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摘要： 氯代磷系阻燃剂（Chlorinated phosphorus flame retardants）在全球范围内的广泛分布使其成为一种新型全球性污染物,引起了社会上的广泛专注,有关它的生态毒性研究已成为当前的热点问题。本研究选取磷酸三（1,3-二氯异丙基）酯(Tris（1,3-dichloroisopropyl）phosphate,TDCPP,C9H15Cl6O4P)、磷酸三（2-氯丙基）酯(Tris（2-chloropropyl）phosphate,TCPP,C9H18Cl3O4P)、磷酸三（2-氯乙基）酯(Tris（2-chloroethyl）phosphate,TCEP,C6H12Cl3O4P)作为典型氯代磷系阻燃剂,将化学和细胞生物学有关方法与技术相结合,分子水平研究了这三种阻燃剂与人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）的相互作用机制并在细胞层次研究了对肝癌细胞（SMMC-7721）的氧化损伤毒性效应。主要工作和结论如下:1.利用毛细管电泳（Capillary electrophoresis,CE）技术建立典型氯代磷系阻燃剂与人血清白蛋白结合反应的分析方法。生理条件下,构建配体（氯代磷系阻燃剂）-受体（HSA）相互作用模型,研究不同浓度TDCPP,TCPP和TCEP与HSA的结合反应机制并比较不同阻燃剂作用机理的异同。结果表明,这三种阻燃剂与HSA发生结合反应形成TDCPP-HSA、TCPP-HSA和TCEP-HSA复合物。依据有效淌度变化,通过非线性拟合方程得到TDCPP-HSA、TCPP-HSA和TCEP-HSA的结合常数KB,分别为6.3111×10～4,1.2598×10～3和2.5706×10～3 L·mol-1。相关数据表明TDCPP与HSA的相互作用是慢平衡结合反应,而TCPP和TCEP与HSA的相互作用是快平衡结合反应。相关结果阐明了血清白蛋白输运TDCPP,TCPP和TCEP的生理作用,为深入研究氯代磷系阻燃剂与生物大分子的结合反应提供理论参考。2.分析TDCPP,TCPP和TCEP作用于SMMC-7721细胞后的氧化损伤情况。采用CCK-8方法考察这三种阻燃剂对细胞增殖的影响,确定细胞增殖抑制效应的时间-量效关系,并分析细胞毒理损伤机制。结果表明TDCPP,TCPP和TCEP均能显著降低细胞存活率（P<0.05）,具有明显的细胞毒性,染毒12～72 h时段内具有时间量效关系。乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）表达的检测结果表明,这三种阻燃剂可使胞内LDH外漏,而胞内SOD、CAT含量随染毒浓度的增高而降低。荧光定量PCR结果显示,这三种阻燃剂可下调SOD-1、CAT基因的表达。研究发现TDCPP、TCPP和TCEP可对SMMC-7721细胞产生氧化损伤毒性效应,推断氧化损伤是生物毒性效应的重要机制之一。有关研究结果对评判氯代磷系阻燃剂的生态毒性效应具有重要意义。
关键词: 氯代磷系阻燃剂 ；人血清白蛋白 ；相互作用 ；SMMC-7721细胞 ；氧化损伤
被引量
2
会议时间： 2019-09-17
摘要： 有机磷酸酯阻燃剂（Organophosphate flame retardants,OPFRs）是磷系阻燃剂中应用最广泛的一类,其阻燃效果好,兼具增塑性,被广泛使用在建筑材料、塑料制品、电子产品、家居用品等工业与民用产品中。随着多溴联苯醚等溴代阻燃剂在各个国家和地区的逐步禁用,OPFRs成为溴代阻燃剂的替代产品,其生产和使用量迅速增长,环境含量逐年升高,潜在的生态风险和人群健康危害引起了全球范围的高度重视。OPFRs可引起内分泌干扰、生殖毒性、肝脏毒性、神经毒性及发育毒性等健康危害,发育损伤是其主要毒性效应。