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摘要： 运用多种色谱技术,对人工打洞沉香乙醇提取物的正丁醇相进行化学成分分离,并根据波谱数据结合理化性质共鉴定了7个单体化合物的结构,分别为selina-3,11-dien-9,15-diol(1)、aquilarone D(2)、5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(2-hydroxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone(3)、6,7-dimethoxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]chromone(4)、syringin(5)、顺式对羟基肉桂酸甲酯(6)和4'-甲氧基肉桂酸(7),其中化合物1为新的倍半萜类化合物,化合物5~7为首次从沉香中分离得到。生物活性测试结果表明化合物6,7对全齿复活线虫具有较好的致死活性,化合物4,6,7对人肝癌细胞株BEL-7402、人胃癌细胞株SGC-7901和人肺癌细胞株A549的生长有不同程度的抑制作用。
关键词: 沉香 ；正丁醇相 ；倍半萜 ；生物活性
被引量
25
摘要： 沉香是沉香属或拟沉香属植物含有树脂的木材,是名贵药材和天然香料,主要产于东南亚及南亚地区和中国南方省区。其中,海南沉香气味典雅、香味悠长,是世界公认最优质的沉香,具有极高的经济价值。随着市场对海南沉香需求的不断增长,其他产地沉香冒充海南沉香的现象日趋严重。采用传统的标志化合物鉴定沉香产地的方法存在结果不直观和不精准的缺点,而机器学习分类方法是一系列专门用于区分样本种类的计算机数学模型,在基于化学成分的药用植物产地、种类和品质鉴定中有着广泛的应用,其鉴定速度快捷,结果直观且精准。因此,本研究拟采用基于沉香特征性化学成分的机器学习分类模型用于海南沉香的产地区分。
首先,为完善研究组含有179个沉香特征性物质的质谱数据库,以便后续对各产地沉香进行更加全面的气相-质谱联用(GC-MS)分析,从而得到可用于构建机器学习分类模型的数据集。本研究对各产地沉香中分离得到的70个特征性化合物进行了系统的结构鉴定,从国产打洞沉香中鉴定了13个5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮(1-13)和11个2-(2-苯乙基)色酮二聚体(14-24),从斯里兰卡瓦拉沉香中鉴定了30个倍半萜(25-43和46-56)和2个2-(2-苯乙基)色酮二聚体(44和45),从印度尼西亚丝沉香中鉴定了12个2-(2-苯乙基)色酮(57-68)和2个2-(2-苯乙基)色酮二聚体(69和70)。上述特征性化合物作为标准品补充了沉香特征性物质质谱数据库,为各产地沉香的GC-MS分析奠定了基础。
其次,采用GC-MS分析了海南、柬埔寨、马来西亚及泰国等不同产地56份沉香样品,共鉴定出315个化合物,其中包括2-(2-苯乙基)色酮8个、倍半萜130个,其他为简单芳香类化合物和链状烃类化合物。由GC-MS结果发现,海南沉香中2-(2-苯乙基)色酮类化合物的种类更多,但平均相对含量略低,而倍半萜的相对含量及数量均高于其他产地沉香。该研究结果为区分海南沉香提供了科学依据。
最后,在上述GC-MS分析得到的数据集基础上,建立了正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)模型,通过变量投影重要性(Variable Importance in Projection,VIP)及p值筛选出了用于区分海南沉香与其他产地沉香的差异化合物,并利用差异化合物组成正交偏最小二乘法降维(Orthogonal Partial Least Squares Regressio Dimension Reducing,ODR)数据集,进一步在GC-MS数据集和ODR数据集的基础上构建了正交偏最小二乘回归(Orthogonal Partial Least Squares Regression,OPLSR)、逻辑回归(Logistic Regression,LR)、支持向量机(Support Vector Machine,SVM)、决策树(Decision Tree,DT)、随机森林(Random Forest,RF)、人工智能神经网络(Artificial Neural Networks,ANNs)等6种常见机器学习分类模型。随后,通过交叉验证对不同分组模式下测试集的二元分类评判参数:F1,准确度,精确度和召回率等进行计算,并依此评判两种情况下各种模型在不同分组模式下的分类效果。在进一步考虑搭建各种分类模型的耗时情况之后,发现建立于ODR数据集之上的RF及ANNs是可以用于快速区分海南与其他产地沉香的最佳机器学习分类模型。
综上,在对70个沉香特征性成分进行结构鉴定并完善沉香特征性物质质谱数据库的基础上,对海南、柬埔寨、马来西亚及泰国产56个沉香样品进行GC-MS分析,所得数据集进行OPLS的VIP值和p值筛选降维得到ODR数据集后,构建了用于区分海南沉香与其他产地沉香的RF和ANNs最佳机器学习分类模型,可用于区分海南与其余产地沉香。这是机器学习分类方法首次在海南沉香产地区分研究中系统性的应用。
