 4.3)和C-17(△δ3.2)化学位移有一定的差异，旋光度也不同。因此，作者推断天然产物XyloallenoideA中丙氨酸的立体构型应为L型，而不是D型。为此，作者又以L-Boc-Lys(Cbz)-OH-D-Boc-Val-OH，L-Boc-Ala-OH为原料，经相同的方法合成了目标物Xyloallenoide A2，经各种谱图和旋光度表征，结果与天然产物的数据一致。因此，作者推定Xyloallenoide A中环三肽的立体构型应为L-Lys，D-Me-Val，L-Me-Ala。本文以口腔癌细胞KB和KBv200为靶点对所合成的重要中间体及目标物的细胞毒活性进行了研究，发现直链三肽Boc-Lys-MeVal-MeAla-OH，环三肽cyclo(Lys-MeVal-MeAla-)对口腔癌细胞KB和。KBv200没有活性，合成的xyloallenoide Al具有中等强度的活性(KB，IC<,50>=36μM;KBv200，IC<,50>=43μM)。
本文在合成Xyloallenoide A过程中，还研究了连烯类化合物抗肿瘤活性构效关系。
目前，从天然产物中发现了150多种连烯化合物，这些连烯化合物大都显示出较好的生理活性。本课题组从海洋真菌Xyllaria ＃2508中分离出多个连烯芳香醚类化合物。本文对这类结构新颖的连烯化合物进行合成及其生理活性研究，共合成出12个连烯化合物，所有化合物经IR，<'1>H-NMR，<'13>C-NMR，MS，X-Ray和元素分析进行了表征。
本文以口腔癌细胞KB和KBv200为靶点对所合成的十二种连烯化合物的细胞毒活性进行了研究，所有12个连烯化合物都显示出或弱或强的抗肿瘤活性，构效关系研究表明：连烯基团的引入可以产生或增强这类芳香醚类化合物的抗肿瘤活性。对这类连烯化合物进行全合成及构效研究尚属首次。
第二部分海洋真菌＃2106，＃2508代谢产物的研究
本论文研究了中国南海红树林内生真菌＃2106和＃2508的代谢产物，本课题组先前已从＃2508中分离出很多结构新颖，活性较好的化合物，此次作者又从＃2508代谢产物中分离得到四个新的连烯化合物。从＃2106代谢产物中分离得到No 2106 A和环二肽两个新化合物。通过<'1>H、<'13>C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、EIMS和HREIMS等光谱方法确定了它们的结构。No2106 A和环二肽的相对立体化学通过X．单晶衍射得到表征。
关键词: Xyloallenoide A ；海洋真菌 ；天然化合物 ；环三肽 ；连烯化合物 ；抗肿瘤活性
摘要： 艾塞那肽(Exenatide)，分子式为C184H282N50O60S，分子量为4186.61，氨基酸序列His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽属于肠促胰岛素类似物。与肠促胰岛素中著名的胰高血糖素类肽-1(GLP-1)相比，艾塞那肽在体内的降糖作用时间更长。同时，艾塞那肽还能显著降低糖基化血红蛋白，减轻体重。相对于其他糖尿病治疗药物，艾塞那肽很少引起低血糖是一个相当重要的优点。因此，艾塞那肽是治疗2型糖尿病更为理想的途径。 在标准固相合成中，全保护肽链的分子间疏水性聚集和二级结构会导致不完全缩合的产生。苏氨酸，丝氨酸的恶唑衍生物结构上与脯氨酸相似，故被称为假脯氨酸(Pseudo-Prolines)。假脯氨酸可以防止多肽聚集，β折叠的形成，从而提高多肽的溶解性与偶合动力。 本文在标准固相合成的基础上，引入假脯二肽片段，合成艾塞那肽。