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摘要： 目的:探讨人参蛋白(GP)对β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)和过氧化氢(H2O2)诱导神经元损伤的影响,阐明GP对神经元的保护作用及其机制。方法:从新生乳鼠大脑皮层中分离纯化神经元,培养12d后,分别采用Aβ1-40(30μmol·L-1)和H2O2(200μmol·L-1)诱导神经元损伤,并随机分为模型组(Aβ1-40模型组与H2O2模型组,不加药物)、GP组和GP含药血清组。采用MTT法检测各组神经元存活率;试剂盒法检测细胞培养上清液中一氧化氮合酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)水平;Hoechst 33342/PI荧光染色检测细胞凋亡与坏死率。结果:倒置荧光显微镜,Aβ1-40和H2O2处理后,神经元数量明显减少,轴突缩短或消失,胞体变圆、缩小,大小不等,核固缩,核染色质聚集;Heochst 33342染色呈现高蓝光;部分细胞PI染色呈现高红光。加入GP及其含药血清后,神经元数量增多,胞体增大,细胞核着色形态为圆形、淡蓝色,PI阳性细胞数量减少。MTT法,GP组细胞存活率明显高于模型组(P<0.05或P<0.01),GP含药血清组与模型组无显著差异(5%GP含药血清组除外,P>0.05);试剂盒法,GP组细胞培养上清液中NOS活性与NO水平明显低于模型组(P<0.05或P<0.01);Hoechst 33342/PI法,GP及其含药血清组细胞凋亡率低于模型组,以GP组差异更明显(P<0.05或P<0.01),GP及其含药血清组细胞坏死率与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GP具有神经保护作用,作用机制与减少NOS活性、降低NO水平、抑制神经元凋亡有关。
关键词: 人参蛋白 ；血清 ；神经元 ；G淀粉样蛋白 ；细胞凋亡
被引量
12
摘要： 目的探讨N-乙酰基半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)对β淀粉样蛋白毒性片段25-35(Aβ_(25-35))活化calpain活性的影响及可能机制。方法运用Aβ_(25-35)来诱导皮质神经元的损伤,实验分为空白对照组、Aβ_(25-35)组、NAC与Aβ_(25-35)共同作用组,采用荧光酶标法检测calpain活性、氧自由基(H2O2)和线粒体膜电位;用化学发光法测定神经元内ATP水平。结果 Aβ_(25-35)(20μmol·L_(-1))作用12h可明显升高calpain活性;与Aβ_(25-35)处理组相比,NAC(10 mmol·L_(-1))预先作用24h,然后再与Aβ_(25-35)共同作用12h,可明显降低calpain活性;与空白对照组相比,Aβ_(25-35)处理组中的H_2O_2明显升高、线粒体膜电位和ATP水平明显下降;而与Aβ_(25-35)处理组相比,NAC预处理组中的H_2O_2水平下降、线粒体膜电位和ATP水平升高,这些差异皆有统计学意义。结论这些研究结果提示,NAC可能通过线粒体的保护作用来降低Aβ_(25-35)诱导的异常活化的calpain活性。
关键词: N-乙酰基半胱氨酸 ；Aβ25-35 ；calpain ；H2O2 ；线粒体膜电位 ；ATP
被引量
2
摘要： 老年斑中存在大量β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)是老年痴呆症(Alzheimer′sdisease,AD)的重要病理特征.大量数据表明,Aβ上具有与过渡态金属离子共价结合的位点,二者能结合成为寡聚复合物.Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物通过Cu2+的还原催化O2产生H2O2,但反应机制不清.本文尝试以天然抗氧化剂维生素C(VC)来对抗Aβ1-40及Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物产生的H2O2对原代培养的神经细胞的毒性.结果表明,VC能够起到显著的保护作用,其有效浓度为1mmol/L.本文用胞外乳酸脱氢酶泄漏量和H2O2生成量的数据证实了细胞存活率(MTT实验)的实验结果.这些结果表明,Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物能够释放更多的H2O2,引发细胞膜破裂并最终引起细胞死亡.加入VC后,神经元受到的损伤较轻,提示VC在保护细胞免受氧化损伤方面发挥了重要作用.
关键词: Aβ1-40 ；Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物 ；维生素C ；H2O2
被引量
2
摘要： 阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病,随着全球人口老龄化问题的日益严峻,AD患者的数量呈上升趋势。发掘有效的饮食干预策略以缓解AD引起的认知障碍,具有重要的公共健康意义。研究表明,麦角硫因(Ergothioneine,ET)能够穿透血脑屏障具有调控中枢神经系统氧化应激反应的能力,且在人体内具有高度的安全性与稳定性。而血浆中ET水平会随着年龄的增长而下降,通过饮食补充ET能成为一种有效缓解AD相关认知障碍的策略。鉴于此,本研究以ET为研究对象,使用线虫、细胞和小鼠等多种体内外模型,从缓解氧化应激胁迫、调节肠脑轴等角度系统研究了 ET对AD症状的缓解改善效果,通过多组学分析ET饮食干预改善AD症状的调控机制,为开发具有改善缓解AD症状的ET饮食干预剂提供理论依据,研究结果如下:
(1)使用在肌肉细胞中表达β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的转基因线虫CL4176为AD模型,评估了 ET对Aβ毒性的缓解作用。25 mmol/L ET能够显著降低线虫的瘫痪率,使瘫痪率下降63.92%。此外,25 mmol/LET显著降低了线虫体内的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平和以剂量依赖性的方式有效延长CL4176线虫的平均寿命,平均寿命延长了 39.58%。转录组数据分析发现,ET处理诱导了 36个基因上调和44个基因下调。GO功能和KEGG通路分析表明,ET主要影响了线虫的氨酰酶活性、对异源刺激的反应和细胞氨基酸代谢过程等生物学过程以及精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、鞘脂代谢、结核病通路、酮体的合成与降解等信号通路。
(2)利用人源型小胶质细胞HMC3氧化应激模型探究ET对细胞氧化损伤的缓解作用。研究表明,75～2400μmol/LET对HMC3细胞无毒性作用。ET预处理2h能够显著缓解H2O2导致的HMC3细胞氧化损伤。WB检测表明,600 μmol/L ET预处理可以显著上调HMC3细胞的抗氧化酶NQO1蛋白表达水平(p<0.05),降低促凋亡蛋白Bax的表达水平(p< 0.05)。通过转录组数据GO功能和KEGG富集分析显示,ET涉及广泛的生物过程,包括信号转导、细胞周期、细胞分化、蛋白质转运、凋亡过程和氧化还原过程。此外,ET通过参与调节细胞周期、P53信号通路、PI3K-Akt信号通路等关键途径,对HMC3细胞的生存、增殖和凋亡过程产生重要影响。
(3)采用双转基因APP/PS1小鼠作为AD动物模型,对3月龄的AD小鼠开展长达6个月的ET饮食干预实验。实验分为WT组、AD模型组、ET低剂量组(20 mg/kg体重,AD-LET)和高剂量(40mg/kg体重,AD-HET)四组。研究表明,AD-HET组小鼠体重增长、饮水量以及主要器官的脏器比未发现显著变化,表明ET具有良好的安全性和生理耐受性。Y迷宫和新物体识别实验表明,AD组小鼠的交替成功率和新物体探索时间随着月龄显著降低(p<0.05),而40 mg/kg ET饮食干预显著改善了AD小鼠的认知功能。HE和尼氏染色表明,ET摄入显著减轻AD小鼠脑组织中神经元的损伤。Aβ和Iba-1免疫荧光实验表明40 mg/kg ET干预可以显著降低小鼠脑组织中Aβ斑块的沉积并且抑制小胶质细胞的过度激活。WB数据表明40 mg/kg ET显著降低了肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达。对小鼠脑组织中15种神经递质分析发现,与WT小鼠相比,AD小鼠多巴胺、5-羟色胺、谷氨酸和乙酰胆碱含量显著降低(p<0.05) 。四组小鼠脑组织中共检测出9种趋化因子,相对WT组,AD组小鼠脑组织中CXCL13、CX3CL1、CCL20和CCL27等水平显著升高(p<0.05),AD-LET 和 AD-HET 组 CXCL13 和 CCL20 水平则显著降低(p< 0.05)。
(4) ET饮食干预后,APP/PS1小鼠肠道菌群的丰富度和多样性得到改善。PCA及热图聚类分析表明,AD-LET组小鼠粪便肠道菌群更接近WT组。血清代谢组分析发现ET饮食干预后小鼠血清中ET含量显著升高(p<0.0001),聚类分析表明AD-HET组小鼠的代谢模式与WT组小鼠更接近。对二级质谱鉴定出的39种显著差异代谢物进行KEGG通路分析表明,主要富集在三羧酸循环、牛磺酸代谢、鞘氨醇脂质信号通路、甘油磷脂代谢、亚油酸代谢和氨基酸合成等通路。此外,四组小鼠粪便样品中共检测出11种短链脂肪酸(Shortchain fatty acids,SCFAs),其中,乙酸、丙酸和丁酸占95%以上。AD-LET组异丁酸、丁酸、戊酸和2-甲基丁酸含量显著升高(p<0.05)。采用GC-IMS从小鼠粪便中检出60种挥发性化合物,其中己醛、正丁醇、2-甲基丁醛、丙醇和戊醛随着AD小鼠月龄的增长而增加,与小鼠月龄存在显著的正相关(R2≥0.88),可作为潜在的AD诊断生物标志物。
(5)对小鼠行为学表现、代谢组学、神经递质、趋化因子、肠道菌群及代谢产物SCFAs等多模态数据集关联分析表明,ET通过肠脑轴调节肠道微生物组成、增加丙酸、丁酸和戊酸等SCFAs产生、影响神经递质平衡及调节炎症和免疫反应等多个层面,共同改善了 AD的症状。
综上所述,本论文通过采用Aβ线虫模型CLA176和人源性小胶质细胞模型HMC3初步探讨了 ET的抗氧化和神经保护能力。另一方面,本研究基于APP/PS1小鼠模型较系统地研究了 ET的抗AD效果,并从肠脑轴角度探讨了 ET的抗AD作用机制。研究发现,ET通过肠脑轴重塑小鼠肠道菌群、促进SCFAs产生及调节神经递质平衡等机制,有效改善了 APP/PS1小鼠的认知功能。不仅为缓解AD症状的ET饮食干预剂开发提供了理论支撑,也强调了维护肠脑轴健康对于防治AD的重要性。
关键词: 麦角硫因 ；阿尔茨海默症 ；线虫CL4176 ；小胶质细胞 ；APP/PS1双转基因小鼠 ；肠脑轴
被引量
1
摘要： 目的:糖尿病（Diabetes mellitus,DM）已严重威胁人类健康。糖尿病认知功能障碍是糖尿病中枢神经系统并发症的一种,它与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）存在着相似的临床表现,包括脑皮质变薄,脑神经元损伤以及阿尔茨海默病特有的β淀粉样蛋白（Aβ）异常沉积和tau蛋白过度磷酸化等,而且在严重情况下,这些症状可能会发展为糖尿病脑病（Diabetic Encephalopathy,DE）。已有的研究表明,糖尿病患者脑内神经炎症、氧化应激损伤以及线粒体功能障碍等均与神经退行性疾病的发生发展相关,从而影响患者的认知能力。然而,有效预防和治疗糖尿病引起的认知功能障碍的方法尚未大量报道。铁是一种强氧化剂,可催化多种细胞反应产生活性氧,而且当细胞中的铁浓度达到较高水平时,可与H2O2发生Fenton化学反应,产生大量羟自由基,从而影响细胞活性。另外,细胞内铁过多还可引发铁依赖性氧化应激以及由大量脂质过氧化引发的细胞铁死亡。有报道指出,糖尿病机体铁蛋白（Ferritin,Ft）异常升高说明机体铁过载,并且胰岛素敏感性与血清Ferritin水平呈负相关,由此可推断机体过多的铁可能会加重糖尿病及其并发症的发生发展。但是,糖尿病患者脑铁是如何沉积的以及铁过载影响糖尿病认知功能障碍的机制是什么,至今仍尚无定论。方法:本实验中,我们采用一次性腹腔注射65mg/kg链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）的方法制作1型糖尿病大鼠模型（Type 1 diabetes mellitus,T1DM）,21天后,侧脑室注射去铁胺DFO（Deferoxamine,DFO）小剂量（5μg/kg/d）连续28天给予治疗。采用Morris水迷宫实验评价动物对空间定位的学习记忆能力;同时采用旷场试验和高架十字迷宫试验观察大鼠的自主探索和焦虑行为;应用Western blot免疫印迹实验检测海马、皮层组织中铁蛋白（FTH/FTL）、铁代谢相关蛋白（Tf Rc/DMT1/FPN1）、铁死亡相关蛋白（GPX4/SLC7A11/ACSL4）、突触可塑性相关蛋白（SYN/PSD95/VAMP2）表达变化;并利用尼氏染色及免疫荧光化学法深入研究海马CA1区、CA3区和皮层神经元微结构变化;最后利用透射电镜观察海马CA1区神经元超微结构变化,以期获得T1DM大鼠认知功能障碍的主要机制。结果:1.Morris水迷宫结果显示T1DM大鼠出现认知功能障碍,DFO处理对T1DM大鼠学习认知行为产生积极影响。同时有无DFO处理,T1DM大鼠均未出现焦虑样行为。2.生化检测T1DM大鼠血清SOD及MDA水平,结果显示T1DM大鼠机体氧化应激水平升高;ICP-MS检测T1DM大鼠脑海马中总铁含量升高;DFO处理后有明显的改善;同时Western bolt及免疫荧光结果显示,海马、皮层FTH、FTL蛋白水平表达显著增加,表明脑海马、皮层铁过载;DFO可缓解T1DM大鼠脑铁过载,同时降低大鼠氧化应激水平。3.T1DM大鼠海马、皮层区Neu N蛋白表达下降,免疫荧光显示Neu N阳性神经元受损,DFO干预可改善神经元损伤。4.蛋白和mRNA水平结果同时显示,T1DM大鼠海马、皮层铁摄取蛋白DMT1表达升高,铁输出蛋白FPN1表达下降;DFO处理后DMT1、FPN1蛋白水平的表达得到恢复,但DFO对mRNA水平没有影响。海马Tf Rc蛋白表达升高,皮层区Tf Rc结果与海马相反,Tf Rc蛋白表达下降,DFO逆转这一结果,但对mRNA水平无影响。5.电镜下T1DM大鼠线粒体皱缩,膜密度增高,DFO处理后线粒体形态得到一定程度的改善;尼氏染色结果显示,DFO抑制铁死亡后,对神经元免受氧化应激损伤具有一定的保护作用。与Ctrl组相比,T1DM组大鼠海马、皮层中GPX4、SLC7A11蛋白的表达显著下降,ACSL4蛋白表达升高;DFO干预后GPX4、SLC7A11及ACSL4的水平得到不同程度的恢复。6.Western blot结果显示,T1DM组大鼠海马、皮层突触功能相关蛋白SYN、PSD95、VAMP2的表达显著下降,DFO干预后三者水平得到明显恢复。透射电镜下,DFO处理后T1DM大鼠突触活跃区长度及突触小泡体积都有明显的改善作用,同时DFO对神经纤维髓鞘的形成也有一定的影响。结论:1.DFO可缓解T1DM大鼠学习记忆能力减弱;2.DFO可降低铁沉积,改善机体氧化应激状态;3.DFO通过抑制铁死亡保护海马神经元损伤;4.DFO可改善突触形态可塑性及突触功能相关蛋白的表达。
