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摘要： 癌症是一大类恶性肿瘤的统称。医学术语亦称恶性肿瘤（malignantneoplasm），为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，造成了世界范围内13％的人类死亡。由于癌症转移性是癌症死亡率居高不下的主要原因，开发潜在的抑制癌症转移的化合物受到科学界极大的关注。地球上的全部动物和植物的80％居住在海洋环境中，因此海洋环境中存在着大量具有神奇的生物及药理活性的天然化合物。截至目前，已经从海洋生物中分离出超过20,000个新的化合物。而海洋藻类，作为海洋生物的重要成员之一，已被视为一个抗肿瘤转移等新型药物的重要来源。
本研究中，我们于2009年在韩国济州岛沿岸采集到韩国附近海域特有的可食性的褐藻Ecklonia Cava，并成功从该藻类中分离提取并鉴定得到phlorotannins类化合物Dieckol 118.78 mg及6,6′-bieckol 172.51mg，并通过相关实验所得结果，发现化合物Dieckol及在低于200μM的时候对人类纤维肉瘤细胞（HT1080）没有表现出显著的细胞毒作用，同时化合物Dieckol及6,6′-bieckol可以有效的抑制抑制HT1080细胞的迁移和侵袭能力，在三维培养条件下Dieckol及6,6′-bieckol可以抑制HT1080细胞突触的产生的数量及其突触的长度，并且这种抑制作用呈现出浓度依赖的特性。实验结果还证明Dieckol及6,6′-bieckol对基质金属蛋白酶-2和-9有明显的抑制作用，然而这种抑制作用并不是由于Dieckol及6,6′-bieckol直接作用于基质金属蛋白酶-2和-9蛋白本身，从而影响MMP-2和-9的酶活性，而是通过影响相关信号通路，下调基质金属蛋白酶-2和-9的表达。基于基质金属蛋白酶-2和-9在肿瘤细胞的迁移和侵袭起到了非常关键的作用，所以可以推测Dieckol及6,6′-bieckol对于基质金属蛋白酶-2和-9的表达量的下调是其抑制HT1080细胞的迁移和侵袭的重要分子机制之一。
已有的研究成果表明，AP-1和NF-κB是调节MMP-2和-9表达的主要转录因子之一。在研究中我们发现Dieckol及6,6′-bieckol可以显著地抑制NF-κB信号途径中磷酸化的p65和p50亚单位向核内移位锚定在相应的DNA位点，从而激活MMP-2和-9的表达，本研究中NF-κB的核内转移却被抑制，最终NF-κB并没有起到促进基质金属蛋白酶-2和-9的功能。在另外一条调控基质金属蛋白酶-2和-9表达的信号通路当中（MAPK-AP-1信号通路），Dieckol及6,6′-bieckol没有影响MAPK途径中ERK，P38和JNK的磷酸化和以及AP-1（c-jun）的磷酸化。同时，我们观察到内源性基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1和TIMP -2的表达也没有受到明显的影响。所以我们可以预测，Dieckol及6,6′-bieckol对于基质金属蛋白酶-2和-9的表达量的下调其主要机理是其对于NF-κB的p65和p50亚单位的核内转移的抑制。
目前研究的研究表明Dieckol及6,6′-bieckol在没有明显细胞毒性的浓度下，对于癌细胞的侵袭和迁移的有着显著的抑制作用，这些结果提示我们，这两个化合物在肿瘤抗转移治疗方面有着一定的应用潜力。
关键词: Matrix Metalloproteinases ；Ecklonia Cava ；Dieckol ；6,6'-bieckol
被引量
2
【专利/发明】 • CN202111039759.7 •
+1位作者
•
申请日：2021-09-06,
公开日：2025-04-01
申请人： 中国海洋大学
公开（公告）号： CN115770235B
摘要： 本发明公开了一种海洋藻来源的化合物双‑(2,3,6‑三溴‑4,5‑二羟基苄基)醚(BTDE)在抑制肿瘤新生血管生成中的应用。本发明经试验证实，BTDE在体外对人静脉内皮细胞HUVECs增殖无影响，但可显著抑制其迁移与侵袭。进一步实验证明，BTDE在体外能够抑制HUVECs血管拟态生成，但对既存血管无影响。此外，我们进一步探究发现BTDE抑制HUVECs基质金属蛋白酶9活力，但不影响AKT，ERK蛋白分子及其磷酸化水平表达。体内斑马鱼胚胎实验显示BTDE抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。BTDE可以从海洋藻类中获得，易分离提取，同时可用化学合成途径大量制备，是一种非常有应用前景的抗肿瘤新生血管生成先导化合物。
【专利/发明】 • CN202111039759.7 •
+1位作者
•
申请日：2021-09-06,
公开日：2023-03-10
申请人： 中国海洋大学
公开（公告）号： CN115770235A
摘要： 本发明公开了一种海洋藻来源的化合物双‑(2,3,6‑三溴‑4,5‑二羟基苄基)醚(BTDE)在抑制肿瘤新生血管生成中的应用。本发明经试验证实，BTDE在体外对人静脉内皮细胞HUVECs增殖无影响，但可显著抑制其迁移与侵袭。进一步实验证明，BTDE在体外能够抑制HUVECs血管拟态生成，但对既存血管无影响。此外，我们进一步探究发现BTDE抑制HUVECs基质金属蛋白酶9活力，但不影响AKT，ERK蛋白分子及其磷酸化水平表达。体内斑马鱼胚胎实验显示BTDE抑制斑马鱼胚胎背部节间血管生成。BTDE可以从海洋藻类中获得，易分离提取，同时可用化学合成途径大量制备，是一种非常有应用前景的抗肿瘤新生血管生成先导化合物。
会议时间： 2013-08-19
摘要： 褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是源于海洋褐藻的天然产物,富含L-岩藻糖和硫酸基团的酸性杂多糖,具有来源广泛,毒副作用低等优点,且具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和免疫调节等多种生物学功能,其中,Fucoidan的抗肿瘤活性备受关注。本实验室前期工作表明,Fucoidan可耗竭人肝癌SMMC-7721细胞GSH,致线粒体氧化损伤,通过线粒体途径诱导细胞凋亡;抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长及血管新生,抑制小鼠Hca-F肝癌和Lewis肺癌实体肿瘤生长,并对荷瘤小鼠具有免疫调节作用等。肿瘤细胞在发生发展及转移过程中分泌的相关因子,可同时刺激自身增殖、外周淋巴管新生及细胞外基质的降解,进而促进其经淋巴道转移。PI3K/Akt信号通信是细胞内重要的信号传导通路,与肿瘤细胞的增殖、存活、抗凋亡及侵袭转移等密切相关。近年来研究发现,Akt在介导VEGF信号通路与肿瘤淋巴管新生及淋巴道转移也存在着紧密联系;血管内皮生长因子C(VEGF-C)作为一种特异性生长因子,可以与其特异性受体血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)结合,从而激活VEGF-C/VEGFR-3通路,促进肿瘤细胞增殖及其外周淋巴管新生。同时,MAPK信号通路中,细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)可促进细胞增殖信号的转导,可将上游信号转导至细胞及其核内,介导细胞的增殖、分化和迁移等过程。基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一类具有降解细胞外基质(ECM)活性的蛋白水解酶,其中MMP-2,-9在降解细胞间胶原和血管基底膜,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,是肿瘤迁移、侵袭转移中的关键因子,其活性受其特异性抑制剂(FIMP)的调节。本研究从海洋褐藻Undaria pinnatifida孢子叶中分离纯化Fucoidan,采用体外实验,探讨其对小鼠肝癌Hca-F细胞增殖、迁移及侵袭转移能力的影响并探究肿瘤淋巴道转移的机制。采用MTT法、流式细胞术检测Fucoidan对Hca-F细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响;Transwell实验观察Fucoidan干预Hca-F细胞迁移,侵袭能力;Western-blot法检测胞内总蛋白中相关基因p-PI3K,p-Akt,ERK1/2,p-ERK1/2,TIMP-1的蛋白水平变化,ELISA法检测Hca-F细胞分泌VEGF-C,MMP-2,-9水平的影响,半定量RT-PCR法检测以上基因mRNA水平的表达变化。实验结果表明,Fucoidan可抑制Hca-F细胞增殖、存活及侵袭能力,下调p-PI3K,p-Akt,ERK1/2,p-ERK1/2,VEGF-C,并上调TIMP-1的蛋白及mRNA表达水平。表明Fucoidan抑制Hca-F细胞增殖及淋巴道转移,其机制与干预PI3K/Akt/VEGF及MAPK信号通路有关。