关键词: 海南沉香 ；化学成分 ；2-(2-苯乙基)色酮 ；倍半萜 ；GC-MS ；机器学习分类
摘要： 沉香为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)植物受伤后所产生的含树脂的芯材,且市场价值极高、历史悠久、用途广泛,是中国和东南亚国家的珍贵药材和天然香料。沉香因为市场需求量大、自身形成缓慢、产量低等原因面临资源枯竭。本次研究对柯拉斯那沉香和国产沉香进行化学成分研究,通过分离鉴定得到结构新颖的单体化合物,以此丰富沉香中化合物的骨架类型,同时也为不同产地、不同来源的沉香的真伪鉴别和质量评价提供参考依据,以期为市场上人工和野生柯拉斯那沉香的开发和利用提供科学理论依据。本研究将柬埔寨柯拉斯那沉香通过乙醇提取、石油醚萃取获得不同极性部位,采用ODS柱色谱、Sephadex凝胶柱色谱及硅胶柱色谱,结合半制备型高效液相等多种色谱分离方法从柬埔寨柯拉斯那沉香中分离得到了16个单体化合物,其中包括个11个2-(2-苯乙基)色酮类化合物(1～11),3个倍半萜类化合物(12～14),2个苯丙素类化合物(15～16)。一共有3个为新化合物,包括2个2-(2-苯乙基)色酮类化合物(2和4),1个倍半萜类化合物(12),利用波谱数据鉴定这16个化合物结构分别为(5S,6R,7S,8S)-2-[2-(4′-methoxyphenyl)ethyl]-6,7-epoxy-5,8-dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone(1)、5,6-环氧-7β-羟基-8β-甲氧基-2-[2-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(2)、Aquilarone I(3)、8-氯-6-羟基-2-[2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)乙基]色酮(4)、Tetrahydrochromone F(5)、(5R,6S,7S,8R)-2-[2-(3′-Hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone(6)、Tetrahydrochromone I(7)、Isoagarotetrol(8)、5,6,7,8-tetrahydroxy-2-hydroxy-4-methoxyphenethyl)-5,6,7,8-tetrahydro-4H-chromen-4-one(9)、(5R,6S,7S,8R)-2-[2-(4′-Methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone(10)、8-chloro-5,6,7-thihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenethyl)-5,6,7,8-tetrahydro-4H-chromen-4-one(11)、Baimuxinal A(12)、(rel)-4β,5β,7β-eremophil-9-en-12,8α-olide(13)、15-hydroxyl-12-oxo-α-selinen(14)、Dihydroferulic acid methyl ester(15)、3-羟基-4-甲氧基-苯丙酸甲基酯(16)。对已分离鉴定的化合物进行生物活性测试,结果显示化合物3和9表现出了一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性。同时将国产人工打洞沉香通过乙醇提取、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得不同极性部位,采用ODS柱色谱、Sephadex凝胶柱色谱及硅胶柱色谱,结合半制备型高效液相等多种色谱分离方法最终使2个新的2-(2-苯乙基)色酮聚合物从国产人工打洞沉香中分离得到,利用波谱数据鉴定其结构将其命名为:(+)-3′,3′′′-dihydroxy-4′,4′′′-dimethoxyaquisinenone G(1)、(5α,6β,7α,8β)-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯)乙基]-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢-8-{6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮-7-氧}色酮(2)。对已分离鉴定的化合物进行生物活性,测试结果显示化合物1具有一定的DPPH自由基清除率。
关键词: 柯拉斯那沉香 ；国产沉香 ；2-(2-苯乙基)色酮 ；2-(2-苯乙基)色酮类聚合物 ；生物活性
被引量
2