关键词: 糖尿病 ；铁死亡 ；神经退行性病变 ；去铁胺
摘要： 氧化损伤是引发神经退行性疾病的重要原因之一。在神经系统中,当β-淀粉样蛋白聚集、多巴胺氧化和脑缺血等现象出现时会导致H2O2产生,并转化为羟基自由基,进一步损害脂质、蛋白质和DNA,从而导致神经元细胞凋亡。6-姜酚和姜黄素是生姜中的主要活性成分,也是天然的酚类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。然而,这些酚类化合物进入人体后往往要经过复杂的两相代谢过程,生成多种代谢产物。因此,为了揭示膳食多酚对多种疾病的预防和治疗作用机制,研究这些代谢产物的生物活性或许具有重要意义。本研究比较了姜黄素、6-姜酚及它们的主要代谢修饰产物（四氢姜黄素、姜黄素-β-D-葡萄糖醛酸盐、6-姜烯酚、6-姜酚-4′-O-β-葡萄糖醛酸盐）对H2O2诱导的大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。本文的主要研究内容及结果如下:（1）姜黄素、6-姜酚及它们的代谢产物对H2O2诱导的PC12氧化损伤的保护作用。建立H2O2损伤的PC12氧化损伤细胞,研究了姜黄素、6-姜酚及它们的代谢产物对细胞存活率、细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放量、细胞内活性氧自由基（ROS）和脂质过氧化物（MDA）含量的影响。结果表明,姜黄素、6-姜酚及它们的代谢产物对H2O2损伤的PC12细胞均有一定的保护作用。与H2O2损伤组相比,样品处理组能够显著（P<0.05）提高细胞存活率、减少细胞乳酸脱氢酶的释放,降低细胞内ROS和MDA水平。除6-姜烯酚外,其它代谢修饰物对氧化损伤的PC12细胞的保护作用均弱于母体化合物。（2）姜黄素、6-姜酚及它们的代谢产物对H2O2损伤的PC12细胞抗氧化酶活性的影响。采用商业化试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性,荧光定量PCR和Western Blot法测定细胞内血红素加氧酶1（HO-1）和NAD（P）H醌脱氢酶1（NQO1）的mRNA及蛋白表达。结果表明,与H2O2损伤组相比,姜黄素、6-姜酚及它们的代谢产物均能够提高细胞SOD活性,促进PC12细胞二相解毒酶（HO-1、NQO-1）mRNA及蛋白的表达。然而,除6-姜烯酚外,其它代谢产物对氧化损伤的PC12细胞抗氧化酶活性的诱导作用均显著（P<0.05）弱于母体化合物。（3）姜黄素、6-姜酚及它们的代谢产物对PC12细胞Nrf2-Keap1信号通路的调控作用。采用荧光定量PCR和Western Blot法测定六种样品对氧化损伤的PC12细胞中Nrf2、Keap1核酸和蛋白表达的影响。实验结果表明,姜黄素、6-姜酚能够促进PC12细胞Nrf2 mRNA及蛋白的表达,降低Keap1蛋白的表达,并促进Nrf2由细胞质向细胞核转移,从而激活Nrf2,促进下游HO-1、NQO-1的表达,起到保护细胞免受氧化损伤的作用,并具有一定的时间效应。然而,两相代谢修饰对姜黄素、6-姜酚的Nrf2激活作用有一定影响。其中,6-姜烯酚增强了对PC12细胞Nrf2的激活作用,其他三种代谢产物对Nrf2的激活作用均减弱。说明代谢产物通过影响母体化合物对Nrf2的激活作用,从而使其抗氧化活性改变。通过siRNA转染沉默PC12细胞中Nrf2的表达,可以发现活性成分对PC12细胞的保护作用几乎消失,说明Nrf2是它们发挥抗氧化损伤作用的主要靶点。
关键词: 姜黄素 ；四氢姜黄素 ；6-姜酚 ；6-姜烯酚 ；葡萄糖醛酸 ；大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 ；氧化损伤 ；Nrf2
被引量
2
摘要： 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是目前最常见的一种慢性中枢神经系统退行性疾病,一旦患病,患者的病症会随时间推移而逐渐恶化。其临床典型表现为渐进性记忆衰退和认知障碍,患者脑内病变通常表现为细胞外Aβ淀粉样蛋白沉积形成的老年斑(senile plaques,SP),细胞内高磷酸化Tau蛋白异常缠绕形成的神经纤维缠结(neurofibrillartangle,NFTs)以及大量神经元丢失。目前为止,由于AD发病机制的复杂性,因此其具体的发病机制仍然不明确,但随着对AD研究的不断深入产生了多种学说,经典的学说有:胆碱能丢失学说,Aβ蛋白级联学说,Tau蛋白过度磷酸化学说,金属离子异常学说,氧化应激学说,线粒体受损学说,神经炎症学说。其中胆碱能丢失学说是发展时间最长的学说,FDA批准上市用于抗AD的药物中(多奈哌齐,他克林,加兰他敏,利凡斯的明,美金刚)前四种均是胆碱酯酶抑制剂。但所有这些上市药物在发挥抗AD治疗作用时仅仅只能改善患者症状,达到延缓疾病进程的作用,却无法扭转病情进而彻底治愈。越来越多的研究表明,对于治疗像AD这样的复杂疾病,多靶点药物设计策略是一种重要、有效的解决方案。近年来,很多研究都表明HDAC(histonedeacetylase)与长期记忆的形成和认知的产生关系密切,因此HDAC成为研发抗AD药物的热门靶点。HDAC抑制剂的药效团模型共有三个部分组成。1)金属锌离子螯合基团ZBG,该部分用于螯合HDAC催化活性中心底部的锌离子。2)Cap结构,该部分结构用于识别并占据HDAC活性口袋的疏水性表面,通常是具有疏水性的结构例如各种芳香基团。3)Linker结构,该结构用于连接ZBG基团与Cap结构,该部分通常处于酶活性口袋的管状疏水通道。本课题以HDAC药效团模型为基础,选取AChE抑制剂多奈哌齐结构中能与AChE催化活性位点结合的苄基哌啶部分做Cap部分,以芳香性结构或不同长度的脂肪结构作为Linker,异羟肟酸或邻苯二胺作为ZBG部分,设计并合成两个系列共31个新型HDAC-AChE多靶点抗AD化合物。对HDAC-AChE多靶点抗AD衍生物进行初步的体外抗AD活性评价,评价指标包括组蛋白去乙酰化酶和胆碱酯酶抑制活性,ABST自由基清除活性,金属离子螯合活性,抑制Aβ1-42聚积活性,解聚Aβ1-42活性以及对H2O2损伤的PC12细胞保护活性。结果显示,多数化合物都表现出很好的HDAC抑制活性,但是在AChE酶活性上表现稍弱。其中化合物d5和d10相对其他化合物表现出更为均衡的酶活抑制活性(d5:AChEIC50=6.8900 μM,HDACIC50=0.1713 μM,d10:AChEIC50=3.2193 μM,HDACIC50=0.4526 μM)。选取部分酶活活性较好的化合物进一步评估ABST自由基清除活性和金属离子螯合活性,我们发现,多数化合物都表现出与阳性药Trolox相当的自由基清除能力。在金属Cu2+螯合实验中,化合物d5-d10,d15,d31的铜离子螯合活性明显优于多奈哌齐,其中化合物d5,d7,d8,d9,d10 和 d15 铜离子螯合率分别为 38.97%,39.03%,41.07%,36.65%,30.67%和37.29%。实验结果说明设计的化合物具有靶向调节AD疾病网络中自由基过剩和金属离子稳态失衡的潜力。对部分化合物进一步进行Aβ1-42相关实验,d5和d10都表现出轻度的抑制、解聚Aβ1-42自身诱导聚积体的活性,此外,这两个化合物还表现出明显的抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集活性(抑制率d5:33.8%,d10:34.2%)。最后,在化合物对H2O2损伤的PC12神经细胞保护实验中,化合物d5和d10表现出优于多奈哌齐和SAHA的神经细胞保护作用。
关键词: AD ；组蛋白去乙酰化酶(HDAC) ；胆碱酯酶(ChE) ；多奈哌齐 ；多靶点
摘要： 【研究背景及目的】
阿尔茨海默病（AD）是最常见痴呆类型,其起病隐匿并呈进行性进展,临床主要表现为认知功能下降、精神症状和行为障碍、以及日常生活能力的逐渐下降。当前全球每年痴呆的经济负担已经达到1万亿美元,而罹患痴呆人数超过5000万,预计到2050年将达到1亿5000万[1,2]。据估计,我国目前AD患者约983万。随着中国人口结构逐渐进入老龄化,该病预计会给家庭和社会带来沉重的医疗、照料和经济负担[3]。
AD以β淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白异常过度磷酸化为主要病理改变,最终导致神经元损伤及突触改变。目前AD致病机制尚未完全明确,几种经典的致病假说包括β淀粉样蛋白假说、Tau蛋白假说、衰老假说、线粒体级联假说、血脑屏障功能障碍假说及脑肠轴假说等[4-9]。基于当前的致病假说,临床上治疗AD的两大类药物包括胆碱酯酶抑制剂（Ch EIs）和N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂,但它们仅仅能在一定程度上改善AD的临床症状,并不能终止或者逆转疾病进程[2]。为实现疾病修正治疗,到目前为止,主流研究的热点都是聚焦在直接靶向AD的病理改变。而当前FDA批准的两个针对β淀粉样蛋白的单克隆抗体,Aducanumab和Lecanemab单抗,因其脑微出血和脑水肿等副作用,从批准到临床应用均存在争议[10,11]。因此,临床上亟需新的AD药物治疗策略。
鉴于年龄与AD发病的关系,衰老在AD的致病机制中发挥重要作用[5]。虽然中枢神经系统存在神经元细胞、胶质细胞以及构成血脑屏障的周细胞、血管内皮细胞等多种细胞类型,但是最近有研究表明,小胶质细胞的衰老在促进AD的病理改变及疾病进展等方面发挥重要作用[12-14]。因此,改善小胶质细胞衰老可能是治疗AD的有效策略。基于当前抗衰老治疗药物谱的逐步拓宽,姜黄素,一种兼具抗衰老、抗炎、神经保护作用等药理活性的天然植物提取物,得到越来越多关注[15,16]。姜黄素口服的安全剂量能够达到每日8g。然而,由于其易降解、水溶性差、易代谢等特性导致生物利用度极低,由此限制了其药理学价值[16]。为增加姜黄素的生物利用度,本研究拟采用源自小鼠黑色素瘤细胞的细胞外囊泡作为负载姜黄素的生物纳米载体,并将对姜黄素改善小胶质细胞衰老、姜黄素纳米药物的表征、姜黄素纳米药物的透血脑屏障（BBB）能力及姜黄素纳米药物体内改善小胶质细胞衰老和AD相关病理进行系统探讨。旨在为抗AD药物开发提供一种新的策略和方向,同时也为抗衰老疗法治疗AD提供理论支持。
【实验方法】
一、过氧化氢（H2O2）诱导BV2细胞（小鼠小胶质细胞）衰老及姜黄素的抗衰老作用
1、H2O2诱导BV2细胞衰老
通过CCK-8法测定H2O2对BV2细胞的毒性,确定H2O2的安全浓度范围。将BV2细胞接种在六孔板中,光学显微镜下观察BV2细胞密度。待密度为40-50%时,使用不同浓度的H2O2分别处理1至4天。处理完成后进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色,确定最佳H2O2浓度及处理时间。
2、姜黄素体外抗衰老作用
首先,通过CCK-8法测定姜黄素对BV2细胞的毒性,确定细胞实验中姜黄素的最大安全剂量。然后,用姜黄素处理成功诱导的衰老BV2细胞模型适当的时间。通过SA-β-gal染色,Western blot（WB）检测P16INK4A蛋白水平,q PCR检测促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平这三个维度验证姜黄素的体外抗BV2细胞衰老作用。
二、负载姜黄素的纳米药物（NP-CUR）的制备、表征和细胞毒性研究
使用脂质体挤出器,通过挤出法制备黑色素瘤细胞囊泡（B16-EV）,并利用超声法完成NP-CUR的制备。然后使用马尔文粒度电位仪和透射电子显微镜、多功能酶标仪等对B16-EV及纳米药物的粒径、电位、形态、载药量、稳定性等进行表征分析。通过CCK-8法测试NP-CUR对BV2细胞的细胞毒性作用。通过荧光倒置显微镜进行BV2细胞对NP-CUR的摄取研究。
三、B16-EV透血脑屏障能力
1、B16-EV体外透BBB模型实验
