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摘要： 目的探讨腺病毒介导的神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因脑内转移对帕金森病(PD)的保护作用。方法采用C57Bl/6小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-henyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine,M PTP)法建立PD模型,随机分为重组GDNF腺病毒(Ad-GDNF)实验组和对照组。Ad-GDNF实验组将Ad-GDNF定向注射至侧脑室,对照组将无GDNF基因的腺病毒定向注射至侧脑室,并测量体质量,进行行为学实验评分,行中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色,高压液相色谱-电化学仪(HPLC-ECD)检测纹状体多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量,采用ELISA、RT-PCR法检测Ad-GDNF在中脑的表达。结果侧脑室注射病毒后2周,Ad-GDNF实验组体质量、行为学实验得分、黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞、纹状体DA含量均显著高于对照组(P<0.05);Ad-GDNF实验组在中脑内有过表达,中脑GDNF含量约是对照组2倍。结论侧脑室注射腺病毒介导的GDNF基因可减轻1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-henyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine,M PTP)诱发的小鼠DA能神经元进行性变性,保护DA能神经元,提示这一手段在PD保护性治疗方面具有一定的应用价值。
关键词: 神经胶质细胞源性神经营养因子 ；腺病毒 ；帕金森病 ；基因治疗 ；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶
被引量
6
摘要： 目的 探讨腺病毒介导的胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)基因直接转移对帕金森病 (PD)的保护作用。 方法 实验SD大鼠分重组GDNF腺病毒 (Ad GDNF)实验组、LacZ腺病毒 (Ad LacZ)对照组和磷酸缓冲液 (PBS)对照组。将重组腺病毒及PBS定向注射至一侧黑质附近 ,1周后于同侧纹状体注射 6 羟基多巴胺 (6 OHDA)诱发多巴胺 (DA)能神经元进行性变性。通过旋转行为观察和中脑酪氨酸羟化酶 (TH)免疫组化染色及纹状体单胺类递质高压液相色谱 电化学仪 (HPLC ECD)检测评估其治疗效应 ;通过RT PCR、ELISA检测Ad GDNF在脑内的表达情况。 结果 Ad GDNF组阿扑吗啡诱发的旋转次数明显低于 2个对照组 ;Ad GDNF组约 70 %的黑质DA能神经元得以保存 ,而Ad LacZ及PBS对照组仅有 30 %左右 ;Ad GDNF组纹状体DA含量也显著高于Ad LacZ及PBS对照组 ;Ad GDNF在脑内可有效表达 ,注射后 5周黑质附近GDNF含量达 1ng/ 10mg脑组织湿重 ,是对照组的16～ 2 0倍。 结论 腺病毒介导的GDNF基因脑内直接转移可阻止 6 OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性 ,提示这一手段在PD保护性治疗方面具有一定的应用价值。
关键词: 脑源性神经营养因子 ；腺病毒 ；基因 ；帕金森病 ；保护作用 ；动物实验
被引量
11