摘要： 沉香(agarwood)是沉香属(Aquilaria Lam.)或拟沉香属(Gyrinops Gaertn.)植物形成的含树脂木材,作为传统名贵香料和珍稀药材,具有极高的经济价值。旺盛的需求和野生资源的濒危使得人工种植沉香树和寻求高效调控结香手段已成为必然趋势。沉香的形成是沉香树受到伤害等逆境胁迫后,抵御伤害的物质形成、积累、转化的过程。此过程中,沉香特征性成分的变化动态以及沉香的形成是否与矿质营养存在协同关系有待进一步研究。本研究在探讨白木香打洞结香过程中沉香特征性成分动态变化规律的基础上,明确沉香能量物质、营养元素代谢与沉香形成的关系,从营养元素的角度出发进行白木香结香调控,以期指导沉香高效生产技术创制。以4年树龄热科2号白木香植株为试验材料,通过测定打洞结香过程中沉香特征性成分、能量物质和营养元素动态变化,探讨沉香特征性成分形成的机制,同时通过营养元素单施、混施试验,探究白木香结香与营养元素的关系。研究结果如下:1.结香后一年内,沉香由黄褐色向黑褐色转变,乙醚得率呈上升趋势,且在结香6个月时达到10.53%,12个月时乙醚提取物得率为18.25%左右。结香1个月后可检测到2-(2-苯乙基)色酮、2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮、2-[2-(3-甲氧基-4-羟基)苯乙基]色酮、2-[2-(3-羟基-4-甲氧基)苯乙基]色酮4个色酮类成分;结香6个月时检测到的色酮类成分最多,达到6种,结香1年后色酮种类平均为4个,色酮类化合物相对含量为92.67%。结香6个月前检测到倍半萜类成分在1种以内,结香6个月检测到倍半萜类成分平均为10.67种,相对含量达到5.50%;结香一年后倍半萜相对含量为3.98%。2.结香过程中,沉香层淀粉和蔗糖含量始终低于白木含量,其淀粉的转化率呈现先上升后下降的趋势,结香6个月的转化率达到高峰,为70.93%。另外,结香1个月后,叶片蔗糖含量显著降低,同时树干中蔗糖含量显著增加,说明结香初期可能能量物质以蔗糖形式从叶片向结香部位转移。而光合测定表明,结香过程中植株叶片光合速率、SPAD值无显著性差异。3.结香过程中,叶片中N、K和Ca元素含量无显著变化,P、Mg和Fe元素含量呈减少的趋势。P元素含量在结香1个月后下降就达到显著水平,而在结香3个月之后均无显著变化。Mg元素同Fe元素一样,在结香3个月到6个月期间其含量下降才达到显著水平。树皮中P和K元素含量在结香1个月时呈现减少趋势,而Ca、Mg、Fe元素含量呈现先增加后减少的趋势。结香9个月后Ca、Mg、Fe元素含量均小于对照组,在结香12个月时,Ca和Mg元素含量显著小于对照组。树干中P、K和Ca元素含量无显著变化,N、Mg和Fe元素含量呈现上升趋势。结香1个月后N元素含量增加达到显著水平,而结香3个月后Mg和Fe元素含量增加才达到显著水平,结香12个月后,N、Mg和Fe元素含量变化均无显著差异。4.沉香产量、品质与营养元素相关性分析表明:沉香中K元素含量与产量之间呈现正相关关系,且达到显著水平;而K和Fe元素含量与乙醚提取物得率呈现负相关关系,但未达到显著水平。5.通过结香时和结香4个月后混合施用营养元素表明:T1和T3处理(结香时混合施用N、P、K大量营养元素)能显著提高沉香产量;而T2、T3和T4处理(结香时及结香期间混合施用Ca、Mg、Fe中微量元素)均能显著提高乙醚得率;沉香特征性成分检测结果表明,T1和T3处理所产沉香的倍半萜类成分相对含量及种类较多,说明结香时需要大量营养元素的补充;总体来说T3处理(结香时施用大量营养元素,结香4个月后补充中微量元素)的结香效果更优于其他处理。6.通过结香时和结香4个月后单一施用营养元素表明,与CK相比,低水平P(3Kg/亩)和低水平Fe(0.6Kg/亩)处理能显著提高产量;中水平Mg(4Kg/亩)和低水平Fe(0.6Kg/亩)处理能显著增加乙醚得率;同时低水平Mg(2Kg/亩)和低水平Fe(0.6Kg/亩)处理后,其倍半萜类成分相对含量和种类相对较多;此外P和Mg元素可能通过影响淀粉转化从而影响乙醚得率。
关键词: 白木香 ；沉香 ；特征性成分 ；营养元素
摘要： 沉香不是植物,而是在沉香植物受伤后产生的含有黑色树脂的具有芳香性气味的芯材,是一种用途广泛、历史悠久的稀有香料和珍贵药材。沉香因其稀有、珍贵和广泛的用途,受到广泛关注。但由于沉香基源植物的不同,结香时间的长短,都会影响沉香的品质,目前还没有完善的快速检测评价体系。本研究对4种不同植物来源的沉香特征性成分进行分离和鉴定,寻找不同基源植物所产沉香的特征差异。同时研究2-(2-苯乙基)色酮类化合物的质谱裂解规律,建立快速鉴定2-(2-苯乙基)色酮类化合物的方法,分析不同结香时间所产沉香中色酮成分的差异。利用多种色谱柱分离技术和波谱结构解析,从国产人工打洞沉香中分离鉴定了18个倍半萜(1～18)和14个2-(2-苯乙基)色酮(19～32),从柯拉斯那沉香中分离鉴定了 5个倍半萜单体成分(37～41)和15个色酮单体成分(33～36,42～52),从柳叶拟沉香中分离鉴定了 14个倍半萜(53,57～69)和9个2-(2-苯乙基)色酮(54～56,70～75),从瓦拉沉香中共分离鉴定了10个倍半萜(76～84)和6个2-(2-苯乙基)色酮(85～90)。