关键词: Fucoidan ；侵袭转移 ；p-PI3K ；p-Akt ；ERK1/2 ；VEGF-C ；TIMP-1
会议时间： 2010-11-01
摘要： 目的:XJ-6-A是一种根据碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺的化学结构及AQP1蛋白的三维结构设计的全新化合物。在前期的研究中发现,XJ-6-A既能抑制肿瘤转移又能抑制AQP1蛋白的功能。本研究拟观察XJ-6-A对在体移植性肿瘤Lewis肺癌模型动物及离体高转移前列腺癌细胞系PC-3M细胞的抑瘤作用,同时探究其抑制肿瘤细胞侵袭及转移的可能机制,为该类化合物发展成为抗肿瘤药物提供科学资料。方法:(1)用C57BL/6小鼠建立Lewis肺癌荷瘤小鼠动物模型,肿瘤接种后第二天开始,根据体重随机分组,连续21天灌胃给予生理盐水或10mg/kg、20mg/kg和40mg/kgXJ-6-A,从给药第6天开始,每两天测一次肿瘤体积,第22天处死小鼠,分离移植瘤和肺组织,称重,统计肺部转移灶数目,观察XJ-6-A抑制肿瘤生长和转移的作用。(2)采用蛋白质双向电泳法,结合质谱技术,对模型组和给药组小鼠血清进行差异蛋白质组学分析,并应用QPCR及WesternBlot技术作进一步的鉴定。(3)采用MTT法观察不同浓度的XJ-6-A对培养的PC-3M细胞活力的影响;采用划痕实验和Transwell观察XJ-6-A对PC-3M细胞侵袭及迁移能力的影响。(4)采用流式细胞术观察XJ-6-A对转染了pEGFP/AQP1质粒的HEK293水通透性的影响。(5)采用明胶酶谱法观察XJ-6-A对基质金属蛋白酶MMP2/9酶活性的影响。(6)采用免疫印迹法观察XJ-6-A对肿瘤转移密切相关的水通道蛋白(AQP1)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及基质金属蛋白酶MMP-2/9蛋白表达的影响。(7)给予各种信号分子抑制剂,研究XJ-6-A抑制肿瘤转移与侵袭可能涉及的信号通路。结果:(1)XJ-6-A(20mg.kg-1.d-1和40mg.kg-1.d-1)能够抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长和肺转移(p<0.05),提高给药组小鼠21天内的生存率。(2)PDQuest软件分析结果显示给予XJ-6-A(40g.kg-1.d-1,ig.,21d)后,模型组和给药组小鼠血清中蛋白质表达谱发生了明显的改变,我们对表达变化明显且分离效果较好的4个差异蛋白进行质谱分析。(3)MTT实验结果显示,10-12～10-6M的XJ-6-A对PC-3M细胞的增殖无明显影响,10-5M则可明显抑制肿瘤细胞的增殖(p<0.01)(。4)划痕实验结果显示,10-10～10-6M的XJ-6-A可抑制PC-3M肿瘤细胞的迁移,尤以10-8M的浓度最为明显(p<0.01);Transwell实验结果显示,0.1μM和1μM的XJ-6-A可以明显抑制PC-3M细胞的侵袭和迁移。(5)流式细胞术结果显示,1μM的XJ-6-A可明显抑制转染了pEGFP/AQP1质粒的HEK293水通透性。(6)免疫印迹结果显示,XJ-6-A(40g.kg-1.d-1)可抑制肿瘤组织和PC-3M细胞中AQP1、OPN和MMP-2/9蛋白的表达,并可抑制MMP2/9的酶活性(p<0.05)。(7)XJ-6-A可抑制pJNK、PI3K和pAkt蛋白的表达(p<0.05)。结论:XJ-6-A可抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长,并能明显抑制肿瘤的肺转移。低浓度的XJ-6-A对PC-3M细胞的活力没有影响,但能明显抑制肿瘤细胞的迁移。XJ-6-A通过抑制与肿瘤转移相关的蛋白AQP1、OPN和MMP-2/9的表达来抑制肿瘤的侵袭与转移。XJ-6-A通过抑制JNK和PI3K/Akt信号通路活性发挥抑制肿瘤侵袭与转移的作用。
关键词: 肿瘤转移 ；水通道-1 ；骨桥蛋白 ；基质金属蛋白酶 ；双向电泳 ；免疫印迹
摘要： 目的： 1.从海洋天然产物(Marinenaturalproducts,MNP)中筛选出具有抗非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer,NSCLC)增殖能力的活性化合物。 2.探讨活性化合物对NSCLC的抗肿瘤作用。 3.探讨活性化合物抑制NSCLC的作用机制。 方法： 首先将H1975、H1299、A549和MDA-MB-231细胞分为对照组和不同浓度的MNP处理组（处理浓度为0.08、0.4、2、10、50μM）。用MTT法从MNP中筛选出具有强效抗肿瘤增殖能力的活性化合物。随后，通过文献调研，挑选出尚未进行过深入抗肿瘤机制研究的化合物，通过比较化合物的活性并考虑到实验室分离得到的化合物量，做出合适的实验设计。 随后，在体外实验中，形态学观察，吖啶橙染色、克隆形成实验、划痕实验、侵袭实验、流式细胞术等技术分别检测活性化合物对细胞形态、细胞克隆形成、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡、细胞周期、细胞线粒体膜电位、细胞内活性氧生成量的影响。免疫荧光检测相关蛋白表达水平，Westernblot检测细胞增殖、转移、凋亡相关蛋白水平。人类磷酸化RTK阵列试剂盒筛选抗肿瘤作用靶点，Westernblot检测靶点蛋白及相关信号通路的蛋白表达水平，RT-qPCR法验证靶点的mRNA水平。在体内实验中，采用裸鼠异种移植瘤模型研究活性化合物对肿瘤增殖的影响，苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,Hamp;E)检测心肝脾肺肾的病变情况，免疫组化法（Immunohistochemistry,IHC）检测Ki-67指标，免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测靶点蛋白表达情况。 结果： 1.活性化合物筛选：在582个化合物中，共有40个化合物显示出强抗肿瘤增殖的活性（IC50＜10μM）。通过文献调研，大环内酯类化合物UlapualideB(UlaB)和西松烷二萜类化合物3-dehydroxylpresinularolideB（compound10）未进行过深入的抗肿瘤机制研究，且分离得到的化合物量可以完成后续实验。最终选取上述两种化合物做进一步的抗肿瘤机制研究。两者相较而言，UlaB的活性更好，得到的化合物量可以支持更多的实验开展。 2.UlaB的抗肿瘤活性及其作用机制研究：UlaB在体内外均表现出显著的抗NSCLC活性。体外实验中，UlaB抑制NSCLC细胞增殖及集落生成，诱导细胞周期阻滞在G2/M期进而诱导DNA损伤，减弱CyclinB1入核能力;此外，UlaB可以呈时间和剂量依赖性抑制细胞转移，诱导p-γH2AX阳性细胞增加，降低线粒体膜电位水平并刺激活性氧的生成;下调ErbB3的mRNA和蛋白水平，并影响ErbB3相关信号通路蛋白（如ROR1/WNT5A、JAK2/STAT3）的表达，从而发挥抗肿瘤作用。体内实验中，UlaB能够抑制裸鼠体内移植肿瘤的增殖;小鼠心肝脾肺肾器官无明显病变;Ki-67阳性细胞减少;下调ErbB3和ROR1的蛋白表达。关于UlaB的抗癌机制，结果表明，UlaB通过激活ErbB3和ROR1信号通路来抑制NSCLC的增殖。这些结论表明UlaB具有潜在的抗NSCLC的作用。 3.Compound10的抗肿瘤活性及其作用机制研究：compound10在体外具有显著的抗肿瘤活性。compound10对A549细胞具有明显的细胞毒性，通过诱导A549细胞周期阻滞在G2/M期及细胞凋亡发挥抗肿瘤活性。此外，compound10抑制A549细胞的转移，诱导活性氧生成。关于compound10的抗癌机制，目前的研究结果表明，compound10可减少CyclinB1蛋白的表达，同时，还可以影响肿瘤转移相关蛋白MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin，肿瘤凋亡相关蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Bcl-2的表达量。此外，compound10可以抑制ROR1-ErbB3活性，影响下游Src/STAT3信号通路的表达，从而达到抗肿瘤效果。总体而言，这些结论表明compound10具有潜在的抗肿瘤作用。 结论： 1.UlaB抑制细胞转移，诱导细胞周期阻滞和DNA损伤而抑制细胞增殖，可能与抑制ROR1-ErbB3信号通路有关;2.Compound10抑制非小细胞肺癌细胞转移、诱导细胞周期阻滞而抑制细胞增殖并且诱导细胞凋亡，可能与抑制ROR1-ErbB3信号通路有关。
