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摘要： 目的观察间断皮下注射信号选择性甲状旁腺素(PTH)模拟肽对去势雄性小鼠骨折愈合的影响。方法 36只7周龄C57/BL雄性小鼠去势,1周后制作股骨中段骨折模型,术后用人重组甲状旁腺素(hPTH(1-34)),信号选择性PTH模拟肽[Gly1,Arg19]hPTH(1-34)(G1,R19(1-28))和等量溶解剂注射,于术后14 d和28 d处死,双能X线骨密度仪测量骨痂区骨密度以及骨矿物含量;术侧骨折愈合情况通过X线、显微CT、生物力学和组织学显示。结果术后14 d,G1,R19(1-28)组骨密度显著高于对照组(P<0.05)。最大力和刚度G1,R19(1-28)低于hPTH(1-34)组。X线和显微CT显示,G1,R19(1-28)组骨痂的改建和重塑优于对照组,略差于hPTH(1-34)组。结论信号选择性甲状旁腺素模拟肽G1,R1(91-28)促进骨折的愈合,cAMP/PKA通路对促进骨折愈合具有重要作用。
关键词: 甲状旁腺激素 ；去势 ；骨折愈合 ；信号通路 ；PKA
被引量
18
摘要： 研究背景
植骨融合在脊柱疾患的手术治疗中是最常用的手术方法之一,腰椎手术的成败与融合的成败休戚相关。自体骨植骨融合是融合的金标准。
在美国,每年有将近五十万病人因为脊柱或者骨折而通过目前融合手术来缓解严重的腰痛或骨折不愈合翻修来促进愈合而接受治疗。在这些手术中脊柱手术占了1/2。在进行各种脊柱融合手术或明显骨缺损的骨折治疗时,往往在术中需要进行植骨。面对自体骨,同种异体骨,DBM等形形色色备选植骨材料,究竟为病人选择哪种植骨材料是临床脊柱外科医生一直面临的一个困惑。使用自体骨植骨融合已获广大学者的公认,尽管目前有很多种异体骨,但始终不可能完全取代自体骨,自体骨植骨有很多优点等(如费用低廉,无免疫排斥性等),但是自体骨植骨同时也带来了很多问题,如自体骨移植出现的不融合率在逐年增加,由此可导致邻近节段退变、不稳、假关节形成等。如何提高脊柱融合率已成为当前研究的热点。
甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)是甲状旁腺分泌的一种激素,主要调节机体的钙磷代谢及骨代谢。大量研究证实,甲状旁腺激素及其片段和类似物具有直接和强有力的刺激骨生长作用,尤其在小梁骨丰富的脊柱、骨质疏松的患者。各年龄人群的骨折修复和宇航员失重造成的骨丢失者中均显示出理想的疗效。椎骨和非椎骨骨折的发生率均下降。
目前国外已开发的PTH类似物有两种,分别为美国Lilly公司采用大肠杆菌表达系统成功开发的rhPTH(1-34)和Allelix公司运用蛋白酶缺失的大肠杆菌表达系统,并对天然PTH的基本序列改造成功研发的rhPTH(1-84)。PTH类似物特立帕肤(teriparatide)是由美国礼来(Lilly)公司开发,已于2002年在美国、奥地利、丹麦、芬兰、德国、希腊、冰岛、爱尔兰、荷兰、挪威、葡萄牙、瑞士上市,并于2003年和2004年在英国和澳大利亚相继上市,是目前唯一治疗骨质疏松症的药物。特立帕肽为人甲状旁腺激素类似物,通过与细胞表面受体特异性地高亲和力结合来介导,增加成骨细胞的活性及数量而促进骨的形成,而应用于骨质疏松症及预防骨质疏松性骨折的治疗,它具有与天然甲状旁腺激素(PTH)N端34个氨基酸序列相同的结构,它可以与PTH-1受体结合,发挥PTH对骨骼与肾脏的生理作用；同时不存在C端肽对骨代谢的不利影响。研究表明该药可以促进骨形成,增加骨密度,降低骨折风险,并可与其他治疗骨质疏松症药物联合应用增强疗效。Anastasilakis等[1]对22例绝经后骨质疏松症妇女分别应用特立帕肽20 u g·d-1与每周利塞膦酸钠35mg,在开始治疗前、治疗后第3个月、第6个月观察骨转换指标改变,1年后停用药物。研究发现,反映骨形成相关指标如血清碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原N端前肽(PNP)在特立帕肽组明显增加(P<0.001),而在利塞膦酸钠组明显下降(P<0.001)；反映骨吸收指标血清Ⅰ型胶原C端肽(CTX)在特立帕肽组也增加,而在利塞膦酸钠组下降,提示特立帕肽独特具有促进骨形成与骨吸收的双重作用。目前原发性骨质疏松症常规治疗药物如双膦酸盐、降钙素、雌激素类,其作用机制均是通过抑制破骨细胞活性达到治疗骨质疏松症效果,而特立帕肽是目前唯一认为具有促进骨合成代谢的药物。单独或联合应用特立帕肽,可以增加骨密度、改善骨微结构、降低骨折风险。Lilly's公司对1637名患骨质疏松症-相关骨折的绝经后妇女的Ⅲ期临床试验结果表明,rhPTH(1-34)具有显著降低病人患中度或严重脊椎骨折危险率及非脊椎骨折危险率的明显疗效。PTH对于患骨质疏松症的大鼠和人不但能刺激骨形成而且还能增加骨质量和强度。因灵长类动物骨重建和结构与人骨相似,所以灵长类动物逐渐被应用到实验中,研究证实,连续6个月每天皮下注射重组人PTH(rhPTH)(1-34),能够增加卵巢切除猴的脊椎骨矿物质密度,不影响血清离子化钙水平或尿钙排泄。这是目前第一个被批准具有促骨形成的药物,因而受到各国的特别关注。hPTH(1-34)是骨形成药物,通过增加成骨细胞数及(或)其活力来促进新骨生长。
