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摘要： 目的观察GnRH受体在人卵巢癌细胞系OVCAR3中的表达,并研究促性腺激素释放激素激动剂(Triptorelin)对卵巢癌细胞体外生长调控作用。方法采用免疫组化SP法检测卵巢癌细胞系OVCAR3 GnRH I受体的表达;分别应用不同浓度Triptorelin作用于细胞,MTT法检测细胞生长抑制率。结果人卵巢癌细胞系OVCAR3表达GnRH I受体,Triptorelin可明显抑制GnRH I受体阳性的OVCAR3细胞生长。结论促性腺激素释放激素激动剂Triptorelin通过与人卵巢癌OVCAR3细胞株GnRH I受体结合,发挥抗增殖的作用。
关键词: 促性腺激素释放激素激动剂 ；OVCAR3细胞株 ；GnRH ；I受体
被引量
1
摘要： 目的:研究促性腺激素释放激素(GnRH)类似物曲谱瑞林(triptorelin)体外逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的效果,并探讨其作用机制。方法:体外建立卵巢癌顺铂耐药细胞系模型OVCAR-3/CDDP;MTT法检测单独使用曲谱瑞林或顺铂及两药联合使用时对OVCAR-3/CDDP细胞的抑制作用;流式细胞术检测不同加药组细胞的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达改变。结果:(1)卵巢癌OVCAR-3/CDDP细胞耐药指数为13.42;(2)顺铂与曲谱瑞林联合化疗逆转倍数为3.91;(3)OVCAR-3/CDDP细胞EGFR表达在两药联合处理组降低最明显。结论:曲谱瑞林能部分逆转OVCAR-3/CDDP细胞对顺铂的耐药性,且此作用可能与下调细胞EGFR表达有关。
关键词: 曲谱瑞林 ；卵巢肿瘤 ；顺铂 ；耐药性
被引量
5
摘要： 研究背景:成年女性的生命周期可根据月经状态分为三个阶段,分别为生育期、围绝经期、绝经期。绝经期,血脂异常发病率明显增加,而血脂异常是心脑血管疾病的主要危险因素。传统观点认为,绝经后血脂异常的潜在机制是雌激素缺乏。围绝经期体内激素特点为,雌激素(estrogen,E2)水平相对稳定,仅卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)水平升高。但是,这一阶段也出现血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著升高,因此,绝经前出现的血脂异常就不能单纯用雌激素缺乏来解释。不可否认,雌激素替代治疗(HRT)可以明显降低血清胆固醇水平,但近年来研究发现,这种治疗手段可能带来严重的不良反应,比如,乳腺癌、冠心病的发病风险明显增加。绝经相关血脂异常治疗手段可选择的匮乏,发现新的防治策略成为亟待解决的问题。FSH是一种垂体前叶分泌的糖蛋白激素,主要功能为调节性腺合成和分泌性激素。在围绝经期,由于卵巢功能减退,血清FSH水平出现代偿性增加以维持相对正常的雌激素水平。研究发现,血清FSH水平升高与绝境后肥胖、骨质疏松发生密切相关,而阻断FSH作用能够降低绝经后脂肪沉积并增加绝经后骨量。有报道指出,较高基础水平FSH(≥ 7 IU/L)与较低基础水平FSH(<7 IU/L)的生育期女性比较,血清中TC、LDL-C含量显著增加。近期,黄荷凤院士团队也发表了类似的报道,高血清FSH(≥78.3 IU/L)与相对降低FSH水平(40-78.3 IU/L)的绝经后妇女比较,血清TC、LDL-C水平同样显著升高,同时,摘除卵巢的小鼠鼠表现为,血清FSH、血清胆固醇水平升高、肝脏中低密度脂蛋白受体(LDLR)表达降低。综上所述,这些数据表明FSH参与了绝经相关血脂异常的发病机制。然而,FSH信号通路是否是治疗血脂异常的一个有价值的靶点,目前尚不清楚。FSH的功能主要通过FSH受体(FSHR)介导。FSHR是一种典型的G蛋白偶联受体(GPCR)。研究发现,FSHR可以与Gs α偶联,参与颗粒细胞的分化和成熟;可以与Gi α偶联,从而调节破骨细胞骨代谢,以及脂肪细胞中脂肪堆积和重新分配。GPCR在受到其特异性配体刺激活化后,能够通过胞内结构域的构象变化进行一系列的胞内信号传导。抑制蛋白(arrestins)是一个小的蛋白家族,GPCRs活化信号可招募arrestins蛋白,两者结合后促进G蛋白与受体解离,从而导致信号转导作用终止。随着研究深入,有研究发现,β-arrestin2还可以作为多功能适配器参与GPCR激活后多种代谢过程。肝脏是维持体内胆固醇稳态的重要器官。肝脏中胆固醇代谢过程包括五个方面,即胆固醇的生物合成、摄取、转化、转运和酯化。胆固醇的生物合成是从乙酰辅酶A开始的,其中3hydroxy-3-methylglutaryl coase A reductase(HMGCR)是合成过程的限速酶。已经证实,HMGCR启动子区域含有两个重要的结合位点,即,cAMP反应元件(CRE)和固醇调节元件(SRE),可以分别与cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和固醇调节元件结合蛋白(SREBP-2)结合,从而调控HMGCR信号。其中,SREBP-2为SREBP家族的一个亚型,是参与胆固醇合成的关键分子。本研究,以围绝经期女性胆固醇代谢紊乱为切入点,通过流行病学调查和多种卵巢去势小鼠模型,发现血清高水平FSH导致血清胆固醇水平升高及肝脏胆固醇合成增加,而阻断FSH作用可以防止FSH升高或高胆固醇的饮食诱发的胆固醇沉积。研究围绕FSH调节肝脏胆固醇合成主要信号通路及阻断FSH信号转导进行研究:分别通过体内、体外研究,论证了阻断FSH信号转导后体内胆固醇含量变化,及Gi2 α/β-arrestin-2/Akt/FoxO1/SREBP-2/HMGCR信号通路在此过程中的地位和作用,阐明了阻断FSH作用对肝脏胆固醇合成及血清胆固醇含量的影响,揭示了围绝经期胆固醇代谢紊乱的分子机制。为探究绝经相关的胆固醇代谢紊乱提供新的观点,在医学实践上为女性血脂代谢紊乱提供新的治疗思路及策略。目的:1、本课题通过流行病学调查及构建合理的卵巢去势小鼠模型,探索FSH在绝经相关的胆固醇代谢紊乱中的作用。2、本实验证实肝细胞表面存在功能性FSHR,通过阻断FSH信号转导过程,即阻断FSH与其受体结合或敲除Fshr基因,肝细胞内胆固醇含量减少,降低了高胆固醇血症的发生,从而揭示了 FSH在绝经相关胆固醇代谢紊乱中的重要作用。3、通过蛋白组学及PCR array筛选出FSH对肝细胞内胆固醇代谢的调节主要依赖于胆固醇合成,上调肝细胞HMGCR表达。4、通过FSH刺激肝细胞Gi2 α/β-arrestin-2/Akt/FoxO1/SREBP-2信号途径的实验研究,揭示FSH增加肝细胞HMGCR的表达的作用机制。研究方法:1、流行病学调查:在流行病学调查中,我们纳入了154例处于生育期及124例处于围绝经期女性,对其基本情况(年龄、体重、BMI等)、血清激素(E2及FSH)水平及血脂水平通过线性、非线性相关方程等多种统计学方法分析,探索血清FSH与血脂之间的相关关系。2、动物模型:(1)OVX小鼠模型:9周龄性成熟C57BL/6雌鼠被随机分为4组:1)假手术(Sham),2)双侧卵巢去势并补充雌激素(OVX+E2),腹腔注射溶媒,3)OVX+E2并腹腔注射低剂量FSH(OVX+E2+L-FSH),4)OVX+E2并腹腔注射高剂量FSH(OVX+E2+H-FSH),持续注射2周。(2)GnRHa小鼠模型:双侧卵巢去势并补充雌激素C57BL/6雌鼠被随机分为2组:1)腹腔注射溶媒(N.S.)组,2)腹腔注射促性腺激素释放激素的类似物(GnRHa)组,持续注射4周。(3)FSHAb去势小鼠模型:双侧卵巢去势并补充雌激素C57BL/6雌鼠随机分为3组:1)腹腔注射溶媒(N.S.)组,2)腹腔注射IgG组,3)腹腔注射FSHβ抗体(FSHAb)组,持续注射4周。(4)FSHAb小鼠模型:9周龄性成熟C57BL/6雌鼠被随机分为2组:1)腹腔注射IgG组,2)腹腔注射FSHAb组,持续注射8周。(5)Fshr基因敲除小鼠:雌性Fshr-/-小鼠从4周龄起开始补充雌激素,同窝出生的雌性Fshr+/+小鼠作为对照。性成熟后,约9周龄时所有小鼠行双侧卵巢去势手术(在此之后野生型小鼠也补充雌激素),然后再每日注射高剂量FSH,持续2周。(6)Fshr基因敲除高脂饲养小鼠:雌性Fshr-/-小鼠从4周龄起开始补充雌激素,同窝出生的雌性野生型小鼠作为对照。约7周龄起两种基因型小鼠均随机分为两组:1)普通饲料(NC)喂养组,2)高胆固醇饲料(HC)喂养组,持续喂养20周。(7)Fshr干扰RNA:双侧卵巢去势并补充雌激素C57BL/6雌鼠被注射Fshr干扰腺病毒7天后(每隔7天重复注射一次,共3次),第一次注射病毒7天后小鼠随机分为2组:1)腹腔注射溶媒(N.S.)组,2)腹腔注射高剂量FSH组,持续注射2周。(8)Ldlr基因敲除小鼠:Ldlr基因敲除雌鼠被随机分为3组:1)假手术(Sham),2)双侧卵巢去势并补充雌激素(OVX+E2),腹腔注射溶媒,3)OVX+E2并腹腔注射高剂量FSH(FSH),持续注射2周。3、细胞培养:1)细胞系:人肝癌细胞HepG2、β-arrestin1/2敲除人肝癌细胞HepG2、小鼠肝细胞(NCTC 1469)及仓鼠卵巢细胞CHO、均按培养条件要求培养。2)小鼠原代肝细胞:通过原位两步灌注法,接种原代细胞前6cm培养皿预铺鼠尾胶原,接种细胞后置于37℃ 5%CO2条件下培养,每24小时换液。待细胞生长至70%～80%时,弃掉原完全培养液,PBS洗两遍,无血清培养液培养过夜再添加相应处理,以排除血清中脂蛋白及各种激素对实验的干扰作用。4、血清激素:通过酶联免疫法(ELISA)测定血清内E2及FSH水平。5、血脂及肝功测定:血脂(总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇)、肝功(谷丙转氨酶、谷草转氨酶),采用Olympus Au5400全自动生化分析仪(山东省立医院检验科)检测。6、肝细胞内胆固醇测定:擦用组织/细胞内总胆固醇、游离胆固醇相应检测试剂盒(北京普利莱公司),实验操作按照说明书进行定量测定。7、VLDL生成速率测定:通过腹腔内注射poloxamer 407,在注射后1,2,3,4小时内眦静脉取血测定胆固醇含量。8、iTRAQ标记蛋白组学:采用4种同位素编码的iTRAQ技术,分析不同组间蛋白表达差异。9、RT2PCR array:用于检测FSH对肝脏中胆固醇相关分子基因表达影响。10、新生RNA测定:通过run-on RT-qPCR测定细胞内新和成的RNA。11、新生胆固醇测定:参考相关文献检测方法,测定FSH对小鼠肝脏中新生胆固醇的调节。12、HMGCR活性测定:参考相关文献检测方法,测定FSH对小鼠肝脏中HMGCR活性测定。13、FSH-FSHR结合实验:采用放射性标记FSH(125I-FSH),通过测定细胞放射活度,检测细胞上FSHR表达。14、免疫荧光:用于检测肝脏中FSHR的表达和分布情况。15、荧光素酶活性检测:含有CRE及SRE结合位点及突变位点的HMGCR启动子区域重组质粒转染HepG2细胞,共转海肾荧光素酶报告基因质粒作为对照,荧光素酶活性分析。含有IRE1、IRE2位点及突变位点的SREBP-2启动子区域重组质粒转染HepG2细胞,共转海肾荧光素酶报告基因质粒作为对照,荧光素酶活性分析16、cAMP含量测定:采用GloSensor cAMP assay试剂盒测定。17、小动物活体成像:采用小动物活体成像仪检测FSH对小鼠肝脏中HMGCR启动子区及SREBP-2启动子区的影响。18、化学合成siRNA干扰实验:将针对人Gα蛋白各亚基(Gsα,Gi1α,Gi2α,Gi3α,G12α,G13α及Gqα)的siRNA转入HepG2细胞,以分别干扰其表达。19、RNA提取及实时荧光定量PT-PCR检测各种分子基因水平的表达:小鼠Fshr,Hmgcr,Hmgcs,Srebp2,Cyp7a1,Ldlr,Abca1,Abcg1,Srb1,Acat2和β-actin(Actb);人FSHR,HMGCR,SREBP2,Gsα,Gi1α,Gi2α,Gi3α,G12α,G13α,Gqα和β-αctin(ACTB)。20、蛋白提取及western blotting检测各种蛋白表达水平:FSHR,HMGCR,LDLR,CYP7A1,ABCA1,SRB1,ACAT2,p-Ser133 cyclic AMP response element-binding protein(CREB),CREB,SREBP-2,p-Ser473 Akt,Akt,Gi2α,β-arrestinl/2,LMB1 和GAPDH。21、统计学分析:采用SPSS17.0统计软件分析实验数据。定量资料采用均数±标准误(x±SEM)表示,组间均数比较采用t检验或者单因素方差分析,方差不齐的采用Kruskal-Wallis秩和检验,当P<0.05时认为有统计学差异。结果:1、围绝经期女性血脂水平及高胆固醇血症发病率与血清FSH水平正相关在流行病学研究中,围绝经期女性与生育期女性比较,一般情况(BMI、血糖、血压、肝功等)无明显差异,血清E2水平相当,但血清FSH水平明显升高,同时血清TC、LDL-C及高胆固醇血症患病率显著增加(P<0.01)。研究中,根据FSH水平将研究对象分为四组,结果发现随着FSH水平增加,无论血清TC、LDL-C还是高胆固醇血症患病率显著升高(P<0.05)。2、FSH在卵巢去势小鼠模型中增加体内胆固醇沉积在卵巢去势小鼠中(补充E2),外源性给予不同剂量FSH,血清TC、LDL-C,和肝脏中总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)含量及肝脏中VLDL生成速率,随血清FSH浓度呈剂量依赖性增加(P<0.05)。体重和代表肝功能的谷丙转氨酶(ALT)没有明显变化。同样,体外实验检测到FSH增加肝细胞内胆固醇含量<0.