关键词: 非小细胞肺癌 ；海洋天然产物 ；人表皮生长因子受体3 ；酪氨酸激酶样孤儿受体1 ；细胞凋亡
摘要： 组织蛋白酶D(Cathepsin D,Cath D)在恶性肿瘤细胞内高度表达,参与肿瘤细胞的侵袭、增殖、转移和凋亡等过程。目前,Cath D已经被认为是治疗癌症的潜在靶点。Tasiamide B是Richard E.Moore等人在2003年首次从海洋藻青菌Symplloca sp.中分离得到的一种线性八肽,该化合物显示出较强的天冬氨酸蛋白酶抑制活性。本课题组前期完成了天然产物tasiamideB的全合成及其衍生物的设计与合成,并获得了多个具有高活性和高选择性的Cath D抑制剂。其中尤以衍生物TB-9和TB-11活性最优。两者在酶水平上均表现出较高的抑制活性,且对另外两种天冬氨酸蛋白酶(Cath E&BACE1)的选择性也较高。但经过仔细分析发现,其有进一步优化的空间:分子量过大、细胞水平上活性较差,该类抑制剂结构中每个氨基酸单元的作用尚未完全确定。在此基础上,本论文将从减小分子量、增加透膜性,以及寻找最小活性单元这几方面出发,进行新一轮的设计工作,采用片段合成策略,设计出三个系列共计21个目标化合物。1)A系列共设计并合成14个目标化合物(A-1～A-14)。该系列化合物在保留Val-N-Me-Gln-Ahppa片段的基础上,依次删除C端的氨基酸单元,同时在C末端采用甲酯或游离羧基的形式。2)B系列共设计5个化合物(B-1～B-5),成功合成B-1～B-4。该系列化合物基于活性最佳的TB-9,通过水解甲酯得到B-1;通过一个酪氨酸(Tyr)单元替换苯丙氨酸(Phe)单元,C末端为甲酯或游离羧基,得到B-2～B-4。3)基于细胞穿膜肽(CPP)的较强透膜能力,其可携带多种大分子物质进入细胞,开辟了介导药物进入细胞的新途径。C系列共设计并合成2个偶联体:将B-1(或B-3)以一个柔性连接链(linker)与靶向溶酶体的CPP相结合,得到偶联体C-1(或C-2)。本论文设计合成了三个系列的化合物,并完成了初步的生物活性研究。活性测试结果显示:1)C端的Pro残基可以删减,但C端的其他疏水性氨基酸残基则必须保留;2)C末端采用甲酯进行封闭活性略优;3)N末端采用Cbz保护活性更优;4)Tyr替换Phe,获得新型高活性和高选择性CathD抑制剂;5)连接CPP后的偶联体,能够成功透膜并靶向溶酶体,提高了原型抑制剂的细胞活性。
关键词: 多肽合成 ；组织蛋白酶D ；选择性抑制剂 ；tasiamide B衍生物
被引量
2
【会议论文】 •
会议时间： 2007-10-01
摘要： 贝类是我国的传统海洋中药材,大多具有清热泻火、凉血解毒、镇静安神、软坚散结等作用．其中文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus、近江牡蛎(Ostrea rivularis Gould)、白蛤(Mectra quadrangularis Deshayes)、毛蚶(Arca subcreta Lischke)为药用海洋贝类的典型代表．本文综述了这四种海洋贝类的生物活性成分研究进展,为进一步研究开发海洋贝类提供依据．现代研究表明,海洋贝类含有丰富的活性成分,这些活性物质具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗血小板聚集、抗氧化和抗高血压等药理学功能．如文蛤含有多种生理活性物质,主要包括蛋白质、多肽、多糖、核酸、甾醇化合物、牛磺酸等,具有显著的抗肿瘤活性．另外,文蛤提取物还具有增强机体免疫功能,主要体现在器官免疫与体液免疫两个方面。由文蛤中发现了多种抗肿瘤活性的多肤,对肿瘤细胞具有显著的抑制活性．研究发现牡蛎肉对癌症有抑制作用,并能减轻抗癌药物阿霉素对心脏的副作用．采用体内及体外多种实验方法,观察牡蛎提取物有抑制脂质过氧化损伤、抗血小板聚集的作用．近年来对于毛蚶的药用价值研究,主要集中于其体内的抗菌蛋白,也有资料表明毛蚶有抗癌作用．对于白蛤的药用价值开发较少,主要是用于提取牛磺酸和辅助治疗支气管疾病．随着现代生化与生物技术药物研究的发展,从海洋贝类中已分离出多种生物活性物质,具有独特的分子结构与作用机制,采用生物工程技术对贝类中的多肽类活性成分进行克隆表达,极大地增加了贝类的应用价值．我国海洋贝类资源丰富,易于产业化,故开发贝类药源活性物质有着广阔的前景．但是其大部分活性物质如蛋白质和多糖类还存在分子结构不明确,作用机制不清楚等问题,因此其活性成分组成和药理作用机制还需要深入的研究．
关键词: 活性成分 ；海洋贝类
被引量
3
摘要： 紫杉醇(paclitaxel)是1971年从美国西部短叶红豆杉中分离提取出来的一种天然抗肿瘤药物,具有独特的抗癌机制。紫杉醇的主要靶点是细胞内微管系统,通过促进微管聚合抑制微管解聚,使细胞阻滞于G2/M期,并最终导致细胞死亡。目前紫杉醇己成为包括乳腺癌、卵巢癌、非小细胞性肺癌等多种实体瘤的一线治疗药物,应用前景十分广阔。然而,紫杉醇的开发也面临着诸多问题,如来源有限,水溶性差等,而获得性耐药现象的出现则是制约其临床疗效的最主要问题。紫杉醇耐药的产生机制十分复杂,主要包括：药物外排泵ABC转运蛋白过表达和功能上调导致细胞内药物浓度降低；药物作用靶点改变；凋亡信号通路调控异常以及紫杉醇耐药相关基因TRAG-3过表达等。 目前,解决耐药问题主要有两条思路：一是利用肿瘤耐药逆转剂抑制转运蛋白的功能或表达,以恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；二是开发本身具有抗耐药活性的化合物直接杀伤或抑制耐药肿瘤的生长。近年来,抗耐药研究越来越受到关注。我国具有丰富的天然产物资源,从天然产物中分离提取有效成分并进行相应的结构修饰是当前抗耐药研究的一大热点。在本研究的第一部分,我们以对紫杉醇耐药的细胞株及体内耐药裸鼠异体移植瘤模型为研究对象,考察了一种紫杉烷类衍生物Lx2-32c体内外的抗肿瘤耐药活性,并对其可能的抗耐药机制作出研究。 为研究肿瘤多药耐药的机制,或筛选耐药逆转剂及具有抗耐药活性的化合物,建立多药耐药细胞系及体内裸鼠异体移植瘤模型是主要手段之一。在本研究的第二部分,我们建立了对紫杉醇耐药的人胃腺癌BGC-823细胞亚系和体内耐药模型,并对这两个模型进行了耐药性的鉴定,以及主要耐药机制的探讨。 第一部分新型紫杉烷类化合物Lx2-32c抗肿瘤耐药药效学及机制研究 本部分实验主要研究了Lx2-32c体内外抗肿瘤耐药作用,并对其主要的耐药机制进行了较深入的探讨。Lx2-32c是由中国医学科学院药物研究所天然药物化学研究室方唯硕研究员课题组通过对三尖杉宁碱(Cephalomannine)进行结构修饰半合成得到的一类全新紫杉烷类衍生物中活性最强的一个。此类类化合物已申请中国化合物专利(申请号200610080890.7)与国际PCT专利(申请号PCT/CN2007/003235) 体外研究中,Lx2-32c可抑制多种不同组织来源的耐药细胞的生长,如人乳腺癌多药耐药细胞株MX-1/T及亲本细胞株MX-1,人肺腺癌多药耐药细胞株A549/T及其亲本细胞株A549,人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/T及其亲本细胞株MCF-7,人胃腺癌多药耐药细胞株BGC-823/TA及亲本细胞株BGC-823,人口腔上皮癌多药耐药细胞株KB/V及其亲本细胞株KB,以及人肝癌多药耐药细胞株Bel-7402/5-Fu及亲本细胞株Bel-7402。MTT法测得其在体外的半数抑制浓度IC50为29.61±5.76nmol/L(从1.02至98.92nmol/L)。接下来,我们选择人乳腺癌多药耐药细胞株MX-1/T及亲本细胞株MX-1作为研究对象,以Paclitaxel作为阳性对照药,探讨Lx2-32c较确切的抗耐药作用机制。 SRB法测得Lx2-32c对MX-1/T细胞的GI50为67.35nM,集落形成实验测定Lx2-32c对MX-1/T细胞的IC50为5.33nM,均显著低于Paclitaxel的相应值。 体内实验表明Lx2-32c能够抑制对紫杉醇耐药的人乳腺癌MX-1裸鼠异体移植瘤的生长。Lx2-32c(15、30、45mg/kg)对裸鼠移植瘤生长的抑制率分别为40.11%、63.46%及77.67%,呈现较好的剂量效应关系,而Paclitaxel30mg/kg组的抑瘤率仅为22.85%。