间歇性应用PTH有较强的成骨作用但作用机制尚不完全清楚。目前主要有以下观点：抑制成骨细胞凋亡；促进成骨母细胞与成骨细胞的增生与分化,此过程可能与核结合因子有关；促进骨衬里细胞向成骨细胞转化；调节成骨细胞自分泌与旁分泌。PTH具有很强的成骨作用,现在已有大量的文献报道小剂量hPTH(1-34)能够增加全身BMD,治疗骨质疏松。hPTH(1-34)对脊柱融合率的影响,也有文献报道能够提高融合率,增加融合区的骨量。
已经证实hPTH(1-34)主要是通过激活PTH1R受体,从而激活了几个信号转导通路,包括cAMP/PKA、NonPLC/PKC和PLC/PKC等。经研究证明PLC/PKC促进骨代谢转换,促进骨吸收。PTH的临床应用复杂而且本身具有促骨合成和促骨吸收作用,如何避免其促骨吸收发挥其促骨合成作用是目前来研究的热点之一。通过设计PTH信号选择性模拟肽从而单一刺激某一PTH的信号通路是一条重要的研究途径。G1,R19(1-34)和G1,R19(1-28)是基于hPTH的改建肽。YangD等证实了G1,R19(1-34)不能激活PLC/PKC信号途径,可通过PTH1R受体激活cAMP/PKA信号和NonPLC/PKC信号通路,可增加全身BMD和促进骨松质形成,改善其微结构；并证实间断小剂量G1,R19(1-34)在对成骨细胞的促分化和松质骨的促合成作用上优于hPTH(1-34),理论上因不刺激PLC通路(研究证明PLC促进骨代谢转换,促进骨吸收)更加合理。
研究目的
1、通过建立大鼠脊柱融合模型,研究三种信号选择性PTH模拟肽全身使用对大鼠脊柱融合以及骨量的影响。分析研究PTH通过非PLC信号通路影响移植骨愈合的机制。
2、阐明PTH通过不同信号转导通路对自体骨脊柱融合的影响,为PTH(1-34)及其信号选择模拟肽在脊柱外科的临床应用提供理论依据。为临床促进脊柱融合提供实验依据,并为下一步临床实验和PTH相关药物设计奠定基础。
研究方法
32只纯种健康雄性SD大鼠(动物,麻醉及抗菌素用药均由南方医科大学动物中心提供),平均重220g,周龄8周,3%戊巴比妥腹腔注射麻醉,所有动物均行后外侧路脊柱融合术,术后随机分成四组,每组8只。G1,R19(1-28)组——皮下注射G1,R19(1-28)(200μg/kg), hPTH(1-34)组——皮下注射hPTH(1-34)组(15μg/kg),G1,R19(1-34)组——皮下注射G1,R19(1-34)组(30μg/kg),对照组——皮下注射适量生理盐水。分笼饲养,采用颗粒营养饲料喂养,自由饮水,同等采光通风条件。术后第四天各组采用上述方法分别开始肩胛下区皮下注射,每天1次,每周5天,共6周。术后6周分别行手法触诊检查融合节段的活动度、融合节段X线进行评分、融合节段BMD和BMC、Micro-CT和组织学观察。
结果
手法触诊：G1,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组融合率分别达到37.5%、50%、87.5%和50%；X线评分系统(“0”=无骨形成,“5”=完全融合)在G1,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组分别为(1.8750±1.3562)分、(2.8333±1.3101)分、(3.8750±0.7546)分和(2.5417±1.3206)分,四组之间统计学差异显著(x2=8.850,P=0.031),平均秩次分别为10.69、16.56、24.13和14.63；离体融合节段BMD四组之间统计学差异显著(F=9.136,P=0.000),从均值上看,G1,R19(1-34)组高于其他三组,和G1,R19(1-28)组间统计学差异显著(P=0.001),和hPTH(1-34)组(P=0.524)及对照组(P=1.000)的差异没有统计学意义,hPTH(1-34)组和G1,R19(1-28)组统计学差异不显著(P=0.056),hPTH(1-34)组和对照组差异不显著(P=0.600),G1,R19(1-28)组明显低于对照组统计学差异显著(P=0.001)。离体融合节段BMC四组之间统计学差异显著(F=22.353,P=0.000),经统计检验,G1,R19(1-34)组高于hPTH(1-34)组(P=0.008)、G1,R19(1-28)组(P=0.000)和对照组(P=0.000),hPTH(1-34)组高于对照组(P=0.001),hPTH(1-34)组和G1,R19(1-28)组差异没有统计学意义(P=0.430),G1,R19(1-28)组和对照组差异没有统计学意义(P=0.112)；Micro-CT扫描后分析融合区体积,结果显示四组间统计学差异显著(x2=8.031,P=0.045)。G’,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组组分别为290.233±49.201mm3、343.356±106.742mm3、401.008±97.116mm3和339.789±44.198mmm3,平均秩次分别为9.13、16.75、22.13和18.00；6周后对所有样本进行组织学观察。G’,R19(1-34)组和hPTH(1-34)组可见骨小梁分布规则,髓腔完全再通,而对照组骨小梁较厚排列紊乱,髓腔未完全再通,G’,R19(1-28)组大部分髓腔未相通,同时还可见大量的未吸收的移植骨碎片。G1,R19(1-34)组和hPTH(1-34)组还可见大量的软骨细胞；对照组和G1,R19(1-28)组较少见到软骨细胞,虽然可以看到一些新骨形成,但生长较慢,在一些骨不连区域,大量胶原纤维样组织出现。