关键词: 卵泡刺激素(FSH) ；围绝经期 ；胆固醇合成 ；HMGCR ；SREBP-2 ；G蛋白偶联受体(GPCR)
被引量
4
摘要： 下丘脑是调控生殖和能量代谢的高级中枢,主要由下丘脑背内侧核(dorsal medial hypothalamic nucleus,DMH)、下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)、下丘脑室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus,PVH)以及弓状核(arcuate nucleus,ARC)区域参与。促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone,GnIH)是Tsutsui团队在鹌鹑脑中发现的一种可以抑制促性腺激素释放激素(Gonadotrophin-releasing hormone,GnRH)的新型下丘脑神经肽。同时,在脊椎动物中发现了具有C末端序列Arg-Phe-NH2(RFamide相关肽)的GnIH直系同源物RFRP神经肽,该神经肽主要包括RFRP-1和RFRP-3。在许多哺乳动物中,RFRP-3能够抑制促性腺激素的合成和释放,因此认为RFRP-3是GnIH的功能类似物。GnIH/RFRP-3主要存在于下丘脑背内侧核(DMH)或邻近区域。GnIH有两种受体GPR147和GPR74,其中GPR147是RFRP-3的主要受体且广泛存在于哺乳动物的下丘脑、卵巢、子宫和睾丸等组织中。已证实GnIH可通过下丘脑-垂体-性腺轴与GPR147结合从而抑制GnRH的分泌及黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)的释放,抑制卵巢发育降低雌激素等性激素的合成与分泌,调节神经内分泌系统。蛋白质组学的高速发展给基础医学的研究开辟了新领域,在一定程度上为生命科学指明了探索方向。生物信息学是由生命科学、自然科学和生物学等多学科相结合的新型分析工具,其依赖于计算机对复杂的大数据的处理,来探究一切生物体活动的规律。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,与肺癌和结肠癌并列为全球三大常见癌症之一。研究发现雌激素水平的升高与乳腺癌的发生发展密切相关,其原因可能与下丘脑释放GnRH,刺激FSH和LH的分泌有关。FSH可刺激卵巢卵泡中雌激素的合成,然后作用于下丘脑以诱导LH的产生。LH的急剧升高会触发排卵和黄体发育。绝经后,卵巢产生的雌激素水平可忽略不计。初潮提前和绝经期滞后与乳腺癌的高发风险有关,这突出了性腺激素生成在正常乳腺发育和乳腺癌中的重要性。本课题组前期研究显示,卵巢摘除术补充雌激素(Ovariectomized Estrogen Primed,OEP)大鼠侧脑室微量注射RFRP-3后,可影响GnRH、LH、FSH等激素的释放,但对激素依赖性肿瘤研究较少。促性腺激素对卵巢中雌激素、孕激素等性激素的释放具有调节作用,因此本课题假设侧脑室微量注射RFRP-3后可影响OEP大鼠下丘脑蛋白质的分泌,而下丘脑蛋白质的变化可能影响GnRH的分泌,进一步调节垂体促性腺激素的释放,从而影响下游靶器官的生理或病理变化。本实验通过蛋白质组学结合生物信息学的方法探讨侧脑室微量注射RFRP-3后OEP大鼠下丘脑蛋白质表达的变化,发现差异蛋白主要参与糖酵解等途径。已知糖酵解可以刺激GnRH的释放,故推测糖酵解途径可能是GnIH抑制GnRH释放的机制之一,GnRH可以调节雌激素、孕激素等性腺激素的释放,而雌激素的异常与乳腺癌的发生发展相关。因此本实验假设RFRP-3可能通过此通路调节激素依赖性乳腺癌的发生发展。为验证此假设,本实验用RFRP-3处理人乳腺癌细胞系MCF-7结果显示10000ng/ml的RFRP-3可能通过阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1通路抑制糖酵解诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡。第一部分 基于蛋白质组学研究侧脑室微量注射RFRP-3对OEP大鼠下丘脑蛋白质的调节目的:通过蛋白质组学与生物信息学探索侧脑室微量注射RFRP-3对下丘脑蛋白质调节情况。方法:1、选取30只成年雌性SD大鼠,构建卵巢摘除术补充雌激素(ovariectomized estrogen primed,OEP)大鼠模型,随机分为注射RFRP-3实验组和生理盐水对照组,根据《The Rat Brain in stereotaxic coordinates》确定大鼠侧脑室位置,分别注射RFRP-3和生理盐水(16μl/kg,RFRP-3 浓度为 2μg/μl),每 30 秒注射 0.5μl,于 4min 完成注射。给药6h后取出下丘脑,制备蛋白样品。2、下丘脑蛋白样品酶解,经戴安Dionex ultimate 3000 nano LC system纳升级液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。用Maxquant-1.5.2.0算法对肽段进行非标记蛋白质组学定量分析,得到质谱检测的原始数据。3、对质谱原始数据进行GO基因本体分析、KEGG信号通路富集分析和蛋白-蛋白互作分析,筛选差异表达蛋白质和信号通路。4、通过CPTAC和HPA数据库鉴定节点蛋白在肿瘤中的表达及生存分析。结果:1、下丘脑差异蛋白的质谱结果由Uniprot Mouse数据库检索并匹配,共鉴定出253个差异表达蛋白,其中129个蛋白上调,124个蛋白下调。2、GO结果显示,差异蛋白的生物过程(Biological Process,BP)主要在单一生物体和小分子代谢过程中存在富集,细胞成分(Cell Component,CC)差异蛋白主要在细胞质和胞核富集,分子功能(Molecular function,MF)主要体现在与小分子结合的功能上。3、KEGG结果显示,差异蛋白主要参与糖酵解、代谢途径、内分泌等10条重要信号通路(P<0.05)。4、OmicsBean软件可视化蛋白互作网络图(Protein-Protein Interaction,PPI)分析显示:节点蛋白 GALM、ADPGK、PGM1、PFKL为上调,ALDH2为下调蛋白(FC≥2)。5、CPTAC和HPA数据库结果提示节点蛋白GALM(P=0.050)、ADPGK(P=0.0060)、PGM1(P=0.25)、PFKL(P=0.0062)和ALDH2(P=0.0092)在乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达及生存分析。第二部分 RFRP-3通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解途径诱导人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的研究目的:探讨RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7凋亡的影响及作用机制。方法:1、体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468,设空白调零组、PBS对照组和RFRP-3实验组(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml),CCK-8法确定最佳作用时间和浓度。2、流式细胞术检测人乳腺癌细胞系MCF-7经RFRP-3处理后的凋亡率。3、利用蛋白印迹法(Western Blot),检测RFRP-3在最佳浓度10μg/ml 时人乳腺癌细胞系 MCF-7 的 ADPGK、Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-lα和 G 蛋白偶联受体GPR147的蛋白表达情况。4、使用实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR),检测RFRP-3在最佳浓度时人乳腺癌细胞系MCF-7的Bcl-2、Bax、cytochrome C、Caspase-3、P53、PI3K 和 AKT 的 mRNA表达情况。结果:1、各浓度组RFRP-3对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞作用情况。人乳腺癌细胞系MCF-7常规培养,设空白调零组、对照组和RFRP-3 实验组(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml)加入 RFRP-3 作用 24h 和 48h。组间比较,当 RFRP-3作用时间为24h时,药物浓度达到10μg/ml时对MCF-7细胞增殖显著抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。各浓度组RFRP-3对细胞系MDA-MB-453 和 MDA-MB-468 均无影响(P>0.05)。2、对照组与RFRP-3(10μg/ml)实验组细胞凋亡情况。流式细胞仪检测结果:对照组和RFRP-3(10μg/ml)时的细胞凋亡率分别为(7.76±1.57)%、(16.14±3.001)%。对照组与 RFRP-3(10μg/ml)实验组比较细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3、RFRP-3 上调 MCF-7 细胞 ADPGK、Bax、Caspase-3、cytochrome C、P53蛋白的表达水平。MCF-7细胞中加入RFRP-3后,与对照组相比,RFRP-3(10μg/ml)实验组 Bax(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、cytochrome C(P<0.01)和 P53(P<0.05)及关键蛋白 ADPGK(P<0.01)表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。4、RFRP-3 下调 MCF-7 细胞 Bcl-2、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR、HIF-1α蛋白的表达水平。MCF-7细胞中加入RFRP-3后,对照组和RFRP-3(10μg/ml)实验组组间比较 Bcl-2(P<0.05)、PI3K(P<0.05)、AKT/p-AKT(P<0.01)、mTOR(P<0.05)、HIF-1α(P<0.05)蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义。5、RFRP-3 上调 MCF-7 细胞 Bax、Caspase-3、P53mRNA 的表达水平。在MCF-7细胞中加入RFRP-3后,10μg/ml实验组与对照组相比Bax mRNA表达水平上调(P<0.05)、Caspase-3 mRNA表达水平上调(P<0.01)和TP53 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。6、RFRP-3 下调 MCF-7 细胞 Bcl-2、PI3K 与 AKT 的 mRNA表达水平。在MCF-7细胞中加入RFRP-3后,10μg/ml实验组与对照组相比Bcl-2 mRNA表达水平显著下调(P<0.01)、PI3K mRNA表达水平显著下调(P<0.05)与AKT mRNA表达水平显著下调(P<0.05)。结论:1、侧脑室微量注射RFRP-3,结果显示差异蛋白主要参与糖酵解途径,其中 GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL 为节点蛋白。2、RFRP-3可能通过GPR147受体诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,其凋亡机制可能与阻碍PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α通路抑制糖酵解有关。
关键词: 促性腺激素抑制激素 ；蛋白质组学 ；人乳腺癌MCF-7细胞系 ；细胞凋亡 ；G蛋白偶联受体147(GPR147)
摘要： 背景:Kisspeptin是KISS-1基因编码的多肽类激素,2001年由Kotani等在研究肿瘤细胞转移机制的过程中首次发现,也被称为转移抑制素。作为促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)的上游调节因子,其与G蛋白偶联受体-54(G protein-coupled receptor 54,GPR-54)结合,进而在调控下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamus-pituitary-ovary axis,HPOA)的功能方面发挥重要作用。Kisspeptin通过介导雌激素的正负反馈来调节Gn RH的分泌,继而影响青春期启动、性分化、能量代谢等生命过程,在女性生殖系统活动中具有重要作用。近年来有研究表明,kisspeptin/KISS1R系统在滋养层细胞的侵袭和迁移中发挥着不可替代的作用。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族相关蛋白在机体内分布广泛,参与免疫调节、类固醇激素合成、细胞内稳态维持、卵泡募集及排卵等多项关键生理活动。TGF-β1是TGF-β亚家族中功能极为多样的一员,在结缔组织细胞、内皮细胞和造血细胞中均有表达。研究表明,TGF-β1在卵母细胞发育、类固醇激素生成及胚胎发育等生殖生理过程中均扮演着重要角色。绒毛外滋养层细胞(Extravillous trophoblast,EVT)的正常侵袭是维持胎盘功能和妊娠的关键。EVT细胞侵袭不足会导致子痫前期(Preeclampsia,PE)的发生,进而可能引发孕产妇围产期的死亡。TGF-β1和kisspeptin在人胎盘中表达,均已被证明可以抑制EVT细胞的侵袭。Kisspeptin是人乳腺癌细胞中TGF-β1的下游靶点,然而在人胎盘滋养层细胞中,kisspeptin是否受TGF-β1调控,并介导TGF-β1对人EVT细胞侵袭的抑制过程尚不清楚。目的:探讨kisspeptin在TGF-β1抑制人胎盘滋养层细胞侵袭过程中的作用及其分子机制,并研究TGF-β1和kisspeptin在PE患者血清中的表达情况。方法:1.本研究的细胞模型为人EVT细胞系HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞,后者是通过对人工流产患者胎盘绒毛组织分离培养得到的。2.通过实时荧光定量PCR(Real time-qPCR,RT-qPCR)和Western blot技术检测不同浓度、不同时长的TGF-β1处理对HTR-8/SVneo细胞kisspeptin mRNA和蛋白表达的影响,以及用特异性受体抑制剂预处理HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞后,TGF-β1对kisspeptin表达的影响是否改变。