摘要： 研究背景:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是世界上最常见的神经退行病之一。功能异常的细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase,CDK5)被认为在神经退行性疾病的发生发展中起重要作用,包括帕金森病。p35是CDK5酶活性的调控因子,其裂解片段p25可以结合并且激活CDK5。但p25半衰期比p35更长,导致激酶下游底物蛋白被过度磷酸化,包括神经炎症和神经元凋亡相关的底物蛋白等。前期研究我们证实了使用腺相关病毒(AAV-9)介导CDK5抑制肽(cip)能有效阻止CDK5/p25复合物的活性,并且能缓解阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)转基因模型鼠的病理及行为学改变。本研究探索AAV9-GFP-CIP是否能缓解MPTP/p诱导PD模型鼠的多巴胺能神经元丢失。研究目的:1.构建病毒载体AAV9-GFP-CIP以及对照空载体病毒AAV9-GFP。2.观察AAV9病毒载体在活体内表达水平、范围及持续时间等特点。3.分组实验观察CIP是否能缓解MPTP/p诱导PD模型鼠的多巴胺能神经元丢失,以及可能的保护机制。4.通过行为学检测分析CIP是否有改善PD模型的行为学指标。研究方法:1.通过质粒构建相应病毒载体及病毒包装。2.MPTP+丙磺舒方案进行PD模型构建。3.立体定位仪行定位行右侧侧脑室注射,切片观察病毒注射后颅内表达特点。4.分组实验后通过病理切片免疫组化实验及Western blot分析中脑多巴胺能神经元含量,以及相应的蛋白表达水平变化。5.行为学检测分析各组小鼠行为学变化特点。6.统计分析:本研究全部数据均采用SPSS20.0及GraphPad Prism 6.05统计分析软件进行,两组间比较采用独立样本t检验分析;检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。研究结果:1.前期实验我们已经成功构建了相应的病毒质粒载体,经细胞转染实验后观测荧光标记蛋白表达及Western blot检测分析验证GFP-CIP及GFP产物均有明显表达。2.PD模型构建后中脑病理切片和Western blot检测造模组酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)较对照组均降低,提示造模成功。3.立体定位注射AAV9病毒后免疫组化可见病毒在双侧海马、皮层及中脑均有广泛表达,后期观察注射后10月后仍能检测目的蛋白表达。4.分组实验结果显示在MPTP/p给药前一周行侧脑室注射AAV9-GFP-CIP能有效缓解模型鼠基底节黑质致密部多巴胺能神经元丢失,同时对照组及治疗组的磷酸化MEF2D较模型组及阴性对照组减少,提示CIP可能通过阻止神经保护因子MEF2D被CDK5/p25磷酸化而发挥作用。5.行为学检测提示治疗组的运动功能及焦虑行为改变较模型组及阴性对照组有所缓解,提示CIP可缓解PD模型鼠运动及焦虑的行为学改变。结论1.AAV9病毒后经侧脑室注射后可在海马、皮层及中脑部位神经元内有广泛表达,而且其在体内表达维持10月后仍能检测目的蛋白,具有安全、有效、持久及特异性好等特点。2.在MPTP/p构建慢性PD模型前使CIP在多巴胺能神经元内持续有效的表达能缓解MPTP/p造成的CDK5/p25过度激活以及多巴胺能神经元的丢失,同时缓解慢性PD模型的焦虑行为表现。
关键词: CDK5 ；p25 ；帕金森病 ；AAV9 ；MEF2D
被引量
2
摘要： 随着医疗技术的进步与人类老龄化进程的加快,接受手术的老龄患者数量也在不断增加,术后出现的认知功能障碍也逐渐受到关注。术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction,POCD）是术后常见并发症,尤其在老年患者中更为常见,其临床表现为手术后人格、社交能力及认知能力的变化[1,2]。导致POCD的因素,主要包括:患者自身因素、手术因素和麻醉因素等。随着研究的深入,人们对其致病机制有了更深层次的了解,主要有:胶质细胞介导的炎症反应、线粒体功能的损伤以及细胞自噬功能障碍等[3]。而其中胶质细胞所介导的炎症反应备受关注,在与POCD发病机制相似的中枢神经损伤相关的神经退行性疾病中,发现过量脂滴引起的神经炎症会促进疾病的进展[4]。同时,在POCD患者中也发现了其胶质细胞上有脂滴的积累,且伴随有高炎症反应。因此,阐明POCD患者的胶质细胞中脂滴聚集所诱发的神经炎症反应机制,是治疗POCD的重要突破口。星形胶质细胞作为脑内最为丰富的胶质细胞,在维持脑内稳态平衡中起着至关重要的作用。