结论
1、间断皮下注射G1,R19(1-34)能够增加大鼠后外侧路脊柱融合率及融合区的体积,且比hPTH(1-34)更为显著；再次证实了G1,R19(1-34)不能激活PLC/PKC信号途径,可通过PTH1R受体激活cAMP/PKA信号和NonPLC/PKC信号通路,增加全身BMD和促进骨松质形成,改善其微结构。并证实间断小剂量G1,R19(1-34)在对成骨细胞的促分化和松质骨的促合成作用上优于hPTH(1-34),理论上因不刺激PLC通路(研究证明PLC促进骨代谢转换,促进骨吸收)更加合理。为临床上选用G1,R19(1-34)片段提供了实验依据。
2、从手法触诊、X线评价、融合节段BMD和BMC、MicroCT、组织学观察来看,G1,R19(1-28)抑制了大鼠的脊柱融合；这说明抑制了NONPLC/PKC信号通路,则抑制了骨的再生及重建,从而抑制了脊柱融合。
关键词: G1，R19(1-34) ；大鼠模型 ；脊柱融合 ；骨移植 ；腰椎
被引量
1
摘要： 背景:骨质疏松症是一类伴随年龄衰老或医学原因一起的,以骨量丢失、骨密度降低、骨组织显微结构破坏、骨脆性增加、骨强度下降,以及易于发生骨折为主要临床特征的代谢性、全身性骨骼疾病。WHO于1994年制定了以骨密度测量为基础,诊断骨质疏松的标准为骨密度值低于或等于正常年轻人2.5个标准差即可诊断为骨质疏松,有过一次或多次骨折经历的都肯定有严重的骨质疏松。随着全球人口的老龄化,骨质疏松在全世界常见病、多发病中的地位逐渐上升至第七位。在我国骨质疏松症也已跃居常见病第六位,患病人数已达到9500万。其中50～60岁的发生率为21%,60～70岁的为58%,70岁以上几乎是100%,尤以绝经后妇女的发生率更高,据调查显示,50岁以上男性及40岁以上女性都有不同程度的骨质疏松,随着年龄的增加,骨质疏松的发生率明显增加。健康人的骨密度(矿物质含量)在30岁以前是上升的,并在30～39岁达到高峰,到40岁以后逐渐下降,矿物质量下降往往没有感觉或者感觉轻微,只有在减少12%以上时才会出现变矮、驼背、弯腰等临床症状,并且随着年龄的增加和矿物质含量的减少而加重。当患者发生骨折时,此时的矿物质含量丢失已达25%以上。目前治疗骨质疏松的主要方法分为饮食治疗和药物治疗,通过调整饮食结构、补充钙剂及维生素D等具有一定的治疗效果。药物治疗主要分为抑制骨吸收药物和促进骨形成药物,前者包括雌激素替代疗法、降钙素、维生素D及其代谢产物、二膦酸盐、异黄酮衍生物等,后者有甲状旁腺激素、氟化物、他汀类药物、钙剂、锶盐、男性激素治疗等。在增加骨量促骨形成的代谢药物中,目前只有甲状旁腺激素(商用名:特里帕肽)获得认可。甲状旁腺激素对骨代谢具有独特的作用,这是其它药物所不具备的。这些作用主要包括增加骨密度、促进骨微结构的重塑以及降低骨折的发生率。甲状旁腺激素(PTH)是调节骨代谢的重要激素之一。美国FDA于2002年批准使用低剂量甲状旁腺激素间断注射用于治疗骨质疏松,在2010年,我国批准使用PTH用于治疗绝经后老年女性、老年男性及由糖皮质激素引起的骨质疏松症。其治疗效应可能是通过抑制细胞凋亡从而增加成骨细胞数量最终增加骨量来实现的。虽然间断性小剂量应用可促进骨形成,但是连续大剂量应用会促进骨吸收以及可能存在致癌的风险和减低PTH的疗效,因此优化PTH,促进疗效,缩短使用时间,避免其副作用是目前PTH领域研究的重要方向之一。PTH引起的这两种极端的效应,是由于PTH的作用效果是与时间和剂量相关的。体内和体外研究表明,PTH具有刺激成骨细胞的增殖、分化和凋亡的能力。PTH及其相关肽(PTHrP)调节成骨细胞的增殖、分化和凋亡是通过激活甲状旁腺受体1(PTHR1)及其下游的多个信号途径实现的。目前研究表明,PTH的生物学效应主要通过以下三条信号通路的激活:分别是cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。PTH主要通过cAMP/PKA这条通路对骨的代谢进行调节,但这种调节是双向的并且与应用剂量相关。PLC/PKC信号通路对PTH的破骨作用起辅助增强的效应,而nonPLC/PKC信号通路具有能够特异性的对某些部位进行成骨调节的作用。参与介导PTH/nonPLC/PKC的亚信号通路还没有明确的界定,但是与其相关的研究提示存在多因子的参与及多亚信号通路的介导的可能。