3.通过RT-qPCR、Western blot及siRNA转染技术检测HTR-8/SVneo细胞中SMAD2和SMAD3能否被TGF-β1激活,以及敲除内源性SMAD4后,TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的影响。4.用ERK1/2和AKT信号通路的抑制剂分别预处理HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞后,通过RT-qPCR和Western blot技术检测TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的影响。5.通过siRNA转染和Transwell侵袭试验检测敲除内源性kisspeptin对HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞的侵袭性的影响。6.利用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测PE患者及正常孕妇血清样本中TGF-β1和kisspeptin水平,样本来源于同一时期就诊于我院产科的患者。7.实验结果采用PRISM 5统计软件包进行分析。符合正态分布的连续型变量用“平均值±标准差”描述,两组间比较采用独立样本T检验,多重分析选用One Way ANOVA和Tukey法。P<0.05时认为有统计学差异。结果:1.在HTR-8/Svneo细胞中,5ng/mL和10ng/mL TGF-β1分别作用12h、24h均可显著上调kisspeptin mRNA和蛋白水平。使用特异性TGF-βI型受体(ALK5)抑制剂SB431542预处理,可阻断TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。应用ALK5 siRNA敲低内源性ALK5表达,可抑制TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。2.在HTR-8/SVneo细胞中,5ng/mL TGF-β1处理可以激活细胞内SMAD2和SMAD3。应用SMAD4 siRNA敲低内源性SMAD4表达,并不影响TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。3.在HTR-8/SVneo细胞中,5ng/mL TGF-β1处理可以激活细胞内ERK1/2和AKT信号通路。应用MEK1/2抑制剂(U0126)阻断ERK1/2信号通路的激活,可阻断TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用;应用PI3K抑制剂(LY294002)阻断AKT信号通路的激活,不影响TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。4.在人原代培养的EVT细胞中,5ng/mL TGF-β1处理显著上调kisspeptin蛋白水平。使用SB431542和U0126分别预处理,均可阻断TGF-β1对kisspeptin蛋白水平的促进作用。5.Transwell侵袭试验表明,5ng/mL TGF-β1以及1μM kisspeptin能显著抑制HTR-8/SVneo细胞的侵袭性。在HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞中,应用kisspeptin siRNA敲低内源性kisspeptin表达后,TGF-β1对kisspeptin蛋白水平的促进作用消除,同时TGF-β1对细胞侵袭的抑制作用减弱。6.和正常孕妇相比,PE患者血清TGF-β1和kisspeptin水平显著升高(22.41±8.44 ng/mL vs.13.87±6.39 ng/mL,P<0.001;88.26±35.80 pg/mL vs.59.31±35.08 pg/mL,P=0.006)。结论:1.在人EVT细胞中,TGF-β1通过ALK5上调kisspeptin表达。2.在人EVT细胞中,TGF-β1通过活化ERK1/2信号通路而非SMAD信号通路上调kisspeptin表达。3.Kisspeptin介导了TGF-β1对人EVT细胞侵袭的抑制作用。4.PE患者血清TGF-β1和kisspeptin水平上调,提示与PE患者EVT细胞侵袭性减弱密切相关,为PE发病机制的研究提供了新思路。
关键词: TGF-β1 ；人胎盘滋养层细胞 ；侵袭 ；kisspeptin ；子痫前期
摘要： 生殖过程中机体在内外部环境作用下,外周器官和中枢神经系统共同协作确保生物个体的成功繁殖。这个过程是通过协调生殖行为和排卵过程的下丘脑-垂体-卵巢轴完成。来自中枢神经系统的主要信号是促性腺激素释放激素(GnRH),GnRH通过调节垂体前叶促性腺激素的活性来调节卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的释放。随着卵巢内卵泡的发育,卵巢释放雌二醇,负反馈调节促性腺激素释放激素和卵泡刺激素的释放。当雌二醇水平达到峰值,可引发促性腺激素释放激素的快速释放,诱发黄体生成素峰最终完成排卵过程。中枢神经系统促性腺激素释放激素的释放有利于调节生殖行为从而为生殖调节提供一个节点。内分泌信号在控制生殖中起重要作用。个体逐渐生长足以说明中枢内分泌信号可以调节靶器官的生物过程,这种信号传导包括基因表达,细胞因子和/或淋巴因子的释放和激素的活性。此外,内分泌活动在胎儿的半同种异体种植过程起非常重要的作用。这种胎儿着床过程需要母亲免疫细胞重编程过程使得母亲在整个妊娠过程保持免疫耐受性。通常来说,母亲免疫细胞是支持所有的这些过程,并且有利于成功生育。不同内分泌介导的生理和病理生理过程中从不同方面影响女性受孕过程并诱发不孕。体外受精(IVF)技术的发明是20世纪医学界的一大奇迹,为数以万计家庭提供了获得子代的机会。然而,目前提高临床妊娠率仍然是生殖医学研究的大方向。为了改善不孕症的结局,我们实施了以下两个实验并得出了相应的结论。1.背景:多囊卵巢综合征(PCOS)是一种最常见的多因素作用下的内分泌紊乱性疾病,表现为复杂的内分泌病理过程包括黄体生成素(LH)水平的增加,胰岛素抵抗(IR)和高胰岛素血症。PCOS妇女常常表现为超重或者肥胖,2型糖尿病的风险增加和糖耐量受损以及心血管疾病。另外,7%生育期非PCOS妇女也常伴有高雄激素血症和慢性无排卵。然而,许多调节蛋白对PCOS发病机制的影响仍不清楚。黄体激素(LH)控制女性月经周期的长度和过程。重要的是,LH刺激和生成睾酮,睾酮又可以通过颗粒细胞转化成雌激素。越来越多的证据表明PCOS同时是一种代谢紊乱性疾病,一些不利的因素直接与高LH的分泌有关。有研究者认为无排卵和PCOS患者雄激素水平升高的机制是在高LH的刺激下,卵巢的卵泡膜细胞数增加,从而使得卵泡膜细胞产生的雄激素增加。由于LH相对于FSH水平升高,卵巢颗粒细胞不能将雄激素芳香化转变成雌激素,因此导致雌激素水平的下降和最终的无排卵。Phoenixin-14和Phoenixin-20是最近被分离和鉴定的两个新的内源性神经肽。Phoenixin-14是一种14个残基肽,在多种生物体内发现存在该物质,包括人脑,大鼠,小鼠,猪和犬。而phoenixin-20则是一种20残基肽,是Phoenixin-14N端扩展而成,在人,犬或猪序列的编码区之间的仅存在一个氨基酸的差异。在体外,用小RNA干扰方式敲除下丘脑phoenixin的表达,可导致雌性大鼠的发情期延迟,同时伴随着垂体GnRH受体的表达下降,提示phoenixin可能参与正常卵巢的周期调节。利用垂体前叶细胞的体外研究表明,phoenixin可通过调节垂体中促性腺激素释放激素(GnRH)受体的表达,上调垂体促性腺激素(包括FSH和LH)的分泌,并通过GnRH增强该受体本身的上调。基于以上研究基础,认为在大鼠下丘脑-垂体-性腺轴中,phoenixin-14参与促性腺激素的分泌,本研究旨在研究PCOS患者中phoenixin-14的循环水平及其与LH分泌的关系。方法学:纳入自于浙江大学附属妇产科医院门诊病人78例妇女作为研究对象(其中37例为对照组,41例为PCOS患者),年龄24-35岁。所有患者都签署知情同意。PCOS的诊断标准依据欧洲生殖年会和美国生殖年会的联合标准,要求患者至少符合以下三项中的两项:1)稀发排卵或无排卵;2)临床和/或生化高雄激素血症(≥2.08 nmol/L);3)B超提示卵巢多囊改变(卵巢中直径2-9mm的小卵泡≥ 12个,或卵巢体积≥ 10 cm3)。排除甲状腺疾病,柯兴氏综合征,先天21-羟化酶缺乏,分泌雄激素的肿瘤,卵巢储备功能下降(原发卵巢功能不全),或者1型或2型糖尿病的患者。所有纳入患者都有临床和/或生化的高雄激素血症和慢性无排卵,绝大部分患者B超表现为多囊改变。对照组妇女月经周期规则(26-30天),无上述内分泌紊乱性疾病,最近三个月内无用药史。两组中其他的一些排除标准包括吸烟和酗酒的患者。空腹12小时后,在对照组和PCOS自然月经周期的3-5天早上9时采集血液样本。检测所有纳入的妇女中血液基础血清卵泡刺激素(FSH),黄体生成素(LH),孕酮(P4),泌乳素(PRL)和总睾酮(TT),游离睾酮(FTT),空腹血糖(FBG),空腹胰岛素(FSI),雄烯二酮(AS)和脱氢表雄酮(DHEA-S)水平。同时检测血清中总胆固醇(TCHOL),高密度脂蛋白(HDL)胆固醇,低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯(TG)的水平。激素的测定采用2006自动免疫分析仪,脂质的测定则采用Olympus临床化学分析仪(AU2700)。HOMA胰岛素抵抗指数按照标准公式计算。血液中Phoenixin-14,nesfatin-1和kisspeptin的浓度采用商业化的ELISA试剂盒进行测定。采用SPSS15.0进行数据的统计分析。对照组和PCOS组之间的各项参数比较采用t检验,用Pearson方法分析参数之间的相关性。结果:两组之间一般资料如年龄、BMI和生化指标如HDL,LDL,TG和TCHOL水平均无显著差异。然而,PCOS组性激素结合球蛋白,AS,DHEA-S,TT,游离TT,LH,PRL,FSI以及HOMA-IR指数均显著升高,但是两组之间的P4,FSH和E2水平无差异。PCOS患者血液中phoenixin-14水平显著较对照组升高(0.57±0.04 ng/mL vs.0.37±0.05ng/mL,n=37)。同样,血清中nesfatin-1水平在PCOS组患者中升高明显(p<0.05)。但两组之间血清kisspeptin水平无显著差异。用phoenixin-14作为独立变量,多元相关分析结果显示在PCOS患者中,phoenixin-14与nesfatin-1和LH水平呈显著正相关,与HOMA-IR,kisspeptin,E2,FBG和胰岛素水平呈负相关,但未达统计学差异。结论:我们的结果指出,PCOS患者相对于正常妇女,血清中phoenixin-14显著升高。phoenixin-14与nesfatin-1和LH水平呈显著正相关,因此推测phoenixin-14的存在可能在一定程度上影响PCOS患者LH的分泌。然而,仍需要更多的研究来明确phoenixin-14 和 PCOS 的关系,从而有利于对 PCOS 不良生殖结局进行干预性的治疗。2.背景:正常子宫内膜是一类对卵巢类固醇类激素起反应的活性组织,随着月经周期经历增殖、分化和脱落的过程。雌激素和孕激素在人子宫内膜成熟中发挥重要的作用。在增殖期,雌二醇(E2)刺激内膜上皮细胞和间质细胞成分增殖。控制性超促排卵是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术中常用的手段,常伴随着雌二醇水平的显著升高。在IVF-ET治疗过程中同时有多个卵泡成熟产生超生理的E2水平,引发与子宫内膜容受性相关的形态学和生物化学改变。然而,升高的E2水平对子宫内膜种植的影响仍然存在争议。之前的研究报道血清E2水平在超促排卵过程中浓度依赖性的影响胚胎种植。临床研究同样获得了一些类似的结果。在过度刺激患者中,不考虑血清中孕酮的水平,注射hCG日高E2水平不影响胚胎质量,但对子宫内膜的容受性不利。另外一个研究发现升高的E2水平对胚胎有毒害作用,降低胚胎粘附。鉴于血清中高水平的E2可能浓度依赖性的影响IVF妊娠结局,我们评估了生理水平的E2对子宫内膜细胞的影响,来揭示在控制性超促排卵中升高的血清E2水平对子宫内膜细胞蛋白表达的可能影响。方法学:从上海生物科学研究所获得人类子宫内膜细胞-IK细胞,置于RPMI1640培养基中培养。用不同浓度的E2(10-9M和10-7M)进行细胞处理,10-9ME2接近妇女月经周期中分泌中期的生理浓度,10-7ME2接近超促排卵中超生理水平。体外粘附实验模型采用人类绒毛膜癌细胞系JAR细胞,参照标准的操作步骤制备细胞,加入到IK细胞中培养一个小时,离心六孔板(10×g;10分钟)使细胞表面朝下而分离非粘附球体。每组雌激素处理后的IK细胞用细胞裂解液裂解后收集细胞分离蛋白。送检不同浓度雌激素处理后的IK细胞,用iTRAQ方法进行蛋白组学测定,进行液相色谱-质谱(LC-MS/MS)的四种生物重复序列的蛋白质鉴定和定量,并结合Andromeda搜索引擎使用MaxQuant(MQ)软件进行分析。根据应用错误发现率(FDR)与过滤出B值的比值进行选择,即按照差异倍数≤0.67和≥1.5,或者P值≤0.05的标准过滤来选取差异蛋白。为了证实蛋白质组学结果,在两组中通过蛋白质印迹分析验证了三种已知在胚胎粘附中起作用的上调蛋白,包括补体(C3),纤溶酶原和激肽原-1。同时获得5个正常排卵周期(连续观察2个月经周期)LH峰后7天的子宫内膜组织做免疫组化进行验证。在子宫内膜活检前患者均签署知情同意书,实施的项目通过浙江大学医学院伦理委员会审批。结果保留了所有差异蛋白(p>value<0.05以及差异倍数超过1.2倍)。然后通过分层聚类分析(聚类分析 3.0,http://bonsai.hgc.jp/～mdehoon/software/cluster/software.htm 和 Java 树视图软件http://jtreeview.sourceforge.net)评估得到的差异表达蛋白进行区组。使用IPA功能分析法分析差异蛋白之间的生物调控网络,疾病分析和调控通路。计算z-score可以推断有潜在生物过程的激活状态("激活"或"抑制")。使用作图软件Prism6进行数据的统计分析。Fisher精确检验用于计算p值,以确定数据集中蛋白质之间的关联以及生物过程可以单独解释的可能性。使用非配对t检验,确定两组间比较的统计学意义。所有样品都进行四个生物重复的检测,数据以均数士标准差的形式表示,p<0.05认为有统计学差异。结果:不同浓度的雌激素水平处理子宫内膜影响胚胎着床。10-9M浓度的雌激素作用后JAr粘附率为65.19±2.67%。然而,10-7M处理后的IK细胞的粘附率明显升高,为77.78±3.39%。使用iTRAQ技术,分析获得2,709差异表达蛋白,其中包括2,362上调蛋白和347下调蛋白。与对照组(10-9 M E2)相比,我们验证了 10-7 M雌激素处理后的45个差异蛋白,包括43个上调蛋白和2个下调蛋白。这些差异蛋白的聚类分析显示在热图中。热图结果显示两组明显分离成两个主要成份,提示10-7M雌激素处理组蛋白表达显著不同于10-9M雌激素处理组。使用Western blot验证补体C3,纤溶酶原和激肽原-1的表达与蛋白组学结果一致。结果提示高浓度雌激素处理后的IK细胞中补体C3,纤溶酶原和激肽原-1表达显著升高,推测10-7M雌激素处理后可能增加补体C3,纤溶酶原和激肽原-1表达促进JAr粘附到内膜细胞。在子宫内膜容受阶段,C3,纤溶酶原和激肽原-1在人子宫内膜中的定位表达揭示了这些蛋白质很可能是人子宫内膜容受性因子。此外,IPA分析结果显示10-7 M雌激素处理后绝大多数的差异表达蛋白都与"分子与细胞功能","生理系统功能"和"疾病与病症"有关。基于上述的p值,筛选出的差异表达蛋白其中有26个差异蛋白与子类别"生理系统与功能"和"疾病与紊乱"相关,而24个差异蛋白与子类别"分子和细胞功能"相关。为了理解在功能分组中显示出显著变化的蛋白质之间的特异性相互作用,我们利用IPA分析差异表达蛋白之间的相互作用网络。此外,雌激素处理后的内膜细胞呈现出两种典型的信号通路,包括LXR/RXR活化途径和通过最大数量的识别的差异表达蛋白介导的急性期反应信号以及表示由随机机会发现的对数概率的z-score。