通过分析比较,4种不同基源植物所产沉香都含有沉香的特征性共有成分,但也存在差异性的特征性成分。同时,在上述研究结果基础上,对色酮的质谱裂解进行了系统的研究,其质谱裂解规律如下:2-(2-苯乙基)色酮由色酮母核和苄基两部分组成,并以CH2-CH2连接。在MS2裂解时,CH2-CH2键断裂,检测到苄基碎片,出现以下碎片之一:151[C7H5+20CH3]+,137[C7H5+OH+OCH3]+,121[C7H6+OCH3]+和 107[C7H6+OH]+。在无取代时,其母核分子量不同,分别为:268,254,282,250;在MS2裂解时,四氢色酮可裂解产生[M+H-18]+和[M+H-18-18]+、单环氧色酮裂解产生[M+H-18]+和[M+H-28]+、双环氧色酮裂解产生[M+H-28]+、而flidersia类型色酮则只产生色酮母核碎片和苄基碎片。首次分析总结了单环氧色酮和双环氧色酮的质谱裂解规律,并通过质谱规律快速鉴别沉香中的色酮成分。结合2-(2-苯乙基)色酮的质谱裂解规律,采用HPLC-MS技术对不同结香时间的人工打洞沉香中的色酮类化合物进行分析,从中快速鉴定了 56个2-(2-苯乙基)色酮类成分:包括37个flidersia类型的色酮,7个四氢色酮类成分,7个双环氧色酮和5个单环氧色酮。研究结果表明,随着结香时间的延长,单环氧色酮和双环氧色酮的相对百分含量降低,四氢色酮和flidersia类色酮的相对百分含量却增加,其中沉香6种flidersia类色酮成分随着结香时间的增加而增多。研究结果为判断沉香结香时间的长短提供科学参考。
关键词: 沉香 ；化学成分 ；2-(2-苯乙基)色酮类 ；质谱裂解规律 ；快速鉴定 ；特征性差异
摘要： 白木(?)fAquilaria sinensis (Lour.) Gilg为瑞香科Thymelaeaceae沉香属植物,文献报道白木香含有黄酮、萜类、木脂素、甾体等化学成分,具有抗菌、镇痛抗炎、抗肿瘤、利泄、降糖等生物活性。健康的白木香树通过自然因素或人为因素的作用后可形成含有树脂的芯材,即沉香。沉香的主要成分为倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮类化合物,且沉香作为一种传统中药,具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效,可用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症状。
本研究应用多种色谱技术和波谱技术,从白木香树干正丁醇萃取物中分离纯化出16个单体化合物(化合物1～16),根据理化性质和波谱数据(MS, UV, IR, ID,和2D-NMR)鉴定上述化合物的结构,分别为threo-buddlenol C (1), thero-ficusesquilignan A (2), erythro-buddlenol C (3),(±)-buddlenol D (4),(-)-杜仲树脂酚(5),(-)-松脂素(6),5’-甲氧基落叶松脂醇(7),erythro-guaiacylglycerol-β-coniferyl ether (8), threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl ether (9), herpetin (10),(+)-丁香树脂酚(11),curuilignan (12),刺五加酮(13),松伯醇(14),3,4,5-三甲氧基苯酚(15),雪胆甲素(16)。其中化合物1～13均为木脂素类化合物,且化合物1～4为首次从瑞香科植物中分离得到的倍半木脂素类化合物。
本次研究应用多种色谱技术和波谱技术,从人工打洞沉香乙酸乙酯萃取物中分离纯化出38个(化合物17～54)单体化合物,根据理化性质和波谱数据(MS,UV,IR,1D,和2D-NMR)鉴定其结构,分别为8a,12-dihydroxy-selina-4,11-dien-14-al (17),9β-hydroxy-selina-4,11-dien-14-al (18),9β-hydroxy-selina-3,11-dien-14-al (19),9β-hydroxy-selina-3,11-dien-12-al (20),9β-hydroxy-eudesma-3,11(13)-dien-12-methyl ester (21),1,5;8,12-二环氧-愈创木-12-酮(22),4-epi-15-hydroxyacorenone (23),7αH-9(10)-ene-11,12-epoxy-8-oxoeremophilane (24),12,15-dioxo-a-selinen(25),(4αβ,7β,8αβ)-3,4,4α,5,6,7,8,8a-octahydro-7-[1-(hydroxymenthyl)ethenyl]-4a-methylnaphthalene-1-carboxaldehyde (26), eudesmane-1β,5α,11-triol (27),(-)-7βH-eudesmane-4a,11-diol (28), ent-4(15)-eudesmen-11-ol-1-one (29),缬草萜烯醇(30),11-hydroxy-valenc-1(10)-en-2-one (31), neopetasane (32),(1β,4αβ,7β,8αβ)-octahydro-7-[1-(hydroxymenthyl)ethenyl]-1,8a-dimethylnaphthalen-4a(2H)-ol (33),1,5,9-三甲基-1,5,9-环(34),5-羟基-6-甲氧基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(35),6-甲氧基-2-[2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)乙基]色酮(36),5,6-环氧-7β-羟基-8β-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(37),6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基-4-羟基苯基)乙基]色酮(38),5-羟基-6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮(39),6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮(40),6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]色酮(41),6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(42),6,8-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮(43),4’-羟基-6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮(44), oxidoagarochromone A (45),oxidoagarochromone B(46),5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮(47),3-hydroxy-4-methoxy-methyl ester(48),姜油酮(49),对甲氧基苯丙酸(50),正三十二烷醇(51),(20R)-24-ethylcholest-4-en-3-one (52),麦角-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(53),豆甾醇(54)。化合物17-34为倍半萜类化合物,化合物35～46为2-(2-苯乙基)色酮类化合物,其中,化合物17～23,35～37为新化合物。
采用滤纸片琼脂法对上述54个化合物(化合物1～54)进行金黄色葡萄球菌和烟草青枯菌的抑制活性测试,结果显示化合物1,4,20～21,23～26,32,45～46,49对金黄色葡萄球菌和烟草青枯菌均有一定的抑制活性,化合物8,13,17,36,39仅对金黄色葡萄球菌有一定的抑制活性；化合物3,32,53仅对烟草青枯菌有一定的抑制活性；其余化合物对两种菌株均无抑制活性。参照Elmann的方法对化合物17～54进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性的测试,结果显示：化合物20,22～26,28,32,35～37,40,42,44～46对乙酰胆碱脂酶具有一定的抑制活性,其中包括8个倍半萜和8个色酮类化合物。
本次对白木香树干部位进行研究得到13个木脂素类化合物,并结合前人的研究,可知白木香树干的主要化学成分为木脂素和黄酮类；对人工打洞沉香进行研究发现其主要成分为倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮类,与文献报道的沉香主要化学成分类别一致。由此可知,白木香与沉香的化学成分存在明显差别,二者化学成分上的差别可用于区分沉香与白木香,为更好的评价沉香的品质及揭示沉香的结香机制奠定了基础,也为更好地开发利用白木香及沉香资源提供了科学依据。
关键词: 白木香 ；打洞沉香 ；化学成分 ；抗菌活性 ；乙酰胆碱酯酶抑制活性
被引量
10
摘要： 目的:沉香为著名理气止痛珍稀名贵中药,为白木香树干经外界刺激后所形成含树脂部分(俗称结香),长期以来白木香结香存在时间长、产量低、品质差等关键问题,正品沉香市场上长期供不应求,现有的人工刺激结香方法仍不能解决白木香结香的关键问题,同时耗时、耗工。生物诱导法为本团队所研发的一种白木香结香新技术,预试验显示可在短期内达到诱导白木香心材部位通体结香的效果。为进一步完善生物诱导法诱导白木香通体结香新技术,作者开展了系统研究。方法:在五华沉香基地随机选择四年生沉香18株,进行田间试验,分为生物诱导法、火烫法及空白组三组,每组6棵,分别进行刺激试验,观察并记录。刺激6个月后采样、干燥,待用。其他蚁蛀法、断干法、打洞法、霉菌法组沉香样品随机于茂名电白沉香基地采集,供药材质量评价用。