目前OPFRs的发育毒性研究主要关注暴露引起一般发育毒性、神经系统、内分泌干扰等指标变化;研究内容多侧重观察形态、行为等宏观效应的改变;分子机制尚未阐明;亟需识别表征早期暴露的敏感生物标志物并建立完善的评价指标体系。心血管系统是胚胎发育期最早发生并执行功能活动的系统,血管发育是胚胎发育的基础。外源化学物通过血管进入胚胎组织,血管细胞接触外源化学物时间早,极易成为其早期毒作用靶标。但目前关于OPFRs对心血管发育的影响知之甚少。TDCPP是儿童产品中最常使用的一种OPFR。我们选择血管特异性荧光标记斑马鱼进行TDCPP暴露实验,将受精2小时的鱼卵暴露于0、50、300、500μg·LTDCPP,分别在30小时和48小时记录死亡率和畸形率,采用激光共聚焦显微镜活体观察小血管ISV和和大血管CCV发育情况。500μg·LTDCPP暴露组死亡率和畸形率较对照组显著升高。血管形态学观察结果显示,300和500μg·LTDCPP暴露组体节间血管（ISV）生长完成率显著下降,总主静脉（CCV）面积显著减小,提示TDCPP暴露抑制血管发育,且TDCPP对血管发育的影响较畸形率、孵化率和死亡率等一般毒性评价指标更敏感。此外,暴露70小时后收集幼鱼进行基因表达分析。结果显示,血管内皮细胞生长因子Vegfa、Vegf受体（Vegfr1和Vegfr2）以及上游缺氧诱导因子Hif1a表达下降,均呈显著剂量-效应关系。我们将人脐静脉内皮细胞HUVEC给予VEGF刺激增殖,同时暴露于0、10、50、100、150、200μmol·LTDCPP,24小时后采用Calcein AM Cell Viability Assay Kit检测存活细胞数,计算细胞增殖率。与对照组相比,TDCPP暴露组增殖率均显著下降,且呈明显的剂量-效应关系。结果表明,TDCPP暴露抑制血管内皮细胞生长因子的表达,并干扰其下游信号通路。出生10天小鼠暴露TDCPP24小时及28天后,神经组织内炎症因子升高和小胶质细胞激活,血脑屏障渗透性增加。结果表明VEGF信号及炎症反应可能是TDCPP影响血管发育的重要分子机制。
关键词: 有机磷酸酯阻燃剂 ；血管发育毒性 ；毒性机制 ；毒性通路 ；早期生物标志物
被引量
2
会议时间： 2015-10-25
摘要： 【目的】(1,3-二氯-2-丙基)磷酸三酯(TDCPP)作为一种目前最常见的有机磷系阻燃剂,已成为环境新型有机污染物研究的又一个热点。前期研究表明,水生生物和禽类暴露于TDCPP后,显著干扰机体甲状腺激素稳态,包括降低T4水平,升高T3水平。目前研究着重探讨TDCPP是否对哺乳动物也具有甲状腺内分干扰影响,并尝试阐释其可能的分子机制。【材料和方法】分别以0,50,100,250mg/kg/d的暴露剂量连续经口灌胃青春期雌性SD大鼠21天,每天观察临床特征并记录体重。收集血清检测TSH,TT3,TT4,FT4含量变化;组织切片(HE染色)用于检测甲状腺形态学病变。另外,甲状腺和肝脏组织中涉及甲状腺功能以及毒物代谢相关基因和蛋白被分析,用于进一步探究化合物在分子水平影响和作用机制。【结果】暴露于250mg/kg/d剂量的TDCPP,造成实验动物体重明显下降,血清TT3水平显著升高。与对照组相比,TT4和FT4水平虽然没有统计学差异,但均呈现出剂量依赖性下降的趋势。而且在100和250mg/kg/d两高剂量暴露组中,甲状腺、肝肾绝对重量,以及甲状腺脏器系数均出现统计学意义升高。前期RT-PCR和Western blot结果表明,TDCPP暴露诱导肝脏CYP3A1和UGT1A6基因与蛋白表达出现显著的剂量依赖性上调变化。此外,组织病理结果表明,100和250mg/kg/d的暴露剂量可造成大鼠甲状腺滤泡细胞增生。然而,血清TSH水平和甲状腺TSHR基因表达仅在低剂量(50mg/kd/d)组出现有统计学意义下降,但在两个高剂量组却出现恢复到对照组水平的趋势。【结论】高剂量TDCPP暴露激活大鼠体内解毒、脱碘、以及葡萄苷酸化代谢通路,造成机体甲状腺激素紊乱,从而诱发甲状腺滤泡增生作为一种代偿机制维持机体甲状腺激素稳态,保证机体正常生理功能。低剂量和高剂量TDCPP暴露对哺乳动物甲状腺毒性作用可能涉及不同的分子机制,因此,下一步研究将主要关注长期低剂量TDCPP暴露对哺乳动物的毒性作用和不良影响。