关键词: Phoenixin ；多囊卵巢综合征 ；黄体生成素 ；体外受精-胚胎移植 ；雌二醇 ；子宫内膜 ；胚胎种植 ；蛋白组学
被引量
3
摘要： 卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其死亡率占妇科恶性肿瘤的首位。虽然手术方式、化疗、放射治疗等手段不断改进,但5年生存率仍徘徊在30%-40%,而且发病年龄日趋年轻化。近年来,随着人们健康意识的提高、检查手段的进步,很多早期卵巢癌被及时发现和诊治。怎样使患者得到更有效、更安全的治疗,提高患者的生存率和生活质量,保护年轻患者的生殖内分泌功能成为卵巢癌研究的新热点。
“促性腺激素理论”认为促性腺激素对卵巢癌生长起促进作用。促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)对促性腺激素的降调节作用在理论上能够抑制卵巢癌的生长和增殖。GnRH是下丘脑释放的十肽激素,主要作用是调控垂体卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)的合成与分泌,维持正常的生殖系统功能。由于GnRH的半衰期很短,一般应用其类似物(包括激动剂和拮抗剂)来进行相关研究和应用。基础研究报道GnRH激动剂或拮抗剂能够抑制体外培养的卵巢癌细胞生长,提示GnRH类似物在H-P-O轴外也有作用。有研究推测轴外作用是通过GnRH受体(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)产生的。哺乳动物GnRHR有两型：GnRHR 1和GnRHR2。另一方而,研究显示青春期前的儿童暴露于化疗药物造成卵巢功能损害的比例只有10%。提示临床上可以人为创造暂时的青春期前环境,保护卵巢功能免受化疗药物的损害。GnRH能够抑制H-P-O轴,抑制FSH和LH的分泌,使卵巢功能处于青春期前水平,理论上能够对卵巢功能起到保护作用。抗苗勒管激素(Anti-Mullerian hormone, AMH)是卵巢颗粒细胞分泌的糖蛋白激素,研究提示AMH能够抑制卵泡的初始募集和循环募集,调控卵泡发育的过程,是能够早期反应卵巢功能的指标。本研究从体外细胞实验和体内动物实验两方面证实GnRH类似物的抑制卵巢癌和保护卵巢功能的双重调节作用,并比较GnRH激动剂和拮抗剂的作用差异。这将为临床选择应用GnRH激动剂或拮抗剂治疗卵巢癌、保护卵巢功能提供实验依据。本研究分别选用GnRH激动剂goserelin和拮抗剂cetrorelix作为实验药物。
课题共分四个部分：1.GnRH类似物对卵巢癌细胞生长、增殖的影响；2.人卵巢颗粒细胞体外培养,检测GnRH类似物对颗粒细胞分泌AMH、E2和P的影响；3. GnRH类似物对裸鼠皮下移植瘤和裸鼠卵巢功能的双重调节作用；4.临床资料研究,分析GnRHR与卵巢癌临床分期和病理分级的相关性。
第一部分GnRH类似物对卵巢癌细胞生长、增殖的影响
目的研究GnRH类似物对卵巢癌细胞生长、增殖的影响。
方法用RT-PCR方法检测卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3-ip上GnRHRl和GnRHR2基因的表达。分别用不同浓度(0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)GnRH激动剂goserelin或拮抗剂cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip细胞,24 h后用磺基罗丹明染色(SRB)法检测细胞增殖情况。分别用10"5 mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip细胞14天,观察细胞集落形成情况。应用流式细胞仪分析10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2或SKOV3--ip细胞24 h后对细胞周期的影响。蛋白印迹法检测10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用于ES-2和SKOV3-ip细胞24 h后,对细胞周期蛋白cyclinB1和cyclinD1表达的影响。以及10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用不同时间(0、15、30、60、120、240 min)对ES-2和SKOV3-ip细胞pAKT蛋白表达的影响。
结果ES-2和SKOV3-ip细胞株均表达GnRHR1和GnRHR2。SRB结果提示GnRH激动剂和拮抗剂均不同程度抑制了ES-2和SKOV3-ip细胞的增殖,且浓度越高抑制越明显。在ES-2细胞株,10-5 mol/L cetrorelix的抑制作用比10-5mol/Lgoserelin更明显(P<0.05)。10-5 mol/L goserelin或cetrorelix能抑制卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3-ip集落形成；在SKOV3-ip细胞株,cetrorelix的抑制作用大于goserelin (P<0.05)。细胞周期结果提示goserelin和cetrorelix均能略微增加S期细胞比例,但差异没有统计学意义(P>0.05)。Goserelin和cetrorelix均能使ES-2和SKOV3-ip细胞周期蛋白cyclin B1的表达降低,使cyclin D1的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法检测提示10-5 mol/L goserelin或cetrorelix作用达2h及以上均能抑制ES-2和SKOV3-ip细胞pAKT蛋白的表达。
结论ES-2和SKOV3-ip细胞株均表达GnRHR1和GnRHR2。GnRH激动剂和拮抗剂均能抑制卵巢癌细胞株ES-2和SKOV3-ip的生长和增殖。
第二部分GnRH类似物对卵巢颗粒细胞分泌AMH、E2和P的影响
目的研究GnRH类似物对卵巢颗粒细胞分泌AMH、E2和P的影响。
方法用免疫细胞化学方法检测原代分离培养的人卵巢颗粒细胞上Calretinin、Inhibinα、EMA、Vimentin、CD99、Desmin、CD34的表达,并进行油红染色和H-E染色鉴定颗粒细胞。用免疫细胞化学方法检测颗粒细胞上GnRHR1和GnRHR2的表达情况。分别用顺铂(DDP)、goserelin、goserelin+DDP、cetrorelix或cetrorelix+DDP处理颗粒细胞24 h后,用ELISA方法检测颗粒细胞分泌AMH的水平,用化学发光法检测颗粒细胞分泌E2和P的水平。
结果免疫细胞化学方法证明颗粒细胞上存在GnRHR1和GnRHR2表达。Goserelin能上调颗粒细胞分泌AMH的水平,cetrorelix能明显上调颗粒细胞分泌AMH的水平(P<0.05)；但goserelin和cetrorelix对E2和P的分泌无明显影响(P>0.05)。
结论颗粒细胞上存在GnRHR1和GnRHR2表达。GnRH类似物能上调颗粒细胞AMH的分泌。
第三部分GnRH类似物对裸鼠皮下移植瘤和卵巢功能的双重调节作用
目的研究GnRH类似物对裸鼠皮下移植瘤和卵巢功能的双重调节作用。
方法ES-2细胞连续培养传代后调整浓度为2.5×107/ml取0.2 ml注射于36只裸鼠右侧肩胛区皮下,随机分为6组。处理如下：(1)生理盐水(NS)组：皮下注射NS 0.1 ml/天；一周后腹腔注射NS 0.2 ml/周。(2)DDP组：皮下注射NS 0.1 ml/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀释至0.2 m1)/周。(3) goserelin组：皮下注射100μg goserelin(稀释至0.1 m1)/天；一周后腹腔注射NS 0.2 ml/周。(4)goserelin+DDP组：皮下注射100μg goserelin(稀释至0.1 m1)/天；周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀释至0.2 m1)/周。(5) cetrorelix组：皮下注射100μg cetrorelix(稀释至0.1 m1)/天；一周后腹腔注射NS 0.2 ml/周。(6)cetrorelix+DDP组：皮下注射100μg cetrorelix(稀释至0.1 m1)/天；一周后腹腔注射5 mg/kg DDP(稀释至0.2 m1)/周。比较各组裸鼠体重、移植瘤体积、移植瘤组织Ki-67表达情况、动情周期、血AMH、FSH、E2和P的分泌、卵巢各级卵泡比例和卵巢体积的差异。卵巢组织和移植瘤切片H-E染色观察病理形态学变化。
结果各组裸鼠体重变化无明显差异(P>0.05)。用药第12天开始,DDP组、goserelin组、goserelin+DDP组、cetrorelix组、etrorelix+DDP组肿瘤体积均明显小于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。DDP组、goserelin组和goserelin+DDP组移植瘤组织Ki-67的表达明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,goserelin组、goserelin+DDP组和cetrorelix组的动情次数明显减少(P<0.05)；goserelin+DDP组动情周期时间明显延长(P<0.05)。Goserelin组裸鼠血中AMH的表达明显高于空白对照组(P<0.05),各组裸鼠血中FSH、E2和P的变化无明显统计学差异(P>0.05)。Goserelin组卵泡闭锁率明显小于DDP组(P<0.05)。Goserelin组、goserelin+DDP组、cetrorelix组和cetrorelix+DDP组原始卵泡+窦前卵泡率明显高于DDP组(P<0.05)。病理形态学观察到DDP组卵巢组织间质纤维化明显,卵泡数量减少,窦前卵泡减少,各级卵泡均出现较高比例闭锁。空白对照组移植瘤增殖活跃、分化差、并出现肝转移。
结论Goserelin或cetrorelix能抑制裸鼠皮下移植瘤生长和增殖同时上调AMH分泌、减少裸鼠动情次数、延长动情周期、增加原始卵泡+窦前卵泡率,保护卵巢功能。
第四部分GnRHR在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌临床分期、病理分级的关系
目的研究GnRHR (GnRHR1和GnRHR2)在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌临床分期、病理分级的关系。
方法用免疫组织化学的方法分别检测GnRHR 1和GnRHR2在54例上皮性卵巢癌组织中的表达,分别统计分析GnRHR 1、GnRHR2表达量与卵巢癌临床分期和病理分级及肿瘤转移的关系。
结果GnRHR1在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌组织中的表达明显高于Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌(P=0.001)。GnRHR2在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌组织中的表达亦明显高于Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌(P<0.001)。GnRHR2在高分化的卵巢癌组织中的表达明显高于中分化和低分化的卵巢癌组织(P<0.001)。GnRHR1在不同病理分级的卵巢癌组织中的表达无明显统计学差异(P>0.05)。GnRHR1和GnRHR2在卵巢癌原发灶和转移灶中的表达无明显统计学差异(P>0.05)。GnRHR1和GnRHR2之间在表达量上无明显相关性。
结论GnRHR1和GnRHR2在卵巢癌组织中广泛表达。GnRHR1和GnRHR2在Ⅰ-Ⅱ期卵巢癌中表达较高。GnRHR2在高分化的卵巢癌中的表达较高。GnRHR1和GnRHR2与卵巢癌生长、增殖密切相关。
综上所述,GnRH类似物goserelin或cetrorelix能抑制卵巢癌细胞生长和增殖、抑制裸鼠皮下移植瘤的生长和增殖。上调颗粒细胞分泌AMH,抑制卵泡募集,降低生长卵泡对FSH的敏感性,增加原始卵泡+窦前卵泡率,减少裸鼠动情次数、延长动情周期,从而保护卵巢功能。在裸鼠体内实验中同时观察到上述两种作用。这为临床应用GnRH类似物对年轻、早期卵巢癌患者进行卵巢癌治疗和生殖内分泌功能保护提供了实验依据。
关键词: 卵巢癌 ；促性腺激素释放激素 ；激动剂 ；拮抗剂 ；卵巢功能保护 ；抗苗勒管激素
被引量
4