由于艾塞那肽序列中含丝氨酸较多，因此主要选取Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψ Me,Me pro)-OH，Fmoc-Leu-Ser(ψ Me,Mepro)-OH，Fmoc-Thr(OtBu)-Ser(ψ Me, Me pro)-OH三个假脯二肽片段。考察单个片段的选择和不同片段的组合进行合成时，对产物纯度的影响。 以Rink Amide MBHA Resin为固相载体，采用Fmoc固相合成法，以V(DMF)∶V(DCM)=1∶1为溶剂，连接保护氨基酸时用HBUT/HOBt/DIEA为缩合剂，连接假脯二肽片段时用HAUT/HOBt/DIEA为缩合剂，反应室温下进行，合成全保护肽。最后脱除载体和保护基，即得艾塞那肽。 产物采用质谱与高效液相鉴定，实验结果表明，仅使用Fmoc-Leu-Ser(ψ Me, Mepro)-OH固相合成艾塞那肽时，产物纯度达60％。
关键词: 艾塞那肽 ；固相多肽合成 ；片段缩合 ；假脯氨酸 ；降糖药物
被引量
1
摘要： 第一部分海洋环三肽cyclo-（Lys-Me-Val-Me-Ala）的全合成
海洋环三肽cyclo-（Lys-Me-Val-Me-Ala）是海洋真菌代谢产物Xyloallenoid A的核心片段（见图1），Xyloallenoid A是从海洋真菌#2508分离出来的一种结构异常新颖的化合物，这一物质在真菌生物体内估计会有独特的作用，其药理活性值得深入研究。本论文首次报道Xyloallenoid A的核心片段环三肽cyclo-（Lys-Me-Val-Me-Ala）的全合成研究，以期为Xyloallenoid A的研究打下基础。
本文首次报道了Xyloallenoid A核心片段环三肽cyclo-（Lys-Me-Val-Me-Ala）的全合成，其全合成路线共有12步，反应总产率为38.1％（以Boc-Val-OH计算）。反应中间体及目标化合物用各种波谱进行了鉴定和结构表征。
环三肽的合成首先是直链三肽的合成。因为含有N-甲基，与普通的成肽过程不同。高产率合成直链肽的关键在缩合点和缩合剂的选择。研究发现，二肽Me-Val-MeAla-OM与Boc-Lys（Cbz）-OH缩合时，得不到直链三肽，而选择二肽Boc-Lys（Cbz）-MeVal-OH与MeAla-OMe缩合时，可以高产率的得到直链三肽。
本文还研究了Bop、Bop-Cl、及EDC／HOAt等缩合剂对直链肽产率的影响。Boc-MeVal-OH和MeAla-OMe缩合时，以Bop-Cl为缩合剂时，几乎不反应，而用Bop时，产率可高达91％。
环三肽cyclo（L-Lys-D-Me-Val-D-Me-Ala-）的合成关键在于闭合点和缩合剂的选择两个方面，环三肽1由Lys，Me-Val，Me-Ala三个氨基酸片段组成，可以有三个不同的关环位置（A，B，C）。有文献报道，N-甲基氨基酸具有较大的空间位阻作用，不利于关环，因此，作者首先选择无N-甲基的Lys和Me-Ala处关环（即位置A），从而避免N甲基的空间位阻作用。当闭合点在A时，不同的缩合剂对关环的产率也有很大的影响，研究发现，当缩合剂采用BOP-Cl或EDCI／HOAt时，环化的产率可分别达到42％和56％，但用Bop时，产率仅为7％。
第二部分南海真菌#2106的代谢产物
本论文研究了中国南海红树林内生真菌2106的代谢产物，从中分离得到No 2106 A、麦角甾醇、过氧化麦角甾醇、甘露醇、琥珀酸等多种化合物，其中No 2106 A是首次发现的新化合物，并通过1H、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、EIMS和HREIMS等光谱方法确定了它们的结构。No 2106 A的相对立体化学结构通过X-单晶衍射得到解析。
关键词: 环肽 ；合成 ；海洋真菌 ；代谢产物