关键词: TDCPP ；甲状腺激素 ；肝脏代谢 ；内分泌干扰
被引量
4
会议时间： 2015-10-25
摘要： 【目的】随着世界范围内溴代阻燃剂的广泛禁用,有机磷酸酯类阻燃剂的使用量大幅增加,这些阻燃剂作为添加剂加入到人类生产生活各种产品中,如家具、纺织品、电子产品、婴儿玩具等,对人类和生态环境产生威胁。科学家们对有机磷酸酯类阻燃剂进行调查研究,在水、空气、土壤、鱼类、鸟类体内检测到了各种浓度范围的有机磷酸酯类阻燃剂,其中松花江中已检测出2.5-40 ng/L的TDCPP,人类尿样中也检测出TDCPP的代谢物BDCPP。研究发现有机磷酸酯类阻燃剂具有内分泌和甲状腺毒性,但对其神经毒性及其机制的研究尚少。本课题选取TDCPP为材料进行典型有机磷酸酯类阻燃剂的神经毒性研究,并探索其可能的神经毒性分子机制。【材料和方法】选取PC12细胞为体外神经培养模型,采用0-50μM的TDCPP进行0-6天的染毒处理,对细胞形态进行观察,MTT法对细胞凋亡率进行测定,采用流式细胞仪对细胞凋亡和细胞内钙离子改变进行检测,运用RT-PCR和Western-blot技术对关键蛋白的基因水平和蛋白水平以及MAPK信号通路蛋白磷酸化水平进行检测,采用CaMK2蛋白抑制剂KN93抑制CaMK2活化后检测MAPK通路磷酸化水平的改变。【结果】经TDCPP暴露的PC12神经细胞神经丝、突触发生发展减少,细胞生存率减少、凋亡率增加。CaMK2(A/B)、GAP43、NF-H、Tubulin(α/β)在基因和蛋白水平均出现显著性改变,细胞内钙离子动态失衡,CaMK2和JNK,ERK1/2,p38 MAPK通路磷酸化水平增加,同时CaMK2活化被抑制后阻碍了MAPK通路的磷酸化水平增加。【结论】典型有机磷酸酯类阻燃剂TDCPP对PC12细胞具有神经毒性,CaMK2(A/B)、GAP43、NF-H、Tubulin(α/β)可能成为TDCPP对PC12细胞神经毒性的生物标志物,钙离子动态失衡、CaMK2磷酸化和其部分活化的MAPK通路可能成为TDCPP对PC12细胞神经毒性的分子机制。
关键词: TCEP ；TDCPP ；神经毒性 ；NF-H ；Tubulin ；CaMK2 ；Ca2+ ；MAPK
被引量
3
摘要： 有机磷系阻燃剂作为一种高效、低烟、低毒的阻燃剂,在生活中的应用愈加广泛,磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)和磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(TDCPP)作为典型的、常见的氯代有机磷阻燃剂(Cl-OPFRs),近年来在水环境中被频繁检出,其带来生态环境和健康安全问题日益引发关注。已有文献报导Cl-OPFRs的生物毒性,但其在水环境的生态风险评估尚有不足。铜绿微囊藻在维持水生态系统平衡和稳定中扮演着至关重要的角色,与蓝藻水华的发生息息相关。本实验选取TCEP和TDCPP为模式化合物,以铜绿微囊藻PCC7806为研究对象,从氧化应激水平和光合活性响应等方面探讨Cl-OPFRs对蓝藻水华发生与抑制的机理,同时对微囊藻毒素的释放进行检测和预测,得到了以下结论:(1)TCEP和TDCPP对铜绿微囊藻生长的影响均呈现典型的Hormesis效应特性,即在低浓度(TCEP 0.05～0.5 mg/L;TDCPP 0.5～1 mg/L)下刺激生长,高浓度(TCEP 50～250 mg/L;TDCPP 5～10 mg/L)抑制生长。且不同浓度TCEP和TDCPP暴露下,光合色素(叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素等)和光合放氧速率与细胞生长具有相似的变化趋势。(2)从铜绿微囊藻活性氧(ROS)水平和抗氧化系统相关酶活性的变化,初步探究两种Cl-OPFRs对藻细胞生长影响的机理。