将适量b.end3细胞（小鼠脑微血管内皮细胞）接种于六孔板Transwell上室中,待细胞生长融合后,通过4小时液面渗漏实验判断BBB模型造模成功。在进行B16-EV的体外透BBB模型实验前6小时将BV2细胞接种于Transwell下室,将DID标记的B16-EV加入Transwell上室,对照组加入同等剂量的游离DID。18小时后,将下室BV2细胞用Hochest33342染色,荧光倒置显微镜下观察BV2细胞对DID的摄取。
2、B16-EV体内透BBB实验
APP/PS1/TAU三转基因小鼠（3×Tg小鼠）通过腹腔注射DID标记的B16-EV及游离DID。24小时后处死小鼠并取出脑组织,置于小动物活体成像系统中拍摄观察,检测小鼠脑中荧光水平。
四、NP-CUR体内抗衰老小胶质细胞并改善AD病理作用
选择15-16月龄的3×Tg AD模型小鼠作为实验小鼠,小鼠每3天通过腹腔注射不同的药物（PBS缓冲液、游离姜黄素、NP-CUR）,注射15次后,处死小鼠并提取脑组织,制作成脑匀浆和脑病理切片后,通过Western Blot、免疫荧光染色实验、q PCR、尼氏染色评估NP-CUR对衰老小胶质细胞清除及AD小鼠的病理改善作用。
五、NP-CUR体内生物相容性与安全性
1、各治疗组小鼠的肝肾功能等指标的差异情况
在动物给药结束后,采用眼眶取血的方式收集小鼠血液,采用离心法获得血清。通过相关检验仪器和试剂,检测各组小鼠的肝肾功能等指标,以评估NP-CUR在体内是否存在肝肾毒性。
2、各治疗组小鼠重要器官病理切片情况
每次给药前,测量各小鼠体重并记录。在药物治疗结束后,解剖收集各组小鼠的重要器官（心、肝、脾、肺、肾等）。然后将小鼠器官石蜡包埋行病理切片,并进行苏木精&伊红染色（HE染色）,倒置光学显微镜下观察各组的病理切片是否存在形态学改变或者炎性损伤等,进一步评估NP-CUR在体内的安全性。
【实验结果】
一、H2O2诱导BV2细胞衰老的最佳条件为300μM连续诱导4天。20-30μM浓度以下姜黄素对BV2细胞安全性良好。因此我们选择25μM的姜黄素进行体外抗BV2细胞衰老实验,并成功验证其能减少SA-β-gal阳性衰老小胶质细胞比例,降低P16INK4A蛋白表达及促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平。
二、超声法制备NP-CUR。马尔文粒度电位仪测量其粒径及电位,负染电镜拍照显示载药前后纳米载体均为基本规则圆形。通过酶标仪测量姜黄素浓度提示NP-CUR能显著增强姜黄素的水溶性及体外稳定性。CCK-8实验表明50μM浓度及以下的NP-CUR对BV2细胞无明显毒副作用,提示NP-CUR具有缓释特性,为后续体内实验中NP-CUR的安全性提供了依据。
三、细胞摄取实验结果表明,NP-CUR可以显著提升BV2细胞对姜黄素的摄取,提示B16-EV能增加细胞的药物摄取。同时,体内外穿透BBB实验表明,B16-EV组DID荧光显著升高,证实了B16-EV穿透血脑屏障的能力。
四、动物实验结果表明,对比未治疗组及游离CUR组,NP-CUR组P16INK4A及IBA-1免疫荧光共定位、p-TAU、Aβ免疫荧光强度显著降低。WB结果显示NP-CUR组P16INK4A蛋白、p-TAU及APP表达减少。q PCR结果显示NP-CUR能有效降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平。尼氏染色结果表明NP-CUR最终挽救神经元损伤。以上结果共同说明NP-CUR能有效改善小胶质细胞衰老并缓解AD病理。
五、在给药期间,各组之间小鼠体重变化方面没有观察到显著差异。治疗结束后通过对小鼠血液进行生化检测,结果显示在空白对照、游离姜黄素、NP-CUR各组之间没有观察到显著变化。同样的,对心、肝、脾、肺、肾切片并行HE染色,结果与血生化结果一致,未观察到明显的病理损伤等改变。
【结论】
1、在体外细胞实验中,姜黄素可以改善H2O2诱导的小胶质细胞衰老。
2、B16-EV具有良好的透血脑屏障能力,B16-EV负载后能增加姜黄素的水溶性及细胞摄取,并具有良好的稳定性和药物缓释能力,在一定程度上降低姜黄素的细胞毒性。
3、对比游离姜黄素,NP-CUR纳米制剂具有良好的生物利用度,在体内能有效改善小胶质细胞衰老,从而改善AD相关病理,并挽救神经元损伤。
4、NP-CUR具有良好的体内生物相容性。
关键词: 阿尔茨海默病 ；小胶质细胞 ；衰老 ；姜黄素 ；细胞外囊泡
摘要： 糖尿病脑病(diabetic encephalopathy,DE)是由糖尿病(diabetes mellitus,DM)引起的中枢神经系统损害,导致大脑神经发生功能和结构的改变,以获得性认知功能障碍和行为缺陷为特征。主要表现为记忆力减退、反应迟钝、注意力下降。其发病隐匿、进展缓慢,不易被及时诊断发现,是糖尿病并发症中较难防治的并发症之一,给家庭和社会带来沉重的负担。随着社会的老龄化和糖尿病患病率的增加,对糖尿病脑病的防治已成为众多研究者关注的重点问题。文献报道糖尿病脑病大鼠呈现阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)样病理改变,如神经元变性、海马萎缩、Aβ沉积和神经元纤维缠结等。流行病学研究也提示糖尿病将增加AD的患病风险,糖尿病是AD的独立风险因子之一。我们推测糖尿病脑病和AD存在某些相似的病理改变和发病机制。氧化应激(oxidative stress)损伤被认为是糖尿病和AD发病的重要机制。由于中枢神经系统(central nervous system,CNS)细胞膜由大量高度不饱和脂肪酸构成,对氧化应激损伤更加敏感。因此,氧化应激是糖尿病脑病和AD发病的早期事件,并且贯穿病程的始终。研究表明氧化应激可诱导一系列基因表达的失衡,参与机体的应激反应并在神经和精神系统疾病发病中发挥重要作用。微小RNA(micro RNA,miRNAs)是长度约为22个碱基的非编码小RNA,属于生物功能调节中的负向调控因子。miR-132是脑内含量最丰富的miRNAs之一,它在神经元的神经发生和可塑性中都发挥着关键作用。研究发现,miR-132在AD患者死亡后脑中显著下调,并伴有神经元死亡、淀粉样蛋白沉积等病理表现,提示miR-132可能参与AD的分子机制。本课题组的前期研究用H2O2刺激小鼠原代海马神经元制备氧化应激细胞模型,结合快速老化痴呆模型小鼠SAMP8和SAMP10,以及在AD患者外周血清中,采用芯片和q PCR技术筛选并验证了一系列氧化应激介导的与AD发病相关的miRNAs,其中miR-132表达显著下调,提示miR-132可能在AD中起作用。糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是参与调控Tau蛋白异常过度磷酸化酶之一。研究证实,在AD发病机制中,miR-132模拟剂通过GSK-3β可以减少Tau蛋白在ser396和ser404位点的磷酸化,从而起到对AD的治疗作用。那么miR-132是否参与糖尿病脑病发病,其机制并不十分清楚,本研究旨在探讨miR-132是否通过介导GSK-3β/Tau通路参与糖尿病脑病的发病。第一部分miR-132在糖尿病脑病动物海马中的表达和意义目的:探究miR-132在糖尿病脑病动物海马中的表达情况。方法:1.选取40只8周龄体重在200g左右的雄性SD大鼠,用高脂饲料喂养28天。通过随机对照方法将40只大鼠分为两组,其中对照组大鼠10只,模型组大鼠30只。在大鼠禁食24 h后,给予模型组大鼠腹腔注射1%的STZ(40 mg/kg),给予对照组大鼠腹腔注射生理盐水。72 h后,所有大鼠继续禁食24 h后尾静脉采血测空腹血糖。空腹血糖≥16.7 mmo1/L提示SD大鼠DM模型建立成功。造模28周后,利用Morris水迷宫实验对大鼠进行神经认知功能学测量,进而判定SD大鼠空间学习记忆能力,在DM大鼠中筛选出DE大鼠模型。之后分别将Con组、DM组及DE组大鼠麻醉后脱臼处死,提取DE大鼠海马组织中的微小RNA,按反转录说明操作进行反转录,之后利用实时荧光定量PCR法测定miR-132的表达水平。2.选取出生1 d的新生雄性SD大鼠,取海马组织按原代细胞培养操作步骤进行原代海马神经元细胞生命维持。制造不同浓度下的H2O2、高糖、甘露醇孵育原代海马神经元的细胞损伤模型。提取原代海马神经元细胞损伤模型中的微小RNA,按反转录说明操作进行反转录,之后利用实时荧光定量PCR法测定miR-132的表达水平。结果:1.DE组和DM组miR-132的表达明显降低,miR-132在DE组海马组织中的表达较DM组明显降低(P<0.01)。2.甘露醇、高葡萄糖和H2O2干预原代海马神经元组miR-132的表达水平与对照组相比均降低,但仅高葡萄糖和H2O2组与对照组相比具有统计学意义(P<0.01)。小结:在糖尿病脑病大鼠海马组织及原代海马神经元细胞氧化应激损伤模型中,miR-132表达水平减低,提示miR-132可能是糖尿病脑病发病过程中的保护性分子。第二部分miR-132介导GSK-3β/Tau信号通路参与糖尿病脑病的发生目的:探究miR-132是否通过调控GSK-3β/Tau通路,参与大鼠糖尿病脑病发病和HT-22细胞氧化应激损伤。方法:1.利用Western Blot技术检测DE模型海马中GSK-3β、p-GSK-3β(T216)、p-Tau(Ser404)和p-Tau(Ser396)蛋白的表达水平;Western Blot技术检测HT-22氧化应激损伤条件下GSK-3β的表达;Western Blot技术验证miR-132过表达对氧化应激条件下HT-22细胞中GSK-3β的表达情况。2.培养HT-22海马神经元细胞系,用不同浓度的H2O2、高糖和AGEs分别刺激HT-22细胞建立氧化应激细胞损伤模型,在体外模拟DE早期病变。3.实时荧光定量PCR技术检测miR-132在HT-22细胞中成功转染(过表达)。4.免疫荧光技术检测Con、DM和DE组GSK-3β和p-Tau(Ser404)的表达及共定位情况。5.免疫沉淀技术检测GSK-3β和p-Tau(Ser404)蛋白之间是否存在相互结合关系。6.免疫组织化学技术检测Con、DM和DE组GSK-3β、p-Tau(Ser404)和p-Tau(Ser396)的表达情况。结果:1.Western Blot结果显示,DM和DE组海马组织中GSK-3β、p-GSK-3β(T216)、p-Tau(Ser404)、和p-Tau(Ser396)的表达水平均高于对照组,且DE组较DM组明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.体外模拟DE实验表明,H2O2、高糖和AGEs刺激后HT-22细胞中GSK-3β的蛋白表达水平升高。3.GSK-3β和p-Tau(Ser404)在糖尿病大鼠海马组织中表达水平上调(P<0.05)。4.免疫沉淀结果表明GSK-3β与p-Tau(Ser404)蛋白之间存在着相互结合关系,DE组结合程度较DM组和Con组之间相比显著增强。5.免疫组化结果显示,GSK-3β与p-Tau(Ser404)蛋白表达水平在Con、DM和DE组之间表达呈上调趋势。6.miR-132下调HT-22损伤细胞中GSK-3β的表达水平(P<0.05)。小结:1.miR-132通过介导GSK-3β/Tau信号通路参与大鼠糖尿病脑病的发生,可能是糖尿病脑病发病的分子机制之一。2.miR-132通过介导GSK-3β信号通路参与HT-22细胞的氧化应激损伤,可能是糖尿病脑病发病的分子机制之一。第三部分2型糖尿病脑病患者外周血miR-132和GSK-3β的水平变化及意义目的:探讨2型糖尿病脑病患者外周血的miR-132和GSK-3β的水平变化及意义,为2型糖尿病脑病的防治提供新思路。方法:1.选择2018年12月-2020年12月于河北医科大学第一医院内分泌科治疗的60例DE患者作为实验组,选择性别、年龄等一般人口统计学资料匹配的健康志愿者60名,作为健康受试组。2.分别收集DE组和健康受试组患者的各2管静脉血,每管5 m L,分别完成血清和血浆的分离。3.q RT-PCR检测DE患者外周血血清中miR-132的水平。4.酶联免疫吸附法检测DE组外周血血浆中GSK-3β的水平。结果:1.DE组患者外周血血清中miR-132水平明显下调(P<0.05)。2.DE组患者外周血血浆中GSK-3β相对水平明显上调(P<0.05).小结:糖尿病脑病患者外周血的miR-132水平下调,GSK-3β水平上调,进一步验证了我们基础实验的研究结果,miR-132可能是糖尿病脑病发病机制过程中的保护性分子。
关键词: 糖尿病脑病 ；miR-132 ；GSK-3β ；Tau ；p-Tau(Ser404) ；p-Tau(Ser396) ；Morris水迷宫实验
被引量
2