1)PTH(1-34)的 C 端结构,包括 PTH(3-34)和 PTH(29-34),介导nonPLC/PKC信号通路,具体的信号介导机制需要深入研究。2)不能排除cAMP/PKA参与介导nonPLC/PKC的可能。最近我们的研究发现cAMP/PKA选择性PTH模拟肽,G1y1Arg19hPTH(1-28),可激活PKC,提示cAMP/PKA可能部分参与 PTH/nonPLC/PKC 信号途径。3)Rho A/Rho Kinase/PLD 可能介导nonPLC/PKC。通过对这三条通路的研究以及在甲状旁腺激素基本结构的基础上,研究具有更强的成骨作用、结构更短、副作用更小的模拟肽是研究的重要方向之一。改变任何蛋白的氨基酸序列或者构象都会改变该蛋白的能力,PTH(1-34)也不例外,其构象的改变及氨基酸序列的变化都有可能影响某些信号通路的激活能力。如:PTH(1-34)完整的N端结构是cAMP/PKA和PLC/PKC通路的激活的必要条件;G1y1替换Ser1可使PTH(1-34)失去激活PLC的特性;Arg19替换Glu19能够补偿因29-34氨基酸残基缺失而引起的受体结合力减弱;当Leu 24,Leu28,val31突变成Glu后,PTH(5-34)不与受体结合;在PTH(1-14)的氨基酸残基中,Val2,G1u4,Ile5,Lys7,Met8,His9突变成Ala后,不能激活cAMP/PKA信号通路;在PTH(1-34)中,Ile5,Glu19,Va121等位点的突变,严重干扰PTH(1-34)与受体的结合力;Aib1,3,Nle8,21,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Arg19 构成的组合突变亦称M突变,M突变可使PTH(1-14)cAMP的合成能力提高约40倍,PLC的激活能力提高66倍,与PTHR的结合力提高约10倍;[Nle8,18,Tyr34]PTH(3-34)可使PTH(3-34)拥有激活cAMP/PKA通路的能力,但仍远小于(10倍以上)PTH(1-34)激活cAMP的能力等;基于以上PTH模拟肽的结构特点,通过利用PKC激活的荧光能量共振转移(FRET)技术,即通过加入不同的信号通路阻滞剂以及不同信号通路的模拟肽改变信号通路来观察FRET效率以及青色荧光与黄色荧光强度的比值(C/Y)是否改变以及改变的强度,以此来判断是否激活PKC。本课题组于近年设计和筛选出具有nonPLC/PKC通路特异性PTH模拟肽(简称MY1肽)。该MY1肽具有PTH/nonPLC/PKC的激活能力,即1)MY1肽激活PKC是与PTHR结合后通过PTH/nonPLC/PKC通路实现的并且不依赖于cAMP和PLC信号通路的激活。2)PTH/nonPLC/PKC模拟肽MT1肽具有显著增强成骨相关基因CITED1及ALP的作用。我们前期的研究揭示:PTH经nonPLC/PKC通路促进受力区松质骨合成,促进新骨形成,但是nonPLC/PKC通路的具体信号中介分子仍不清楚,相应的影响骨代谢的机理还需要深入研究。最近研究发现,PTH短时间(1小时)刺激引起的细胞增值主要是由PKA通路主导的,而PKC通路主要参与PTH的长时间(24和48小时)的刺激从而导致细胞增殖的减少和凋亡的增加。但是对于PTH/nonPLC/PKC信号通路对于细胞的增殖与凋亡目前尚不清楚。既往本课题组通过注射PTH(1-34)与G1R19(1-34)对去势小鼠骨折愈合的影响发现:发现PTH(1-34)和 G1R19(1-34)组骨密度明显高于 G1R19(1-28)组且 G1R19(1-34)组的骨小梁重建速度比G1R19(1-28)组更快,也就是PTH/nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁结构和增加受力区松质骨骨量的效应。基于PTH的基本结构,我们设计和筛选了不依赖PKA及PLC信号转导的特异性PTH/nonPLC/PKC信号通路选择性模拟肽MY1肽,利用MY1肽干预去睾丸小鼠股骨骨折的进程以及对比其与PTH(1-34)对股骨骨折的愈合以及对骨质疏松骨代谢的差异,观察该信号通路特异性模拟肽MY1肽对于骨折愈合和骨质疏松骨代谢的影响,通过分析胫骨骨松质及骨皮质和股骨骨折端骨痂区的差异,进一步明确PTH/nonPLC/PKC通路对骨代谢的影响。目的:1.观察甲状旁腺激素的非依赖PLC的PKC转导通路(PTH/nonPLC/PKC)是否会对成骨细胞(MC3T3E1)的凋亡以及细胞数量的影响。2.在显微CT上分析特异性PTH/nonPLC/PKC模拟肽对去势骨折小鼠的胫骨骨小梁、骨皮质的影响及股骨骨折的愈合情况,进一步了解nonPLC/PKC通路对骨代谢的影响。方法:培养MC3T3-E1细胞,以1.5×104密度接种到96孔板,然后置于培养箱培养3天直到细胞达到汇合状态,随机分为5组:1OOnmol/LG1R19hPTH(1-28)组;1OOnmol/IG1R19hPTH(1-34)组;1OOnmol/LG1R19hPTH(1-34)+1μmol/L Go6983组,1μmol/LGo6983组;空白对照组加入等体积的0.1%TFA(TFA为甲状旁腺激素模拟肽的溶剂),分别刺激细胞1小时,24小时,48小时,然后使用细胞计数试剂盒(CCK-8)和Caspase-Glo(?)3/7试剂盒(Caspase-3)检测细胞的数量及凋亡情况。