一方面,星形胶质细胞可分泌多种炎症因子,例如白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）等促炎因子,导致神经元细胞的损伤[5];另一方面,星形胶质细胞也可分泌营养因子与抗氧化因子,如白介素-10（Interleukin-10,IL-10）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）等,减少细胞内氧化应激带来的损伤,从而起到神经保护效应。此外,作为脑内有害物质降解的重要场所,星形胶质细胞中脂滴的分解代谢即可降低神经元细胞的损伤,同时也为细胞的代谢提供了能量底物。另有研究表明:星形胶质细胞中的A1型炎性表型与A2型抗炎表型都与POCD有关,提高A2型星形胶质细胞比例,降低A1型星形胶质细胞的数量是缓解POCD患者神经损伤的重要方式[5,6]。因此,了解星形胶质细胞所参与的生理功能,探索其分解代谢脂滴与缓解神经炎症的具体机制,是探寻POCD治疗学的重要方向。大麻素Ⅱ型受体（Cannabinoid type Ⅱ receptor,CB2R）作为G-蛋白偶联受体（G protein coupled receptor,GPCR）,是治疗多种炎性相关疾病的重要靶点。在神经退行性疾病的相关研究中发现:阿尔兹海默症（Alzheimer's disease,AD）病人的尸检结果提示:CB2R在AD患者脑内上调明显[7,8];另外激活动物模型中的CB2R可缓解小胶质细胞介导的神经毒性作用[9]。在其他的神经退行性疾病如帕金森病（Parkinson's Disease,PD）、亨廷顿病（Huntington's disease,HD）中都发现了CB2R在脑内明显上调[7]。除此之外,在肿瘤的研究中,也发现了癌症的预后生存、组织分级等都与高表达的CB2R相关[10]。因此,CB2R作为极具治疗潜力的作用靶点,是治疗POCD的潜在受体。因此,了解其作用机制,探索其发挥作用的重要通路,是研究CB2R治疗学的重要方向。本课题在前期的研究基础上,第一部分通过腺相关病毒敲减星形胶质细胞上的CB2R,使用免疫荧光染色与脂滴荧光探针BODIPY染色,检测星形胶质细胞上脂滴的积累;另外通过实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantification PCR,Q-PCR）检测海马脑区脂滴代谢与氧化还原相关基因的表达、行为学检测小鼠的认知能力等,发现CB2R在星形胶质细胞上的敲减会加重POCD中脂滴的积累与认知能力的损伤。同时又在小鼠的侧脑室注入CB2R激动剂JWH133或抑制剂AM630,通过BODIPY脂质探针检测、Q-PCR检测脂滴代谢相关基因以及认知行为学的检测等,发现CB2R的激动不仅减少了星形胶质细胞上脂滴的积累与炎症因子IL-1β的表达,同时缓解了小鼠的认知障碍。在此基础上,我们在第二部分的研究中,通过免疫组化染色、尼氏染色、高尔基染色检测发现:CB2R的激活减少了海马神经元的丢失,抑制了星形胶质细胞的激活,缓解了神经元损伤;另外我们培养U87细胞系,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）建立体外细胞的炎症模型,使用脂滴荧光探针BODIPY与线粒体膜电位荧光探针JC-1与线粒体探针Mitochondrial Tracker检测CB2R对U87细胞脂滴积累与线粒体功能的影响,发现CB2R的激活减少了LPS引起的脂滴积累、缓解了线粒体功能的损伤。第三部分我们研究CB2R激活影响脂滴积累的机制,通过转染转录因子EB（Transcription factor EB,TFEB）的突变质粒以及转染si RNA-PGC-1α等,观察细胞内自噬相关表型的变化以及脂滴沉积与炎症因子的表达;另外通过染色质免疫共沉淀（Chromatin co-immunoprecipitation,Ch IP）与荧光素酶报告基因实验检测到TFEB与PPARG共激活剂1 alpha（PPARG coactivator 1 alpha,PGC-1α）结合的具体位点为PGC-1α启动子的1100bp-1400bp与1509bp-1850bp位点。因此,本课题阐明了CB2R调控POCD小鼠星形胶质细胞脂滴沉积与代谢降解的具体机制,为后续POCD患者的治疗提供了新的理论基础。