摘要： 在全世界范围内,农药大量应用于农业生产、室内环境、公共卫生等方面。由于农药被人为的释放到环境中,从而导致食物、水、土壤、大气受到污染,经常能在生物体内和环境介质中检测到许多农药残留。越来越多的研究表明,农药作为一类内分泌干扰物能影响野生动物和人类的内分泌系统,导致出生缺陷以及生殖和发育障碍等,因此,农药对人类和野生动物生殖健康的风险一直备受关注。促性腺激素在调控脊椎动物的生殖功能和性腺发育过程中起重要作用,它由卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)构成,由垂体促性腺细胞分泌,受促性腺激素释放激素(GnRH)调控。流行病学调查表明,人体内的FSH和LH水平与有机氯农药的暴露水平存在显著正相关,然而,在环境暴露水平上有机氯农药对促性腺激素合成的影响机制尚未报道。动物实验研究表明,苯并咪唑类和三唑类等农药能导致动物胚胎着床失败、胚胎重吸收、胚胎死亡,说明这些农药对胎盘存在一定的毒性效应。胎盘是妊娠期间的一个特异的内分泌器官,在维持妊娠和胎儿发育过程中起重要作用。然而,农药对胎盘毒性效应的机制少有报道。本研究利用小鼠垂体瘤细胞系LβT2细胞作为体外模型,检测了有机氯杀虫剂对促性腺激素亚基基因转录和激素合成的影响。利用人胎盘滋养层细胞检测了苯并咪唑类杀菌剂和三唑类杀菌剂对该细胞的的细胞毒性、细胞周期、细胞迁移和侵润以及调节因子转录的影响。本论文研究内容主要包括以下三部分：(1)已有研究表明,暴露DDT类似物能导致FSH和LH分泌失调,促性腺激素(FSHβ, LHβ and Cga)基因转录的快慢决定了FSH和LH合成速度,然而DDT类似物对促性腺激素基因表达的影响机制未知,因此,本论文检测了p,p'-DDT,o,p'-DDT,p,p'-DDE和MXC对垂体促性腺激素基因转录及激素合成的影响。结果表明,p,p'-DDT和MXC在实验浓度10-9-10-7 mol/L下,能刺激促性腺激素基因转录和激素分泌并且存在剂量效应关系,这种刺激作用是通过ERK信号通路实现。本研究表明p,p'-DDT和MXC刺激垂体细胞促性腺激素基因转录和激素合成是通过ERK途径调节。(2)苯菌灵和多菌灵属于苯并咪唑类杀菌剂,被全世界广泛应用于农业真菌性病害的防治。这两种杀菌剂能通过食物、呼吸、职业暴露等途径进入人体,从而给人类健康带来一定的危害。然而,目前尚未有关于苯菌灵和多菌灵对人胎盘毒性效应的报道。因此本研究利用人胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo (HTR-8)来评价苯菌灵和多菌灵对胎盘的毒性效应。结果表明这两种杀菌剂能降低HTR-8的细胞活性,减少滋养层细胞G0/G1期的百分比,诱导细胞发生凋亡,也能抑制细胞的侵润、迁移能力。通过进一步研究还发现这两种杀菌剂能显著改变侵润相关蛋白酶系MMPs/TIMPs和uPA/PAI-1的基因转录,也能改变HTR-8细胞中粘附分子整合素α5亚基和整合素p1亚基的基因转录。(3)三唑类杀菌剂使用非常广泛,是目前使用量排名前十的农药之一。尽管三唑类杀菌剂对哺乳动物有生殖毒性,但是目前很少有数据显示该类杀菌剂能影响人胎盘的功能。戊唑醇是三唑类农药常用的一种杀菌剂,广泛用于农业真菌性病害的防控。本文研究结果显示,暴露戊唑醇抑制了人胎盘滋养层细胞HTR-8的增殖,使该细胞在G1期和G2期百分比升高,也能诱导该细胞凋亡。在蛋白水平上,戊唑醇能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时也能诱导促凋亡蛋白Bax表达水平的上升,这表明该杀菌剂通过线粒体途径诱导胎盘滋养层细胞凋亡,戊唑醇也显著降低了滋养层细胞的侵润和迁移能力。戊唑醇能干扰胎盘主要功能基因的的转录,这些功能基因包括MMP-2、MMP-9、TIMP-1、 TIMP-2、uPA、PAI-I、VEGF、PIGF、α-hCG、β-hCG、HB-EGF和TNF-α。由此可见,戊唑醇通过干扰胎盘侵润相关蛋白酶系、激素、血管生长因子、生长因子和细胞因子,从而抑制人胎盘滋养层细胞侵润。由于滋养层的侵润和迁移能力对成功妊娠和胎儿发育有重要作用,本研究结果提示三唑类杀菌剂暴露对人类妊娠存在潜在风险。
关键词: 有机氯农药 ；苯并咪唑类杀菌剂 ；三唑类杀菌剂 ；垂体促性腺细胞 ；胎盘滋养层细胞 ；细胞毒性 ；内分泌干扰
被引量
17
摘要： 卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居妇科恶性肿瘤之首位。虽然近年来在手术及药物治疗方面取得很大进展,但5年生存率一直徘徊在25%-30%。其原因之一在于卵巢癌起病隐匿,缺乏有效的早期诊断措施,当临床确诊时70%以上的患者已处于晚期阶段。此时手术难以清除所有病灶,放疗效果有限,所以在治疗过程中化疗占据了重要地位。但是传统化疗又有很大的缺憾,即药物分布缺乏选择性,很大一部分集中在非病灶区,导致“真正”的有效剂量大大降低,而且带来严重的剂量限制性毒副作用。这就使得传统化疗受到很大限制,以致疾病进展或复发,生存率徘徊不前。因此,积极开发精确的科学的个体化靶向治疗策略,在提高药物疗效的同时降低毒副作用,已成为肿瘤研究的重要任务。
靶向治疗具有很强的目的性,能够特异性的针对肿瘤某些特定分子,在提高药物对肿瘤细胞杀伤力的同时,可以显著减少药物对其它无关组织的毒副作用,所以在肿瘤的生物治疗中具有相当的优势。按照靶向源动力可将靶向给药系统分为被动靶向和主动靶向两类。其中,被动靶向药物,如普通纳米粒和脂质体药物进入体内首先被单核巨噬系统摄取,随着载体的逐步降解,药物缓慢释放。药物多集中到肝、脾等器官,很难到达其它靶部位。与此相比,主动靶向制剂用修饰过的药物载体作为“导弹”,将药物特异性输送到靶细胞,可使药物在靶区浓集。然而采用酯化或化学修饰方法构建的系统对药物理化性质要求较高,很可能影响化疗药物的活性。应用较多的单抗介导的靶向治疗,多由肿瘤相关抗原或细胞因子制备。由于靶抗原在动物体内是肿瘤特异性的,而在人体内仅具有肿瘤相关性,使得实际应用中特异性较差,而且单抗具有较强的免疫原性和种属选择性,而人源化抗体的制备又较为复杂。目前受体介导的靶向治疗研究所选择的目标受体多在性腺以外的正常组织也有分布,就卵巢癌而言,仍缺乏足够的选择性。理想的抗肿瘤靶向给药系统应该是仅作用于拟定的肿瘤细胞靶点,而不作用于正常细胞的相同靶点。
为了克服上述缺陷,本课题基于卵巢癌病因学和生化特征,结合受体靶向治疗和纳米粒载体各自的优势,构建了一种新型的卵泡刺激素受体(Folliclestimulating hormone receptor,FSHR)介导的卵巢癌主动靶向治疗系统—卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒给药系统(Follicle stimulating hormone peptide modifiednanoparticulate system,FSHP-NP),以克服目前治疗所遇障碍。该新型治疗系统将经聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)表面修饰的纳米粒作为药物载体,可显著提高载药量和药物运送能力,并增加药物稳定性,减少单核巨噬系统的吞噬。卵巢是促性腺激素的靶器官,FSHR多局限性分布于生殖系统,且在卵巢表面生发上皮(Ovarian surface epithelium,OSE)、卵巢癌细胞系及组织都有表达。因此将卵泡刺激素结合片段作为靶向头基,可通过FSHR特异性介导的内吞方式,选择性的递送更多药物进入靶细胞,提高“真正”有效剂量,降低毒副反应。该新型给药系统在国内外均未见报道,具有较高的创新性。
为了评价将FSHR作为卵巢癌治疗靶点的可行性,本文第一部分采用免疫细胞化学、免疫组织化学以及Western blot方法对如下细胞系和组织中FSHR和促黄体激素受体(Luteinizing hormone receptor,LHR)的表达情况进行了检测:几种常见人卵巢癌细胞系、中国仓鼠卵巢细胞、人肝癌细胞系;人卵巢癌组织;人卵巢癌裸鼠模型的瘤体及重要器官组织。结果证实人卵巢癌细胞系Caov-3和OVCAR-3,56.67%和30.00%的人卵巢癌组织,以及裸鼠Caov-3皮下移植瘤都表达有FSHR和LHR。除了子宫卵巢以外,FSHR和LHR在裸鼠心、肝、脾、肺和肾组织中均未见表达,人肝癌细胞系BEL-7402和人卵巢癌细胞系SKOV-3也呈阴性表达。这些结果以及既往文献报道都提示促性腺激素受体的局限性分布,提示将其用作卵巢癌治疗靶点是可行的。
本文第二部分旨在找寻能够与卵巢癌细胞特异性结合且对细胞无促增殖作用的FSH结合片段,用作给药系统的靶向头基。首先合成并用生物素和异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记FSHβ链第1-15、33-53、51-65、81-95氨基酸片段,然后采用非竞争酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedimmunosorbnent assay,ELISA)对这些多肽与FSHR的亲和力进行了检测,并用荧光显微镜和流式细胞术对其特异性加以验证,最后通过MTT实验检测了其对人卵巢癌细胞生长的影响。结果表明这4条多肽均能够识别并结合FSHR,其中,FSHβ33-53和FSHβ81-95的结合能力相对较强,能够特异性识别FSHR阳性的Caov-3细胞,且对人卵巢癌细胞系Caov-3的生长也没有显著影响。因此,本课题将选择FSHβ33-53和FSHβ81-95作为靶向头基进行初步研究。
本文第三部分为FSHP-NP的构建和表征。将马来酰亚胺聚乙二醇-聚乳酸(Maleimide-PEG-PLA)和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methoxyl PEG-polylactic acid,MPEG-PLA)以1:9的比例,采用复乳/溶媒蒸发法制备得到纳米粒(Nanoparticle,NP)。通过NP表面的马来酰亚胺基分别与FSHβ33-53和FSHβ81-95的巯基进行共价连接,得到FSHP33-NP和FSHP81-NP。所制备的NP平均数粒径在100nm以下,Zeta电位为-25 mV左右。NP表面经多肽修饰后粒径并没有显著增加。X射线光电子能谱分析表明纳米粒表面的N元素主要来自于表面所修饰的多肽,证实纳米粒表面成功连接了靶向头基FSHβ33-53和FSHβ81-95。
为了评价FSHP-NP的递药特性,第四部分制备了载6-香豆素和载紫杉醇(Paclitaxel,PTX)的NP以及FSHP-NP,并建立了相应的高效液相色谱(Highperformance liquid chromatography,HPLC)分析方法。采用6-香豆素作为荧光探针,通过荧光显微镜和流式细胞术观察并测定载6-香豆素的FSHP33-NP和FSHP81-NP对FSHR表达阴性和阳性的卵巢癌细胞的靶向作用。同时采用HPLC测定了Caov-3细胞对载PTX的FSHP33-NP和FSHP81-NP的摄取能力。细胞摄取实验结果表明,FSHR表达阳性的Caov-3细胞对FSHP33-NP和FSHP81-NP的摄取显著高于FSHR表达阴性的SKOV-3细胞;Caov-3细胞对FSHP33-NP和FSHP81-NP的摄取显著高于未修饰FSHP的普通NP。而且摄取呈现时间、浓度和温度依赖性。三种纳米粒的靶向效率依次为:FSHP33-NP＞FSHP81-NP＞NP。
为了实现对卵巢癌的靶向治疗,第五部分以PTX为模型药物,制备了包载PTX的FSH多肽修饰的纳米粒,并对其进行了体内外的疗效学考察。首先采用MTT方法检测了其对人卵巢癌细胞的抑制作用;其次建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,分为生理盐水、市售PTX、NP-PTX、FSHP33-NP-PTX和FSHP81-NP-PTX五组,考察了其抑瘤效果,及对肿瘤细胞周期的影响。体外检测结果表明四组药物对Caov-3细胞的抑制效应依次为:FSHP33-NP-PTX＞FSHP81-NP-PTX＞NP-PTX＞PTX。FSH多肽修饰后纳米粒的IC50比普通纳米粒低2倍左右,比游离PTX低10倍左右。当累计给予30 mg/kg体重的PTX时,靶向治疗组裸鼠瘤体的细胞周期明显受到阻滞,体积抑瘤率和重量抑瘤率均为69%左右,分别是普通纳米粒和市售PTX的2倍和3.5倍左右。上述结果表明本部分构建的PTX靶向制剂无论在体内外都具有较强的抗肿瘤作用,提示这种主动靶向给药系统能够提高相同剂量化疗药物的抑瘤效果。
综上所述,本课题构建的这种新型的FSHP-NP药物递送系统,能够通过FSHR介导的特异性内吞,选择性的递送更多药物进入卵巢癌细胞,实现高效低毒的目的。本课题为改善卵巢癌治疗现状奠定了坚实的实验基础。
关键词: 卵巢肿瘤 ；靶向治疗 ；卵泡刺激素 ；受体 ；纳米粒 ；紫杉醇 ；6-香豆素
被引量
4
摘要： 第一部分人卵巢黄素化壁层颗粒细胞多种细胞因子的表达与卵巢反应性及临床妊娠的关系
【研究目的】
研究在体外受精—胚胎移植过程中获取的人卵巢黄素化壁层颗粒细胞（mural granulosa cells，MGC）分泌IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin和bFGF，探讨多种细胞因子表达水平与超促排卵的卵巢反应性及临床妊娠的关系。
【材料和方法】
1．壁层颗粒细胞标本人黄素化壁层颗粒细胞取自2006年3月至9月在南方医院生殖中心行IVF-ET治疗妇女的卵泡液，共32例，均为输卵管因素或男方因素不孕者。
2．壁层颗粒细胞体外培养经拾卵后的所有卵泡穿刺液，用Percoll梯度离心法分离壁层颗粒细胞。根据取卵时平均直径在14mm以上的卵泡数不同，将患者分为卵巢高反应、正常反应和低反应3种类型，即高反应型卵泡数=14个，正常反应型卵泡数5～13个，低反应型卵泡数=4个。按胚胎移植后35天B超检查见胎心搏动分为妊娠组，反之，为未妊娠组。
3．Luminex system（LumAvidin Beads）检测运行Luminex检测细胞培养上清液中9种细胞因子：IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin、bFGF的浓度。
【统计方法】
利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较≤35岁和≥36岁组，妊娠组和非妊娠组组间因子水平的差异。方差分析分析卵巢反应组间因子表达量的差异，用偏相关分析各细胞因子表达量之间，细胞因子与获卵数、成熟卵子数和雌二醇之间的相关性。P=0.05差异有统计学意义。
【结果】
1．≤35岁组与≥36岁组的IVF患者MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF有统计学差异（P=0.05）。
2．IL-la、IL-6、VEGF与获卵数、成熟卵子数、雌二醇相关关系显著，相关密切。IL-1β、bFGF与获卵数、成熟卵子数相关关系显著，相关密切（P=0.05）。
3．根据取卵时卵泡发育数不同进行卵巢反应性分组，卵泡直径为14mm以上的卵泡数≤3个为卵巢低反应组，卵泡数4～13个为卵巢中反应组，≥14个为卵巢高反应组。在卵巢反应分组中，IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、VEGF、leptin和bFGF在组间有显著差异（P=0.05），余因子水平未见差异（P＞0.05）。
4．在卵巢正常反应组中，IL-1α和IL-6，IL-1β和IL-1ra、IL-6，IL-1ra与IL-6，IL-6与VEGF相关关系显著，相关密切（P=0.05）。IL-6和leptin负相关关系显著，相关密切（P=0.05）。