选50只六周龄C57BL/6J雄性小鼠,饲养一周后,在异氟烷气体(300ml/min)吸入诱导麻醉后,于阴囊皮肤正中线切开越1cm,暴露双侧睾丸、附睾及周围组织,切除睾丸并缝合阴囊,术毕皮肤消毒。在去势后的1周后,异氟烷气体麻醉后,选择右侧大腿外侧作切口,在膝关节处逆行插入直径约0.45mm钢针进行髓内固定,然后钝性分离肌肉及软组织,在直视下用手术刀环形切断股骨中段,缝合切口,术毕皮肤消毒,造成股骨骨折模型。将50只小鼠随机分为5组。骨折术后第二天开始分别给予PTH(1-34)、0.1%TFA(空白对照组)、PTH(3-34)、MY1及MY2肽。骨折2周及4周后,使用显微CT分别测量小鼠非术侧胫骨骨皮质及骨小梁骨量和术侧股骨骨折处骨痂区愈合情况,根据显微CT参数分析nonPLC/PKC特异性模拟肽与PTH(1-34)对骨代谢影响的区别,从而判断nonPLC/PKC通路对骨代谢的影响。结果:通过分析细胞计数试剂盒(CCK-8),结果显示G1R19(1-34)组与G1R19(1-34)+Go6983组相比,在1小时及24小时具有提高细胞数量的趋势,但结果没有统计学差异,48小时G1R19(1-34)组与G1R19(1-28)组相比,可以明显提高细胞的数量(P<0.05)。进一步的研究发现在G1R19(1-34)组添加抑制剂Go6983后,细胞数量增多的效应消失(P<0.05)。Caspase-Glo(?)3/7试剂盒结果显示,G1R19(1-34)组与G1R19(1-34)+Go6983组相比,在1小时及24小时具有抑制细胞凋亡,但是差异无统计学意义。48小时检测凋亡显示,G1R19(1-34)组与G1R19(1-28)组相比,前者可以明显抑制细胞的凋亡(P<0.05),给予PKC抑制剂Go6983后,这种抑制凋亡的现象消失。通过切除小鼠睾丸,制造骨质疏松模型,1周后再次进行手术横切股骨中段,造成骨质疏松股骨骨折模型。药物刺激2周及4周后,处死小鼠,血清学检测分析显示,MY1肽组与空白对照组相比,钙离子及ALP明显升高并且具有统计学差异(P<0.05)。显微CT分析得,在2周及4周时,MY1肽组与空白对照组相比,其具有改善骨小梁结构并且提高骨小梁的骨密度及骨量,同时也会提高胫骨骨皮质周径并且能够促进骨折的愈合。结论:1.初步发现PTH的nonPLC/PKC信号转导通路可能在长时间(48小时)作用于MC3T3-E1细胞时,会抑制成骨细胞凋亡,增加成骨细胞数量。这有益于我们加深对PTH/nonPLC/PKC通路的理解,并为甲状旁腺激素对骨质疏松的治疗增添了新的研究方向。2.nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁结构且促进受力区松质骨的合成.;3.PTH(1-34)促进骨细胞的分化,增加骨量改善骨小梁退化的效应,最主要是由PTH/nonPLC/PKC转导通路引起的。4.nonPLC/PKC通路特异性模拟肽在短时间刺激时(2周),可提高皮质骨的骨量及骨密度。5.nonPLC/PKC通路特异性模拟肽能够促进骨折的愈合并且在短时间刺激下(2周)可提高骨痂区骨骨密度的效应。
关键词: 甲状旁腺激素 ；信号转导通路 ；骨质疏松 ；凋亡 ；去势 ；骨折愈合
摘要： 研究背景
骨质疏松症,顾名思义是骨质多孔,以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,骨密度和骨量降低,致使骨的脆性增加,骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症主要分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症两大类。据流行病学调查估计,欧美国家和日本约有7500万人患骨质疏松症,患病人数还在不断的增加。美国骨质疏松杂志基金会调查结果显示,依据WHO的诊断标准,绝经后白人女性分别有54%和30%患骨量减少和骨质疏松,大于50岁男性有3%-6%患骨质疏松。据WHO预测,至2050年亚洲65岁以上老年人将达9亿,每年将有320万髋部骨折患者,其中主要原因为骨量减少和骨质疏松。随着我国人口的老龄化,骨质疏松症现在也成为公共健康最严重的问题之一。据我国九五攻关课题调研结果发现：中国人群骨质疏松患病率为22.6%,骨量减少患病率为13.3%。骨质疏松症的严重后果是骨折以及骨折后并发症所致的残疾和死亡,不仅给患者带来痛苦,同时给社会和家庭带来沉重的负担。
治疗骨质疏松的基本方法包括基础治疗和药物治疗。其中,基础治疗包括饮食调节、钙剂和维生素D等。药物治疗以促骨形成、抑制骨吸收为基本原则。目前运用于临床的抗骨吸收的药物有如雌激素、二磷酸盐、降钙素、活性维生素D衍生物等。促骨形成药物如氟化物、雄性激素及其衍生物、生长激素、锶盐、PTH片段等。增加骨量促骨形成的代谢药物中,目前仅有甲状旁腺素(Parathyroid Hormone, PTH)获得一致认可(尽管锶盐被认为有一定的促骨形成作用,但需要更多的研究证实)。