结果显示,在低浓度TCEP和TDCPP暴露条件下,铜绿微囊藻细胞内ROS和丙二醛(MDA)含量轻微降低,抗氧化系统处于稳定状态;但当TCEP和TDCPP浓度分别在高于5 mg/L和50mg/L时,细胞内ROS显著增加(P<0.05),此时膜脂过氧化水平MDA与ROS表现出相同的变化趋势,在此阶段抗氧化系统超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)表现活跃,为清除机体内过量的ROS发挥着积极作用,但并未缓解氧化应激反应。(3)通过研究两种Cl-OPFRs对细胞光合活性的影响,分析TCEP和TDCPP对铜绿微囊藻光合作用的影响机制。低浓度TCEP和TDCPP促进了铜绿微囊藻的色素含量、光系统I(PS I)环电子传递活性以及光合放氧速率,此阶段光合作用将光转化为能量,从而促进了微藻的生长;运用荧光定量以及蛋白免疫印迹证明了低剂量Cl-OPFRs刺激了NAD(P)H脱氢酶(NDH-1)的活性,其介导的环电子传递活性的升高,与类胡萝卜素等光合色素协调工作,共同降低了细胞内ROS的产生,促进了蓝藻的生长。但是,高浓度TCEP和TDCPP通过光系统II(PS II)和PS I之间的不平衡,致使生长和光合放氧活性受到严重抑制。叶绿素荧光诱导、77K荧光发射光谱和光系统化学计量学结果表明,高浓度TCEP和TDCPP抑制了状态转换,固定细胞进入状态I,提高了PS II/PS I的比率。PS II/PS I比值的升高造成了两个光系统之间的不平衡,最终导致活性氧的过度产生,从而对细胞生长产生不利影响。(4)TCEP和TDCPP促进了铜绿微囊藻微囊藻毒素-LR(MC-LR)的分泌,且随着TCEP和TDCPP浓度升高,其促进的效果越明显。与此同时,TDCPP还促进了铜绿微囊藻类色氨酸物质和类酪氨酸物质的释放,这类物质的动态释放规律有可能作为铜绿微囊藻MC-LR释放的预测参量之一。
关键词: 氯代有机磷阻燃剂 ；铜绿微囊藻 ；光合系统 ；活性氧 ；微囊藻毒素-LR
被引量
1
摘要： 有机磷酸酯阻燃剂（organophosphate flame retardants,OPFRs）是一类广泛使用的磷系阻燃剂,由于OPFRs容易被释放到环境中且具有毒性效应,对环境和人体健康构成了潜在威胁,近年来已受到人们的普遍关注。然而目前关于OPFRs的微生物降解性能和机制的研究还相对较少。本文以磷酸三苯酯（triphenyl phosphate,TPHP）作为OPFRs的代表污染物,利用短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）为实验菌株,研究了B.brevis对TPHP的降解特性和转化机制以及菌体在TPHP胁迫下的蛋白表达变化,此外还分析了TPHP及其降解产物的细胞毒性效应和作用机理。主要研究结果如下:（1）B.brevis可以有效降解TPHP并且利用TPHP作为碳源和能源生长,菌体对TPHP的降解效果与投菌量,温度和体系pH值有关,当温度为30℃,pH值为7.0时,2 g/L的B.brevis在5 d内对TPHP（1 mg/L）的降解率达到92.1%,在此过程中降解体系的pH值也随时间增加逐渐降低。B.brevis对较低浓度（≤10 mg/L）的TPHP处理4 d后降解率可达80%以上,而高浓度（50 mg/L）的TPHP则会破坏菌体细胞正常的形态结构,造成细胞破损,导致其降解率仅为26.9%。利用B.brevis生物强化修复河水体系中的TPHP,显著减少了TPHP降解过程的迟滞期,处理96 h后TPHP的降解率达到97.9%。这些结果表明生物强化可以作为一种原位修复TPHP污染水体的潜在方案。（2）在B.brevis降解TPHP的过程中,利用LC-Q-TOF-MS高分辨质谱共检测到7种TPHP的代谢产物,包括DPHP,PHP,单羟基TPHP,单羟基DPHP,单羟基PHP,双羟基TPHP和双羟基DPHP。根据代谢产物推测TPHP的降解途径,主要涉及水解和羟基化过程。