对移植瘤组织的TUNEL检测亦显示Lx2-32c可剂量依赖性诱导耐药瘤组织产生凋亡现象。 接下来我们研究了Lx2-32c对MX-1/T细胞内微管蛋白的作用。首先,我们利用微管蛋白间接免疫荧光法及Western Blot法检测细胞内微管的原位聚合,以探讨Lx2-32c对耐药细胞微管动态平衡的影响。免疫荧光实验结果表明,Lx2-32c的作用方式呈典型的紫杉醇样作用,可促进细胞内微管聚合,诱导细胞内微管形成微管束,阻碍细胞内纺锤丝的形成,从而干扰细胞的有丝分裂。细胞内原位微管聚合实验表明,Lx2-32c能够明显地将细胞内微管的动态平衡由“可溶”态向“不溶”态推进,使微管向着聚合态偏移,结果同间接免疫荧光结果类似。然后我们检测了细胞内Tau蛋白的表达,结果表明,与亲本MX-1细胞相比,耐药的MX-1/T细胞Tau蛋白表达明显增高,Lx2-32c可剂量依赖性地降低Tau蛋白的表达。 P-gp蛋白与肿瘤的多药耐药现象关系密切,首先,我们利用RT-PCR及Western Blot法检测了P-gp在细胞内的表达,结果表明,MX-1/T细胞是一株典型的P-gp高表达细胞株,这可能是其具有多药耐药性的主要原因,而Lx2-32c对MX-1/T细胞内P-gp的表达无明显影响。接下来,我们考察了MX-1/T细胞内的药物蓄积情况。质谱分析表明,相同剂量的Lx2-32c在细胞内的蓄积量明显高于Paclitaxel的蓄积量,脱药后Lx2-32c的外排亦明显少于Paclitaxel,其脱药后的6h蓄积率为脱药时的32.63%,显著多于Paclitaxel的6h蓄积率(1.74%)。Rhodamine123蓄积实验显示,与MX-1/T细胞的基础荧光强度相比,Paclitaxel可使细胞内的荧光强度有一定程度的回升,提示此时P-gp在转运Rhodamine123的同时参与Paclitaxel的外排,故P-gp对Rhodamine123的转运减少,胞内荧光增强。Lx2-32c对细胞内荧光强度影响不大,说明此时P-gp对Lx2-32c的外排较少,仍主要参与Rhodamine123的外排,此结果间接反映了Lx2-32c在MX-1/T细胞内的蓄积多于Paclitaxel的蓄积。10uMVerapamil与不同剂量Paclitaxel合用72h后,可明显逆转MX-1/T细胞对Paclitaxel的耐药性,逆转倍数达38.89倍,而其与不同剂量Lx2-32c合用72h后,对Lx2-32c的IC50值影响不大,结果提示P-gp在MX-1/T细胞对Paclitaxel产生耐药的过程具有重要地位,而对Lx2-32c在耐药细胞内的蓄积影响不大。 药物与P-gp作用的另一个重要方面是二者的结合能力。计算机辅助设计提示,Lx2-32c与P-gp的结合力较弱,Fitness评分为31.41,显著低于Paclitaxel与P-gp的Fitness评分(36.90)。P-gp ATPase的测定也表明与Paclitaxel处理组相比,Lx2-32c三个剂量组(20,100,500nM)产生的荧光强度均明显增加,说明ATP的消耗量减少,由于P-gp对底物的转运有赖于ATP的水解,故此结果间接反映了P-gp对Lx2-32c的外排较Paclitaxel组减少,与前述实验结果吻合。另外,由于Lx2-32c处理组产生的荧光强度呈剂量依赖性降低,说明Lx2-32c在耐药细胞内增加的蓄积并不是由于其具有抑制P-gp功能的作用。结合其他实验,我们推测,Lx2-32c在细胞内的蓄积较Paclitaxel增加的原因在于其与P-gp亲和力较低,故P-gp对其外排亦降低,因此Lx2-32c可在P-gp高表达的耐药细胞中仍保持有效浓度,这是其具有抗耐药活性的最主要机制。 解除耐药细胞的凋亡抑制是抗耐药药物研究的一大思路,我们也考察了Lx2-32c对MX-1/T细胞的凋亡诱导作用。流式细胞术显示不同剂量的Lx2-32c可使MX-1/T细胞产生G2/M期阻滞,染色体数目不稳定性及凋亡峰(亚G1峰)的出现。Annexin V-FITC/PI双染法定量地检测了Lx2-32c(20、100、500nM)作用48h产生的凋亡百分比,分别为14.09%、30.67%和63.52%。利用DAPI染色及AO/EB染色均可观察到Lx2-32c作用后MX-1/T细胞呈现的典型凋亡形态,如核固缩,核碎裂等。DNA ladder实验可见Lx2-32c诱导细胞DNA片段化,产生明显的梯形条带。JC-1染色及DiOC6染色均显示Lx2-32c对细胞线粒体膜电位的降低作用。Western Blot结果显示,Lx2-32c可剂量依赖性地升高Bax/Bcl-2比例,使细胞色素C、AIF从线粒体释放到胞浆,进而活化Caspase-9,-3,和PARP,启动内源性凋亡通路,而对Fas, FasL、Caspase-8的表达无影响。 最后,我们检测了Lx2-32c对肿瘤细胞侵袭转移及血管生成的影响。划痕-愈合试验结果表明,50nM Lx2-32c持续作用24h,明显抑制MX-1/T细胞侧向迁移能力；粘附试验结果表明,10nM及50nM Lx2-32c预处理30min,可明显抑制MX-1/T细胞与人工基底膜成分Matrigel的粘附；明胶酶谱法结果表明,Lx2-32c作用24h,可在一定程度上抑制人乳腺癌细胞MDA-MB231细胞分泌MMP-9及MMP-2,人纤维肉瘤细胞HT-1080分泌aMMP-9,以及人黑色素瘤细胞分泌MMP-2。另外,10nM及50nM Lx2-32c可显著减弱人脐静脉内皮细胞融合细胞EA-hy926的铺展能力及体外形成血管环的能力,显示出一定的抗血管生成作用。 综上所述,Lx2-32c是一种具有确切的体内外抗耐药活性的新型紫杉烷类化合物,其抗耐药机制可能与促进微管聚合,降低Tau蛋白表达,较少被P-gp外排从而能保持较高的细胞内药物蓄积浓度,以及诱导耐药细胞凋亡有关,同时,Lx2-32c亦显示出一定的体外抗肿瘤侵袭转移及抗血管生成的作用。 第二部分紫杉醇耐药的人胃腺癌BGC-823/TA细胞株及BGC-823/Paclitaxel裸鼠异种移植瘤模型的建立及耐药机制的探讨 本部分研究主要是建立并鉴定了对紫杉醇耐药的人胃腺癌BGC-823/TA细胞株及体内耐药的BGC一823/Paclitaxel裸鼠异种移植瘤模型,并对其耐药机制进行了探讨。 本研究选用人肺腺癌细胞株BGC-823作为亲本细胞,以紫杉醇对BGC-823细胞的IC1。为初始诱导剂量,经紫杉醇小剂量逐步增加剂量诱导和克隆选择,18个月后,成功建立了能在含2.00×10-8rnol/L紫杉醇的培养基中正常生长和传代的耐药株BGC-823/TA,耐药倍数为92.31倍。MTT法检测显示BGC-823/TA细胞对Docetaxel. Vincristine.Adriamycin及Lx2-32c等多种细胞毒类化合物也具有出不同程度的交叉耐药性,表现出典型的多药耐药特征。与亲本BGC-823细胞相比,BGC-823/TA细胞的细胞形态、细胞核形态、细胞周期分布、运动能力,粘附能力等基本生物学特征无明显改变,但生长速率较亲本细胞略微减慢,集落形成能力也有所降低,集落形成率分别为62.88%和74.38%。间接免疫荧光检测显示两株细胞内微管蛋白形态无明显改变,Western Blot法检测显示,BGC-823/TA细胞内p微管蛋白亚型(βⅠ、βⅡ、βⅢ、βⅣ微管蛋白)的表达与亲本BGC-823细胞无明显差异,两株细胞内Tau蛋白的表达量也差别不大。 P-gp.MRP及LRP等耐药蛋白的表达及活性是细胞多药耐药性形成的重要机制。RT-PCR检测发现BGC-823/TA细胞MDR1表达显著升高,间接免疫荧光法与Western Blot法均显示BGC-823/TA细胞P-gp高表达,Western Blot法还显示BGC-823/TA细胞内其它药泵蛋白如MRP.BCRP.LRP表达未见变化。 P-gp蛋白的功能研究证实BGC-823/TA细胞泵出Rodaminel23.阿霉素及Flutax-1的能力强于BGC-823细胞。质谱检测显示BGC-823/TA细胞内Paclitaxel含量明显低于BGC-823胞内含量,且脱药2h后BGC-823/TA细胞内Paclitaxel含量下降更为明显。
关键词: Lx2-32c ；肿瘤多药耐药 ；紫杉烷类 ；P-gp ；微管 ；凋亡
被引量
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摘要： 本博士研究论文内容是结合指导教授的研究领域及方向，在大量国内外文献研究和本实验室前期研究成果的基础上，针对目前大肠癌疾病的临床统计现状而设计完成的。
据最新世界卫生组织研究统计报道，大肠癌疾病死亡率是居第3位的恶性肿瘤，在全世界每年造成约655000人死亡。且在中国发病率呈增高趋势，已经成为最常见的恶性疾病之一。虽然目前对大肠癌的信号传导通路因子已有了深入的研究，但仍不尽完善，主要的方法还是外科手术及放化治疗，而安全性高疗效确切的治疗药物还很少见。