甲状旁腺激素(PTH)是体内重要的钙稳态调节剂。PTH(1-34)是天然PTH(1-84)的短肽形式,具有相同的结合能力和相同的电位,激活Ⅰ型的PTH受体(PTHR1)。PTH (1-34)已在美国上市治疗骨质疏松,并于2011年10月正式在我国投入临床使用。临床随访观察其具有可靠的抗骨质疏松作用,但仍未达到理想的效果。重要的原因之一是：PTH对骨组织的作用是双向的,即间断小剂量促进骨形成,连续大剂量促进骨吸收。PTH可以调节成骨细胞的生成、转化、增殖或凋亡等各个环节,也促进破骨细胞的骨吸收功能。现认为,PTH对骨组织的作用主要通过与成骨系细胞表面的Ⅰ型PTH受体(PTHR1)结合,对破骨细胞的作用是通过对成骨细胞的影响而间接达到的。PTH影响骨形成和骨吸收功能与其PTHR1引起的多个信号途径有关。与PTHR1结合后,G蛋白偶联的cAMP/PKA信号级联反应被触发,其中包括cAMP/PKA, PLC/PKC和PLC-independent/PKC通道,每条通道都对应至PTH(1-34)的氨基酸序列的关键性区域。其中1位丝氨酸对于PLC的激活是至关重要的,N末端开始的3个氨基酸是cAMP/PKA活化所必须的。我们以前的研究证实,PTH(29-34)对于PLC-independent/PKC信号通路非常重要。随着对PTH(1-34)信号通路的认识加深,我们设计出[Glyl, Arg19]hPTH(1-34)是一个模拟PTH缺乏激活PLC信号通路的模拟肽,第1位丝氨酸(Serl)突变成甘氨酸(Glyl)大幅度失去激活PLC信号的特性。19位谷氨酸突变成精氨酸(Arg19)可以补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力的减弱。该结论已经通过前期的实验证实,间断小剂量注射PTH及其改建缺陷模拟肽能增加胫骨平台下方骨小梁数量和大小,增加全身骨密度。
PTH(1-34)促进骨折愈合的作用已在多篇动物实验研究中报道,如间歇性注射PTH(1-34)可提高骨痂的骨密度和骨形成,促进骨折愈合,增加全身骨密度,影响血清成骨标志物形成。尚无文献报道PTH模拟肽作用于骨折愈合的研究。
雄激素在生物体内存在广泛的生理作用,尤其是在雄性生殖器官的发育、性成熟和生精功能的维持等方面。其中,雄激素的主要成分为睾酮。有研究报道睾酮对于人的骨骼生长、发育具有重要影响,但随着年龄的增加,人体内睾酮的浓度逐渐降低,低水平睾酮浓度的老年男性容易导致骨转换加快以及增加骨折发生的风险。低睾酮水平的骨微结构变化及其骨折愈合的情况,以前相关的研究十分有限。去睾丸动物骨折后,运用信号选择性甲状旁腺激素模拟肽进行干预,观察骨折愈合的情况,将有利于了解PTH信号通路对于骨折愈合的影响,探讨新药的设计及运用。
研究目的
1、通过建立雄性小鼠睾丸摘除去势模型,分析研究小鼠去睾丸后血清雄激素水平变化以及小鼠骨量和骨显微结构变化。在此基础上建立股骨骨折模型,观察去势组与对照组之间骨折愈合情况。
2、观察甲状旁腺素(PTH)信号选择性模拟肽对去势雄鼠骨折的作用,比较具有不同信号转导通路激活特性的PTH模拟肽对骨折愈合的影响,为PTH促进骨折愈合理论研究和新型骨折愈合刺激药物的发展提供研究资料。
研究方法
1、雄性小鼠去势模型及股骨骨折模型建立
40只7周龄C57BL/6J雄性小鼠,其中8只作为基线组,余下32只随机分为去势组与对照组,该实验通过南方医院动物实验伦理委员会同意。异氟烷气体(300ml/min)吸入诱导麻醉后,通过面罩给氧持续吸入。常规备皮、皮肤消毒,于阴囊皮肤正中线剪开约1cm,暴露双侧睾丸、附睾及周围组织,切除睾丸并缝合阴囊,术毕皮肤消毒。对照组行假手术,切开阴囊皮肤后缝合。去势后1周后建立股骨中段骨折模型,异氟烷气体麻醉后,选择右侧大腿备皮、皮肤消毒,根据小鼠股骨骨折模型文献报道,于右大腿后外侧作切口,从膝关节处逆行插入直径为0.45mm钢针进行髓内固定,钝性分离肌肉及软组织,暴露股骨中段,直视下用手术刀环形切断股骨中段部分,造成横行骨折,逐层缝合肌肉及皮肤,术毕皮肤消毒。术后定期观察伤口愈合情况,所有小鼠均未发生感染,切口愈合良好。骨折后2周及4周,摘除小鼠眼球取血并分离血清。ELISA法测量血清雄激素(睾酮)浓度,运用显微CT测量胫骨平台下2mm骨量及骨微结构,骨折愈合情况通过显微CT显示。应用SPSS13.0统计学软件进行数据处理,计量资料以(x±s)表示；组间比较采用采用两独立样本t检验进行统计学分析。以P<0.05为差别有统计学意义。
2、信号选择性甲状旁腺素模拟肽对去势小鼠骨折愈合的影响
48只7周龄C57/BL雄性小鼠,摘除睾丸去势后1周制作股骨中段骨折模型,术后随机分为3组,每组16只,模型建立后的第2天开始注射hPTH(1-34)(40ug/kg)、PLC信号缺陷模拟肽G1,R19(1-34)(40ug/kg)和等量的溶解剂。术后2周和4周,双能X线骨密度仪测量骨痂区骨密度。骨折愈合情况通过X线、显微CT、生物力学和组织学显示。
结果