5．妊娠组与非妊娠组的获卵数、成熟卵子数、雌二醇均没有统计学差异。两组比较，前者MGC的IL-1 ra、EGF分泌水平低于后者，有统计学差异（p＜0.05），而IL-1a、IL-1β、IL-6、VEGF水平高于后者，余因子水平未见统计学差异。
【结论】
1．随着年龄的增加，高龄患者的MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF降低。
2．IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、VEGF、leptin和bFGF在不同的卵巢反应组间有显著差异，提示上述细胞因子与超促排卵的卵巢反应性有关。高反应组的MGC分泌更多的细胞因子。3．通过IVF治疗获得妊娠的妇女比未妊娠者MGC分泌更高的IL-1α、IL-1β、IL-6和VEGF，而IL-1ra和EGF则相反。提示IL-1a、IL-1β、IL-6和VEGF，有利于卵母细胞发育及以后的胚胎生长发育。
4．Luminex液相蛋白芯片分析系统具有灵活性好、通量大、灵敏度高、信噪比好的特点，能同时检测到同一样本多个极微量的分子蛋白，比其它的检测方法具有更多优势。
第二部分人卵丘细胞多种细胞因子的表达与卵巢反应性及临床妊娠的关系
【研究目的】
研究体外培养的卵丘细胞（cumulus cells，CC）分泌IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin、bFGF的水平，探讨上述多种细胞因子表达与卵巢反应性及临床妊娠的关系。
【材料和方法】
1．卵丘细胞标本人卵丘颗粒细胞取自在南方医院生殖中心行IVF-ET治疗的妇女，共13例，均为输卵管因素或男方因素不孕者。
2．卵丘细胞体外培养取卵后，机械法分离卵子周围的卵丘颗粒细胞团，用0.1％透明质酸酶消化并用吸管反复吹打直至将卵丘颗粒细胞团分散为单个细胞。按活细胞1×10～4／mL密度接种于24孔培养板中，每瓶加1mL细胞悬液。加入含10％小牛血清的RPMI-1640液lmL后，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养，细胞贴壁后更换无血清RPMI-1640液，24小时后收集上清液。
3．Luminex system（LumAvidin Beads）检测方法同第一部分
【统计方法】
利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较妊娠组和非妊娠组组间因子水平的差异。方差分析分析卵巢反应组间因子表达量的差异，用偏相关分析各细胞因子表达量之间，细胞因子与获卵数、成熟卵子数和雌二醇之间的相关性。P=0.05差异有统计学意义。
【结果】
1．CC分泌的IL-1ra与成熟卵子数相关关系显著，相关密切（P=0.05）；VEGF与获卵数、成熟卵子数、雌二醇相关关系显著，相关密切（P=0.05）。
2．根据取卵时卵泡发育数不同进行卵巢反应性分组，卵泡直径为14mm以上的卵泡数≤3个为卵巢低反应组，卵泡数4～13个为卵巢中反应组，≥14个为卵巢高反应组。三组患者间年龄无差异（P＞0.05）。VEGF在组间有显著差异（P=0.05），余因子水平未见统计学差异（P＞0.05）。
3．妊娠组与非妊娠组的年龄、获卵数、成熟卵子数、雌二醇及孕酮均没有差异（P＞0.05）。两组卵丘细胞培养上清液中的9种细胞因子水平相近，均未见统计学差异（P＞0.05）。
【结论】
1．体外培养的人卵丘细胞分泌的IL-1ra水平与成熟卵子数相关，VEGF与卵子数、成熟卵子数、雌二醇正相关，IL-1ra和VEGF可能调节卵母细胞的发育成熟。
2．年龄相似的不同卵巢反应性组卵丘颗粒细胞的VEGF表达水平有显著差异，而其它细胞因子未见差异，提示VEGF在卵巢对超促排卵的反应性中发挥了重要作用。
3．卵丘细胞分泌的上述9种因子与临床妊娠率无明显关系，提示卵丘细胞表达的上述9种因子不影响IVF—ET的临床妊娠率。第三部分促性腺激素释放激素激动剂对人卵巢壁层颗粒细胞多种细胞因子的调节作用
【研究目的】
研究在IVF-ET治疗中使用促性腺激素释放激素激动剂对人卵巢壁层颗粒细胞分泌的IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、EGF、leptin和bFGF的调节作用，探讨GnRHa在IVF-ET中应用的安全性。
【材料和方法】
1．壁层颗粒细胞标本同第一部分。
2．壁层颗粒细胞体外培养MGC培养24小时，观察细胞贴壁后，更换无血清RPMI-1640液，促性腺激素激动剂（Gonadotrophinreleasing hormone agonist，GnRHa）组为培养液中加入GnRHa，终浓度为100pg／ml。培养24h后，收集上清液。
3．Luminex system检测同第一部分。
【统计方法】
利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较GnRHa组和对照组问因子水平的差异。P≤0.05差异有统计学意义。
【结果】
比较加入GnRHa（实验组）体外培养的MGC分泌上述细胞因子并与未加GnRHa（对照组）。两组间的获卵数、成熟卵子数、妊娠率无明显差异（p＞0.05）。两组间的上述9种细胞因子分泌水平无统计学差异（p＞0.05）。
【结论】
GnRHa对MGC表达IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、EGF、leptin和bFGF无明显影响，提示在IVF治疗中应用GnRHa对卵巢颗粒细胞分泌细胞因子以调控卵母细胞发育无不利作用。
关键词: 体外受精 ；妊娠 ；颗粒细胞 ；卵丘细胞 ；细胞因子 ；生长因子 ；雌二醇 ；卵巢 ；反应性
被引量
4
摘要： 研究背景化疗是临床上晚期卵巢癌的主要治疗手段之一,目前卵巢癌化疗的一线药物以铂类为主,但是肿瘤细胞对铂类药物表现出的耐药性的逐渐增强已经显著限制了其临床疗效。因此,为解决晚期卵巢癌对铂类药物耐药的难题,寻找有效的化疗增敏药物以制定更佳的化疗方案,改善患者的生活质量,国内外学者做了许多的研究。 流行病学研究显示,甾体激素在卵巢癌的发生中起到一定的作用,促性腺激素、雌激素以及雄激素可能是致病因子,而促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone,GnRH）可能是保护因子。GnRH是下丘脑肽能神经元分泌的一种十肽激素,其在体内的重要功能是由GnRH受体介导完成的。有研究发现,除垂体外,在人类的一些恶性肿瘤细胞中也有GnRH及其受体的表达。目前临床应用人工合成的GnRH类似物（gonadotropin releasing hormone analog,GnRHa）治疗多种性激素依赖性肿瘤（如乳腺癌,前列腺癌等）,机制在于此类药物和GnRH受体结合,通过垂体的“去势作用”而抑制性激素的分泌,或直接对肿瘤细胞产生抗增殖作用。 许多研究表明,约80%的卵巢癌组织中有GnRH及其受体的表达,GnRHa对卵巢癌细胞系的抗增殖作用与抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor recaptor,EGFR）信号转导通路密切相关。正常卵巢上皮组织中EGFR表达量很低或缺如,但70%以上的卵巢癌组织中有EGFR高水平表达。GnRHa与受体结合后激活磷酸酪氨酸磷酸酶（Phosphotyrosine phosphatase,PTP）,抵抗表皮生长因子（epidermal growthfactor,EGF）诱导的EGFR酪氨酸自磷酸化作用,从而干扰表皮生长因子受体上的有丝分裂信号转导,抑制癌细胞的增殖。 最近,有研究指出卵巢癌细胞通过EGFR介导的信号转导效应的增强,导致卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的增加,而下调或抑制EGFR表达可以增加癌细胞对化疗的敏感性。有关GnRH类似物作为化疗逆转剂逆转人类乳腺癌细胞的多药耐药性研究已被证实,而GnRH类似物对卵巢癌耐药细胞的化疗逆转作用,目前较少有文献报道。本实验建立了卵巢癌顺铂耐药的体外细胞模型,观察GnRH类似物曲谱瑞林（Triptorelin）对逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的效果,为卵巢癌临床联合化疗提供新的思路。 研究目的观察体外实验中曲谱瑞林逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的效果,并初步探讨其作用相关机制。 方法和结果 第一部分实验方法和结果 实验方法体外建立卵巢癌顺铂耐药亚细胞系OVCAR-3/DDP:1、采用浓度梯度递增法,基于人类卵巢癌OVCAR-3细胞系诱导建立卵巢癌顺铂耐药细胞系模型,命名为OVCAR-3/DDP;2、MTT法测定IC50、耐药指数（RI）;3、流式细胞技术检测细胞周期分布情况。 结果1、采用浓度梯度递增法对OVCAR-3细胞进行体外诱导,历时10个月获得其耐药细胞亚系,在浓度为3μmol/L的顺铂环境下能生长良好,于无药培养基中培养2个月耐药性稳定,命名为OVCAR-3/DDP细胞;2、细胞周期FCM分析:相对于亲本OVCAR-3细胞,其顺铂耐药株OVCAR-3/DDP细胞对数生长期的增殖速度减慢,细胞多数分布于G0/G1期,细胞主要处于潜伏期,增殖缓慢,S期细胞数目明显减少,从而避开顺铂主要作用的细胞周期S期;3、MTT增殖实验结果分析:OVCAR-3细胞对顺铂的IC50为6.22μM,OVCAR-3/DDP对顺铂的IC50为83.48μM,耐药指数（RI）为13.42。 第二部分实验方法和结果 实验方法研究曲谱瑞林对OVCAR-3/DP细胞的化疗逆转作用及耐药细胞表面EGFR表达改变1、实验分组:选取两药的血药峰值浓度（Cmax）作为联合作用的基础。设计0.01、0.1、1、10、100倍Cmax共5个浓度梯度,分为:Ⅰ、耐药细胞顺铂处理组;Ⅱ、耐药细胞曲谱瑞林处理组;Ⅲ、耐药细胞两药联合处理组（处理浓度为相同梯度倍数的浓度值相加）;Ⅳ、耐药细胞未处理组;Ⅴ、亲本细胞未处理组。2、比较Ⅰ-Ⅳ不同加药情况下细胞抑制率的差异;3、MTT法检测IC50、化疗逆转倍数（RR）:RR=IC50（顺铂处理组）/IC50（顺铂+曲谱瑞林联合处理组）;金式公式求q值分析两药是否具有协同作用;4、EGFR流式免疫荧光测定:采用流式细胞仪将各组别EGFR（RPE）标记好的细胞应用Cell quest软件程序进行资料处理。计算分别以Cmax-T、Cmax-D、Cmax-（T+D）作用和不加药处理四种情况下各组耐药细胞样品中表达EGFR的细胞阳性率及单个细胞表达EGFR的平均荧光强度,以此表示其相对含量。 结果曲谱瑞林对OVCAR-3/DDP细胞的化疗逆转作用及耐药细胞表面EGFR表达改变:1、各组细胞生长情况比较:顺铂组、曲谱瑞林组的耐药细胞生长状况与耐药细胞未加药处理组接近,两组间各时间点的生长抑制率比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）;而两药联合处理组的耐药细胞生长受到较明显抑制,与单用顺铂处理组比较差异有统计学意义（P＜0.01）;2、采用MTT法及Excel软件加权线性回归法计算Ⅰ-Ⅲ不同加药组别耐药细胞的IC50,化疗逆转倍数（RR）为3.91;根据金氏公式求q值为1.75,q值＞1说明曲谱瑞林和顺铂对耐药细胞的联合作用为协同作用。3、耐药细胞的EGFR表达改变:与单药处理组及未加药处理组细胞比较,在两药联合处理组中表达EGFR的细胞阳性率明显下降（P＜0.01）,且单个细胞表达EGFR的荧光强度明显降低（P＜0.01）。提示联合用药时,耐药细胞表面EGFR的表达显著下调。 结论1、成功建立了卵巢癌顺铂耐药细胞亚系OVCAR-3/DDP,为研究逆转卵巢癌顺铂耐药提供了体外实验模型;2、细胞增殖实验结果显示,曲普瑞林与顺铂联合应用可部分逆转卵巢癌顺铂耐药细胞OVCAR-3/DDP对顺铂的耐药性,且两药联合对耐药细胞的杀伤作用为协同作用;3、和单药作用比较,两药联合应用时耐药细胞EGFR的表达降低明显,提示曲普瑞林对顺铂耐药卵巢癌细胞的化疗逆转作用可能与其下调细胞表面EGFR表达有关。
关键词: 曲谱瑞林 ；卵巢癌 ；顺铂 ；顺铂耐药 ；EGFR ；化学敏感性
摘要： 重组免疫毒素是由靶向区和细胞毒性区组成、可以识别并选择性杀伤特定细胞的融合蛋白,是一类重要的肿瘤靶向性治疗药物。靶向区为能与肿瘤细胞表面抗原特异结合的抗体、细胞因子或激素,毒性区为细菌毒素,如铜绿假单胞菌外毒素(PE)和白喉毒素(DT),或植物毒素,如蓖麻毒素(RT)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)和皂草素等。重组免疫毒素用于恶性肿瘤的导向治疗已取得很大成功,如以人IL-2为导向分子,以DT为毒性部分的免疫毒素制剂(商品名ONTKA)已获得美国FDA批准,用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL),另有多种重组免疫毒素在临床试验研究中也显示出良好的抗肿瘤效果。尽管重组免疫毒素具有广阔的应用前景,但是在临床应用中仍面临许多挑战,如免疫原性强和穿透性差,解决方法之一就是构建小分子的重组免疫毒素。
丝瓜毒素(luffin)LuffinP1和luffinS2是从丝瓜籽中分离到的两种只有5kDa和8kDa的小分子量I型核糖体失活蛋白(RIP),具有N-糖苷酶活性,能特异性水解真核细胞核糖体28s rRNA 4324位的腺嘌呤,使真核细胞核糖体60s大亚基失活,从而抑制蛋白质合成,对兔网织红细胞裂解液的IC50分别为10-9和10-10M左右,可作为潜在的免疫毒素弹头分子。人Ⅰ型促性腺激素释放激素( gonadotropin-releasing hormone, GnRH或luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH)是下丘脑分泌的一种十肽类激素,用于调控脑垂体促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的分泌。GnRH受体通常分布于脑垂体、性腺的细胞膜上,但研究发现,GnRH受体也高表达于某些癌细胞表面,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌及肝癌细胞等。因此GnRH和相关肽已经应用于妇科学和肿瘤学领域的研究,如用于性腺机能减退、不育症和性腺依赖性肿瘤的治疗。另外,肿瘤细胞表面的GnRH受体与GnRH有较高的亲和力,因此GnRH可以作为肿瘤靶向治疗中的导向分子。如制备的LHRH-PE40重组免疫毒素对人多种肿瘤细胞系有明显的杀伤作用,目前已进入临床试验阶段。因此,以GnRH为导向分子、以luffinP1或luffinS2为毒性部分构建的重组免疫毒素是一种潜在的免疫原性低、穿透力强的小分子抗肿瘤药物。