摘要： 阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）又被称为老年痴呆,是一种隐匿、持续发展的神经退行性疾病。AD主要在老年人中发病,病情恶化程度随时间延长而加重,病人会逐步丧失全部记忆、自理能力和行动能力,最终走向死亡。目前,AD已经成为威胁全世界65岁以上老年人生命的第五类致死性疾病。因此,对于AD的研究及抗AD的药物的开发是十分必要且紧迫的。对于AD具体的发病原因和机制至今尚不明确,其中以淀粉样蛋白级联假说机制和氧化损伤机制最为广泛被学者认可。Aβ的产生和清除失衡导致过其多在脑组织中聚集和沉积,而Aβ的大量产生、异常聚集和神经细胞外沉积会对神经细胞产生毒性,这种毒性可以使大脑皮层内发生复杂的级联变化,如突触丧失、炎症级联反应、氧化压力、胞内离子通道破坏、PHF并最终导致神经细胞损伤死亡,最终引发AD。目前对于单一靶点抗AD的药物研究进展并不理想,多靶点药物的开发成为抗AD的热点研究方向。本实验室前期实验研究中根据抗坏血酸过氧化物酶的主体结构、微过氧化物酶MP-9的结构、以亚血红素为靶分子筛选噬菌体展示肽库所得到的序列,设计了一种含His的过氧化物酶模拟酶次血红素六肽（Deuterohemin-AlaHisThrValGluLys,DhHP-6）,具有较高的过氧化物酶活力,在体内具有清除自由基、抗氧化的作用。文献报道iAβ5p（LPFFD）是经过改造的β片层断裂肽（BSBp）,能够结合到Aβ1-42的核心疏水区域进而破坏β-片层结构的形成,从而阻止Aβ1-42聚集。因此,本论文拟通过抑制Aβ1-42聚集和抗氧化应激两个靶点来设计合成一条具有拟过氧化物酶-抑制Aβ1-42聚集的双功能肽（BP,Dh-βAlaHisThrValGluLysLeuProPhe Phe Asp）,即以共价连接的形式将β片层断裂肽iAβ5p连接在过氧化物酶DhHP-6上。利用固相肽合成法合成BP后,通过在体外测定其过氧化物酶活力,清除自由基能力;在蛋白水平检测其与Aβ1-42相互作用,构建并利用AD细胞模型SH-SY5Y细胞测定其在体外抗AD作用效果,并以过表达人源Aβ1-42突变体秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）CL4176线虫作为动物模型,测定对线虫寿命和瘫痪率的影响,并通过Aβ1-42斑块沉积、ROS含量以及Aβ1-42和hspmRNA表达水平探究其抗AD的作用机制。本论文首先通过Fmoc固相肽合成法合成BP,经MALDI-TOF-MS确定相对分子质量为1848,确认为目标产物,通过HPLC制备BP纯品0.997g,收率为53.95%;通过维生素C和H2O2双底物法测定BP酶活力为20.8U/mg,为DhHP-6的38.3%,并通过DPPH自由基清除法,证明BP具有抗氧化的作用,0.9μM BP即可达到50%DPPH清除率;通过生物大分子相互作用系统（BLI）证明BP具有与Aβ1-42亲和作用,KD值为9.07,并通过Tris-Tricine-SDS实验和ThT荧光染色实验,证明BP在体外具有抑制Aβ1-42聚集成寡聚体和β淀粉样蛋白成熟体即β片层纤维的作用;利用40μM Aβ25-35在37℃温育24h后诱导细胞损伤,细胞存活率为67.73%,成功建立阿尔兹海默症细胞模型,并通过MTT法证明,BP在体外细胞模型中具有Aβ1-42损伤保护作用,15μMBP实验组细胞存活率达到85.13%;通过AD模型突变体线虫CL4176,证明BP能够延缓由Aβ1-42表达产生而引起的线虫瘫痪和死亡,其抗Aβ1-42损伤作用是通过减少抑制Aβ1-42聚集形成的斑块沉积和抗氧化清除ROS的方式,同时上调分子伴侣hsp16.2、hsp16.41和hsp12.6表达帮助Aβ1-42正确折叠。综上所述,BP具有抗氧化作用,能够提高抵抗Aβ1-42诱导的氧化损伤能力;又具有β片层断裂肽作用,能够阻止Aβ1-42的产生和聚集,使Aβ1-42正确折叠来减少Aβ1-42斑块沉积,防止其对神经细胞的进一步损伤,双靶点协同发挥抗AD的作用。
关键词: 阿尔兹海默症 ；Aβ ；氧化应激 ；多靶点药物 ；DhHP-6 ；BSBp ；神经退行性疾病
被引量
1
摘要： 阿尔茨海默病(AD)是一种慢性中枢神经退行性疾病,是老年期痴呆最常见的一种类型。虽然AD的发病机制并不完全明确,但多项研究表明其主要与β淀粉样蛋白聚集、乙酰胆碱缺失、tau蛋白磷酸化及氧化应激等相关。β淀粉样蛋白在脑内异常沉积是AD发生和发展的中心环节,研究开发Aβ聚集抑制剂是AD药物研发工作者的主要关注点之一。天然产物一直是活性先导化合物甚至是药物的重要来源,以天然产物的药效骨架和母核开展结构改造研究从而获取结构新颖、药理活性增强及成药性改善的先导化合物或候选药物,是新药研发的重要途径之一。为此,从天然产物中寻找治疗AD的药物成为国内外学者争先关注的热点。中药知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎,具有改善老年性痴呆、学习记忆障碍、抗肿瘤、抗抑郁和抗炎等多种药理活性。菝葜皂苷元(Sarsasapogenin,SG)为中药知母改善神经退行性疾病的主要活性成分,其在治疗AD方面的研究得到越来越多的关注。近年来,菝葜皂苷元衍生化研究也引起了科研工作者的兴趣。本文以菝葜皂苷元为母体化合物,以计算机辅助药物设计中的分子对接技术为指导,对其进行合成多样化研究,通过引入不同的药效片段以期寻找到活性更好的抗AD药物候选物。对其C3位和F环进行结构修饰,设计合成了 86个衍生物,其中57个衍生物为未见文献报道的新化合物,所得系列衍生物的结构经1H NMR、13C NMR、MS等分析手段进行了确认。药理结果表明,菝葜皂苷元三氮唑杂合体具有较好的Aβ聚集抑制活性,其中活性较好的化合物47和52在50μM浓度下对SH-SY5Y细胞没有表现出明显的毒性,此外,化合物47和52对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤具有一定的保护活性,进一步的体内实验结果表明化合物47和52可以显著改善Aβ致痴呆小鼠的学习记忆能力,组织切片染色实验结果表明化合物47和52可以减少Aβ对海马区的神经元所造成的毒性,Westernblot实验结果表明化合物47和52具有的体内神经细胞保护作用可能是通过上调Bcl-xl,pro-caspase3和PARP的表达水平,下调Bax和cleaved PARP的表达水平来阻止神经细胞发生凋亡。此外,我们对部分菝葜皂苷元衍生物进行了细胞毒活性测试,其中,A系列衍生物33和D系列衍生物63具有较好的细胞毒活性,并对它们进行了初步的抗肿瘤作用机制研究。化合物33可以引起MCF-7细胞的G2/M期阻滞和诱导MCF-7细胞发生凋亡。化合物63可以抑制MCF-7细胞的克隆形成和通过线粒体途径诱导MCF-7细胞发生凋亡。
关键词: 阿尔茨海默病 ；计算机辅助药物设计 ；菝葜皂苷元衍生物 ；β淀粉样蛋白 ；抗肿瘤活性
摘要： 阿尔茨海默病（AD）发病机制复杂,且各病理因素相互作用形成恶性循环。因此,开发基于多靶点协同机制的药物是治疗AD的有效策略。纳米材料因其独特的结构优势、良好的稳定性、较大的比表面积以及血脑屏障（BBB）穿透性等优良特性,作为AD治疗药物或者诊疗试剂引起了广泛的关注,具有广阔的应用前景。由于体内复杂的手性微环境,手性相互作用参与了体内众多关键的生物反应,纳米材料的手性会直接影响其进入细胞的途径、在生物体内的行为及最终治疗效果。手性是药物设计、药理学、毒理学、药代动力学需考虑的重要因素。同时,在一对对映体药物中,有时只有一种对映体显示出理想的药物活性,而另一种没有药物活性,甚至可能引起不必要的副作用。基于此,本论文将手性这一自然界普遍存在的内在特征引入到纳米药物的设计中,构建一系列手性纳米平台,用于立体选择性调控阿尔茨海默病及相关手性药物的筛选。为AD早期治疗提供新的思路和研究方向,推动新型抗AD手性药物的开发。
第一部分 手性多金属氧酸盐立体选择性调控β-淀粉样蛋白沉积用于治疗阿尔茨海默病
目的:基于手性识别对抑制β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集的关键影响,开发纳米尺度的手性抑制剂,用于立体选择性识别及抑制Aβ聚集,以实现AD的治疗。
方法:通过引入ZrⅣ离子,将非手性多金属氧酸盐（POM）与手性酒石酸（L/D-TA）相连接,制备一对具有内在手性的多金属氧酸盐（L/D-POM）纳米团簇。采用紫外-可见光谱（UV-Vis）、红外光谱（FT-IR）和圆二色谱法（CD）对合成的手性L/D-POM进行表征。利用硫黄素T（ThT）荧光法考察L/D-POM对Aβ40纤维化聚集动力学的影响,原子力显微镜（AFM）、透射电子显微镜（TEM）表征Aβ聚集体的形貌,CD和全反射红外（ATR-FTIR）表征Aβ聚集体的二级结构。通过核磁共振波谱法（NMR）、bis-ANS荧光等实验手段及分子动力学（MD）模拟得到L/D-POM与Aβ的作用位点及结合模型。使用氮蓝四唑（NBT）等检测体系研究手性POM的抗氧化能力。以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）为细胞模型,通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法等考察L/D-POM对Aβ介导的细胞毒性的抑制作用。采用溶血实验、苏木精&伊红（H&E）染色等方法分析L/D-POM在体内外的生物安全性。以健康C57BL/6J小鼠为正常动物模型,监测L/D-POM在体内跨BBB效率。以APP/PS1双转基因小鼠为AD动物模型,利用Morris水迷宫（MWM）及免疫组织化学（IHC）等实验综合评估手性POM的体内治疗效果及手性差异。
结果:UV-Vis、FT-IR、CD等一系列表征方法证明了L-POM及D-POM纳米团簇的成功制备。ThT荧光法及AFM、TEM图像表明L/D-POM能够抑制Aβ聚集体的形成。L-POM和D-POM抑制Aβ聚集的IC50值分别为17.38μM和2.63μM,进一步证明D-POM的抑制能力优于L-POM。荧光滴定实验计算出D-POM以及L-POM的结合常数分别为1.07×10～6 M-1和5.40×10～5 M-1,经MD模拟计算得到L-POM及D-POM与Aβ间的结合能分别为-476.00 kcal mol-1和-556.98kcal mol-1,以上结果说明了D-POM对Aβ表现出更强的亲和力。此外,手性POM显示出了超氧化物歧化酶（SOD）类酶活性,还能够清除羟基自由基（·OH）。体外细胞实验表明,L/D-POM能够缓解Aβ介导的细胞毒性,并显示出手性选择性作用。体内研究证明了L/D-POM可以穿透BBB,结合其自身的ROS清除活性,L/D-POM表现出改善AD模型小鼠认知缺陷的能力,能明显抑制APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积、缓解神经炎症以及减轻神经元损伤。其中,D-POM具有更佳的疗效。
结论:本研究所合成的具有固有手性的L/D-POM可以手性识别并选择性地抑制Aβ40聚集。动物实验结果显示,L/D-POM能够穿透BBB,可明显提高AD模型小鼠的认知能力,且D-POM的治疗效果明显优于L-POM。我们的工作将为AD手性药物的开发提供理论依据和实验支持。
第二部分 手性硒掺杂碳点调控β-淀粉样蛋白和神经元铁死亡多靶点协同治疗阿尔茨海默病的研究
目的:考虑到AD复杂的发病机制和各种病理因素的相互作用,针对AD早期致病因子Aβ与神经元铁死亡设计手性纳米药物,在抑制Aβ聚集和神经元铁死亡的同时,调节脑铁代谢并减少炎症反应,以实现多靶点协同治疗AD。
方法:以精氨酸为前驱体、手性环己二胺为手性基团、硒氰酸钾为硒掺杂剂,通过微波辅助水热法合成具有高手性稳定性的超小尺寸手性硒掺杂碳点（S/R-Se CDs）。随后,利用TEM、UV-Vis、CD、拉曼光谱及X射线光电子能谱（XPS）等多种手段对合成的S/R-Se CDs进行表征。使用NBT光还原法、自由基比色法等手段考察S/R-Se CDs的抗氧化能力。采用ThT荧光法、TEM以及NMR、bis-ANS荧光法等分别研究S/R-Se CDs对Aβ聚集的抑制作用以及手性选择性结合的作用机制。选择PC12细胞用于考察S/R-Se CDs能否缓解Aβ介导的神经毒性。Aβ聚集体的细胞毒性利用MTT法、游离钙离子浓度、线粒体膜电位等手段表征。同时,以铁死亡激活剂Erastin诱导的PC12细胞为神经元铁死亡细胞模型,使用荧光成像、Western Blot等方法研究S/R-Se CDs抑制神经元铁死亡的作用及作用机制。以APP/PS1小鼠为动物模型,评估S/R-Se CDs的体内抗AD作用,并通过Western Blot方法测定铁死亡相关指标在AD小鼠脑中的表达。
结果:TEM、XPS、CD等方法证明了手性S/R-Se CDs的成功合成。同时,S/R-Se CDs具有优异的抗氧化性能。在一系列体外实验中,S/R-Se CDs对Aβ聚集有明显的手性抑制作用,并且能降低Aβ聚集体诱导的细胞毒性,高浓度的R-Se CDs可以将PC12细胞活性从54.98%提高至90%。此外,S/R-Se CDs可以抑制神经元铁死亡,其中R-Se CDs对铁死亡的抑制能力优于S-Se CDs。体内实验表明,S/R-Se CDs能够穿透BBB到达小鼠脑部及海马体中,并且S-Se CDs组小鼠脑内及海马体的Se含量低于R-Se CDs组。动物水平的MWM测试、IHC以及Western Blot等实验结果显示手性S/R-Se CDs能够降低APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积,减轻炎症反应,保护神经元免受损伤,同时还影响铁死亡相关蛋白的表达水平,从而提高了APP/PS1小鼠的认知功能,与S-Se CDs相比,R-Se CDs取得了更佳的体内治疗效果。
结论:本研究针对AD早期致病因子,基于Se优异的特性合成了手性S/R-Se CDs。手性S/R-Se CDs能够手性选择性抑制Aβ聚集,并且具备抗氧化活性以及对神经元铁死亡的抑制能力,从而提高了APP/PS1小鼠的认知功能。此项工作对于抗AD手性药物的发展具有重要的研究意义和潜在的临床应用价值。
第三部分 手性FexCuySe NPs作为过氧化物酶模拟物通过比色法检测多巴对映体
目的:手性药物在神经退行性疾病的临床药物中占比超过50%。手性药物的对映体在生化活性、效价、毒性、转运机制和代谢途径等方面存在显著差异。发展区分手性药物对映体的方法在药物科学中具有重要意义。因此,本部分研究以区分L-3,4-二羟基苯丙氨酸（左旋多巴,L-dopa）和D-3,4-二羟基苯丙氨酸（D-dopa）为例,构建一种简便的高通量传感平台,用于筛选神经退行性疾病的手性药物。