第一部分CB2R调控的脂滴积累和神经炎症反应与POCD的相关性目的:研究CB2R是否与POCD中星形胶质细胞的脂代谢及神经炎症相关方法:对在体POCD小鼠模型海马脑区注入星形胶质细胞特异性敲减CB2R的腺相关病毒,通过脂滴探针BODIPY染色检测脂滴,Q-PCR检测海马脑区脂滴代谢相关基因的表达与行为学检测等,观察CB2R的敲减对POCD的影响。同时,在小鼠的侧脑室注入CB2R激动剂JWH133与抑制剂AM630,通过与上述相同的BODIPY染色、行为学检测等,观察CB2R的激动或抑制是否影响小鼠海马脑区脂滴的积累与炎症反应等。结果:（1）星形胶质细胞上CB2R的敲低加重了POCD小鼠海马脑区星形胶质细胞上脂滴的积累;（2）星形胶质细胞上CB2R的敲低抑制了POCD小鼠海马脑区脂滴代谢相关基因、抗氧化相关基因的表达;（3）星形胶质细胞上CB2R的敲低加重了POCD小鼠的认知障碍;（4）激活CB2R减少了POCD小鼠海马脑区脂滴分子的积累;（5）激活CB2R减少了POCD小鼠海马星形胶质细胞上脂滴的积累;（6）激活CB2R抑制了POCD小鼠海马脑区星形胶质细胞上IL-1β的表达;（7）激活CB2R提高了POCD小鼠海马脑区脂滴代谢与抗氧化相关基因的表达;（8）激活CB2R缓解了POCD小鼠的认知障碍。结论:（1）CB2R与POCD中脂滴的积累及认知能力相关,敲减海马脑区CB2R会加重POCD小鼠脂滴的积累,损伤认知能力;（2）激活CB2R减少星形胶质细胞中脂滴的积累与炎症因子的表达,缓解认知损伤。第二部分CB2R缓解细胞线粒体功能的损伤与POCD神经保护的相关性目的:研究CB2R是否与POCD小鼠的神经保护及线粒体功能相关方法:在体动物模型中,通过侧脑室注射CB2R激动剂JWH133与抑制剂AM630,使用免疫组化、尼氏染色、高尔基染色等方法观察CB2R与POCD小鼠神经元丢失、星形胶质细胞激活之间的相关性。另外离体培养U87细胞,通过脂滴探针BODIPY染色、线粒体膜电位探针JC-1染色以及线粒体探针Mito Tracker来检测CB2R与U87细胞中脂滴积累及线粒体功能的相关性。结果:（1）激活CB2R抑制POCD小鼠海马脑区星形胶质细胞的激活;（2）激活CB2R缓解了POCD小鼠海马脑区神经元数量的减少;（3）激活CB2R缓解了POCD小鼠海马脑区突触的损伤;（4）激活U87细胞上CB2R减少了LPS引起的脂滴积累;（5）激活U87细胞上CB2R抑制了LPS引起的线粒体膜电位降低;（6）激活U87细胞上CB2R缓解了LPS引起的线粒体数量的减少。结论:（1）在体实验中CB2R的激活缓解了POCD小鼠的神经损伤。（2）离体实验中CB2R的激活缓解了U87细胞中脂滴的积累与线粒体功能的损伤。第三部分CB2R-TFEB-PGC-1α参与的自噬调控促进脂滴分子的降解及减少炎症因子的分泌目的:研究CB2R-TFEB-PGC1α通路调控脂滴分解代谢的具体机制方法:首先干扰U87细胞中TFEB的表达,结合Q-PCR与自噬流双荧光病毒的转染来检测CB2R-TFEB对细胞自噬的调控;其次通过转染TFEB突变位点的质粒GV143-S211A,GV143-S142A,并结合胞浆胞核蛋白的提取与免疫荧光观察TFEB是否入核参与下游自噬的调节;最后结合网站数据分析,应用Ch IP与荧光素酶报告基因实验,验证TFEB与脂代谢关键转录因子PGC-1α的具体结合位点,并干扰PGC-1α来观察CB2R的激活对U87细胞脂滴代谢以及炎症的影响。结果:（1）敲减TFEB会抑制CB2R激活后促进U87细胞自噬相关基因m RNA水平的上调;（2）敲减TFEB会抑制CB2R激活后促进U87细胞自噬流通畅的作用;（3）敲减TFEB会取消CB2R激活后促进U87细胞脂滴降解的作用;（4）敲减TFEB会取消CB2R激活后抑制U87细胞炎症因子IL-6、IL-1β的表达作用;（5）CB2R的激活促进了U87细胞中TFEB的入核;（6）CB2R的激活促进了TFEB第211号丝氨酸的去磷酸化;（7）CB2R的激活促进了PGC-1α的表达;（8）过表达TFEB促进了U87细胞中PGC-1α的表达;（9）CB2R激活后促进了TFEB与PGC-1α启动子区1100bp-1400bp及1509bp-1850bp片段的结合,增强了PGC-1α的转录。（10）敲减PGC-1α,取消了CB2R激活后促进脂滴降解及抑制炎症反应的作用。结论:（1）激活CB2R可促进TFEB介导的自噬作用,增加脂滴的分解,减少炎症因子的产生。（2）激活CB2R可促进TFEB与PGC-1α启动子区1100bp-1400bp及1509bp-1850bp片段的结合,增强脂滴的代谢。综上所述:本文的创新点在于:（1）阐明了CB2R与POCD中脂滴积累及神经炎症的相关性;（2）揭示了激活CB2R可促进TFEB与脂滴代谢相关基因PGC-1α启动子区1100bp-1400bp及1509bp-1850bp片段结合的机制,为后续开发用于早期防治POCD的靶向性药物提供了新的实验依据和理论支持。