在众多相关报道的治疗通路靶向因子的机制中，基质金属蛋白酶表达生物途径正在引起同行学术界的广泛认同和极大重视。在基质金属蛋白酶系28种蛋白酶中，与本项研究相关的金属蛋白酶主要有两种，包括基质金属蛋白酶MMP-2，9。 MMPs的主要作用包括参与细胞外基质降解等一系列的生理过程，如参与胚胎发育，繁殖，血管生成和组织重构等，并且参与其他一些疾病发生发展过程，例如参与关节炎、肿瘤的侵袭和转移等过程。最近几年中，关于基质金属蛋白酶家族过度表达的研究，作为肿瘤的生物标志物及癌症的不良预后标志，已经进行了一系列的深入研究，其中大肠癌为其研究热点之一。例如MMPs基因编码的酶，其可以降解细胞基底膜的主要结构成分—IV型胶原蛋白，从而在促进肿瘤细胞侵袭和转移过程中起起重要作用。相关研究已经在一些肿瘤中检测到基质金属蛋白酶的过表达，如大肠癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、胃癌及卵巢癌等。
前期本研究室对基质金属蛋白酶与大肠癌细胞中的表达相关性研究结果表明，和正常大肠组织相比，基质金属蛋白酶2蛋白在大肠癌组织中的表达量明显升高。并且，MMP-2在大肠癌组织中的表达量、肿瘤的大小、淋巴结转移数、远处转移、肿瘤Dukes'分期、肿瘤的侵袭度均呈正相关性。基质金属蛋白酶的表达较高的患者的整体生存期明显短于基质金属蛋白酶表达低患者。多元分析结果表明，基质金属蛋白酶的表达水平是一个衡量大肠癌患者的生存及预后的独立指标。本实验显示，实验组通过抑制大肠癌细胞MMPs的表达，大肠癌细胞增殖，集落形成及肿瘤细胞生长的侵袭性均受到明显抑制。
因此，在本项课题研究中，我们采用天然产生的褐藻为研究对象，对其化学成分进行了研究，分离纯化了具有生物活性的聚合酚类化合物，并经过核磁共振光谱（NMR）解析技术，对其化学结构进行了鉴定研究。同时与文献进行了比较研究，确证其为褐藻聚合酚类化合物，即Phlorofucofuroeckol A (PFFE－A)。我们研究了该化合物对基质金属蛋白酶的表达作用的研究。结果表明，该化合物具有明显的抑制大肠癌细胞中MMPs过度表达的活性，抑制MMPs-2,9的表达尤为明显。该项研究的实验结果为进一步寻找药物途径治疗大肠癌疾病，提供了详实的科学实验依据。
关键词: 褐藻聚合物酚 ；PFFE－A ；大肠癌 ；基质金属蛋白酶
摘要： 背景和目的:前列腺癌(Prostate cancer)在全球男性中是发病率第二的肿瘤,2012年有1,100,000例新发病例,占男性全部癌症患者的15%。发达国家男性人口占全球男性的17%,但其前列腺癌发病率最高,占全部前列腺癌患者的2/3。虽然亚洲地区前列腺癌发病率较低,但呈现逐年增加的趋势。早期前列腺癌通常没有症状,但发展到晚期常会引起一系列症状,包括排尿困难(尿量减少,排尿次数增多)、血尿、勃起功能障碍等;前列腺癌进一步进展易发生骨转移,癌症转移到骨后会引起臀部、背部、胸部或其他地方的疼痛;当肿瘤压迫脊髓还可能引起腿或足部虚弱麻木、膀胱或者肠失控等。由于前列腺癌的危险因素包括年龄、种族、地理、家族史和基因改变等多不可改变,且具有复杂的分子通路,化疗被认为是治疗前列腺癌的主要治疗方法。因此,找到高效低毒的放化疗药物对于前列腺癌的治疗显得至关重要。电压门控-钠离子通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs)与人类多种恶性肿瘤有关,VGSCs在癌症进程中的各个阶段都发挥着重要的作用,与肿瘤细胞黏附、增殖、迁移、侵袭和转移等相关。研究显示,VGSCs的激动剂能促进癌症细胞的转移,VGSCs的阻断剂能抑制细胞增殖、迁移和侵袭等。VGSCs已经成为癌症治疗的新靶标。因此,重庆医科大学药学院实验室以VGSCs通道蛋白为靶标,运用3D定量构效关系结构模拟软件建立药物结合模型,设计并人工合成了一系列具有VGSCs通道蛋白结合活性的小分子配体-新型钠离子通道胺类配体(Sodium channels amine ligands,SCALs)共15种,分别命名为S0103,S0132,S0135,S0142,S0143,S0152,S0154,S0156,S0158,S0160,S0161,S0163,S0165,S0205,S0307。这一系列小分子配体试图通过与VGSCs的结合,封阻该通道,从而发挥钠离子通道阻断剂的作用抑制前列腺癌转移。本研究以15种SCALs作为筛选化合物,以前列腺癌作为研究对象,评估人工合成的SCALs对前列腺癌生长的影响。VGSCs的通道蛋白Nav1.6和Nav1.7在前列腺癌PC3和LNCa P细胞中大量表达,其m RNA表达水平比正常或增生的前列腺组织高6-27倍(p<0.05),它们可能是潜在的前列腺癌诊断指标和治疗靶点。本研究运用S0154和S0161对PC3细胞进行干预,通过Western blotting实验检测细胞中Nav1.6和Nav1.7蛋白的表达,从而观察SCALs对钠离子通道蛋白的影响。肿瘤细胞发生远处转移是一个复杂的生理过程,需要减少细胞黏附、增加细胞能动性和侵袭能力、蛋白酶解、以及抵抗凋亡等。VGSCs阻断剂多通过抑制肿瘤细胞的侵袭和转移发挥抗肿瘤效应。基质金属蛋白酶类(Matrix metalloproteinases,MMPs)是与癌症转移密切相关的细胞内信号分子,肿瘤细胞分泌MMPs,通过降解细胞基底膜进而迁移和侵袭到其他组织,实现癌症的转移。在一大类MMPs中关于MMP-2和MMP-9的研究较为深入,MMP-2或MMP-9过表达时转移的发生率增加,抑制MMP-2或者MMP-9的表达转移发生率减少。本研究运用S0154和S0161对PC3细胞进行干预,通过检测细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达,从分子水平上观察SCALs对PC3细胞转移能力的影响。同时,我们还运用BALB/c,nu/nu裸鼠建立了PC3细胞移植瘤模型,用S0154或S0161(以DMSO为对照)干预裸鼠移植瘤小鼠,通过监测其体重变化以及移植瘤大小,进而评估S0154和S0161在体内对PC3移植瘤生长的影响。实验方法:1.运用MTT实验初筛15种SCALs对3株前列腺癌细胞(PC3、LNCa P、DU145)生长能力的影响;2.运用钠离子探针实验检测经S0154和S0161处理的PC3细胞内Na+的表达情况,进行Western blotting技术检测干预后PC3细胞中Nav1.6和Nav1.7蛋白的表达;3.运用流式细胞术检测经化合物干预后PC3细胞周期,运用Western blotting技术检测周期相关蛋白的表达情况;4.运用流式细胞术检测经S0154和S0161干预后PC3细胞凋亡情况;5.进行Transwell小室实验,检测S0154和S0161对PC3细胞侵袭能力的影响,Western blotting技术检测MMP-2和MMP-9蛋白的表达;6.采用划痕实验检测S0154和S0161对PC3细胞迁移能力的影响;7.建立PC3前列腺癌移植瘤模型,研究S0154和S0161对裸鼠移植瘤生长情况的影响。实验结果:1.15种人工合成的SCALs中,S0154和S0161抑制前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCa P生长的作用最为显著,IC50值分别在10.51-26.60μM(S0154)、5.07-11.92μM(S0161)之间;2.S0154和S0161增加了PC3细胞内Na+的浓度,抑制PC3细胞中钠离子通道蛋白Nav1.6和/或Nav1.7的表达;3.S0154和S0161通过下调G2/M期的关键蛋白CDK1和Cyclin D1的表达,从而诱导PC3细胞周期阻滞于G2/M期;4.20μM的S0154能促进PC3细胞发生凋亡,但S0161对PC3细胞凋亡作用不明显;5.S0154和S0161下调PC3细胞基质金属蛋白酶类中MMP-2和/或MMP-9蛋白的表达;同时显著抑制PC3细胞的侵袭能力(Transwell小室实验),与对照组相比,2.5μM时即存在显著性差异,10μM的S0154能抑制95%的细胞侵袭,10μM的S0161能完全抑制PC3细胞的侵袭能力;6.划痕实验结果显示,S0154和S0161能抑制PC3细胞的迁移能力,但作用效果不如抑制侵袭明显;7.S0154和S0161能显著抑制PC3移植瘤裸鼠中肿瘤的生长,其中S0161干预2周,实验结束时移植瘤的生长被抑制了50.4%,但其安全性不如S0154。实验结论:在15种SCALs中,S0154和S0161主要通过抑制CDK1和Cyclin D1蛋白表达诱导G2/M期周期阻滞,从而发挥抑制前列腺癌在体内外生长的作用;通过下调MMP-2和/或MMP-9表达抑制肿瘤细胞侵袭进而抑制其转移活性。S0154和S0161可抑制肿瘤细胞生长和侵袭,可抑制前列腺癌移植瘤的生长,是潜在的前列腺癌化疗药。