方法:以L-组氨酸（L-His）或D-组氨酸（D-His）为手性配体,通过配位作用偶联到FexCuySe NPs表面,制备L/D-FexCuySe NPs。使用UV-Vis、TEM、FT-IR及CD等手段对制备的纳米粒子进行表征。通过催化H2O2氧化TMB的反应评价FexCuySe NPs的类过氧化物酶（POD）活性。随后,以L/D-dopa为底物探讨了L/D-FexCuySe NPs检测L/D-dopa对映异构体的可行性。使用MD模拟计算L/D-His和L/D-dopa之间的相互作用,进一步说明传感器的工作原理。最后采用该比色传感器测定市售片剂药物中左旋多巴的浓度,以评估其在实际药品质量监控应用中的可行性。
结果:UV-Vis、TEM、FT-IR及CD等表征手段证明了非手性FexCuySe NPs及手性L/D-FexCuySe NPs的成功合成,这些纳米材料具有POD类酶活性。手性FexCuySe NPs表面的手性配体L/D-His赋予其催化多巴对映体氧化的手性选择性。根据酶反应动力学参数kcat/Km值可知,L-FexCuySe NPs对L-dopa的催化效率是D-dopa的1.56倍。与之相反的是,D-FexCuySe NPs对D-dopa具有更高的亲和性。由于L-FexCuySe NPs在L-dopa氧化过程中具有高催化活性和手性选择性,基于L-FexCuySe NPs的体系可用于检测L-dopa。L-dopa测定的线性范围分别为5μM-0.125 mM和0.125 mM-1 mM,检测限为1.02μM。此外,该比色传感器成功应用于市售左旋多巴片的质量控制。
结论:基于手性FexCuySe NPs在多巴对映体氧化过程中的高催化活性和立体选择性,我们构建的新型比色传感器可以应用于临床使用的实际药品左旋多巴片剂的质量控制。我们的研究为开发简单和灵敏的手性纳米材料传感器用于手性药物筛选提供了启发。
关键词: 阿尔茨海默病 ；β-淀粉样蛋白 ；铁死亡 ；手性 ；药物筛选
摘要： 阿尔茨海默症（AD）是一种原发性神经退行性疾病,其病理特征是大脑中β淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑（SP）、高度磷酸化的tau蛋白聚集而成的神经元纤维缠结（NFTs）。AD的发病持续时间长,发病率不断攀升,治疗费用昂贵。目前,抗AD药物虽能改善部分病理症状,但不能逆转AD的进程。由于AD的病因复杂,病理机制尚不明确,抗AD药物研究面临重大挑战。氧化应激在AD进程中起着重要作用。由于体内氧化还原平衡失调,产生有毒性的活性氧自由基（ROS）,造成神经细胞损伤和死亡。氧化应激也能促进Aβ聚集及tau蛋白的磷酸化,加速AD疾病进程。AD与Aβ寡聚体及其聚集体密切相关。由于各种病因导致Aβ代谢异常,表现为Aβ过度产生,降解和清除减少,造成过量的Aβ聚集形成具有神经毒性的Aβ寡聚体等,引发神经炎性反应、氧化应激、神经元丢失等。在AD患者中,一些金属（Cu、Zn、Fe、A1）离子在SP和NFT中富集。Cu2+离子等能与Aβ形成高亲和性Cu2+-Aβ复合物,促进Aβ聚集和ROS的产生,加剧氧化应激。AD患者脑皮层和海马区HDAC6蛋白水平显著提高,表明HDAC6可能在AD致病过程中发挥了重要作用。高度磷酸化的tau蛋白降低了其对微管的亲和性,从而导致细胞骨架瓦解,最终导致细胞死亡。Aβ影响微管的稳定性和细胞囊泡运输,进而引起线粒体和神经递质的运输恶化,最终导致突触降解或丢失。抑制HDAC6活性可增强α-微管蛋白的乙酰化水平进而增强微管的稳定性。HDAC6的抑制可增加高度乙酰化的α-微管蛋白和恢复线粒体运输。因此,HDAC6抑制剂可以降解tau蛋白,修复Aβ损伤,有望成为治疗AD的新型药物。HDAC6抑制剂药效团模型与其它亚型HDAC抑制剂相似,分为帽子区（Cap）、连接区（Linker）、Zn2+结合基团（ZBG）。Cap—般为芳环或芳杂环等环状结构,Linker通常为脂肪长链或取代芳环,常见的ZBG有异羟肟酸,硫醇等。研究发现,HDAC6蛋白的表面识别区比其它亚型要大,可以选用结构较大的基团作为Cap区。作为抗AD的HDAC抑制剂,必须具备透过过血脑屏障的能力。因此,本课题组选用临床用于治疗中枢疾病药物的药效团,如吩噻嗪,10,11-二氢-5H-二苯并[b,f]氮杂卓,美金刚,作为Cap药效团,通过连接不同的芳环Linker,异羟肟酸作为ZBG基团,来探讨不同的Cap或不同的芳环Linker对HDAC6活性的影响,设计一系列新型HDAC6抑制剂。本研究合成了20个目标化合物,初步测试了对HDAC6的抑制活性,对活性较好的化合物W1和W3进行了 HDAC亚型选择性评价。用MTT法测定了部分化合物对SH-SY5Y细胞和PC12细胞的抗增殖活性,以及对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的神经保护作用。用硫黄素T法评价了化合物W1,W3,W8和W15对Cu2+诱导的Aβ体外聚集的影响,以及对Cu2+诱导的Aβ聚集体的解聚能力。结果表明,W3对HDAC6的抑制活性最好,IC50值为11nM,对HDAC1、HDAC8和HDAC11具有一定的选择性。所测试的化合物对SH-SY5Y和PC12细胞的增殖均无影响,说明这些化合物均无细胞毒性。W1和W3对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤具有神经保护作用,活性与阳性对照药Trolox的相当或比其活性更好。硫黄素T实验结果表明,W1,W3,W8,W15通过与Cu2+螯合抑制Cu2+诱导的Aβ的聚集,抑制活性与阳性对照药氯碘喹啉（CQ）的相当或比其更好。其中,W1和W3表现出很好的Cu2+诱导的Aβ聚集抑制活性,抑制率分别为60%和58%。在解聚Cu2+诱导的Aβ聚集体的解实验中,W1的活性与CQ相当,解聚率约为33%,而W3的解聚能力强,约为75%。以上结果表明,所设计的HDAC6抑制剂能抑制Cu2+诱导的Aβ聚集,促进Cu2+诱导的Aβ聚集体的解聚,并具有一定的抗氧化应激能力,能够靶向AD的多个方面,可用于进一步的抗AD活性评价。
关键词: 组蛋白去乙酰化酶 ；HDAC6抑制剂 ；阿尔茨海默症 ；Aβ ；氧化应激 ；神经保护
被引量
1
摘要： 研究背景：
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种好发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，是引起老年性痴呆最常见的原因，以记忆丢失和认知功能障碍为典型临床表现。其病因目前尚不清楚，大多认为是一种多病因组成的综合症。主要与淀粉样蛋白沉积、雌激素改变、炎症介质、免疫因素、自由基损伤等有关。氧化应激在神经退行性疾病中起重要作用，抗氧化是治疗神经退行性疾病的重要手段之一。开发更多天然、低毒的抗氧化剂可为神经退行性疾病治疗提供有利支持。小檗碱和药根碱是黄连的主要活性成分，对机体多种组织细胞具有抗炎、抗氧化的作用。然而，其在神经细胞氧化应激损伤中研究的较少，深入研究它的神经保护作用和机制将为神经退行性疾病的治疗提供理论依据。
目的：
本实验以H2O2损伤的PC12细胞作为氧化应激损伤的体外模型，探讨小檗碱和药根碱对H2O2损伤作用的影响及其机制。
方法：
第一部分：小檗碱对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
1)CCK-8比色法检测细胞增殖状况;2)细胞内活性氧(ROS)水平的测定;3)细胞MDA含量的测定;4)罗丹明123(Rh123)染色/流式细胞仪(FCM)检测细胞线粒体膜电位(MMP);5)Hochest 33342染色/HCS筛选仪检测细胞凋亡。
第二部分：药根碱对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
1)DPPH法测定药根碱抗氧化、清除自由基的能力;2)CCK-8比色法检测细胞增殖状况;3)细胞LDH释放、MDA含量、SOD活性的测定;4)罗丹明123(Rh123)染色/荧光显微镜摄片及流式细胞仪(FCM)检测细胞线粒体膜电位(MMP);5)细胞内活性氧(ROS)水平的测定;6)Western blot法检测Cleaved caspase-3蛋白、HO-1蛋白的表达。
结果：
1.H2O2对PC12细胞的损伤
1)PC12细胞分别与100μmol、200μmol、300μmol、400μmolH2O2共培养12h，CCK-8法检测细胞活力显示，在100～400μmol H2O2范围内，细胞存活率随药物浓度增加而逐渐降低，呈剂量依赖性关系。
2)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，细胞LDH释放增加、MDA含量升高、SOD活性降低。
3)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，细胞内ROS水平明显增加。
4)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，MMP明显降低。
5)200μmol H2O2处理PC12细胞12h，升高HO-1蛋白表达，使caspase-3蛋白活化。
2.小檗碱对H202诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
1)200μmol H2O2处理PC12细胞前24h，分别给予0.05～50μmol小檗碱预处理，结果发现0.1～10μmol小檗碱可以对抗200μmol H2O2引起的细胞存活率降低;2)0.1～10μmol小檗碱预处理可减少200μmol H2O2诱导的ROS堆积;3)0.1～10上mol小檗碱预处理可以抑制200μmol H2O2引起的细胞MDA含量增高;4)1～10μmol小檗碱预处理可改善200μmol H2O2引起的MMP降低
5)小檗碱预处理可对抗200μmol H2O2诱导的细胞凋亡。
3.药根碱对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制
1)药根碱(0.01～100μmol)对DPPH自由基的清除能力呈剂量依赖性上升;2)200μmol H2O2处理PC12细胞前24h，分别给予0.01μmol、0.1μmol、1μmol、10μmol预处理可以对抗200μmol H2O2引起的细胞存活率降低。药根碱本身(0.01～10μmol)对PC12细胞无明显的毒性作用;3)0.1～10μmol药根碱预处理可以抑制200μmol H2O2引起的细胞LDH释放;4)0.1～10μmol药根碱预处理可以抑制200μmol H2O2引起的MDA和ROS含量增加;5)0.1～10μmol药根碱预处理可抑制200μmol H2O2诱导的SOD活性降低;6)0.1～10μmol药根碱预处理可改善200μmol H2O2引起的MMP降低;7)10μmol药根碱预处理可抑制200μmol H2O2引起的caspase-3蛋白活化;8)10μmol药根碱预处理可增加抗凋亡蛋白HO-1的表达。
结论：
1.建立了H2O2损伤PC12细胞的体外模型，可较好地模拟氧化应激对神经元的损伤;2.小檗碱可对抗H2O2对PC12细胞的损伤作用，其机制与减轻细胞内ROS的堆积、降低MDA含量、改善MMP及抑制细胞凋亡有关;3.药根碱可对抗H2O2对PC12细胞的损伤作用，其机制与抑制LDH释放、降低细胞内MDA和ROS含量、上调SOD活性、改善MMP、及抑制凋亡蛋白的活化和增加抗凋亡蛋白的表达有关;4.小檗碱和药根碱都可以保护PC12细胞对抗H2O2诱导的细胞毒性损伤，其保护机制都与抗氧化应激损伤、改善MMP及抑制细胞凋亡等机制有关，二者在保护机制上是否存在明显不同，在今后的实验中有待于进一步探讨。
关键词: 过氧化氢 ；小檗碱 ；药根碱 ；细胞损伤 ；线粒体膜电位 ；阿尔茨海默病
被引量
1
摘要： 麋鹿是我国特有的珍稀动物,其茸、角、血、肉、骨均是我国传统珍贵中药,入药已逾千年。本课题组前期研究发现麋鹿角水提物具有改善拟阿尔茨海默症（AD）小鼠模型的学习和记忆能力,并可以显著改善慢性不可预知温和性压力应激（CUMS）小鼠抑郁模型的抑郁样行为。中药材多以方剂配伍,麋角丸首载于唐代孙思邈《备急千金要方》,是中医药典籍中首张以麋鹿角作为君药的方剂,由麋鹿角配伍秦艽、人参、甘草、肉苁蓉、槟榔、木通及菟丝子组成,具有“补心神”之功效,是著名的补益方剂。但是麋角丸的现代研究未见报道,严重影响了该经典名方的临床应用与产品开发。因此本论文探讨麋角丸“补心神”传统功效的神经活性评价与作用机制。通过建立海马区注射β淀粉样多肽1-42（Aβ1-42）拟AD小鼠模型和CUMS小鼠抑郁模型,评价麋角丸抗AD和抗抑郁的生物学效用,并分别从神经保护、神经传导和神经营养三个方面探讨麋角丸抗AD和抗抑郁的作用机制。在整体效用评价的基础上,构建神经保护、神经分化和神经营养细胞模型,探讨麋角丸“补心神”传统功效的作用机制。本论文分为三个章节,内容如下:一、文献研究1.通过查阅历代本草及医书典籍,结合现代文献资料,系统梳理总结了麋角丸的处方来源、历史沿革、药物基原与炮制、处方剂量、制法用法等方剂关键信息。2.对中药复方抗阿尔茨海默症的研究进展进行综述。3.对中药复方抗抑郁症的研究进展进行综述。二、麋角丸“补心神”传统功效的整体动物模型作用机制研究1.麋角丸抗AD生物学效用评价与作用机制研究首先采用海马区注射Aβ1-42构建拟AD小鼠模型,模型建立后给以麋角丸提取物,Morris水迷宫和新事物认知实验检测小鼠的学习与记忆能力,发现麋角丸可显著改善模型小鼠学习与记忆能力。从神经保护、神经传导和神经营养三个方面进行生化指标的检测,探讨麋角丸抗AD作用机制。结果发现麋角丸改善Aβ1-42海马区注射拟AD小鼠模型的学习与记忆能力的效应与下调模型小鼠海马区Aβ表达和tau蛋白异常磷酸化,同时抑制中枢氧化应激和炎性导致的神经元损伤、通过激活ERK/CREB信号通路上调神经营养因子BDNF和NGF的表达、降低海马区乙酰胆碱酯酶（AchE）活力改善胆碱能功能、提高海马区突触蛋白的表达有关。2.麋角丸抗抑郁生物学效用评价与作用机制研究首先建立小鼠慢性不可预知温和性压力应激抑郁（CUMS）模型,模型构建后给以麋角丸提取物,进行糖水偏嗜实验、强迫游泳实验和悬尾实验等行为学检测,发现麋角丸具有显著缓解CUMS小鼠抑郁样行为的效用。从神经保护、神经传导和神经营养三个方面进行生化指标的检测探讨麋角丸抗抑郁的作用机制。结果发现麋角丸通过抑制模型小鼠HPA轴激活、抑制氧化应激和中枢炎性导致的海马神经元损伤、同时上调脑内神经递质的水平和突触蛋白的表达、激活ERK/CREB信号通路从而促进神经营养因子BDNF和NGF的表达,以发挥其抗抑郁的效用。三、麋角丸“补心神”传统功效的体外细胞模型作用机制研究1.麋角丸神经保护调控效用评价与作用机制研究以小鼠海马神经元细胞系（HT22）为细胞模型,评价其对神经元的保护作用,并评价麋角丸对炎症、皮质醇、H2O2损伤细胞的保护作用。结果表明,麋角丸通过激活Nrf2/HO-1通路,对神经细胞多重损伤具有保护作用,并能抵抗氧化应激损伤。2.麋角丸神经分化调控效用评价与作用机制研究本节选取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系（PC12）作为细胞模型进行神经分化研究。结果表明,麋角丸提取物能明显诱导PC12细胞突起生长,调节PC12细胞中神经递质合成和降解酶相关蛋白的表达,促进神经丝的表达。3.麋角丸神经营养调控效用评价与作用机制研究本节以大鼠胶质瘤细胞系（C6）为细胞模型进行神经营养研究,通过qPCR检测麋角丸提取物处理后对C6细胞中神经营养因子BDNF、NGF的表达情况。结果表明,麋角丸提取物可通过激活ERK/CREB信号通路显著提高神经营养因子的表达,通过抑制剂U0126和PKI处理进一步验证了这一作用。