本文首先克隆并原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,测定其蛋白合成抑制作用,筛选活性较高的蛋白作为重组免疫毒素的毒性部分;随后将GnRH与luffinS2进行基因融合,原核表达并纯化GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合毒素,测定其体外细胞毒作用;因为铜绿假单胞菌外毒素转膜区(PEⅡ区)具有蛋白酶识别位点和转膜功能,能提高重组免疫毒素的转膜效率,并能使重组免疫毒素的毒性部分和导向部分在胞内分离,从而提高重组免疫毒素的细胞毒作用,所以将其插入到GnRH和luffinS2之间,构建GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素,表达纯化后测定其体内外抑肿瘤活性。具体的实验内容和结果如下:
1. luffinP1和luffinS2全长基因的克隆、表达和活性研究
(1)利用Codon软件,设计luffinP1和luffinS2的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了luffinP1和luffinS2的全长基因。(2)luffinP1和luffinS2分别与表达载体pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/luffinP1、pET-His/luffinS2、pET32a/luffinP1、pET32a/luffinS2、pQE30/luffinP1、pQE30/luffinS2、pBV220/luffinP1和pBV220/luffinS2表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/luffinP1和pET32a/luffinS2转化BL21(DE3)大肠埃希杆菌后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白。随后,利用重组肠激酶(rEK)将Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白切割,获得rluffinP1和rluffinS2。(3)测定rluffinP1和rluffinS2对兔网织红细胞裂解液的蛋白合成抑制作用。结果表明,rluffinP1和rluffinS2的IC50分别为9.51μg/ml和1.58μg/ml,因此选择luffinS2作为重组免疫毒素的毒性部分。
2. GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合蛋白的克隆、表达和活性研究
(1)因为无法确定GnRH和luffinS2的连接顺序对GnRH和luffinS2的活性是否有影响,因此设计了GnRH-luffinS2(GnRH在N端)和luffinS2-GnRH(GnRH在C端)融合蛋白,并对其二级进行预测。(2)利用Codon软件,设计了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的全长基因。(3)GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH分别与pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/GnRH-luffinS2、pET-His/luffinS2-GnRH、pET32a/GnRH-luffinS2、pET32a/luffinS2-GnRH、pQE30/GnRH-luffinS2、pQE30/luffinS2-GnRH、pBV220/GnRH-luffinS2和pBV220/luffinS2-GnRH原核表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/GnRH-luffinS2和pET32a/luffinS2-GnRH转化BL21(DE3)后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH。随后,利用rEK将Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH融合蛋白切割,获得rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH。(4)采用XTT法测定rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH对体外肿瘤细胞Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-luffinS2对上述细胞的IC50分别为67.19μg/ml、70.42μg/ml、84.44μg/ml和106.25μg/ml,rluffinS2-GnRH对上述细胞的IC50分别79.5μg/ml、76.7μg/ml、96.2μg/ml和137μg/ml,两种融合毒素对CEF均无毒性,表明rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH具有一定的抗肿瘤作用,但活性不高。
3. GnRH-PEⅡ-luffinS2融合蛋白的克隆、表达和抗肿瘤活性研究
( 1 )利用PEⅡ具有转膜区和蛋白酶识别位点的特性,设计GnRH-PEⅡ-luffinS重组毒素并对其二级进行预测。(2)利用Codon软件,设计了GnRH-PEⅡ-luffinS的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-PEⅡ-luffinS的全长基因。(3)选择pET32a为表达载体,构建pET32a/GnRH-PEⅡ-luffinS表达载体,转化BL21(DE3)大肠埃希杆菌后获得表达,蛋白以包涵体形式存在。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白,蛋白经透析复性和超滤浓缩后,利用rEK将Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白切割为Trx和rGnRH-PEⅡ-luffinS。(4)采用XTT法测定rGnRH-PEⅡ-luffinS在体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-PEⅡ-luffinS对上述细胞的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,对CEF无作用,表明具有较强的抗肿瘤作用。(5)建立BALB/c小鼠的SP2/0实体瘤模型,检测rGnRH-PEⅡ-luffinS体内抗肿瘤活性。结果表明,剂量为100μg/只,瘤区内穿刺注射,连续10d给药时,rGnRH-PEⅡ-luffinS对SP2/0实体瘤的抑瘤率为50.3%,显示rGnRH-PEⅡ-luffinS具有一定的抗肿瘤作用。
综上所述,本研究原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,利用兔网织红细胞裂解液证实luffinS2具有较高的蛋白合成抑制作用;然后构建了以GnRH为导向分子,以luffinS2为毒性分子的小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH,体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0细胞毒实验表明,GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的细胞毒性较低;为提高重组免疫毒素的细胞毒性,将PEⅡ插入到GnRH和luffinS之间,构建了GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素。体外细胞毒实验表明,其细胞毒性获得明显提高,体内抑瘤实验表明,GnRH-PEⅡ-luffinS具有一定抗肿瘤活性,为进一步探讨其作为抗肿瘤药物的临床应用奠定了基础。
关键词: 肿瘤导向治疗 ；丝瓜毒素 ；促性腺激素释放激素 ；铜绿假单胞菌外毒素 ；抑瘤作用
摘要： GnRH受体是由327-328个氨基酸残基组成，有7个跨膜结构域，属G蛋白偶联受体，与其它G蛋白偶联受体不同的是，该受体缺乏细胞内的C末断结构域，人类GnRH受体基因位于染色体4q13、2-13、3上，是由3个外显子和2个内含子构成的单拷贝基因，其5侧翼区有一段700bp的核酸区，有5个TATA盒，与不同的基因转录起始点有关，与其他哺乳类动物相比，人的转录起始位点处于更上游的位置，表明GnRH受体基因转录起始位点可能存在种属特异性。
传统观点认为,促性腺激素释放激素（GnRH）是由下丘脑弓状核的GnRH神经细胞合成和分泌的，GnRH神经元分泌的GnRH又通过垂体门脉系统以脉冲的方式分泌至垂体前叶，再通过分布在垂体前叶表面的GnRH受体作用于垂体，促使其分泌促性腺激素：卵泡刺激素（LH）和黄体生成激素（FSH），后两者作用于性腺，产生特异性激素，如：在女性刺激卵巢分泌雌二醇，及孕酮，在男性刺激睾丸分泌睾酮及前列腺素，并对乳腺，肾上腺，甲状腺和骨骼生长发挥作用。近几年有关GnRH的基础研究，临床应用，及GnRH类似物的研究方兴未艾。与传统观点观点不同，一些学者认为，垂体外正常组织存在GnRH受体，如：大脑，乳腺，卵巢，睾丸，前列腺，胎盘组织等，并且在乳腺癌，卵巢
癌，前列腺癌等恶性肿瘤组织中亦有高亲和力的GnRH受体的表达。
本实验采用原位杂交法从mRNA水平证明GnRH受体在正常子宫内膜，及子宫内膜癌中的表达。本实验用石蜡切片，其中正常分泌期子宫内膜30例，正常增生期子宫内膜23例，子宫内膜癌30例，子宫内膜不典型增生3例，并取3例用脑垂体组织做阳性对照，PBS代替探针做阴性对照。实验结果显示，在30例正常分泌期子宫内膜组织中GnRH受体的mRNA表达5/30例，正常增生期子宫内膜组织中GnRH受体的mRNA表达4/23，而在子宫内膜癌组织中GnRH受体的mRNA表达12/30例。子宫内膜不典型增生组织中3例均未见表达。
在正常子宫内膜及子宫内膜癌中有GnRH受体的mRNA表达，且正常子宫内膜及子宫内膜癌中GnRH受体的mRNA表达有差异（p<0.05）。正常分泌期子宫内膜与子宫内膜癌GnRH受体的mRNA有差异（P<0.05）。提示：GnRH在生殖调控中除刺激垂体分泌LH、FSH外，尚可直接和生殖器官发生作用，调整器官和细胞的功能活动。且癌细胞表面GnRH可能介导肿瘤细胞增殖，它们是通过自分泌/旁分泌调节影响内环境等。而在正常分泌期子宫内膜及增生期子宫内膜中，无差异（p>0.05）。
特别需要指出的是，本实验除了证明GnRH受体在垂体外组织中的表达外，更希望在正常子宫内膜，子宫内膜不典型增生，子宫内膜癌病变过程中，通过GnRH受体mRNA表达的情况，
找到一些可能的启示，但遗憾的是，由于子宫内膜不典型增生病例数少，故没有这方面的结论。
关键词: 子宫内膜 ；子宫内膜癌 ；GnRH受体 ；原位杂交
摘要： 随着癌症发生率与死亡率的逐年上升,恶性肿瘤的防治己成为世界性的卫生战略问题。由于传统治疗方法的局限性日益凸现,新一代靶向治疗方法日益受到人们关注。其中,智能抗癌药物以其针对性强、效果显著、毒副作用小等突出优点成为21世纪抗肿瘤药物发展的新方向。以往曾经研究过的大量靶向治疗药物均因存在过强的免疫原性及毒副作用而无法应用于临床,而这也是靶向药物设计的关键与难点。有鉴于此,本课题试图研制一种具有良好特异性和安全性的高效抗癌智能药物。
人体颗粒酶B（GrB）是由细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的一种丝氨酸酯酶,能够通过多种途径高效诱导靶细胞死亡,在抗病毒感染、自身免疫、抗肿瘤免疫等过程中均发挥重要作用。人体促性腺激素释放激素（GnRH）是由下丘脑分泌的十肽激素,调节垂体性腺轴的内分泌作用。GnRH受体在多种腺癌细胞表面大量表达,而在垂体外正常组织则数量很少,使之成为腺癌治疗的理想靶点。本研究利用现代分子生物学技术,对人体颗粒酶B进行智能化设计与改造,构建表达融合蛋白,以期准确靶向杀伤一类GnRH受体（GnRHR）阳性的腺癌细胞。
本课题首先对GrB原有的自身细胞结合位点的蛋白编码序列进行替换突变,消除其通过自身静电吸附.交换模式结合人体正常细胞,然后将此GrB突变基因（mGrB）与GnRH基因进行重组,构建mGrB-G4S-GnRH（mGrBLG）融合蛋白编码序列。该设计在不影响GrB细胞毒活性的前提下提高了融合蛋白靶向结合的准确性,从而降低了非特异性细胞杀伤导致的毒副作用。由于GnRH和GrB均为源于人体自身的正常蛋白,从根本上避免了异源蛋白带来的免疫原性问题。另外,利用G4S柔性短肽连接蛋白各功能基团,能够使其基本保持天然空间结构,防止被免疫系统错误识别,以致产生中和抗体而导致药物失效、甚至引发免疫过敏反应,从而使该融合蛋白的免疫原性最小化。
本研究先后利用E.coli原核表达系统及Pichia pastoris酵母真核表达系统对目的蛋白进行了可溶性表达和分泌表达。为了保证工作的严谨性,本研究还同时构建、表达与制备了无突变GrB融合蛋白（GrBLG）、突变GrB蛋白（mGrB）和原始GrB蛋白（GrB）三种对照蛋白,以期全面考察目的蛋白及其各功能基团的生物活性。经亲和层析纯化,研究最终得到酵母分泌表达的4种蛋白GrB、mGrB、GrBLG和mGrBLG,其纯度经SDS-PAGE检测均约达90%。
本课题对4种目的蛋白的生物学功能进行了多方面的分析。在利用合成的GrB特异性肽底物进行的检测中,毕赤酵母表达的4种蛋白均表现出与商品化的人重组GrB标准蛋白相似的酶促反应模式,即以浓度依赖的方式对特异性肽底物进行切割,并具有相似的酶促反应活性。结果显示,GrB结合位点的突变及其与靶向基团GnRH、亲和标签的融合并没有影响mGrB、GrBLG与mGrBLG中GrB基团的酶促生物活性。
在体外细胞毒实验中,本研究分别检验了各蛋白在单独作用以及与氯喹协同作用下,对细胞的体外杀伤作用。结果显示:氯喹能够裂解靶细胞中的内涵体,从而释放内吞入胞的mGrBLG,使之发挥生物活性。在0.1～10000 ng/ml实验蛋白剂量范围内,mGrBLG蛋白在氯喹的协同作用下,对MCF-7（人乳腺癌细胞系,GnRHR+）表现出显著的杀伤作用(mGrBLG蛋白剂量达10μg/ml时,杀伤率为96.3%;蛋白IC50约34.1ng/ml);对HEK293（人胚肾细胞系,GnRHR+）具有一定的杀伤作用（mGrBLG蛋白剂量达10μg/ml时,杀伤率为5.9%）,但此作用弱于GrBLG（GrBLG蛋白剂量达10μg/ml时,杀伤率为13.2%）;而对CCC-ESF-1（人胚胎皮肤成纤维细胞系,GnRHR-）几乎未表现出杀伤作用（蛋白剂量达10μg/ml时,细胞存活率仍高于99%）。