关键词: CB2R ；星形胶质细胞 ；脂滴积累 ；神经炎症 ；自噬 ；术后认知功能障碍
摘要： 多发性硬化症(Multiplesclerosis,MS)是一种中枢神经系统慢性炎症性疾病,以血管周围炎症、脱髓鞘、轴突损伤和神经元丢失为特征。MS的发病机制尚不明确,目前认为与遗传和环境因素有关。在脱髓鞘损伤的早期阶段,少突胶质前体细胞(Oligodendrocyteprecursorcells,OPCs)被募集至脱髓鞘区域诱导分化为少突胶质细胞(Myelinatingoligodendrocytes,OLs)。随着疾病的进展,成熟OLs的生成效率下降导致髓鞘再生能力降低。因此,诱导OPCs分化和成熟是促进髓鞘再生和改善中枢神经系统脱髓鞘的重要治疗策略。CXC趋化因子受体2(CXC chemokine receptor2,CXCR2)是一种在外周中性粒细胞和中枢神经系统少突胶质细胞高表达的G蛋白偶联受体,参与调控OPCs的迁移、增殖和分化过程,但其调控机制尚未完全阐明,本实验旨在进一步研究CXCR2在OPCs分化成熟及促进髓鞘再生中的作用和机制。本研究首先采用原代培养的少突胶质细胞和溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)侧脑室注射诱发脱髓鞘大鼠模型观察抑制CXCR2对少突胶质细胞标志蛋白表达水平的影响。结果表明当用SB225002抑制CXCR2表达后,OPCs未分化标志物血小板衍生生长因子受体 α(Platelet derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)蛋白水平明显降低,成熟标志蛋白脂蛋白(Proteolipid protein 1,PLP1)、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)、髓鞘相关糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein,MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)和接触蛋白相关蛋白(Contactin associated Protein,Caspr)的表达明显增加,提示抑制CXCR2可促进OPCs分化为OLs。劳克坚牢蓝(Luxolfastblue,LFB)染色可用于评价大鼠脑内髓鞘缺失程度,染色结果显示抑制CXCR2能明显改善EB大鼠胼胝体髓鞘断裂和缺失,提高髓鞘相关蛋白MBP、MAG、MOG、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(Myelin-associated oligodendrocyte basic protein,MOBP)和 Caspr 的表达,促进OPCs的分化成熟,进而提高大鼠脑内髓鞘再生功能,减轻脱髓鞘大鼠运动障碍。实验室前期转录组学结果表明磷酸二酯酶(Phosphodiesterase 10A,Pde10a)可能是CXCR2参与双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导脱髓鞘小鼠的重要基因,我们进一步在原代培养的OPCs和EB脱髓鞘大鼠模型中进行蛋白免疫印迹实验,结果证实拮抗CXCR2可显著抑制PDE10A蛋白的表达。为进一步阐明CXCR2与PDE10A的调控作用,采用免疫共沉淀和免疫荧光方法检测发现CXCR2可与PDE10A共定位并相互作用。此外,使用TAK-063抑制PDE10A的表达以及转染pcDNA-PDE1OA质粒过表达PDE10A蛋白,发现抑制或过表达PDE10A均不影响CXCR2表达水平,但PDE10A蛋白表达随CXCR2表达水平减少而降低,表明PDE10A是CXCR2重要的下游蛋白,抑制CXCR2可通过调控PDE10A发挥促进髓鞘再生和修复的作用。为进一步探究PDE10A对少突胶质细胞分化成熟以及对髓鞘再生的作用,使用TAK-063抑制PDE10A的表达观察对少突细胞谱系标记物的影响。