1.去势后1周,所有小鼠都蜷缩在一起,活动缓慢并且减少,其取食饮水与假手术组基本保持一致。术后2周(骨折术后,以下同),对照组的睾酮浓度为215.83±8.36ng/L,去势组的睾酮浓度为186.16±6.47ng/L,两组之间有显著性差异(P<0.05)。术后4周,对照组的睾酮浓度为224.65±4.51ng/L,去势组的睾酮浓度为94.346±3.96ng/L,两组之间有显著性差异(P<0.05),去势组明显低于对照组。去势后2周,去势小鼠胫骨生长板下2mm处骨小梁减少,骨折处新骨形成较对照明显降低(p<0.05)。BV/TV比例也明显少于对照组。4周时,胫骨生长板下2mm处骨小梁显著减少,骨皮质变薄,骨折处新骨形成较对照更明显降低(p<0.05),BV/TV比例在对照组和去势组较2周时增加,但去势组较少BV/TV(p<0.01)。
2.X线检查证实在所有动物骨折端对位对线良好。双能X线骨密度扫描显示,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组具有较高的骨密度(BMD)。2周时,hpTH (1-34)(BMD:45.92±1.62mg/cm2,BMC10.33±0.61mg)和G1,R19(1-34)(BMD49.12±2.11mg/cm2/BMC13.51±1.05mg)处理组的骨密度(BMD)和骨量(BMC)明显高于对照组(BMD33.77±2.17mg/cm2,BMC8.48±0.17mg)。而G1,R19(1-34)较hPTH(1-34)高(p<0.05)。显微CT扫描三维重建图像显示hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组较对照组产生更多的新骨(p<0.05)。4周时,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)基本完成骨折愈合后改建,具有更高的BV/TV。生物力学显示,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组的刚度及最大力明显高于对照组(p<0.05)。组织学分析显示2周时hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组初级骨小梁较多,4周时,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组骨髓腔再通,对照组仍在改建。
结论
1、睾丸摘除引起雄激素缺乏,可导致骨量丢失和骨折愈合延迟,骨微结构改变。
2、G1,R19(1-34)模拟肽不能激发PLC信号途径,但具有不低于PTH(1-34)的促骨折愈合效应,表明该途径在PTH促进骨折愈合中不是必须途径。
关键词: 甲状旁腺素 ；去势 ；小鼠 ；骨折愈合 ；信号转导 ；磷脂酶C ；蛋白激酶C
被引量
1
摘要： 背景：
自从Pornmer在1885年提出骨质疏松以来,人们对骨质疏松的认识也随着历史的发展和技术的进步而逐渐深化。早年一般认为全身骨质减少即为骨质疏松,美国则认为老年骨折为骨质疏松。直到1990年在丹麦举行的第三届国际骨质疏松研讨会,以及1993年在香港举行的第四届国际骨质疏松研讨会上,骨质疏松才有一个明确的定义,并得到世界的公认：原发性骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨胳疾病,并拟定每年的10月20日为“国际骨质疏松日”
我国的骨质疏松流行病学调查发现,40岁以上的骨质疏松患病率为16.1%,随年龄增加,骨质疏松发生率递增,60岁以上人群22.6%,超过80岁时50%人群均有患病。随着人类社会的发展以及医疗水平和护理水平的提高,骨质疏松越来越成为临床护理和治疗的重点,同时我国也逐渐步入老龄化社会,由骨质疏松所带来的社会负担也逐渐增加,骨质疏松的机理研究和治疗已经成为-个热点。
目前骨质疏松治疗的药物主要是抗骨吸收的药物,比如二磷酸盐、雌激素、降钙素denosumab(核因子Kappa B配体的抗体)、odanacatib(破骨酶cathepsinK的抑制剂)、胰高血糖素样肽2等,以放缓骨吸收为主要目的,对骨量的增加有限。骨吸收抑制药使骨吸收量明显减少的同时,也使骨形成量轻度减少,既出现骨转化率(单位时间的骨重建量)减慢,同时呈现骨形成大于骨吸收,因此骨密度升高。但是抗骨吸收药物可能产生一些副作用,比如足量的2种骨吸收抑制药的联合用药,如果雌激素足量,联合Alendronate足量,骨形成作用降低,那么骨折愈合率降低,可能妨碍适量骨形成所保障的生理性微骨折的修复。