关键词: 麋角丸 ；阿尔茨海默症 ；抑郁症 ；中药复方
摘要： 第一部分黄芪主要有效成分对Aβl诱导阿尔茨海默病模型大鼠的保护作用研究目的：阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进展性中枢神经退行性疾病,临床多发于老年人。其主要病理特征包括神经元间p淀粉样蛋白(Ap)沉积形成老年斑(SP),神经元内tau蛋白过度磷酸化形成纤维缠结(NFTs)以及特定脑区中枢胆碱能神经元的大量死亡与丢失。随着社会人口老龄化日益严重,AD对人类健康的危害日趋严重。据统计,在欧美国家AD已成为继心脏病、癌症、卒中之后的第4位死因,而在中国AD患者的人数己超过500万。因而,AD的防治已成为当前社会亟待解决的重大医学和社会问题之一。关于AD的发病机制研究,尚不十分清楚。大量研究证据支持Ap异常沉积导致的级联反应损伤学说,而在此过程中,氧化应激机制是AD形成和发展的关键因素之一。因而,本研究从中药黄芪有效成分黄芪总苷及黄芪甲苷,对AD大鼠学习记忆功能和氧化应激的作用为切入点,揭示黄芪主要有效成分防治AD的可能机制,为其用于临床治疗提供理论基础和科学依据。方法：选用成年雄性SD大鼠(体重250～300 g),以侧脑室注射Ap25-35制备海马损伤模拟大鼠AD模型。大鼠随机分组,分为对照组(假手术组)、模型组、黄芪总苷低剂量组(20mg/kg)、黄芪总苷中剂量组(40 mg/kg)、黄芪总苷高剂量组(80 mg/kg)黄芪甲苷组(50 mg/kg),每组各12只。在模型组和治疗组,采用侧脑室注射聚集态Ap25-35的方法制备AD大鼠模型。用无菌生理盐水将Ap25-35稀释成3 nmol/L的工作液,密封后放置于37℃无菌恒温培养箱中孵育1周,使其变成聚集状态。通过脑立体定位仪向大鼠侧脑室注入聚集态Aβ25-35 5 μ1(15 μg)；向假手术组侧脑室中注入等量的无菌生理盐水。手术后开始灌胃给药,连续21 d,模型组、对照组给予等量的生理盐水。手术后一周开始进行Morris水迷宫训练,连续5 d；手术后第14 d进行测试共记录3 d,观察各组大鼠学习记忆功能的变化,分析各组大鼠逃避潜伏期、游泳总距离、跨台次数及搜索策略的差异。Morris水迷宫测试后,部分大鼠经水合氯醛麻醉后,以4%多聚甲醛进行心脏灌注固定,取脑组织制作冰冻切片。以尼氏染色观察海马区域神经元细胞形态结构的变化,免疫组织化学法观察海马区域神经元形态及数量的变化,Hoechst33342染色检测神经元凋亡情况。部分大鼠在完成Morris水迷宫测试后,立即断头取脑制备海马组织匀浆,采用酶联免疫吸附法(ELISA),检测海马组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。数据均以均数±标准差表示,采用SPSS 15.0 for windows统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)分析或非配对t-检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果：1.水迷宫实验(1)水迷宫定位航行在Morris水迷宫定向航行实验中,正常组和假手术组大鼠比模型组和治疗组大鼠更容易搜索并找到安全平台。在测试第1天,Aβ组大鼠寻找安全平台的逃避潜伏期明显延长(P<0.05),游泳总距离明显延长(P<0.01)；在黄芪总苷低剂量组,逃避潜伏期和游泳总路程有缩短趋势,但无统计学差异；在黄芪总苷中剂量组、高剂量组和黄芪甲苷组,逃避潜伏期明显缩短(P<0.01),而游泳总路程有缩短趋势,但无统计学差异。从测试第2天开始,与模型组比较,黄芪总苷低、中、高剂量组和黄芪甲苷组的逃避潜伏期均明显缩短；黄芪总苷高剂量组和黄芪甲苷组游泳总距离较模型缩短(P<0.05),而黄芪总苷低、中剂量组游泳总距离未发现明显差异。在测试第3天,与模型组比较,除黄芪总苷低剂量组外,其余各治疗组逃避潜伏期及游泳总距离与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)。(2)水迷宫空间搜索能力与对照组相比,模型组大鼠在平台的停留时间明显延长(P<0.05)；与模型组比较,黄芪总苷中剂量组、高剂量组大鼠在搜索平台停留时间明显缩短(P<0.05),黄芪甲苷组大鼠在搜索平台停留时间明显缩短(P<0.05)。与对照组相比,模型组大鼠跨平台次数明显减少(P<0.05),黄芪总苷中剂量组、高剂量组大鼠跨平台次数明显增多,但未恢复到正常水平,黄芪甲苷组大鼠跨平台次数明显增多(P<0.05)。与模型组比较,黄芪总苷低剂量组大鼠在平台停留时间和跨平台次数未发现显著统计学差异。与对照组相比较,模型组大鼠搜索策略评分明显降低(P<0.05),黄芪总苷中剂量组和高剂量组较模型组搜索策略评分均明显增加(P<0.05)；与模型组相比,黄芪甲苷组搜索策略评分也明显增高(P<0.05)。2.病理组织学所见(1)尼氏染色正常组大鼠海马区域神经元细胞排列紧密,胞内尼氏小体丰富,染色较深,核呈淡蓝色；与对照组比较,模型组大鼠海马区域神经细胞染色变浅,尼氏小体数目减少,细胞排列稀疏,细胞间隙增大,分界不清；黄芪总苷各治疗组及黄芪甲苷组细胞数目有所增多,细胞间隙变小,神经元水肿有所减轻。(2)免疫荧光染色免疫荧光染色结果显示,与对照组相比较,AD大鼠模型组海马区域神经元细胞标记物(NeuN)阳性细胞数目明显减少(P<0.05),黄芪总苷中剂量组、高剂量组和黄芪甲苷组较模型组大鼠海马区域NeuN阳性细胞数明显增加(P<0.05)；提示黄芪总苷及黄芪甲苷对Ap诱导的海马神经元损伤具有一定的保护作用。3.氧化应激检测所见(1) GSH-Px活性ELISA结果显示,模型组大鼠海马组织匀浆GSH-Px活性较对照组明显降低(P<0.05)；黄芪总苷中剂量组和高剂量组大鼠较模型组GSH-Px活性显著增高(P<0.05),黄芪总苷低剂量组GSH-Px活性变化不明显；黄芪甲苷组大鼠海马GSH-Px活性明显增高(P<0.01)。(2)SOD活性ELISA结果显示,模型组大鼠海马组织匀浆SOD活性较对照组明显下降(P<0.05)；黄芪总苷高剂量组大鼠海马SOD活性较模型组显著升高(P<0.05),黄芪总苷低剂量组和中剂量组大鼠海马SOD活性有所升高,但统计无显著性差异,黄芪甲苷组大鼠海马SOD活性升高不明显(P>0.05)。(3)MDA含量ELISA结果显示,模型组大鼠海马组织匀浆MDA含量较对照组明显升高(P<0.01)；黄芪总苷各剂量组大鼠海马MDA含量较模型组显著减低(P<0.01)；黄芪甲苷组大鼠海马MDA含量较模型组也显著降低(P<0.05)。结论：1.黄芪总苷及黄芪甲苷能够改善Aβ25-35诱导AD模型大鼠的学习和记忆能力。2.侧脑室注射Aβ25-35后,大鼠海马区域神经元密度明显减少,凋亡细胞明显增多,连续给予黄芪总苷及黄芪甲苷干预3周后,能够显著减轻Aβ诱导的神经元损伤。3.Aβ25-35诱导大鼠海马区域的氧化应激损伤,黄芪总苷能够显著增加抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性,降低海马组织MDA的含量,黄芪甲苷也能显著增加SOD活性,降低海马组织MDA含量,提示黄芪总苷及黄芪甲苷具有抗氧化以及保护大鼠海马区氧化应激的作用。综上所述,黄芪总苷及黄芪甲苷改善AD大鼠学习记忆功能和海马区神经元损伤,可能通过其抗氧化应激机制有关。第二部分 黄芪主要有效成分对Aβ25-35诱导PC12细胞氧化应激的保护作用目的：黄芪为豆科黄芪属植物,其主要有效成分具有益气升阳、利水消肿等功效,具有显著的抗氧化作用。本研究选用神经元细胞株PC12细胞作为实验对象,采用Aβ25-35处理PC12细胞诱导氧化应激损伤,并检测黄芪主要有效成分黄芪总苷及黄芪甲苷是否对Ap诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,是否通过抑制Aβ诱导的氧化应激发挥作用。方法：1.以聚集态的Aβ25-35处理PC12细胞诱导神经损伤,建立体外模拟AD样损伤细胞模型。2.黄芪总苷及黄芪甲苷预处理后,观察药物处理对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用：(1)MTT法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞损伤的保护作用；(2)乳酸脱氢酶(LDH)法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞损伤的影响；(3) Hoechst 33342法观察黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞凋亡的影响；(4)流式细胞技术检测黄芪总苷及黄芪甲苷预处理对活性氧簇(ROS)平均荧光强度的影响；(5) ELISA法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞中抗氧化酶GSH-Px和SOD活性及氧化物MDA含量等的影响；(6)RT-PCR法检测黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞iNOS mRNA的影响。结果：1.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞损伤的影响MTT法结果显示,不同浓度的黄芪总苷及黄芪甲苷(5、10、20、40、80、 100 μg/ml)对PC12细胞不产生毒性作用,也不影响细胞增殖。不同浓度聚集态AP25-35 (2.5、10、20、40μM24 h后,细胞存活率均明显下降,10 μM Aβ25-35作用24 h细胞存活率下降为65%,以此作为PC12细胞损伤的最佳作用浓度。黄芪总苷各浓度均能明显增加Aβ25-35诱导的PC12细胞存活率下降,与模型组相比,不同浓度黄芪甲苷5、 10、 20、40、80 μg/ml)均能显著增加PC12细胞存活率(P<0.01)。LDH检测结果显示,10 μM Aβ25-35作用24 h PC12细胞上清液LDH释放明显增加,黄芪总苷(5、10、20、40、80 μg/ml)均能显著抑制上清液中LDH释放,黄芪甲苷(5、1O、20、40、80 μg/ml)也能明显抑制PC12细胞上清液中LDH释放·(P<0.01)。2.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞凋亡的影响Hoechst33342染色结果显示,与对照组相比,10 μM AP25-35作用24 h后细胞内凋亡小体明显增加,核固缩现象明显；与模型组相比,黄芪总苷10、40μM预处理能明显减少细胞凋亡,核固缩现象明显减少,黄芪甲苷10、40μM预处理也能明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡3.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞氧化应激损伤的影响ELISA结果显示,与对照组相比较,10 μM Aβ25-35作用24 h后,PC12细胞内抗氧化酶GSH-Px和SOD活力明显下降(P<0.01),黄芪总苷各浓度(5、10、20、40、80μM)均能明显增加GSH-Px和SOD活力,黄芪甲苷各浓度(5、10、20、40、80 μM)也能显著抑制GSH-Px和SOD的活力下降(P<0.01)。Aβ25-35诱导PC12细胞MDA含量增加,与模型组比较,黄芪总苷预处理抑制PC12细胞损伤后MDA的释放,黄芪甲苷预处理也能显著降低MDA的含量(P<0.01)。4.黄芪总苷及黄芪甲苷对PC12细胞iNOS RNA表达的影响RT-PCR结果显示,10 μM Aβ25-35作用24 h诱导PC12细胞iNOS mRNA表达显著上调,与模型组相比,黄芪总苷(10、40μM)预处理均显著抑制PC12细胞iNOS mRNA表达,黄芪甲苷(10、40μM)也能明显降低PC12细胞iNOS mRNA表达(P<0.01)。结论：Aβ25-35诱导PC12细胞活性明显降低,LDH释放增加,细胞凋亡和氧化应激增加。黄芪总苷及黄芪甲苷通过抑制PC12细胞活性降低和LDH释放增加,抑制细胞凋亡、氧化应激增加而发挥保护作用；Aβ25-35诱导PC12细胞iNOS表达上调也被黄芪总苷及黄芪甲苷所抑制。第三部分黄芪主要有效成分对H202诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用研究目的：为进一步验证黄芪主要有效成分黄芪总苷及黄芪甲苷的抗氧化作用,该部分旨在检测在神经元细胞株PC12细胞中,观察黄芪总苷及黄芪甲苷对H202诱导PC12细胞损伤的作用,并初步比较两者的抗氧化效果。方法：在体外培养的PC12细胞中,加入300 μM H2O2作用不同时间观察细胞活力的变化时相,确定H202损伤PC12细胞模型的最佳作用条件。给予黄芪总苷及黄芪甲苷预处理,采用MTT法和LDH检测反映PC12细胞存活率和LDH漏出率的变化,比较黄芪总苷及黄芪甲苷的作用效果差异。300 μM H2O2作用时间为4h时,