分析不同刺激结香方法所得沉香产量,采用《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中沉香项下的各项质量评价指标方法分析不同刺激结香方法所得不同沉香性状、显微、显色及浸出物含量测定鉴别特点,并采用GC-MS法、磷钨酸钼-硫酸锂比色法、HPLC法分析比较其挥发油成分组成特征,总色酮含量及色酮指纹图谱研究。同时,还采用上述方法分析了生物诱导法刺激6个月后所得沉香不同部位性状、显微、显色、浸出物含量以及挥发油成分组成特征,总色酮含量、3种色酮成分含量测定、挥发油及色酮类指纹图谱等研究。采用实时荧光定量PCR法检测HMGR、FPS等7个基因在白木香受到生物诱导法及火烫法刺激6个月内每月的基因表达变化情况,并与每月的沉香相关化学成分含量进行对比分析。对白木香诱导前后的差异蛋白质组学进行了研究,提取生物诱导及火烫诱导前后的白木香总蛋白,运用双向电泳仪对诱导前后总蛋白进行分离,考马斯亮蓝染色,通过Progenesis Same SPots软件处理,寻找到蛋白差异点,运用MALDI-TOF-MS对差异蛋白进行分析、鉴定,并对蛋白质进行功能分析。采用蛋白双向电泳方法分析白木香在生物诱导法与火烫法刺激前后蛋白差异点情况,并进行功能分析,探讨两种方法刺激结香的分子机制。结果:1不同刺激结香方法所得沉香质量评价研究1.1不同刺激结香方法所得沉香初产量与常规鉴别研究田间刺激结香试验结果表明生物诱导组对树体产生较为强烈的刺激而大量落叶、断枝,并重新长叶。生物诱导法组可整段结香,而火烫组仅为受伤洞口附近产香。不同刺激结香方法所得沉香质量差异较大。刺激半年的初产量方面,生物诱导法株产沉香327g,其他刺激结香组产量为10.74～58.41g,且生物诱导法组沉香为树干中间部分整段结香,刺激点附近可形成厚3cm、宽7.5cm、长80cm的主结香带,树干整体结香纵向全长(基部至最高结香处)可达120cm。生物诱导法及火烫法相比其他刺激结香方法获得沉香品质相对较佳。生物诱导法诱导半年所获沉香从性状、显微、显色反应及醇浸出物含量测定方面,均达到药典要求,其醇浸出物含量符合药典规定(≥10%),醇浸出物含量达11.62%,而传统火烫法诱导半年所获沉香含量仅为4.44%,其他方法所获沉香含量均低于4%。生物诱导组及火烫组沉香药材薄层行为均与对照药材相似,且生物诱导组样品薄层行为更接近于对照药材。1.2不同刺激结香方法所得沉香总色酮含量测定沉香对照药材含总色酮含量最高,为19.35±1.06 mg· g-1而白木香白木含总色酮含量最低,仅为为2.33±1.25mg·g-1不同刺激方法总色酮含量差异较大,生物诱导法组样品含量较高,为16.67± 1.35 mg·g 1;火烫法组样品次之,其总色酮含量为8.34±0.64mg · g-1其他组样品色酮含量在3.12±0.83～6.45±1.47mg · g-1范围内。1.3不同刺激结香方法所得沉香GC-MS研究不同刺激结香方法中生物诱导法组及火烫法组样品与对照药材所含沉香特征性成分较多,检出物总相对含量均高于50%。其他刺激结香组所含沉香特征性成分较少,蚁蛀组、断干组、打洞组检出物个数较少,其总相对含量依次为39.92%、37.13%、49.85%。霉菌法检出数量及相对含量均较低,基本同白木。传统人工结香方法中火烫法所含沉香特征成分较多,接近于对照药材;但生物诱导法所结沉香含有倍半萜成分相对含量、个数及芳香族成分相对含量、个数等均更接近对照药材,其总体检出物相对含量及个数与对照药材更相近。1.4不同刺激结香方法所得沉香色酮类成分HPLC指纹图谱研究建立了沉香药材HPLC指纹图谱共用模式,通过对照品指认了 10个共有峰中1个共有峰。相似度评价显示,不同刺激方法所得沉香药材在化学成分的组成上存在较大差异。对照药材与生物诱导法组、火烫法组三组药材中化学成分相似度较高。聚类分析结果显示生物诱导法组与对照药材聚为一类。2生物诱导法诱导结香不同部位的研究2.1生物诱导法刺激结香不同部位的鉴别研究根据实际结香颜色变化情况,将该法刺激6个月所得沉香分为外侧黑色部分(B1部位～B4部位)及内侧棕色部分(Z1部位～Z4部位)。B1部位-B4部位沉香各指标基本相同,Z1部位～Z4部位基本相同,但B部分与Z部分差异较大。醇溶性浸出物含量测定结果显示,B1～B4均达到《中华人民共和国药典》(2010年版一部)沉香项下要求,超过10%,而Z1～Z4均未达标。B1～B4各样品薄层行为一致,且与对照药材基本相同,而Z1～Z4各样品薄层行为一致,但与对照药材相比,仅有3个斑点Rf值一致。2.2生物诱导法刺激结香不同部位总色酮含量测定B1-B4样品总色酮含量较高,为13.78±0.38～16.69±0.35mg·g-1,其中B4部分色酮含量相比B1～B3部分低,为13.78±0.38mg·g-1;而Z1～Z4中色酮含量为1.42±0.05～4.19土0.12mg·g-1 且 Z4 含量最低。2.3生物诱导法刺激结香不同部位GC-MS成分分析B部分倍半萜及色酮两类成分种类丰富,相对含量较高,但B1～B3样品成分较接近,B4部位样品除含沉香特征性倍半萜及色酮类特征成分外,还含有其他芳香族化合物等非沉香特征性成分。Z部分所含多为脂肪酸、直链烷烃类成分,未检测到色酮类成分及其他特征性倍半萜,与B部分差异较大。