结果表明抑制PDE10A可明显降低OPCs未分化标志蛋白A2B5的表达,促进成熟标志物PLP1、MBP、MOG和MOBP的表达;而转染Pde10a质粒过表达PDE10A蛋白后,OPCs的分化成熟能力减弱。此外,在EB诱导脱髓鞘大鼠模型中,抑制PDE10A可促进髓鞘分化成熟标志蛋白的表达,促进MS模型大鼠脑内的髓鞘再生。我们进一步使用qPCR检测髓鞘相关转录因子含量,ELISA和蛋白免疫印迹检测信号通路分子和蛋白磷酸化水平。结果显示抑制CXCR2/PDE10A后可激活cAMP/ERK1/2信号通路,促进髓鞘相关转录因子SRY-box转录因子10(SRY-box transcription factor 10,Sox10)、少突胶质细胞转录因子 2(Oligodendrocyte Lineage Transcription Factor 2,Olig2)、髓鞘调节因子(Myelin regulatory factor,Myrf)、锌指蛋白 24(Zinc finger protein 24,Zfp24)的表达,最终促进髓鞘蛋白的生物合成和髓鞘再生功能。综上所述,抑制CXCR2能够促进OPCs的成熟与分化,减轻髓鞘缺失和断裂,促进髓鞘再生。机制研究表明PDE1OA/cAMP/ERK1/2是CXCR2调节髓鞘再生的下游关键信号通路。本研究阐明了 CXCR2是治疗脱髓鞘疾病的重要分子靶点,并为以CXCR2为靶点研发治疗脱髓鞘疾病的药物提供理论依据。帕金森氏病(Parkinson's diseases,PD)是人类第二大中枢神经系统退行性疾病,以黑质致密部多巴胺能神经元变性和路易小体形成为主要病理特征。PD的发病机制尚未完全阐明,目前认为与遗传因素、年龄、性别、环境因素和行为习惯等多种因素均有关。越来越多的证据显示,PD具有明显的神经炎症和免疫功能异常,与抑郁、睡眠障碍和胃肠功能紊乱等非运动症状有关。此外研究表明在PD患者血清和脑脊液中促炎因子含量显著升高,脑内炎性细胞浸润以及小胶质细胞活化水平明显增强。组织学和影像学检查同样证实患者脑内存在持续的神经炎症反应,介导多巴胺能神经元受损,在PD疾病进展中发挥着重要作用。因此抑制脑内过度激活的神经炎症反应,缓解或阻止多巴胺能神经元变性过程是目前PD治疗的重要策略。酪氨酸磷酸化调节激酶 1A(Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A,DYRK1A)是一种双底物特异性的蛋白激酶。研究发现,DYRK1A除了介导神经元发育和细胞周期调节等生物学过程,还可通过调控神经炎症反应在多种神经退行性疾病发病中起着重要作用。在PD疾病进展中,DYRK1A通过磷酸化α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)和PARKIN蛋白介导神经毒性作用,但其通过调控神经炎症参与PD发病的作用和机制尚未阐明,因此本实验将在脂多糖(Lipopolysacchride,LPS)刺激的小胶质细胞神经炎症模型和鱼藤酮诱导的小鼠PD模型中,对DYRK1A介导神经炎症及多巴胺能神经元损伤的作用和机制进行研究和探讨。首先采用LPS诱导BV2小胶质细胞构建神经炎症细胞模型观察DYRK1A激酶的变化。结果显示DYRK1A的含量和激酶活性在神经炎症中显著上调,表明DYRK1A参与炎症过程。当用Harmine抑制DYRK1A后可显著抑制小胶质细胞激活标志物离子钙结合蛋白受体分子1(Ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1)的表达,降低炎症蛋白环氧化酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达水平,进而抑制炎症反应。为了探讨DYRK1A是否可通过调控小胶质细胞极化而抑制神经炎症,本实验进一步在LPS诱导的神经炎症模型中对小胶质细胞M1型和M2型标志蛋白进行检测,发现LPS可明显刺激BV2细胞中一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,iNOS)和CD86蛋白的表达,下调精氨酸酶 1(Arginase 1,Arg1)和甘露糖受体1(Macrophagemannose receptor 1,CD206)水平。