关键词: 阿尔茨海默病 ；β-淀粉样蛋白 ；学习记忆 ；黄芪 ；氧化应激 ；凋亡 ；细胞凋亡 ；β-淀粉样蛋白 ；PC12细胞 ；诱导型一氧化氮合成酶 ；PC12细胞 ；乳酸脱氢酶 ；H2O2
摘要： 阿尔茨海默病是老年人中最常见的神经退行性病。该病的主要病理学特征为脑内神经元斑块沉积和神经原纤维缠结,并引发神经突触和脑内神经元缺失。随着世界人口的老龄化加剧,阿尔茨海默病的发病率日趋上升,已成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一,然而,目前尚不清楚神经元退变损伤的分子机制,临床上对阿尔茨海默病亦缺乏有效地治疗手段。
研究表明,p-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Ap)的沉积是阿尔茨海默病的始发因素和关键环节,是脑内神经元纤维缠结、神经元丢失的直接因素。Aβ可导致神经元损伤,诱导细胞凋亡。因此,降低Ap细胞毒性、抑制Ap异常沉积已成为研究阿尔茨海默病发病机制,寻找治疗方法的关键点。近年来有关中药治疗阿尔茨海默病的研究越来越多。白藜芦醇是一类广泛存在于葡萄、虎杖等植物中的多酚类化合物。具有抗氧化、抗炎症、抗癌及抗衰老等作用。最近的研究发现,白藜芦醇对H2O2、MPP、Aβ及6-羟多巴胺诱导的神经元损伤中都有一定的保护作用,并能够有效延缓阿尔茨海默病和亨汀顿舞蹈症的认知、学习、记忆与行为功能障碍。白藜芦醇对神经元的保护作用已经引起神经科学家的广泛关注。
白藜芦醇可以通过调控多个基因和信号通路而发挥神经保护的作用。研究发现,白藜芦醇能诱导沉默信号调控因子(Silence signal regulating fator1, SIRT1)的高表达,从而引起一系列信号通路的改变。SIRT1是沉默信号调控因子sir-2的同源物,它参与基因转录、延长复制周期、能量代谢及延缓细胞衰老等生物过程。在阿尔茨海默病模型大鼠研究中发现,大鼠脑内SIRT1高表达能增强淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的非淀粉样蛋白分解途径,减少Aβ的沉积。
在SIRT1对阿尔茨海默病的保护机制研究中发现,SIRT1转基因小鼠来源的原代神经元中,β-淀粉样蛋白含量减少,同时ROCK1的表达降低。以往的研究也发现,ROCK1能够调节α-蛋白激酶活性,与淀粉样前体蛋白的代谢有关。这说明SIRT1增强α-分泌酶介导的APP非淀粉样蛋白途径可能部分通过ROCKl通路,然而,SIRT1与ROCK1之间的调控关系以及二者在白藜芦醇对抗Aβ诱导神经元损伤中的作用并不清楚。
基于以上的研究,为探讨白藜芦醇对Aβ25-35毁损神经元的保护作用,并探讨SIRT1和ROCKl在该过程中的作用机制,我们设计了本项实验：(1)选用PC12细胞作为神经元培养模型,加入不同浓度的Aβ25-35,观察Aβ25-35对PC12细胞的损伤情况;(2)在Aβ25-35毁损PC12细胞的培养基内加入不同浓度的白藜芦醇,通过MTT和LDH检测,观察白藜芦醇对Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用,并分析筛选出其最佳保护浓度；(3)通过Hoechst33342/PI双染、流式细胞术及细胞内钙离子浓度检测分析白藜芦醇对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡情况的影响；(4)为进一步探讨探讨白藜芦醇发挥神经保护作用的分子机制,我们应用RT-PCR和Western blot技术检测了SIRT和ROCK1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化；(5)应用尼克酰胺(SIRT1的抑制剂)和Y-27632(ROCK1的抑制剂)处理PC12细胞,进一步明确SIRT1及ROCK1在白藜芦醇对抗Aβ25-35毁损PC12细胞中的作用及二者之间的调控关系。
本实验的研究结果显示,
(1)给予10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L的Aβ25.35毁损PC12细胞,可见细胞的突起从远端开始崩解、碎裂。随着Aβ25-35浓度的升高,PC12细胞毁损逐渐加重。MTT结果显示细胞活性与Aβ25-35浓度呈负相关。在Aβ25-35的三个浓度组中,20μmol/L浓度伤易于观察与检测,作为后续实验中细胞损伤的选用浓度。在A825-35毁损前2h,给予12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L四个浓度的白藜芦醇预孵育PC12细胞,经细胞生长观察及MTT. LDH细胞活性分析,各浓度组均呈现明显的保护作用(P<0.01),其中50μmol/L白藜芦醇保护组的保护作用强于其他浓度组(P<0.01),选为研究白藜芦醇保护作用的使用浓度。
(2) Hoechst33342/PI双染结果显示,白藜芦醇保护组的细胞凋亡率明显低于Aβ25-35损伤组(P<0.01)；流式细胞术检测结果显示,白藜芦醇能够有效地同时抑制Aβ25-35诱导的早期凋亡和晚期凋亡(P<0.01)；细胞内钙离子浓度检测结果显示,Aβ25-35损伤组细胞钙离子荧光强度较空白对照组明显增强,钙离子浓度显著升高,给予白藜芦醇保护以后,钙离子荧光强度较Aβ25-35损伤组明显减弱(P<0.01)。
(3) RT-PCR和Western blot的结果均显示,AP25-35抑制SIRT1的表达,同时增强ROCK1的表达(P<0.01),给予白藜芦醇后,可明显增加PC12细胞SIRT1表达,降低ROCK1表达(P<0.01)。为进一步明确SIRT1及ROCK1的作用及调控关系,本实验应用了SIRT1的抑制剂尼克酰胺和ROCK1的抑制剂Y-27632,结果显示,尼克酰胺显著地抑制SIRT1的表达并激活ROCK1的表达(P<0.01)；Y-27632明显抑制ROCK1的表达(P<0.01),而对SIRT1的表达几乎没有影响。以上数据说明,ROCK1是SIRT1下游的一个信号分子,并且受SIRT1的负调控。
本项研究表明,白藜芦醇通过激活SIRT1进而抑制其下游信号分子ROCK1,对抗β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡,发挥神经保护作用。SIRT1-ROCK1信号通路在阿尔茨海默病的病理机制中起着重要的作用。
关键词: 白藜芦醇 ；β-淀粉样蛋白 ；细胞凋亡 ；SIRT1 ；ROCK1
被引量
7
摘要： 阿尔兹海默症（Alzheimer Diseases,AD）是最普遍的神经退行性疾病,病理学特点主要是细胞外由β-淀粉样蛋白（Aβ）寡聚物沉积斑及Tau蛋白神经纤维缠结以及记忆衰退。虽然导致AD神经元死亡的基本生化和分子机制尚未明确,但是氧化应激与AD的发病机制密切相关。纳米材料作为新型载体材料,具有无毒、粒径小、无免疫原性等优势,可以负载小分子药物突破血脑屏障治疗AD等神经损伤疾病。鉴于此,我们以安全无毒的壳聚糖为原料,将其负载水溶性维生素E类似物Trolox形成壳聚糖-Trolox纳米颗粒（CS-Trolox NPs）。我们以H2O2诱导稳定转染人早老素突变体APPsw质粒的SH-SY5Y细胞株建立AD细胞模型,探讨上述CS-Trolox NPs对神经细胞氧化应激损伤的保护效果及相关机制,具体结果如下:1.CS-Trolox NPs的制备、表征和生物相容性利用H2O2及机械超声的方法,将大分子CS氧化降解为小分子量CS,加入环氧乙烷对其进行羟乙基化修饰,通过自组装得到水溶性壳聚糖纳米颗粒,并通过疏水作用负载Trolox形成CS-Trolox NPs。形态表征证明粒径均匀,约为30nm;高浓度（1mg/m L）CS孵育细胞24h并未对细胞存活率产生影响,证明其生物相容性良好;包裹Trolox后水合粒径大于包裹前,显示Trolox被成功负载进入CS内部;CS-Trolox NPs在水中溶解度比单体Trolox提升了27倍,体现出其生物利用度的提升,以及对Trolox的高负载率。2.建立H2O2诱导APPsw细胞产生氧化应激损伤的AD细胞模型我们使用加入H2O2的方法来模拟AD脑中神经细胞的氧化应激损伤,建立AD细胞模型。综合选定80μM H2O2处理细胞6h这一条件作为随后药物保护实验的主要损伤条件。3.CS-Trolox NPs对H2O2诱导神经细胞损伤的保护效果用H2O2处理细胞后加入CS-Trolox NPs 48h可以明显保护细胞的氧化应激损伤,而单体Trolox基本没有效果。具体表现在,提高细胞存活率、改善细胞形态、减少细胞凋亡水平、维持线粒体膜电位、降低细胞内ROS水平、降低Aβ1-40的分泌、提高线粒体凋亡通路相关蛋白Bax/Bcl-2表达水平比例、降低活化的Caspase-3蛋白水平及其底物PARP的活化程度。
关键词: 阿尔兹海默症 ；纳米载体 ；壳聚糖-Trolox纳米颗粒 ；氧化应激 ；细胞凋亡
被引量
2
摘要： 目的:1.研究肉苁蓉苯乙醇苷对APP/PS1双转基因AD模型小鼠行为和学习记忆能力的影响。2.考察肉苁蓉苯乙醇苷对AD模型小鼠Aβ聚集的影响。3.探讨肉苁蓉苯乙醇苷经胰岛素信号转导通路拮抗AD的作用机制。4.优化构建基于Aβ假说和氧化应激假说的2种AD体外细胞模型,验证肉苁蓉苯乙醇苷对其损伤的保护作用。方法:1.采用APP/PS1双转基因小鼠及同窝野生型C57小鼠为在体实验研究平台,将转基因小鼠随机分为正常组,模型组,多奈哌齐组（剂量为0.65 mg/kg）,肉苁蓉苯乙醇总苷高、中、低剂量组（剂量分别为250、125、62.5 mg/kg）,肉苁蓉毛蕊花糖苷剂量组（125 mg/kg）,每组10只,于6月龄时对小鼠分别实施灌胃治疗,连续给药3个月,模型组和正常组给予等体积双蒸水。运用纸巾筑巢法、Morris水迷宫法和跳台法检测模型小鼠行为和学习记忆能力,评价肉苁蓉苯乙醇苷对AD模型小鼠认知功能的影响。2.采用HE染色法观察脑部海马病变,免疫组化法和Western-blot法检测关键靶标Aβ1-42和Aβ1-40蛋白表达,推断肉苁蓉苯乙醇苷对APP/PS1双转基因小鼠Aβ的影响。3.运用免疫组化法和Western-blot法,考察肉苁蓉苯乙醇苷对胰岛素信号通路中InR、IRS-1、IGF-1R、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等上下游相关蛋白表达水平的影响,从而评价其对胰岛素信号通路的调节作用。4.以PC12细胞为模型载体,选择神经毒性最强的Aβ1-42蛋白片段和最具代表性的H2O2作为诱导因素优化构建2种AD离体实验研究模型,采用MTT法测定细胞存活率,酶标法测定LDH渗漏率,TBA法测定MDA含量,考察肉苁蓉苯乙醇苷对模型损伤的保护作用。结果:1.筑巢实验结果表明,与模型组相比,肉苁蓉苯乙醇苷给药组随剂量的增加,小鼠筑巢分数显著提高。Morris水迷宫结果显示,与模型组相比,肉苁蓉苯乙醇苷干预组小鼠逃避潜伏期明显缩短,目标象限滞留时间明显增加（p<0.05）,小鼠游泳轨迹则多呈直线型或趋向型,小鼠穿越平台次数明显增加（p<0.05）。跳台实验结果发现,与模型组相比,肉苁蓉苯乙醇苷给药组小鼠跳台错误次数显著降低（p<0.05）。2.肉苁蓉苯乙醇苷能够改善APP/PS1双转基因小鼠海马神经元的损伤;免疫组化结果表明,与模型组相比,多奈哌齐组、肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组和毛蕊花糖苷干预组小鼠海马CA1区Aβ1-42、Aβ1-40阳性细胞数显著减少（p<0.05）;Western-blot法结果表明,各蛋白表达结果与免疫组化结果相符。3.免疫组化结果表明,与模型组相比,多奈哌齐组、肉苁蓉苯乙醇苷干预组小鼠海马CA1区InR、IRS-1、IGF-1R阳性细胞数显著减少（p<0.05）。Western-blot结果表明,与模型组相比,多奈哌齐组、肉苁蓉苯乙醇苷干预组小鼠海马CA1区InR、IRS-1、IGF-1R蛋白表达量明显下调（p<0.05）,PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达量明显上调（p<0.05）。4.Aβ1-42损伤模型最佳损伤条件为0.5μM造模浓度损伤48 h,H2O2损伤模型最佳损伤条件为以PBS为溶媒、25μM造模浓度损伤24 h;与模型组相比,肉苁蓉苯乙醇苷干预组可使细胞存活率明显升高,LDH渗漏率减少,MDA含量降低（p<0.05）。结论:1.肉苁蓉苯乙醇苷能够明显改善APP/PS1双转基因模型小鼠的认知功能障碍。2.肉苁蓉苯乙醇苷通过减少模型小鼠海马中Aβ1-42、Aβ1-40的生成,从而影响Aβ级联反应以保护神经元,发挥拮抗AD的作用。3.肉苁蓉苯乙醇苷通过调控通路上游及下游关键靶点,改善胰岛素信号通路转导障碍,调节脑能量代谢,最终发挥神经保护作用。本研究从细胞分子水平、整体动物层面探讨了肉苁蓉苯乙醇苷抗AD具体作用机制,为开发以苯乙醇苷为母核结构的肉苁蓉抗AD新药奠定研究基础。4.2种AD离体实验模型各有优劣,肉苁蓉苯乙醇苷表现出明显的损伤保护作用,印证β-淀粉样蛋白和氧化应激两大经典AD学说的同时,表现出潜在的抗AD活性。