2.4生物诱导法刺激结香不同部位GC-MS指纹图谱研究生物诱导法刺激所得沉香B部分及Z部分样品相似度皆较高,达到0.8638～0.9605%,0.8596～0.9163。2.5生物诱导法刺激结香不同部位3种色酮成分含量测定不同部位不同色酮含量差异较大。B1～B4样品Aquilarone B、Aquilarone C含量分布规律为B1最高,含量为3.2282及0.9889mg · g-1其次B2、B4,其含量分别为 2.0369 及 0.6527 mg· g-1、1.8024 及 0.3439 mg· g-1 含量最低的为 B3,达到 1.4847及0.3152mg·1-1;CX16为B4最高,含量为7285mg·g-1,其次B3、B1,含量为0.4519及 0.3633 mg·-1,最低的为B2,含量为0.24mg·-1。3生物诱导法结香机制研究3.1生物诱导法刺激结香基因表达研究生物诱导法组中白木香DXS1、HMGR及FPS基因基本为下调表达,且下调幅度较小;而火烫法组白木香此三个基因则明显上调表达,且均在刺激后5个月内明显上调表达,变化幅度较大,其中FPS基因表达上调近100倍,HMGR为30多倍。生物诱导法诱导后ASS1与TPS基因基本可上调表达,ASS1在3个月后表达到最高,随后4至6个月后表达下调;TPS在5个月后开始上调表达,6个月后表达到最高,生物诱导法组该2个基因表达变化幅度不大,跟DXS1、HMGR及FPS相似。而火烫组ASS1及TPS在5个月后突然表达量急剧增大,上调至1000多倍。TPS基因在白木香受到生物诱导法组诱导后,上调幅度比ASS1小,其表达量在5至6个月后达到最大,但总体变化幅度不大。在火烫组中TPS表达情况同ASS1,在刺激5个月后明显上调表达。生物诱导法组白木香受诱导后CHS1表达量水平基本呈下调趋势,总体变化幅度不大,而火烫组CHS1在5个月后其表达上调近600倍。CHI1基因受到生物诱导法诱导后表达量水平变化不大,在3个月后表达达到最高,随后开始下调,而火烫法组白木香CHI1基因在刺激后开始下调,但5个月后表达突然增大至10倍,随后开始下调。3.2生物诱导法诱导结香化学成分及其与基因表达对比研究生物诱导法组沉香乙醚浸出物、倍半萜及色酮类成分的相对含量在前3个月无明显变化,4个月后开始各含量开始增加,随后继续增长,至6月份已经可检测生物诱导法组沉香乙醚浸出物含量为5.13%,倍半萜及色酮类成分相对含量为22.04%及64.41%。同样,火烫法组沉香刺激后前3个月未检出色酮成分,倍半萜成分仅为0.35%,随后4个月后各含量指标开始上升,6个月后可检测火烫法组样品乙醚浸出物含量为1.05%,倍半萜及色酮类相对含量为10.55%及42.02%。同基因表达量对比分析,生物诱导法组除TPS表达量与乙醚浸出物含量、倍半萜及色酮类成分的相对含量趋势为上升外,其他均无较明显的规律。火烫组沉香在基因水平及化学水平所呈趋势较为明显,总体均呈上升趋势,基本一致。3.3生物诱导法刺激所得沉香蛋白双向电泳研究通过对生物诱导法及火烫法刺激所得沉香进行蛋白提取、双向电泳及质谱测定等步骤,在每张蛋白双向电泳凝胶图谱上检测到1500～1900个有效蛋白点,其中三组(生物诱导法组、火烫法组及空白组)两两对比共有903个差异斑点,鉴定成功32个,并进行功能分析,鉴定出的蛋白质功能主要集中在呼吸作用、能量代谢、逆境胁迫、次生代谢、氨基酸合成等方面。结论:1不同刺激方法所获沉香质量差异显著,生物诱导法组所获沉香各项指标均达到药典标准,其质量及产量显著优于其他方法所获沉香。生物诱导法诱导半年所获沉香性状、显微、显色反应及醇浸出物含量均符合药典标准,其薄层行为、总色酮含量、挥发油成分、色酮指纹图谱均最接近于对照药材,聚类分析显示为唯一与对照药材聚为一类者;而其他刺激方法所获沉香醇浸出物含量均远远达不到药典限量标准,其薄层行为、总色酮含量、挥发油成分、色酮指纹图谱、聚类分析等均与对照药材有显著差异。此外,生物诱导法结香产量显著高于其他方法。显然,生物诱导法组所获沉香质量显著优于其他方法者,已达到药典规定的沉香药材标准,且产量显著高于现有方法。2生物诱导法组不同部位沉香质量差异显著,Z部分应为从白木到沉香的过度阶段。通过对生物诱导法所得沉香不同部位进行一般鉴别,发现B部分一般鉴别方法测定后品质较佳,基本同对照药材,但不同部位各指标有所不同,可能由于生物诱导法对于白木香树树干上下不同部位的诱导机制略有不同,或者受到树体蒸腾或输导作用的不同而产生细微差异。Z部分均不符合要求,可能由于采集样品时间仅为6个月,但已为生物诱导法的优化提供依据。通过对生物诱导法所得沉香不同部位B1～4及Z1～4等样品进行总色酮含量测定结果分析,总色酮含量H及Z部分从1～4样本基本依次递减。经GC-MS指纹图谱分析,生物诱导刺激所得沉香B部分及Z部分样品进行相似度评价,根据结果可推测生物诱导法所产沉香上下不同部位(1～4部分)成分差异不大,反映了结香技术成熟可靠。根据HPLC法测定不同部位3种色酮含量结果,发现总体分布规律为B部分中B1或B2色酮含量较高,Z部分中Z1色酮含量最高,其他部位不同色酮含量无明细规律。Z部分仍能检测到3种色酮,其中Z1中Aquilarone B及Aquilarone C含量接近B部分样品含量。对不同部位沉香样品进行HPLC指纹图谱分析,并进行聚类分析,根据聚类分析结果可推测生物诱导法所产沉香上下不同部位(1～4部分)成分差异不大。其中Z部分样品与自然结香沉香聚为一类,可见Z部分在化学成分方面在一定程度上仍有沉香的特点。3不同刺激方法6个月内相关基因表达量差异显著,与有效成分具有一定相关性,蛋白差异点分布不同,提示生物诱导法与传统火烫法结香机制有所不同。通过对不同刺激结香方法诱导后白木香6个月内不同时间点,各有效成分生物合成途径关键酶基因表达量进行测定,