关键词: 前列腺癌 ；电压门控-钠离子通道 ；钠离子通道胺类配体 ；细胞周期阻滞 ；侵袭 ；移植瘤模型
摘要： 天然材料作为药物的重要来源,是人类防治疾病的主要策略之一。近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升,已成为威胁人类健康的重要因素。其中前列腺癌(prostate cancer, PCa)是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤,是仅次于肺癌的第二大男性致死癌症。虽然我国前列腺癌的发病率明显低于西方国家,但随着老龄人口的增多、工业化环境污染的加重和饮食生活习惯的改变以及前列腺特异抗原筛查的逐步推广,其发病率呈逐年增加趋势。目前内分泌治疗是治疗早期前列腺癌的标准手段之一,然而大多数患者经内分泌治疗1-2年后易发展为激素难治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC),表现出对雄激素撤除不敏感,恶性程度高,目前临床尚无理想的治疗方法。由于恶性肿瘤发病机制复杂,临床上肿瘤耐药时有发生,故单一的治疗方案或针对于某一细胞信号途径的化疗药物很难取得令人满意的效果。从天然资源中寻求高效低毒且具有多机制抑癌活性的新型天然抗肿瘤药物为癌症治疗提供了新思路。自然界数以百万计的植物、动物、微生物和海洋生物是新药研发的重要来源,从特殊生物资源中发现先导化合物已是目前国际药物研究的主流方向。第一部分天然化合物抗肿瘤活性与诱导自噬活性筛选前列腺癌易发展为雄激素非依赖性HRPC,化疗仍是治疗HRPC的主要手段之一,但目前所用化疗药物的临床治疗效果和预后均不理想。近年来,多种植物来源的天然小分子化合物由于其广泛而独特的生物学活性而备受关注,特别是其潜在的抗肿瘤活性更是现下研发热点之一。在本研究中通过对28种天然小分子化合物进行了抗肿瘤和诱导自噬活性筛选,并初步研究和分析了纯化于地衣的新型五环三萜酸Retigeric acid B(RB)和纯化于黑曲霉菌的环肽类Malformin A1(MA1)对前列腺癌细胞生物学活性的影响,取得了以下研究结果：一、天然化合物抗肿瘤活性和诱导自噬活性筛选通过对28种天然化合物的抗肿瘤活性和诱导自噬活性筛选,首次确定五环三萜类化合物RB和环肽类化合物MA1同时对前列腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用和不同程度的诱导自噬活性。体外抗肿瘤活性筛选显示,前列腺癌细胞对RB敏感性最高,激素依赖型LNCaP细胞的IC50为7.97μM；非依赖型PC3和DU145的IC50稍高,约10μM;相比癌细胞,RB对正常前列腺上皮细胞的抑制活性弱；MA1显著抑制前列腺癌细胞PC3和LNCaP的增殖,IC50分别为130nM和90nM；而对前列腺正常上皮细胞RWPE1抑制作用稍弱,IC50高于200nM。通过稳定表达GFP-LC3 B的U87细胞中绿色荧光点状斑点的分布和数量为指标进行的自噬活性筛选结果显示,12种天然倍半萜类均对自噬的诱导效果微弱,12种天然三萜类中仅RB表现出中等程度的自噬诱导作用,其他影响不大；而同来源于地钱内生真菌黑曲霉的四种化合物中,MA1对自噬的诱导作用强;而其他3种化合物基本无影响。二、RB抑制前列腺癌细胞侵袭转移、诱导细胞周期阻滞和凋亡1.Transwell实验显示,经RB处理的激素非依赖性前列腺癌PC3和DU145细胞穿透matrigel胶的能力呈现浓度依赖性降低,表明肿瘤细胞侵袭转移能力的减弱。2.RB诱导PC3细胞发生S期细胞周期阻滞、抑制DNA合成,并RB诱导凋亡。流式细胞术分析表明RB浓度依赖性诱导PC3细胞发生S期阻滞；RB通过调控PC3细胞中的周期相关调节因子,包括细胞周期蛋白cyclin A、cyclin E、cyclinB的表达和成视网膜细胞瘤抑制蛋白Rb的磷酸化水平,对其周期施加影响。BrdU掺入实验表明RB抑制DNA合成,并下调增殖细胞核抗原PCNA的表达水平；DAPI染色显示RB诱导PC3细胞发生凋亡的形态学特征；RB浓度依赖性下调Bcl-2表达水平,Bax随之累积,Bax/Bcl-2匕例升高导致肿瘤细胞对RB诱导凋亡的敏感性；RB诱导caspases活化,促进PARP剪切,从而诱导凋亡。4.RB抑制LNCaP细胞中AR的转录活性并诱导凋亡。RB浓度依赖性抑制AR的蛋白表达水平；RB浓度依赖性抑制AR目的基因雄激素应答基因PSA的启动子活性,并抑制PSA的分泌,说明RB抑制AR转录活性。RB浓度依赖性激活caspase-3,并促进PARP的剪切,从而诱导凋亡。三、MA1诱导前列腺癌细胞凋亡和坏死1.MA1诱导细胞凋亡。AnnexinV-FITC/PI双染表明,MA1显著诱导PC3和LNCaP细胞发生凋亡；western blottin g结果显示,MA1激活caspase 3,PARP发生剪切,并降低抗凋亡蛋白Bcl-2水平；广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk部分阻断了MA1诱导的细胞死亡,说明其他类型的细胞死亡方式的存在。2.MA1诱导细胞坏死。PI染色显示MA1处理PC3和LNCaP细胞后,时间依赖性引起细胞坏死,伴随LDH大量泄漏；同时定量PCR结果显示,MA1诱导炎症因子的过表达,引起炎症反应。第二部分自噬影响Retigeric acid B和Malformin A,抗肿瘤活性的机制研究自噬(autophagy)是由溶酶体所介导的细胞对自身的降解机制。其作用过程为：双层膜包裹细胞内的组分形成自噬泡,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,通过溶酶体中酸性水解酶将其所包裹的内容物消化和降解,从而实现细胞对于本身的代谢活动需要以及细胞器的更新。自噬的作用属于细胞应对营养缺乏、氧化应激、损伤应激、感染时的自我保护机制,但在强烈的应激条件下,过度的自噬可作为一种细胞死亡程序诱导细胞产生自噬性死亡。近来研究证明,自噬,包括线粒体自噬,在肿瘤细胞中可被化疗药物引起的不同形式的细胞应激所诱导。多种天然来源的抗肿瘤药物如紫杉醇和喜树碱能够诱导自噬,对肿瘤进展的控制和确定肿瘤细胞对化疗的反应具有重要性。基于第一部分的化合物筛选结果,我们对RB和MA1的诱导自噬的信号机制及其对前列腺癌细胞的抑制作用进行了探讨,取得了以下研究成果：一、RB通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导保护性线粒体自噬1.RB诱导前列腺癌细胞自噬标志蛋白LC3B表达与LC3BII的形成。基因芯片和定量PCR数据显示,RB诱导PC3和LNCaP细胞中自噬标志蛋白LC3B上调约2.5-3.5倍,而其它自噬相关基因表达变化程度较小或无影响；western boltting结果显示RB诱导中LC3B表达上调,并促进LC3BII的生成；免疫荧光显示RB作用后,PC3细胞中出现点状LC3B聚集。2.抑制自噬促进RB诱导的细胞死亡。采用siRN A技术和小分子抑制剂3-MA或氯喹抑制自噬过程,显著抑制细胞存活率,并促进RB诱导的PC3细胞死亡,说明RB诱导保护性自噬,延迟前列腺癌细胞死亡。3.RB诱导线粒体损伤和ROS产生,并引起线粒体自噬。RB降低PC3和LNCaP细胞中线粒体膜电位,并呈时间依赖性,24h时膜电位均下降超过90%,导致线粒体严重损伤；通过流式细胞术显示,RB处理PC3和LNCaP细胞后,诱导ROS水平发生时间依赖性上升,24h时升高3倍以上；电镜观察发现RB处理PC3细胞后,线粒体过度肿胀,出现自噬泡和自噬溶酶体,且发现线粒体被自噬溶酶体包裹。4.RB通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬。RB能够抑制Akt及下游作用蛋白mTOR的磷酸化水平,从而通过PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬。二、MA1通过诱导氧化应激激活AMPK/mTOR信号通路而诱导致死性自噬1.MA1诱导前列腺癌细胞自噬标志蛋白LC3B表达与LC3BII的形成。western boltting与定量PCR结果显示MA1诱导LC3B表达上调,并促进LC3BII的生成,而对其它自噬相关基因Atg5,Atg7口Beclinl表达无影响；免疫荧光显示RB作用后,PC3细胞中出现大量点状LC3B聚集。2.采用小分子抑制剂3-MA抑制自噬,部分逆转MA1介导的细胞死亡,说明MA1诱导致死性自噬。3.MA1通过AMPK/mTOR信号通路诱导自噬。