PTH是体内重要的骨代谢调节激素,目前唯一临床可用的促进骨合成代谢的药物。天然的PTH由84个氨基酸构成,其N端34个氨基酸残基(PTH(1-34))具有同84个氨基酸相同的受体结合和受体激活功能,研究证实PTH(1-34)主要通过PKA和PKC两种信号途径发挥作用。随着对PTH信号通路研究的深入,发现PTH N端前两位氨基酸为PTH信号转导的关键性区域,第1位丝氨酸(Ser)突变成甘氨酸(Gly)可极大削弱PTH的PLC激活作用。19位谷氨酸突变成精氨酸(Arg)可以补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力的减弱。实验证明G1R19(1-28)和G1R19(1-34)仅具有极小的PLC激活作用,G1R19(1-28)仅仅激活cAMP/PKA信号途径；G1R19(1-34)由于存在PTH(29—34)结构,除了激活cAMP/PKA信号途径,还能激活PKC (non-PLC/PKC信号途径)。三种肽可以增加小鼠远端股骨骨密度,并且PTH(1-34)和G1R19(1-34)增加股骨密度的量强于G1R19(1-28)。
Wnt基因在胚胎发育、成人组织修复以及肿瘤的发生发面发挥着重要的作用,而近年来Wnt信号通路对骨骼系统,尤其是成骨细胞和软骨细胞的调节作用的研究逐渐增多。Wnt信号通路对调节骨量方面具有重要作用,研究证实PTH(1-84)可以通过激活Wnt信号传导通路来发挥成骨作用。那么PTH发挥成骨作用通过不同的信号途径,这些途径与Wnt信号通路之间存在什么样的关系,目前还没有见到相关研究的文献报道。
目的
1.改进传统的酶消化法,通过Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶消化获取成骨细胞,提供一种温和、高效的成骨细胞原代培养方法。
2.本研究通过表达谱基因芯片技术,筛选信号选择性甲状旁腺素模拟肽成骨效应影响的差异基因,并且探索PTH成骨效应的不同信号通路与Wnt相关因子的关系,为阐明PTH成骨效应的机制提供理论基础。材料与方法
1.选择出生2d的C57BL乳鼠分离颅盖骨,利用Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶,37℃震荡消化20min,弃去第一次上清,收集后四次上清液,加入10%FBS终止消化,2000rpm离心5分钟,弃上清后,接种于细胞培养瓶和六孔板中。取接种于6孔板中的原代成骨细胞进行鉴定：①ALP染色：培养14d时,取部分细胞,PBS冲洗3遍,按照ALP染色试剂盒说明行ALP染色,细胞质染成蓝色为阳性。②茜素红染色：取部分细胞加入成骨诱导液(10%FBS、50μg/mL维生素C、100mmol/L β-甘油磷酸钠),28d时以PBS冲洗2遍,4%多聚甲醛固定,0.1%茜素红37℃孵育30min,观察红色钙结节的形成。
2.将贴壁生长的传一代细胞,PBS冲洗三遍,1%FBS维持培养12h,然后随机分成4组,分别接受10nM PTH(1-34),10nM G1R19(1-34),100nM G1R19(1-28)和等体积的0.1%TFA作用4h,利用Trizol法提取总RNA,送公司进行表达谱基因芯片分析,得到数据后,对数据进行挖掘,寻找三种模拟肽引起变化的Wnt相关因子,
3.实时定量PCR法检验β-catenin、骨钙素(osteocalcin, OC),以及筛选出的Wnt信号通路相关因子的变化(此步骤重复3次)。采用SPSS13.0统计软件包进行分析,数据以均数±标准差表示。组间均数比较时,如果方差齐性,则采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,检验水准a=0.05,如果方差不齐时,采用Welch的修正值进行方差分析,两两比较采用Dunnett's T3检验,检验水准a=0.05。数据统计完成之后,分析这些因子与PTH通路之间的关系。结果
1.培养一周后倒置显微镜观察,细胞形态不规则,呈多边形,三角形；培养14d,ALP染色观察显示胞质中出现蓝染的颗粒；诱导培养28d,茜素红钙结节染色发现红色点状或者片状钙沉积。
2.通过基因芯片初步分析,得出信号选择性甲状旁腺素模拟肽对Wnt家族相关基因的影响：与空白对照组相比,G1R19(1-34)组Wnt2基因表达量下调2.045倍,Wnt5b基因表达量上调2.002倍,两者均参与癌症相关通路(Pathways in cancer),G1R19(1-28)组Wnt7b基因表达量下调2.438倍,参与癌症相关通路(Pathways in cancer)。
3.实时定量PCR检测发现,OC、Wnt5b表达水平处理组均高于空白对照组；Wnt2表达水平处理组均低于空白对照组；β-catenin表达水平PTH(1-34)处理组高于空白对照组；Wnt7b表达水平PTH(1-34),G1R19(1-34)处理组高于空白对照组,且G1R19(1-34)组高于PTH(1-34)和G1R19(1-28)处理组,以上差异均有统计学意义(P<0.05),其余各因子mRNA表达两组比较差异无统计学意义(P>0.05)
结论
1.信号选择性甲状旁腺素模拟肽成骨效应引起变化的下游基因不同,差异基因富集的信号通路不同。
2.在所检测的Wnt相关因子中,PTH(1-34)和G1R19(1-34)对经典Wnt信号因子作用明显,G1R19(1-28)对非经典Wnt信号因子作用明显。
3.Wnt相关因子参与肿瘤发生发展的相关传导通路。
关键词: 甲状旁腺素 ；成骨细胞 ；成骨 ；Wnt信号传导通路 ；小鼠
被引量
1