当用Harmine抑制DYRK1A后可促进M1型BV2细胞转化为M2型,调控小胶质细胞的极化水平,抑制神经炎症反应。随后采用BV2细胞条件培养基研究DYRK1A介导神经炎症对神经元的影响。结果表明LPS可诱导BV2细胞条件培养基中产生大量炎症因子,最终导致SH-SY5Y细胞形态异常和死亡。而抑制DYRK1A的BV2条件培养基通过降低小胶质细胞中促炎蛋白和提高抗炎蛋白表达而缓解神经元损伤,提高SH-SY5Y细胞的存活率。在鱼藤酮诱导PD小鼠模型中,行为学实验结果进一步表明抑制DYRK1A可提高小鼠运动和协调能力。蛋白免疫印迹结果显示Harmine可促进小鼠中脑内小胶质细胞从M1型向M2型的转化,减轻脑内促炎蛋白产生,增加抗炎蛋白的表达。酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)染色结果显示,Harmine可明显改善鱼藤酮诱导小鼠黑质多巴胺能神经元的丢失和死亡,提高多巴胺能神经元存活率。为进一步证实DYRK1A在PD中的调控作用,我们将DYRK1A shRNA腺病毒载体注射至α-syn(A53T)转基因PD模型小鼠的黑质区域,通过蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色检测小鼠脑内神经炎症蛋白和TH阳性神经元数量。结果显示,A53T转基因模型小鼠中脑内DYRK1A表达显著升高。沉默DYRK1A可抑制模型组小鼠炎症蛋白iNOS和COX2的表达,抑制小胶质细胞激活,减轻黑质TH阳性神经元损伤。进一步机制研究表明,细胞凋亡信号激酶(Apoptosis signal regulating kinase-1,ASK1)是 DYRK1A 蛋白的底物,抑制DYRK1A可通过降低ASK1/JNK/P38蛋白磷酸化水平调控体内外小胶质细胞极化进而减轻神经炎症反应,保护PD模型中多巴胺能神经元。此外单独抑制ASK1也可通过减轻JNK/P38蛋白激活调控M1/M2表型,证实ASK1/JNK/P38信号通路通过影响小胶质细胞极化过程参与DYRK1A介导的神经炎症反应。综上所述,抑制DYRK1A能够通过调控小胶质细胞从M1型向M2型转化,减轻神经炎症反应,提高黑质多巴胺能神经元数量,进而改善PD模型小鼠运动功能障碍。机制研究表明ASK1/JNK/P38是DYRK1A调节小胶质细胞极化和神经炎症反应的关键信号通路。本研究不仅阐明了 DYRK1A在PD模型中调控神经炎症反应的重要作用和机制,也为以DYRK1A为靶点治疗PD疾病的相关药物研发提供理论依据。
关键词: 多发性硬化症 ；少突胶质前体细胞 ；CXC趋化因子受体2 ；磷酸二酯酶10A ；髓鞘再生 ；DYRK1A ；帕金森氏病 ；神经炎症 ；小胶质细胞极化 ；鱼藤酮
摘要： 背景:帕金森病(Parkinson's Disease,PD)已经是全球目前已知的第二大神经系统退行性疾病,目前已知的发病机制包括以下两方面:包括遗传因素、环境因素、神经系统老化以及多因素交互作用因素所致的多巴胺能神经元的死亡以及α突触核蛋白蛋白过度磷酸化以及异常折叠、泛素-蛋白酶通路障碍、自噬-溶酶体通路障碍因素所致的α突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)胞质内清除障碍进而沉积形成路易小体,以上因素共同导致了帕金森病的发生与发展。除了胞质内清除障碍,帕金森病的致病过程中是否存在α-syn胞质外清除障碍,目前研究知之甚少,而胶质淋巴系统(Glymphatic system,GS)作为一种胞质外清除路径可能在其中扮演着重要的作用。因此研究帕金森病的发病过程中胶质淋巴系统是否存在清除功能障碍以及其深层的分子机制,可以为我们治疗帕金森病提供一个崭新的视角与思路。目的:通过构建亚急性期帕金森病模型小鼠以模拟帕金森病的病理过程,评估其脑内胶质淋巴系统对细胞有毒性的物质的清除能力,并进一步探究其中参与胶质淋巴系统构成的重要蛋白——水通道蛋白-4(Aquaporin Protein 4,AQP4)的表达、极性分布以及调节机制,探索AQP4极性分布介导的胶质淋巴系统系统对有毒物质的清除功能,揭示AQP4的锚定蛋白α-syntrophin及其下调的具体分子机制,从胶质淋巴系统功能的角度揭示与PD致病相关的异常蛋白沉积和铁沉积的新机制以及为其提供新的干预靶点。