MA1作用后,AMPK显著活化,进而其下游作用蛋白mTOR磷酸化水平被抑制,而mTOR途径的另一上游信号Akt无变化。4.MA1通过诱导氧化应激激活AMPK/mTOR通路和自噬。MA1降低PC3和LNCaP细胞线粒体膜电位,呈时间依赖性,导致线粒体损伤；MA1诱导PC3和LNCaP细胞中ROS快速产生和ATP急剧消耗,并引起抗氧化蛋白SOD2,GSTP1和DJ-1过表达；采用小分子抗氧化剂VC和NAC能够部分逆转MA1介导的细胞增殖抑制；采用siRNA技术敲除SOD2后,LC3II水平上调且促进细胞死亡,通过pEGFP-N1-SOD2质粒使SOD2过表达后,MA1诱导的LC3BII水平发生下调且部分逆转细胞死亡,说明线粒体ROS累积和ATP消耗诱导的AMPK/mTOR信号通路参与MA1介导的自噬。基于以上第一和第二部分的实验结果,由于MA1能够诱导坏死和炎症反应而具有较大的细胞毒性,因此我们在将在后续部分着重研究RB的抗肿瘤作用机制。第三部分Retigeric acid B通过阻断NF-κB信号通路抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭转移NF-κB是前列腺癌多种发病因素下游的一个共同的关键环节,激活NF-κB信号引起肿瘤细胞的增值、浸润和转移。在经典NF-κB信号传导途径中,静息状态下,典型NF-κB二聚体(p50/p65)大部分与细胞质中的IκBa结合而以无活性的状态存在。各种信号通过降解IκBα的方式来活化NF-κB, IκBα的丝氨酸32、36位在IκBs激酶IKK的催化作用下发生磷酸化而被蛋白酶体泛素化降解,形成p50-p65二聚体,原先掩盖的核定位信号暴露,且p65亚基被磷酸化,促进核定位和转录活性,最终诱导目标基因的大量表达。基于第一和第二部分研究发现RB对前列腺癌细胞具有抑制增殖和侵袭转移的能力,并显著抑制Akt信号,在本部分中,我们深入研究了RB对雄激素非依赖型PC3和DU145细胞中Akt下游NF-κB信号通路的影响及RB通过NF-κB发挥增殖和侵袭转移抑制活性的功能机制,并通过动物模型证明RB的体内抗肿瘤作用。一、RB抑制肿瘤细胞p65磷酸化1.RB抑制前列腺癌细胞PC3和DU145中p65磷酸化水平,并呈浓度和时间依赖性；RB对p65总蛋白和mRNA的表达影响较小。2.RB对PC3和DU145细胞中p50与p52表达的无影响,说明RB对NF-κB的作用主要靶向经典通路。3.RB抑制其他癌细胞的p65磷酸化水平,包括人肝癌细胞HepG2、人骨髓白血病细胞K562和其阿霉素耐药株K562/AO2,而对人卵巢癌症SKOV3和人肺腺癌A549细胞影响较小。二.RB抑制前列腺癌细胞中NF-κB核定位与转录活性,同时阻断IκBα的降解1.RB抑制p65核定位。Western blottiong和免疫荧光结果显示,RB浓度依赖性降低PC3细胞核中磷酸化p65的水平,而在未经RB处理的细胞中p65在细胞质和细胞核中均广泛存在。2.EMSA结果显示RB浓度依赖性下调PC3细胞内NF-κB的DNA结合能力。3.RB抑制NF-κB的转录活性。通过荧光素酶报告基因活性检测,RB抑制PC3和DU145细胞中持续活化的以及LNCaP细胞中脂多糖诱导的NF-κB转录活性。3.RB抑制IκBα的磷酸化及其降解。Western blottiong显示RB处理导致PC3和DU145细胞中IκBα总蛋白过表达,IκBα磷酸化水平随之降低,呈浓度和时间依赖性；体外蛋白酶体活性测定显示,RB并未对重组20S蛋白酶体活性发挥抑制作用,说明RB可能通过抑制上游IKK激酶活性而抑制IκBα降解。三、RB通过阻断NF-κB通路下调NF-κB目的基因的表达,抑制细胞增殖和侵袭转移1.RB下调NF-κB目的基因的表达。Western blotting和定量PCR结果显示,RB浓度依赖性降低PC3和DU145细胞中bcl-xL、bcl-2、survivin和cyclin D1的mRNA水平和蛋白质水平。2.基因表达谱验证RB对NF-κB目的基因的影响,
关键词: 前列腺癌 ；Retigeric acid B ；Malformin A1 ；NF-κB信号通路 ；DNA损伤 ；自噬
被引量
1
摘要： 海洋生物体内含有众多的海洋生物活性物质，这是一个重要的天然药物资源。海洋生物活性物质抗肿瘤研究是新型抗癌药物开发和研究的一个重要领域。福安泰(FAT)是本实验室从海洋生物中分离出来的一种海洋生物活性成分，初步研究发现其具有强的抗癌生物活性。在此基础上，有必要对FAT抗肿瘤活性及机理进行深入系统的研究。
肿瘤增殖生长后通过侵袭和转移扩散到远端组织或器官是癌症病人死亡的主要原因。肿瘤侵袭转移是一复杂的过程，其基本过程包括：原发瘤增殖生长，肿瘤血管生成，肿瘤细胞侵袭邻近的基底膜和细胞外基质，进入淋巴道或血道并随淋巴液或血液到达远处部位的微血管，穿出血管进入继发组织或器官并增殖生长，形成转移灶并可继续转移形成新的转移灶。
肿瘤生长和转移都依赖血管生成，这是由美国哈佛医学院FolkmanJ博士发现的，并被一系列的研究所证实。因此，控制肿瘤的血管生成，不仅可以抑制原发瘤的生长，而且可以阻止肿瘤的转移。近年来，以肿瘤血管生成为靶点的抗血管生成疗法已是肿瘤治疗的研究热点之一。
肿瘤的侵袭转移机制在细胞和分子水平上已取得了一定得进展。Liotta等提出侵袭过程分为“三步”：粘附、降解细胞外基质、运动。上述三步重复进行，使得肿瘤细胞持续侵袭直至远处转移。肿瘤的转移受肿瘤转移促进基因和肿瘤转移抑制基因的调控。肿瘤侵袭转移的治疗对策，在于特异性的阻断其各个步骤。因此，根据Liotta提出的三步法则，抑制粘附、抗运动、抑制蛋白水解酶的分泌或其活性的物质，能有效抑制肿瘤的侵袭转移。
本研究旨在探讨FAT对肿瘤细胞诱导的血管生成的影响，对肿瘤细胞粘附、侵袭及肿瘤体内转移能力的影响，并对其可能的机理进行研究。
方法：
1.建立鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型，检测FAT对人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的血管生成的影响。
2.相关基底膜成分粘附实验、重组基底膜侵袭实验、Transwell小室趋化运动实验研究FAT对人高转移卵巢癌(HO-8910PM)细胞的粘附、侵袭和运动能力的影响。
3.明胶酶谱法检测FAT对HO-8910PM细胞Ⅳ型胶原酶的分泌量及Ⅳ型胶原酶活性的影响。
4.小鼠Lewis肺癌裸鼠移植瘤转移模型检测FAT对肿瘤生长与转移能力的影响。
5.B16小鼠黑色素瘤裸鼠转移模型检测FAT对肿瘤转移能力的影响。
6.免疫组化法检测FAT对肿瘤组织中微血管密度(MVD)和转移促进基因c-erbB-2表达的影响。
结果：1.鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验结果显示，FAT能够抑制人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)诱导的CAM的血管生成，且呈剂量依赖性，0.6×102、108×102、5.4×102μg·ml-1FAT的抑制率分别为10.9％、28.3％、33.9％。
2.FAT(20、40、60μg·ml-1)处理HO-8910PM细胞24h，降低HO-8910PM细胞对Matrigel的粘附，抑制率分别为14.72％、34.27％、40.52％;降低HO-8910PM细胞对FN的粘附，抑制率分别为15.06％、27.99％、54.05％。
3.FAT(20、40、60μg·ml-1)处理HO-8910PM细胞24h，对HO-8910PM细胞侵袭能力的抑制率分别为8.55％、14.96％、21.79％。FAT(20、40、60μg·ml-1)处理HO-8910PM细胞24h，对HO-8910PM细胞运动能力的抑制率分别为6.13％、12.07％、17.84％。
4.FAT(20、40、60μg·ml-1)降低HO-8910PM细胞MMP-9的分泌量及其活性，且呈一定的剂量依赖关系。
5.BALB/c裸小鼠灌胃FAT(10、20、30mg·kg-1·d)连续14天，对荷瘤裸鼠的体重无明显的影响。
6.BALB/c裸小鼠背部皮下接种Lewis肺癌细胞，发生自发性肝转移。BALB/c裸小鼠尾静脉接种B16小鼠黑色素瘤细胞，发生实验性肝转移。
7.FAT可明显抑制小鼠Lewis肺癌裸鼠移植瘤的生长，FAT(10、20、30mg·kg-1·d)对肿瘤生长的抑制率分别为20.5％、46.2％、61.5％。
8.FAT(10、20、30mg·kg-1·d)对小鼠Lewis肺癌自发性肝转移抑制率分别为25.9％、55.0％、82.8％;对B16小鼠黑色素瘤细胞实验性肝转移抑制率分别为42.1％、64.2％、89.1％。