体外杀伤实验结果说明,mGrBLG对GnRHR-的人体正常细胞并不敏感;对GnRHR+的人体正常细胞具有一定的毒副作用,但与未经改造的GrBLG相比,在最高实验剂量10μg/ml时的细胞死亡率降低了55.3%,说明突变有效提高了mGrBLG对细胞杀伤的准确性、降低了蛋白的毒副作用;对GnRHR+恶性肿瘤细胞的杀伤率显著高于对GnRHR+正常细胞的杀伤率,这与两种细胞表面的GnRHR富集程度直接相关。在体外实验中,各实验细胞均以相同的概率结合mGrBLG蛋白,据此分析,在体内实验中,mGrBLG可能会表现出更低的毒副作用。进入体内循环系统后,mGrBLG与GnRHR的相互作用将遵循竞争性结合的原理。由于肿瘤细胞表面的GnRH受体数量远远多于正常细胞的受体数量,mGrBLG将以更大的概率结合于GnRH受体富集的肿瘤细胞,而对正常细胞表面GnRH受体的结合作用将会更低于体外实验水平。利用过量GrB抗体和过量商品化的GnRH短肽分别竞争性结合mGrBLG中的mGrB基团以及细胞表面的GnRH受体,以具体分析mGrBLG中两个结构域各自的功能。实验结果进一步证实mGrB为mGrBLG蛋白的杀伤效应基团,GnRH为其结合细胞表面GnRH受体的靶向基团。该结果也显示出连接短肽G4S促进了蛋白各部分的正确折叠和相对独立,进而维护了其各自正常的生物学活性。
在mGrBLG协同氯喹的细胞杀伤实验中,肿瘤细胞MCF-7表现出明显的凋亡形态学特征,如染色体固缩、凋亡小体形成等,同时激发了细胞内caspase-3的活性。在caspase广泛抑制剂存在的情况下,mGrBLG仍能杀伤大于42%的MCF-7细胞。这些结果说明,mGrBLG同天然GrB一样,能够诱导caspase依赖及非依赖性的靶细胞凋亡,而这种多途径的细胞致死能力对于对抗肿瘤细胞中普遍存在的凋亡规避机制无疑具有重大意义。
mGrBLG协同氯喹在体外细胞实验中初步表现出靶向特异杀伤一类GnRHR+腺癌的生物学活性,而其杀伤正常细胞的毒副作用和免疫原性己被最小化。GnRH受体富集的恶性肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌以及垂体瘤等,该类恶性肿瘤往往对化疗与放疗不敏感。因此,研制针对此类恶性肿瘤的新型特效的智能药物具有重要的现实意义。通过今后进一步开展肿瘤动物模型的体内药效学评价、临床前药理、药代、毒理、临床试验等更加深入的研究,mGrBLG有望成为一种高效、安全、特异靶向治疗一类GnRHR+恶性肿瘤的生物技术智能新药。
关键词: 恶性肿瘤 ；颗粒酶B ；促性腺激素释放激素 ；智能药物
被引量
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摘要： 激活素A(ActivinA)是转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族的成员之一，是由二硫键连接的两个βA亚基组成的二聚体分子。激活素A除了可以促进垂体释放促卵泡激素(folliclestimulatinghormone，FSH)外，还是一个多功能的细胞因子，在调节细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞事件中发挥作用。编码激活素A(βA)亚基的Inhba基因敲除导致小鼠进食系统发育障碍，出生后不久即死亡，表明激活素A在调控哺乳动物早期发育中有较重要的作用。 胎盘和蜕膜组织中存在激活素A及其受体，体外研究显示激活素A可增强滋养层组织/细胞的浸润和迁移能力，并促进滋养层细胞产生促性腺激素释放激素(gonodotropin-releasinghormone，GnRH)、人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hCG)、孕酮(progesterone)和基质金属蛋白酶MMP-2等，提示激活素A参与了滋养层细胞分化的调节。有研究发现先兆子痫患者血浆和胎盘组织中激活素A水平显著增高，提示激活素A可能参与先兆子痫的发病过程，但其具体的作用机制尚不清楚。 本研究利用我们实验室已获得的中国汉族人群先兆子痫患者和正常妊娠妇女在妊娠不同阶段的外周血标本，通过ELISA分析了血浆中激活素A的变化模式，并利用TUNEL分析检测了重症先兆子痫患者母胎界面上细胞凋亡状况;进而利用体外培养的原代细胞滋养层细胞和永生化滋养层细胞系HTR8/SVneo为研究模型，通过TUNEL实验、Western蛋白印迹分析、实时定量PCR等手段研究了激活素A对人滋养层细胞凋亡的影响，并探讨了激活素A调节滋养层细胞凋亡的信号通路。 研究结果显示，妊娠妇女外周血中激活素A浓度随着妊娠周龄的增加而升高，至足月时达到峰值。重症先兆子痫患者血浆中激活素A水平从妊娠25周龄起即显著高于正常妊娠组，在孕25-30周、31-35周和36-40周时，其平均水平分别达到相应阶段对照组的3、8和5倍;同时Real-timePCR结果显示重症先兆子痫胎盘中激活素A的mRNA水平也显著增加，达到对照组的12倍。在体外培养的原代细胞滋养层细胞中发现，生理剂量(0.1-10ng/mL)激活素A促进滋养层细胞MMP-2和MMP-9分泌，不影响细胞凋亡;但病理剂量(25-100ng/mL)激活素A不影响细胞MMP分泌，却显著促进细胞凋亡，并上调cleavedcaspase-9和Bax的表达。高剂量激活素A对滋养层细胞的这一促凋亡作用在人类永生化滋养层细胞系HTR8/SVneo中也得到验证。TUNEL实验显示重度先兆子痫胎盘中细胞凋亡率从妊娠25周起即明显高于正常妊娠组。这些结果提示妊娠过程中，胎盘内异常升高表达的激活素A可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡，参与了先兆子痫的发生。 进而我们利用HTR8/SVneo细胞系探讨了高剂量激活素A诱导滋养层细胞凋亡的机制。结果显示，高剂量激活素A对ALK4和ALK7的mRNA表达水平无影响，但上调Nodal的前体蛋白nodalprecursor的表达;特异siRNA敲降ALK4、ALK7或者Noda1表达都可以阻断高剂量激活素A的促凋亡作用，但敲降ALK7并不能减低激活素A导致的Smad2磷酸化。他人研究已表明NodaI/ALK7信号通路的激活可以促进人滋养层细胞凋亡，因而我们的研究结果表明高剂量激活素A可能通过促进Nodal表达，以转导激活Nodal/ALK7信号，实现诱导人滋养层细胞凋亡的作用。此外，我们还发现HTR8/SVneo细胞中激活素A可以上调Nodal辅助受体Cripto的表达，过量表达Cripto也可显著增强Noda1诱导的Smad2磷酸化，但敲降Cripto却并不影响激活素A的促凋亡作用。在激活素A诱导滋养层细胞凋亡过程中，Cripto发挥什么作用仍然有待深入探讨。 总之，本研究表明先兆子痫胎盘中异常高表达的激活素A在配体和受体水平与Nodal/ALK7通路发生信号交联，激活线粒体通路，诱导滋养层细胞凋亡。这可能是先兆子痫胎盘中发生异常细胞凋亡的重要调控通路之一。
关键词: 激活素A ；滋养层细胞 ；细胞凋亡 ；转导激活 ；Nodal/ALK7信号
摘要： 我国属肝癌高发区，由于肝癌恶性程度高，目前仍是严重威胁人类生命的主要疾病之一。原发性肝癌或称肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，由于大多数肝癌患者在就诊时已属中晚期，因而丧失了手术机会。而化疗和放疗等综合治疗的效果并不满意，因此迫切需要找到一种更加高效、安全的治疗方法。近年来肿瘤的内分泌治疗作为一种高效低毒的治疗方法，已引起众多肿瘤病理学家和临床工作者的重视。
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘脑神经元分泌的一种含有十个氨基酸的肽类激素，经下丘脑-垂体-门脉系统进入垂体前叶，作用于垂体前叶的促性腺激素分泌细胞，刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的分泌，从而调节性腺的发育与配子的形成。已有大量证据表明，乳腺、前列腺、卵巢、垂体
第四军医大学硕士学位论文
和胰腺肿瘤细胞上存在GnRH结合位点，GnRH类似物可抑制这些
肿瘤细胞的生长。实验研究还发现，GnRH的肿瘤抑制效应是不依
赖于垂体促性腺激素释放的独立机制实现的。已有研究表明，肝
癌细胞上存在Gll．ca－－－－结合位点，GnRH类似物在体外可抑制肝癌细
胞的生长，但其具体机制仍不明了，有推测认为是通过增加细胞
的凋亡导致的。实验研究和临床观察均提示肝癌可能是一种激素
依赖性肿瘤。己有文献报道体外培养人肝癌细胞上有GnRH受体，
天然的GnRH对肝癌细胞的生长有抑制作用。
Fas又称APO4，现命名为CD95，是两个研究组于1989年在各
自的实验室发现的。Fas属于肿瘤坏死因子（’I’NF）受体和神经生
长因子（NGF）受体家族。而 FasL是 Fas在人体内的天然配体 1994
年Suda等利用亲和层析技术从鼠细胞毒性T淋巴细胞中纯化发现
的。Fas是细胞凋亡的信号分子，表达Fas的细胞在与Fas抗体或自
然存在的FasL以三聚体形成结合后，可活化并传导凋亡信号，触发
Fas所在靶细胞数小时内凋亡。目前研究表明，Fas与FasL在肿瘤
发生、发展及转移中有重要作用。
为进一步探讨GnRH及其受体与肝癌细胞、Fas／FasL与肝癌
细胞相关生物学特性的关系，我们进行了以下研究：①用免疫组
织化学方法检测 SMMC772肝癌细胞中 GnRH及其受体的表达，
以证实SMMC刀21肝癌细胞为G nRHnRH－R阳性细胞；②采用兔疫组
织化学SABC法，检测Fas／FasL在SMMC7721肝癌细胞的表达，
为进一步探讨Fas／FasL系统对肿瘤细胞生长的调控作用提供形态
学依据；③利用半定量 RTPCR技术（QRTPCR ）， 检测不同浓度
GnRH类似物刺激下 SMMC772肝癌细胞中 Fas／FasL－InRNA表达
水平变化。上述研究对揭示GnRH对肝癌细胞增殖阻抑作用的部
4
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分机理以及GnRH－R介导的肝癌细胞信号传导的部分通路，为深
入研究GnRH类似物在治疗肿瘤中的作用提供理论依据。
主要研究结果如下：
1．本实验通过免疫组织化学的方法检测到 SMMC7721 中有
GnRH受体蛋白的表达，SMMC772肝癌细胞中 GnRH及其受体
蛋白均呈黄褐色颗粒定位于胞浆和胞膜，胞核为阴性。这说明
SMMC772肝癌细胞为 GnRH受体细胞，GnRH可能以自分泌的
方式调节肝癌细胞的生长和分化。
2．免疫组化染色后 SMMC772肝癌细胞呈 Fas受体免疫反应
阳性，阳性物质定位于胞质，胞核为阴性反应；同样 SMMC772
肝癌细胞亦呈FasL免疫反应阳性，阳性信号位于胞质，胞核未见
阳性信号。这提示Fas可能参与了肝癌细胞生长的调节，肝癌细胞
的凋亡存在自我调控机制。
3．在GnRH类似物阿拉瑞林的刺激下，随着浓度的增加，
SMMC7721肝癌细胞的Fas／FasLmRNA表达水平逐渐增加，显示
GnAN可通过与肝癌细胞表面的Gll．－－－－－ra受体相互作用，利用GnRH
受体介导的信号传导途径诱导肝癌细胞增加 Fas／FasL系统的表达，
从而促进肝癌细胞的凋亡，达到抑制肝癌细胞增殖的作用。
本研究用形态学方法发现人肝癌细胞系 SMMC7721细胞具有
自分泌GnRH 的功能；FaS／FaSL系统参与了Gll．－－－－－ra类似物对
SMMC77 ZI肝癌细胞生长的抑制作用。该实验为 GnRH类似物用
于肝癌的内分泌治疗提供了依据。
摘要： 我国属肝癌高发区，由于肝癌恶性程度高，目前仍是严重威胁人类生命的主要疾病之一。在肝癌的多种治疗方案中，外科手术切除癌肿仍然为最佳选择；但大多数肝癌患者在确诊时已属中晚期，从而丧失了手术机会。作为保守治疗的化疗和放疗的效果甚微、且毒副作用大。为此人们一直在努力寻找对肝癌高效无毒的治疗手段。近年来肿瘤的内分泌治疗(或称激素治疗)作为一种高效低毒的治疗方法，已引起众多肿瘤病理学家和临床工作者的重视。
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是由下丘脑神经元分泌的一种含有十个氨基酸的肽类激素，经下丘脑-垂体-门脉系统进入垂体前叶，作用于垂体前叶的促性腺激素分泌细胞，刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的分泌，从而调节性腺的发育与配子的形成。已有大量证据表明，GnRH及其受体可广泛存在于下丘脑-垂体轴之外，如免疫系统(T、B淋巴细胞)、生殖系统(卵巢、输卵管、前列腺、睾丸及胎盘等处)以及一些恶性肿瘤(乳腺癌、肺癌、胰腺癌及肝癌等)，对这些组织和器官及恶性肿瘤的生长起调控作用。
实验研究和临床观察均提示肝癌可能是一种激素依赖性肿瘤。文献报道体外培养人肝癌细胞上有GnRH受体，天然的GnRH对该细胞系的生长有抑制作用。为进一步探讨GnRH及其受体与肝癌细胞相关生物学特性的关系，我们进行了以下研究：
[1]首先对人肝癌细胞株SMMC-7721进行了体外培养，并采用免疫细胞化学、原位杂交技术在培养的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞内检测GnRH及其受体的表达；[2]GnRH类似物对体外培养的人肝癌细胞处理后，分别采用MTT法、琼脂糖凝胶电泳、形态学透射电镜观察和末端脱氧核苷酸
——
标记法等技术观察细胞的形态学和生化等指标的变化；pj运用放射免疫
分析法检测了GnRH类似物对人肝癌细胞PKC酶活性的影响，以探讨人肝
癌细胞内GnRH受体介导的信号转导机制；
主要研究结果如下：
1．运用免疫细胞化学和原位杂交的方法发现，培养的人肝癌细胞
含有GnRH及其受体免疫反应阳性物质，同样含有GnRH受体mRNA杂交信
号，二者均位于细胞浆内，胞核为阴性，说明培养的人肝癌细胞能表达
GnRH受体，是GnRH作用的靶细胞。这提示人肝癌细胞可自身合成和分泌
GnRH；在人肝癌细胞中 GnRH可能以自分泌的方式调节肿瘤细胞的功能。
2．MTT法研究结果表明阿拉瑞林在10－’moVL浓度时即可诱导7721
细胞凋亡，并呈量一效效应。透射电镜下可观察到早期凋亡细胞和晚期凋
亡细胞以及核染色质浓缩并见凋亡小体。末端脱氧核苦酸转移标记法进一
步证实阿拉瑞林可以诱导肝癌细胞凋亡并可见凋亡小体；与对照组相比，
阿拉瑞林处理后 TUNEL凋亡指数显著增加（0．29士 0．06 VS 0．11士 0．03，
RO．05）。说明GnRH类似物有明显抑制人肝癌细胞的增殖作用，其作用途
径可能是通过肿瘤细胞自身GnRH受体的直接介导而实现的。
3．我们对GnRHR的信号转导分子进行了研究，运用放射性同位
素的方法检测了GnRH类似物对SMMC－7721细胞PKC酶活性的影响，发现
GnRH类似物刺激肝癌细胞后，PKC活性的变化显示明显的时间和剂量依赖
性，其活性高峰出现在30mh。
综上所述，本研究在体外培养的人肝癌细胞中发现有GnRH及其受
体的存在，提示体外培养人肝癌细胞可自身合成和分泌GnRH，在人肝癌细
胞中GnRH可能以自分泌的方式调节肿瘤细胞的功能；证明了GnRH类似物
对人肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用，并初步研究了这些功能影响的信
号转导机制，PKC”参与了这些功能影响的信号转导途径。
关键词: 肝癌 ；促性腺激素释放激素 ；凋亡 ；信号转导