方法:8～10周C57BL/6J小鼠分为4组(A组:对照组,B组:MPTP组,C组:MPTP+AAV组,D组:MPTP+Snta1组),在使用MP TP造模前3周对对照组和MPTP组行侧脑室注射生理盐水,MPTP+AAV组行侧脑室注射空载的腺病毒(Adeno-Associated Virus,AAV),MPTP+Snta1组行侧脑室注射携带表达α-syntrophin蛋白基因(Snta1)的腺病毒,3周后病毒开始稳定表达,对BCD组小鼠行腹膜腔连续注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)20mg/kg,持续7天以构建亚急性期帕金森病模型,应用WB方法检测各组小鼠黑质及纹状体AQP4、α-syntrophin蛋白的表达水平,采用免疫组织化学荧光(Immunohistochemical fluorescence,IHC-F)方法观察各组小鼠黑质及纹状体AQP-4的极性分布、α-syntrophin、神经元限制性沉默因子(Neuronal Restrictive Silencing Factor,NRSF)的表达情况,采用荧光剂示踪技术观察并评估各组小鼠胶质淋巴系统的清除功能。结果:1.亚急性期PD模型小鼠的胶质淋巴系统功能受损,在黑质及纹状体部位,其对脑脊液示踪剂清除速度减慢而蓄积,而经侧脑室注射携带SNTA-1基因腺病毒的亚急性期PD模型小鼠,其胶质淋巴系统的功能可部分恢复;同时,在黑质部位,MPTP组和MPTP+AAV组的AQP4极性较对照组相比出现了严重紊乱(PB<0.05,Pc<0.001);而 MPTP+Snta1 组的 AQP4 极性较 MPTP组和MPTP+AAV组相比得到了明显的改善(PB<0.01,Pc<0.0001);在纹状体部位,MPTP组的AQP4极性较对照组相比出现了严重紊乱(P<0.01);而MPTP+Snta1组的AQP4极性较MPTP组相比得到了明显的改善(P<0.01)。2.,WB检测提示,在纹状体部位,与对照组相比,MPTP+AAV组及MPTP+Snta1组的AQP4表达量增高(Pc<0.05,PD<0.01);此外,MPTP+Snta1组纹状体部位AQP4表达量较MPTP组增高(P<0.05);MPTP+Snta1组的α-syntrophin蛋白较对照组表达量增高(P<0.05)。在中脑部位,四组AQP4表达量的差异不具有统计学意义(P>0.05);MPTP+Snta1组的α-syntrophin蛋白较其他三组相比均表达增加(A<0.01,PB,C<0.05)。3.IHC-F检测提示,在黑质部位,MPTP组及MPTP+AAV组的AQP4、α-syntrophin、NRSF蛋白与对照组相比表达量均减少(P<0.05),而 MPTP+Snta1 组 α-syntrophin、NRSF 蛋白较 MPTP组及MPTP+AAV组表达增加(P<0.001),而与对照组相比,AQP4、α-syntrophin、NRSF蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);在纹状体部位,MPTP组及MPTP+Snta1组的AQP4较对照组表达量减少,其中MP TP+AAV组AQP4较MPTP组表达量增高(P<0.05);MPTP组及MPTP+AAV组α-syntrophin蛋白表达量较对照组减少(P<0.05);MPTP组、MPTP+AAV组及MPTP+Snta1组NRSF蛋白表达量较对照组均减少(P<0.001)。结论:1.亚急性期帕金森病模型小鼠的纹状体及黑质部位的AQP4极性分布出现紊乱,胶质淋巴系统功能受损,导致其对有害物质的清除能力下降,进而在纹状体及黑质部位沉积,对帕金森病的病理发展起到了一定的促进作用。2.NRSF-Snta1-AQP4可能是影响胶质淋巴系统的功能的通路之一。亚急性期帕金森病模型小鼠的纹状体及黑质部位的NRSF蛋白表达下调导致α-syntrophin蛋白的下调,进而导致AQP4不能有效被锚定在细胞膜上,导致AQP4的极性分布出现紊乱,最终导致胶质淋巴系统受损。3.NRSF蛋白与α-syntrophin蛋白可能存在双向调控机制:对亚急性期帕金森病模型小鼠行侧脑室注射携带Snta1基因腺病毒处理以上调α-syntrophin蛋白的表达,除了可上调AQP4的表达及改善其分布的极性外,也可上调NRSF蛋白的表达,同时部分恢复胶质淋巴的清除能力。
关键词: 帕金森病 ；胶质淋巴系统 ；水通道蛋白4 ；锚定蛋白 ；REST/NRSF