9.免疫组化实验结果显示，FAT灌胃使小鼠Lewis肺癌移植瘤组织中微血管密度(MVD)明显降低;转移促进基因c-erbB-2表达显著降低。
结论：
1.FAT抑制人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成，其抑制效果与剂量呈正相关。
2.FAT显著抑制人高侵袭卵巢癌HO-8910PM细胞对Matrigel、纤维粘连蛋白的粘附，且与剂量相关;FAT降低HO-8910PM细胞侵袭人工重组基底膜能力和对FN的趋化性运动能力。FAT对HO-8910PM细胞侵袭能力的影响，与其降低HO-8910PM细胞的粘附能力、运动能力及其Ⅳ型胶原酶的分泌量及其活性有关。
3.FAT对BALB/c裸小鼠无明显的毒副作用。
4.FAT抑制BALB/C裸小鼠移植性Lewis肺癌的生长及其自发性肝转移。
5.FAT抑制B16小鼠黑色素瘤细胞实验性肝转移。
6.FAT降低小鼠Lewis肺癌组织中的微血管密度(MVD)。
7.FAT下调LLC细胞中转移促进基因c-erbB-2的表达。
8.综合体内外实验结果，FAT对肿瘤生长和转移的影响与其抑制肿瘤血管生成、降低肿瘤细胞的侵袭能力、下调转移促进基因c-erbB-2的表达相关。
关键词: FAT ；抗血管生成 ；微血管密度 ；黑色素瘤 ；肺肿瘤 ；肿瘤转移
被引量
1
摘要： 细胞内蛋白激酶是控制细胞增殖、分化或凋亡的重要调控因子之一。蛋白激酶可以将细胞表面信号传导入细胞核内，引起基因表达改变。在已知的信号传导通路中，MAPK（mitogen-activated protein kinase，丝裂原激活的蛋白激酶）信号转导通路是近年来研究的一个热点。MAPK通路原件进化上高度保守，每个组件均由三个胞浆激酶构成：MAPKKK（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，丝裂原激活的蛋白激酶的激酶的激酶），MAPKK（mitogen-activated protein kinase kinase，丝裂原激活的蛋白激酶的激酶），MAPK。目前普遍被接受的MAPK信号转导通路的模式途径是：Raf-MEK1／2-ERK通路，MEKK1-MEK4／7-JNK通路和TAK-MEK3／6-P38通路。人MEKK1蛋白的分子量为196kDa，由1495个氨基酸组成，是一个重要的MAPKKK蛋白激酶。本论文通过将人MEKK1基因转染入小鼠黑色素瘤细胞B16，经过筛选鉴定，建立了稳定高表达MEKK1的小鼠黑色素瘤细胞株M1B16。研究发现MEKK1基因可以抑制B16细胞的生长。与对照细胞相比，M1B16细胞在体外软琼脂集落形成的能力降低，体内在C57／BL6小鼠致瘤性降低，在Balb／c裸鼠肿瘤生长抑制。MEKK1基因使B16细胞形态变长，体内外生长均呈现类成纤维细胞形态；MEKK1可以使B16细胞粘附能力减弱，细胞内Calpain-1酶活性降低；使B16细胞体外侵袭运动能力增强，体内转移活性增加。这与多数关于MEKK1基因功能的报道一致。采用MTT法，就常见抗肿瘤药物对M1B16的作用进行了初步观察，结果表明与对照细胞B16和PB16相比，Taxotere和Taxol对M1B16的IC50增加了约10倍，PD153035的IC50提高了约20倍。这一结果提示本高表达细胞模型可能用于筛选针对微管和EGFR-MEKK1-MEK4／7-JNK通路的特异性抑制剂。总之，本文成功地建立了稳定高表达MEKK1的小鼠黑色素瘤细胞株M1B16，研究表明该细胞株可以作为细胞水平的药物筛选模型用于筛选针对MEKK1特异性的抑制剂。
MEKK1作为三激酶通路的上游激酶在细胞的生长、增殖、运动、迁移以及机体的应激过程中发挥重要作用，但是国内外尚未见有对肿瘤细胞中MEKK1表达水平的报道。为了快速测定细胞中MEKK1的表达，本研究建立了一套直接竞争ELISA方法，可以快速测定细胞样品中MEKK1的表达水平，其灵敏度为0.17ng／mL，检测范围为0.1-10000ng／mL。方法学实验表明本方法稳定可靠，变异系数的范围在2.81到10.12之间，回收率在89.23％与109.32％之间。本方法在标准样品浓度在1.7×10-4和10μg／mL之间时线性关系良好，相关系数R2为0.9937。总之，所有检测数据显示本方法重复性好、灵敏度高，是一种定量检测细胞样品中MEKK1表达水平的可靠方法。可以用于研究细胞中MEKK1的表达，快速筛选作用于MEKK1的药物。利用已建立的ELISA方法对常见细胞株中MEKK1的表达水平进行了检测。结果表明，人胰腺癌细胞（PC-3）和人胚胎脐静脉内皮细胞（ECV304）中MEKK1的表达明显高于其它细胞株，从另一个角度说明MEKK1在调节胰腺癌细胞生长、分化、增殖以及血管生成方面的重要作用。
本实验室对从传统有毒草药萝摩科娃儿藤和三分丹中分离到的十余种抗肿瘤成分进行了大量的初筛和复筛，从中发现CAT在体内外均具有较强的抗肿瘤活性，且具有良好的量效关系。本文深入探讨了化合物CAT的体外抗肿瘤作用及其作用机制。
MTT法发现CAT可抑制多种体外培养的肿瘤细胞的生长，在体外的半数抑制浓度IC50范围在0.044～0.286μmol／L。SRB法观察了CAT对这些肿瘤细胞生长的影响，结果表明CAT可不同程度地抑制这些细胞的生长，半数抑制浓度GI50范围在0.023～0.103μmol／L，完全抑制浓度TGI范围在0.079～0.390μmol／L。细胞生长曲线和集落形成实验表明，CAT可剂量依赖性地抑制人肝癌细胞Bel7402和人结肠癌细胞HCT-8的生长和集落形成能力。流式细胞分析表明，CAT使Bel7402细胞阻断于Gl和S期。Western Blot分析表明CAT处理Bel7402细胞12h，可使P53蛋白表达量增加，处理Bel7402细胞24h可使P16、P21和CyclinA蛋白的表达量明显升高。将CAT与DNA Topo I及pBR322 DNA在体外共同孵育可观察到对酶活性的抑制作用，结果表明CAT可明显抑制DNA Topo I的解旋活性，使超螺旋型DNA的量明显增加，同时加入CAT的DNA条带位移明显滞后。这一结果提示，CAT可能通过嵌入DNA，抑制DNA解聚及断裂DNA重新连接而发挥作用。
CAT作用小鼠黑色素瘤B16-BL6细胞15h，使B16-BL6细胞侵袭穿过重组基底膜的能力明显下降，0.02、0.04和0.08μmol／L CAT使B16-BL6细胞的侵袭能力分别降低57％、75％和86％（P＜0.01）。经不同浓度CAT作用2h后，B16-BL6细胞与基底膜成分的粘附受到不同程度的抑制，并呈一定的剂量依赖关系。用底物酶谱法观察CAT对人肉瘤细胞HT-1080分泌基质金属蛋白酶能力的影响，结果表明不同浓度CAT作用24h，可以剂量依赖性地抑制MMP-2的分泌。以上结果均表明CAT在体外可有效作用于肿瘤细胞侵袭转移的各环节，阻断侵袭转移的发生。
CAT对人胚胎脐静脉血管内皮细胞ECV304的增殖具有明显的抑制作用，MTT试验测得其半数抑制浓度IC50为0.088μmol／L，SRB试验测得其半数抑制浓度GI50为0.10μmol／L，完全抑制浓度TGI为0.22μmol／L。采用fibronectin作趋化剂，观察了CAT对ECV304细胞迁移能力的影响。结果表明，0.02、0.04和0.08μmol／L CAT可明显抑制ECV304细胞的迁移，对ECV304细胞的趋化性运动能力的抑制率分别为55％、65％和82％（P＜0.01）。用底物酶谱法观察CAT对ECV304细胞分泌基质金属蛋白酶能力的影响，结果表明不同浓度CAT作用24h，可以剂量依赖性地抑制MMP-2和MMP-9的分泌。CAT在体外表现出较强的抑制血管生成的作用，明显抑制ECV304细胞在Matrigel基质上形成的管腔结构。0.02、0.04和0.08μmol／L CAT处理ECV304细胞24h，可使其在Matrigel基质上形成管腔结构的能力分别降低至对照组的81.8％、54.6％和16.1％。另外CAT还可抑制KDR及MMP-9基因的表达。CAT对血管生成的抑制作用可能是其体内抑制肿瘤生长和侵袭转移的一个重要原因。
综上所述，CAT在体外可广泛抑制不同组织来源的肿瘤细胞的生长，其作用机理可能与CAT嵌入DNA，抑制DNA Topo I的解旋活性，使细胞内与细胞周期调控相关的蛋白P53、P21、P16和CyclinA表达增加，细胞停滞于Gl和S期有关。同时CAT在体外还表现出较强的抗转移和抗血管生成作用。因此，CAT很可能成为一个新型具有自主知识产权，作用机制独特的潜在抗肿瘤药物。
关键词: 细胞表面 ；ECV ；中国医学科学院 ；丝裂原激活的蛋白激酶 ；CAT ；MEKK1 ；肿瘤细胞 ；MMP ；基质金属蛋白酶 ；抗肿瘤作用 ；生物碱 ；细胞模型 ；机制研究 ；分子水平