关键词: 白木香 ；生物诱导法 ；基因表达 ；结香机制 ；质量
被引量
6
摘要： 沉香是瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)植物受伤后所产生的含树脂的木材,也是一种历史悠久、用途广泛的珍贵药材和稀有香料。目前市场上野生沉香资源供不应求,因而人工结香技术应运而生,在20世纪70年代左右得到了初步研究和发展,整树结香法和人工打洞法就是其中两种较为成熟的人工结香技术。本研究应用多种色谱技术并结合理化性质和波谱数据,根据2-(2-苯乙基)色酮类化合物(PECs)的薄层色谱特征显色情况和特征紫外吸收曲线从人工打洞沉香中分离鉴定了 38个2-(2-苯乙基)色酮类化合物(1～38)。其中有21个新化合物,即化合物1～5,11～14,18～22,24～30;化合物1～17是5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮(THPECs);化合物18～22是7,8-单环氧-5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮(EPECs);化合物23是双环氧-5,6,7,8-四氢-2-(2-苯乙基)色酮(DEPEC),化合物24～38是fidersia类型的2-(2-苯乙基)色酮(FTPECs)。将上述38个2-(2-苯乙基)色酮类单体化合物,以及课题组前期对沉香的化学成分研究积累的标准品,共65个2-(2-苯乙基)色酮类单体化合物均配制成混合标准样品溶液并按照课题组前期建立的高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)方法进行分析,建立了 2-(2-苯乙基)色酮类化合物的HPLC-MS数据库,从而为沉香样品中2-(2-苯乙基)色酮类化合物的分析奠定了基础。通过整树结香法刺激健康白木香树使之结香,并定期采集样品,运用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和HPLC-MS分析了不同取香时间的10批样品。由GC-MS分析可知,结香样品的挥发性成分中有2-(2-苯乙基)色酮类(PECs)、倍半萜类、脂肪酸/酯类、甾体类和芳香族类化合物。其中PECs为主要成分,在白木香树受伤后的第一个月就检测到了大量的PECs,在结香一年的样品中其总相对含量仍然很高;而沉香中的另一类特征性化合物——倍半萜类成分出现时间相对较晚,且相对含量也较低。对第1至6月、第9月的7批样品以及第12月的3批样品进行HPLC-MS分析,一共检测到64个2-(2-苯乙基)色酮类化合物(PECs),其中有34个化合物根据与标准品匹对或者根据质谱特征及裂解规律确定了结构。通过分别统计分析苄基片段无取代、4,-OCH3取代及3'-OH,4'-OCH3取代的三组PECs在第1～12月间每月样品中的总相对含量之和的变化趋势,推测了 PECs的苄基片段取代类型的演变过程:最先出现的是无取代的苄基片段,其次是4'位被-OCH3取代的苄基片段,然后是3'和4'分别被-OH和-OCH3取代的苄基片段。将2-(2-苯乙基)色酮类化合物(PECs)按照色酮片段的结构特点分为四个类型进行分析发现,FTPECs类型的种类众多,总相对含量最大,其次是THPECs类型,而EPECs和DEPECs类型的数目较少,相对含量也较低。通过计算四组色酮片段不同取代类型的FTPECs在第1～12月间的平均总相对含量之和,发现其大小顺序如下:色酮片段6,7-二甲氧基取代>色酮片段6-羟基取代>色酮片段6-甲氧基取代>色酮片段无取代。对FTPECs的色酮片段和苄基片段的取代基数目随时间推移的变化趋势进行分析,发现FTPECs色酮片段的取代基数目远多于苄基片段,且在结香一年时间内,苄基片段的n/N值(取代基个数与色酮个数的比值)呈上升趋势,而色酮片段的n/N值无明显变化。本次研究在运用柱色谱技术和波谱技术分离鉴定2-(2-苯乙基)色酮类单体化合物并建立标准品数据库的基础上,用GC-MS和HPLC-MS技术对不同时期的结香样品进行分析,揭示了 2-(2-苯乙基)色酮类化合物在人工沉香的前期形成过程中随时间推移的变化规律,从化学成分的角度为深入探讨沉香的结香机理提供思路,也为人工沉香的质量评价提供参考。
关键词: 人工沉香 ；化学成分 ；2-(2-苯乙基)色酮 ；变化规律 ；GC-MS ；HPLC-MS
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