关键词: 肉苁蓉苯乙醇苷 ；APP/PS1双转基因小鼠 ；AD ；Aβ ；胰岛素信号通路
被引量
2
摘要： 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年痴呆症，是老年期痴呆症最常见的类型。AD临床表现为进行性记忆障碍，认知功能损伤，以及日常生活能力减退，同时可伴有幻觉、妄想、行为紊乱、人格异常等多种精神症状和行为障碍。AD常发生于65岁以上的老年人，发病率随年龄增长而迅速增加。据世界卫生组织统计，目前全球以AD为主的痴呆症患者约有3560万，并以每年770万的速度递增；预计到2050年，每85人中将有1人罹患此病。因此，对AD进行有效的预防和治疗不仅为医学界所重视，同时也倍受全社会的关注。AD典型病理改变为细胞外β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）过度沉积形成老年斑（senile plaque，SP），胞内Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT），以及弥漫性神经元变性、缺失和全脑萎缩。在AD病例中，家族遗传性病例约占5%，其他绝大部分散发病例的致病机理尚不明确。研究认为，AD与Aβ过度沉积、Tau蛋白异常修饰、早老素（presenilin，PS）基因突变等有关。其中，Aβ作为AD发病始动因子的观点得到广泛认可，即：淀粉样蛋白斑块的主要成分Aβ在AD发生过程中发挥至关重要的作用。Aβ是淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经过β-分泌酶（BACE-1）和γ-分泌酶（γ-secretase）顺序剪切后的产物。正常情况下，Aβ为可溶解状态，不具有毒性；而在病理状态下，Aβ聚集形成寡聚体、多聚体、原纤维，进一步沉积形成斑块，产生损伤作用。Aβ产生损伤作用的机制包括：引起氧化应激，引发炎症反应，诱导细胞凋亡等。胞外Aβ过量生成、过度沉积是邻近胶质细胞过度活化，神经元死亡，进而导致AD临床症状的主要原因。因此，减轻Aβ的损伤作用是治疗AD的策略之一。 神经甾体（neurosteroid）是中枢神经系统中的甾体类物质及其代谢产物的总称，可由神经元或胶质细胞在中枢神经系统合成，也可由外周腺体合成后通过血脑屏障进入中枢神经系统，神经甾体在脑组织中的含量高于外周血中的含量。神经胶质细胞和神经元合成的神经甾体主要包括：孕烯醇酮（pregnenolone，PREG）、孕烯醇酮硫酸酯（pregnenolone sulfate，PREGS）、脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、脱氢表雄酮硫酸酯（dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS）、孕酮（progesterone，PROG）、别孕烯醇酮（allopregnanolone，ALLO），以及雌二醇（estradiol，E2）等。研究显示，神经甾体具有镇静催眠、抗惊厥、抗焦虑、抗精神分裂症、改善学习记忆，以及神经保护等作用，在中枢神经系统功能调节中发挥广泛作用。研究显示，神经甾体的表达调控改变与包括AD在内的多种神经退行性疾病的发生有关，AD时神经甾体含量及合成代谢酶表达发生改变。对AD患者神经甾体水平变化的研究多为神经甾体水平与AD易患倾向关系的分析研究，其研究对象多为AD患者外周血、脑脊液或尸脑，研究对象来源有限。AD患者血浆或脑组织中神经甾体水平的变化为长时间、多种因素共同作用的结果，而在AD进程中，神经甾体含量的变化与学习记忆能力受损的关系尚不明确。 目的：本研究采用单一损伤因素Aβ25-35诱导AD样学习记忆障碍大鼠模型，通过液液萃取结合高效液相色谱-串联质谱（high performanceliquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）方法分析Aβ损伤大鼠学习记忆相关脑区（前额叶皮质及海马）中主要神经甾体的含量，通过RT-PCR、 Western blot和免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）分析神经甾体合成代谢酶的表达；筛选与学习记忆障碍关系密切的神经甾体，观察其对Aβ损伤大鼠学习记忆能力的改善作用，探讨其学习记忆保护作用的机制。利用原代培养的海马神经元，进一步在细胞水平研究Aβ25-35对海马神经元细胞活力的影响及神经甾体孕酮对抗Aβ损伤的保护作用。本实验为神经甾体尤其是孕酮在AD等学习记忆障碍类疾病中的应用提供理论依据及实验基础。 方法： 1Aβ所致学习记忆障碍大鼠模型的制备 将30只体重210-230g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠随机分为3组，分别为：假手术组、溶剂对照组（假手术+蒸馏水）、以及Aβ损伤组，每组10只。Aβ损伤模型制备方法如下：动物经腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，沿颅骨中线切开皮肤，暴露前囟。参照图谱海马CA1区位置，于前囟后3.5mm，中线左右2.0mm处，开直径1mm的骨窗，垂直颅骨表面进针2.7mm，缓慢注入5μL（2g/L）Aβ25-35溶液，留针10min使注射物充分扩散，缓慢撤针，缝合切口。溶剂对照组注入等体积蒸馏水。术后7天-12天进行Morris水迷宫行为学测试，观察大鼠空间学习记忆能力。行为学测试结束后，动物经多聚甲醛心脏灌流进行预固定，之后取脑组织，外固定，石蜡包埋，制备病理切片，通过硫堇尼氏体染色进行组织病理学分析。 行为学测试：术后7天-12天进行Morris水迷宫（the Morris watermaze）行为学测试。实验开始前将动物置于行为学测试房间，使其适应环境1h。行为学测试于每天14:30开始，室温25℃，水温22℃-24℃，动物测试顺序保持不变，测试开始象限随机选取。Morris水迷宫行为学测试历时6天，前5天进行定位航行实验（the navigation trial），每天训练4次。记录大鼠入水至寻找到隐匿平台所需的时间，即逃避潜伏期（escapelatency）。第6天进行空间探索实验（the probe trial），撤去平台，将大鼠从平台相对的象限面壁放置入水，记录动物90s内穿越平台区的次数（number of platform crossings）以及在平台所在象限（第四象限）停留的时间百分比（Ⅳ time ratio）等行为学指标。 组织病理学分析：预固定的脑组织经4%多聚甲醛固定至少48h，石蜡包埋，常规脑组织切片（5μm），硫堇尼氏体染色观察海马组织学改变。选取相同海马截面的切片进行硫堇尼氏体染色。每张切片随机选取CA1区3个400倍视野，计数海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片海马各计数3个区段取平均数。 2Aβ损伤大鼠学习记忆相关脑区（前额叶皮质及海马）神经甾合成代谢的改变 将90只体重210-230g雄性SD大鼠随机分为3组，分别为：假手术组、溶剂对照组、以及Aβ损伤组，每组30只。动物处理同上。分别于术后7天及12天断头处死每组中的10只动物，迅速取脑，冰浴分离前额叶皮质及海马，-70℃存放，通过HPLC-MS/MS分析神经甾体孕烯醇酮、孕酮、别孕烯醇酮、及17β–雌二醇的含量；其余动物于术后12天取材，每组中的5只动物断头处死，迅速取脑，冰浴分离海马，-70℃存放，通过RT–PCR及Western blot分析神经甾体合成代谢酶CYP11A1、3β-HSD及aromatase的表达改变；其余动物经多聚甲醛心脏灌流进行预固定，之后取脑组织，外固定，石蜡包埋，制备病理切片，通过免疫组化分析神经甾体合成代谢酶aromatase的表达改变。 神经甾体提取：参考本实验室已有方法略加改进，通过液液萃取提取神经甾体。脑组织样品（双侧海马组织或前额叶皮质）加入PBS及MT（内标），制备组织匀浆。乙酸乙酯/正己烷（9:1）萃取3次，转移并合并有机相，50℃水浴下N2吹干；60℃水浴中用丹酰氯衍生40min，离心后取上清，4℃保存。 神经甾体含量测定：色谱条件：色谱柱Agilent XDB C18分析柱（4.6mm×50mm）；保护柱Agilent XDB C18（4.6mm×12mm）；柱温40℃；流动相：A水（含0.1%甲酸），B甲醇（含0.1%甲酸）；流速：0.5mL/min；洗脱梯度：0-6.5min，36%A；6.5-6.6min，30%A；6.6-17min，10%A；17-18min，36%A。进样量30μL，每针运行18min。质谱条件：离子化方式：大气压化学离子源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）；喷雾电压：4500V；鞘气（N2）压力：30L/min；辅助气（N2）压力：5L/min；离子检测方式：正离子多反应监测；用于定量分析的离子反应分别为：(m/z)299.03→(m/z)158.86、280.9（PREG），(m/z)315.03→(m/z)97、109.01（PROG），(m/z)301→(m/z)188.9、282.85（ALLO），(m/z)254.97→(m/z)132.9、158.9（17β-E2），(m/z)303.1→(m/z)97.04、109.06（MT）。 RT-PCR：按照Invitrogen公司产品手册，采用TRIzol一步法，提取组织总RNA。每50-100mg脑组织加入1mL TRIzol试剂，匀浆器内冰浴研磨、裂解组织。将裂解液移至0.1%DEPC处理并高压灭菌的1.5mL离心管中，加入0.5mL氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育，离心，静置，加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置，离心，弃上清，75%乙醇洗沉淀，室温晾干，20μL DEPC水溶解。按照Promega逆转录试剂盒说明，取等量组织总RNA，70℃水浴10min，之后迅速置于冰上；加入逆转录体系各组分，涡旋混匀，瞬时离心，42℃孵育1h，合成cDNA，95℃加热3min终止反应。参考Genbank中mRNA序列设计引物，以反转录产物为模板，进行PCR扩增。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像。凝胶成像分析软件进行相对定量分析。 组织总蛋白提取与Western blot分析：组织加入RIPA裂解液，制备组织匀浆。离心取上清（即蛋白提取液），分装，-20℃保存。以牛血清白蛋白为标准物，采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒进行蛋白定量。取等量蛋白提取液，RIPA裂解液补齐体积，与5×SDS上样缓冲液混合，沸水浴加热使蛋白变性，冷却后上样。稳压电泳，溴酚蓝移动至凝胶底部时，停止电泳。切去浓缩胶，剪取与凝胶相同大小的PVDF膜，甲醇活化后，与滤纸、凝胶一起浸入转膜缓冲液，平衡15min。依次放置滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸，20V恒压半干转膜。将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TTBS中，37℃封闭2h。之后进行一抗结合反应，4℃缓慢摇动过夜。洗膜后，进行二抗结合反应。洗膜后，用化学发光试剂盒检测PVDF膜上抗原抗体结合区带。凝胶成像分析软件进行相对定量分析。 免疫组织化学染色分析：脑组织标本经4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脱水，石蜡垂直定向包埋，5μm厚度连续切片。SP三步法进行免疫组织化学染色，即：石蜡切片脱蜡至水，微波抗原修复，自然冷却；滴加H2O2去离子水，室温孵育10min，消除内源性过氧化物酶影响；PBS冲洗，滴加山羊血清工作液，封闭非特异结合位点；倾去血清，滴加以PBS适当比例稀释的一抗，4℃过夜；PBS冲洗，滴加生物素化二抗工作液，室温孵育15min，PBS冲洗；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min，PBS冲洗；滴加DAB试剂显色，镜下控制显色时间，自来水冲洗终止反应；苏木精复染，常规脱水、透明、封片。阴性对照以PBS替代一抗，其余步骤同上。显微镜下随机选取3个视野，计数阳性细胞数。以细胞中出现棕褐色浓染颗粒作为阳性细胞的判定标准。 3孕酮对Aβ损伤大鼠行为学及组织病理学改变的影响 将50只体重210-230g雄性SD大鼠随机分为5组，分别为溶剂对照组（假手术+蒸馏水）、Aβ损伤组、以及Aβ损伤+孕酮低、中、高剂量保护组。溶剂对照组大鼠双侧海马CA1区注射5μL蒸馏水，其余组大鼠注射5μL（2g/L）Aβ25-35溶液，
关键词: 阿尔茨海默病 ；β-淀粉样蛋白 ；神经甾体 ；水迷宫 ；学习记忆 ；高效液相色谱-串联质谱 ；孕酮 ；TNF-α ；IL-1β ；神经保护
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