DPHP和PHP的含量随着TPHP的降解逐渐累积,反应5 d内最高浓度分别达到77.1和2.1μg/L。此外B.brevis对1 mg/L的DPHP和PHP也具有一定的降解效果,处理5 d后最高降解率分别为14.4%和23.3%。B.brevis在TPHP的胁迫下引发氧化应激反应,导致细胞内MDA含量升高,同时诱导SOD和CAT活性增大。细胞色素P450酶抑制剂胡椒基丁醚显著抑制了B.brevis对TPHP的降解效果以及菌体P450酶基因的表达,并且这种抑制作用随胡椒基丁醚浓度的增加而增强,表明P450酶可能参与了TPHP的生物降解过程。（3）基于同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）分析B.brevis在TPHP暴露下的蛋白表达差异,其中有102个蛋白表达上调,80个蛋白表达下调。这些差异蛋白的功能主要集中于运输与代谢,信息存储与处理,细胞过程与信号等。TPHP刺激了B.brevis的碳水化合物代谢,导致参与糖酵解过程的蛋白表达出现了上调,同时TPHP还通过增强菌体的氨基酸和脂质代谢过程,为细胞的生长代谢活动提供更多的能量。参与装配50S和30S亚基的核糖体蛋白在TPHP的暴露下表达显著上调,对于菌体细胞蛋白质的合成具有重要作用。ABC转运蛋白和抗氧化应激蛋白在TPHP胁迫下也表现出不同的表达水平。B.brevis在环境压力下通过调控不同功能蛋白的表达维持了细胞内环境的稳定同时增强了菌体对TPHP的适应性。（4）TPHP及其降解产物DPHP和PHP均对HepG2细胞的活力产生了不同程度的抑制作用,其中TPHP的抑制效果最强,PHP最弱。TPHP暴露浓度增大可以导致细胞内Ca2+含量显著增加,破坏了线粒体膜的完整性促使ROS在细胞内积蓄,引起了细胞氧化应激,进一步造成细胞线粒体膜电位下降,从而诱导HepG2细胞凋亡。高浓度（≥100μmol/L）的TPHP还会导致细胞核损伤固缩。DPHP和PHP对细胞凋亡的诱导作用相比TPHP要明显减弱。此外,TPHP能使HepG2细胞周期阻滞于G0/G1期,减少了S期细胞的比例。与DPHP和PHP相比,TPHP对HepG2细胞的毒性效应最强,DPHP次之,且具有一定的剂量-时间效应关系。结果表明TPHP及其降解产物对HepG2细胞的毒性与调控细胞周期进程和线粒体途径介导的细胞凋亡有关。总的来说,生物降解消减了TPHP的毒性作用,是一种有效和安全的TPHP污染修复方法。本研究有助于从蛋白水平和毒理学角度揭示微生物降解转化TPHP的机制,以及TPHP及其降解产物可能对环境和人体健康产生的毒害作用,为开发OPFRs污染的微生物修复技术提供了数据支持。
关键词: 磷酸三苯酯 ；生物降解 ；蛋白质组学 ；细胞毒性 ；分子机制
被引量
18
摘要： 抗菌剂、阻燃剂和农药产量大、使用广泛,并可通过多种途径进入水环境对藻类产生毒害作用,进而威胁水生态系统的稳定,但上述污染物共存时对藻类的毒害效应目前还不确定,因此研究典型抗菌剂、阻燃剂和农药在水环境中对藻类的毒性效应及其毒性机制具有现实意义。另外,藻类对很多化合物有“低浓度促进,高浓度抑制”的Hormesis效应,且该效应被认为是藻类水华爆发的原因之一,因此典型抗菌剂、阻燃剂和农药的单一及混合体系是否引发藻类的Hormesis效应及其产生机制也应被重点关注。
本文选择模式生物斜生栅藻为受试生物,选择1种抗菌剂AgNP、3种溴代阻燃剂BFRs（DBDPE、TBBPA、BDE209）、3种有机磷阻燃剂OPFRs（TCEP、TEP、TBP）、3种有机磷杀虫剂OIs（TCF、PFF、CPF）、3种新烟碱类杀虫剂NNIs（IMI、THP、CLO）和3种三嗪类除草剂THs（PMTT、PMOT、SMTT）为受试物,研究AgNP、阻燃剂、农药的单一体系及混合体系对斜生栅藻的毒性效应,使用IA模型法判定混合体系对斜生栅藻的联合毒性作用模式;随后通过判读剂量-效应曲线确定Hormesis效应特征,并获得促进浓度区间、区间跨度、最大促进率等Hormesis效应特征值;最后测定暴露于不同单一及混合体系的斜生栅藻细胞内ROS水平、光合色素水平变化,分析其与斜生栅藻的毒性效应、Hormesis效应的关系,得到以下结果:
1)1种抗菌剂AgNP、6种阻燃剂和9种农药单一体系均对斜生栅藻产生毒性效应。使用EC10比较16种受试物的毒性,EC10从大到小排序:TCEP>AgNP>TCF>TEP>THP>PFF>TBBPA>CPF>IMI>TBP>CLO>BDE209>DBDPE>PMOT>SMTT>PM TT,其中PMTT的EC10最小,毒性最大,THs的毒性大于AgNP、BFRs、OPFRs、OIs、NNIs。所有受试物均使斜生栅藻产生Hormesis效应,16种受试物的最大促进率为5.52%～26.15%,促进浓度区间为1.24×10-12 mol·L-1～5.28×10-5 mol·L-1。受试物在水环境中的检出浓度均落在Hormesis效应的促进浓度区间内,这表明在实际水环境中受试物会使斜生栅藻产生Hormesis效应,促进生长繁殖。该现象可引起或加剧藻类水华的形成。在AgNP、阻燃剂和农药单一体系暴露下,当受试物浓度较低、斜生栅藻受到促进作用时,斜生栅藻细胞内ROS水平和光合色素水平都有明显上升;当受试物浓度较高、斜生栅藻被抑制时,ROS水平极显著地上升,光合色素水平极显著地下降。所有受试物均通过诱导藻细胞产生ROS双向调控藻细胞的生长繁殖,当藻细胞被促进或抑制时,光合色素水平也同步增加或减少,呈正相关关系。
2)6种AgNP+阻燃剂混合体系、9种AgNP+农药混合体系、21种阻燃剂+农药混合体系均对斜生栅藻产生不同程度的联合毒性效应。使用EC10比较上述36种混合体系的毒性,AgNP+NNIs和AgNP+BFRs混合体系的毒性大于AgNP+OIs和AgNP+THs混合体系;BFRs+NNIs混合体系的毒性大于BFRs+OIs混合体系。36种混合体系的联合毒性作用模式有两种,一种为随暴露浓度上升由协同转为拮抗,具体包括AgNP+TBBPA、AgNP+TBP、AgNP+TCF、AgNP+PFF、AgNP+CPF、AgNP+IMI、AgNP+CLO、AgNP+PMTT、AgNP+PMOT、AgNP+SMTT、TBBPA+IMI、TBBPA+THP、TBBPA+CLO、TBP+TCF、TBP+THP、TBP+PMTT共16种混合体系;另一种为协同,其余20种混合体系的联合毒性作用模式均为协同。
3)AgNP+阻燃剂、AgNP+农药、阻燃剂+农药混合体系均使斜生栅藻产生Hormesis效应。36种混合体系的最大促进率范围为4.85%～27.81%,促进浓度区间在3.57×10-11 mol·L-1～4.72×10-5 mol·L-1之间,其中AgNP+TCEP体系的最大促进率最高,促进效果最大。在上述混合体系暴露下,斜生栅藻细胞内ROS水平和光合色素水平变化趋势与AgNP、阻燃剂、农药单一体系暴露下的趋势相似,且当混合体系浓度较低、斜生栅藻受到促进作用时,ROS水平上升幅度比单一体系更大。混合体系在浓度较低时联合毒性表现为协同的原因是混合体系浓度较低时各组分共同诱导ROS水平上升超过促进细胞生长的最佳ROS水平,导致促进作用减弱,联合毒性表现为协同;混合体系在浓度较低时联合毒性表现为拮抗的原因是混合体系中不同组分在藻细胞内产生毒性的作用位点、靶蛋白存在重叠,各组分产生毒性时会抑制其他组分进入细胞和产生毒性,导致混合体系联合毒性减弱,表现为拮抗。
本文对16种环境污染物单一及共存时对斜生栅藻产生的毒性效应、Hormesis效应进行了研究,并从细胞内ROS水平、光合色素水平方面对Hormesis效应机制进行了剖析,可以为污染物的联合毒性研究、环境风险评价以及Hormesis效应研究提供基础毒性数据及理论依据。
关键词: 抗菌剂 ；阻燃剂 ；农药 ；斜生栅藻 ；Hormesis效应 ；活性氧 ；光合色素 ；联合毒性
被引量
1
摘要： 有机磷酸酯(organophosphorus esters,OPEs),作为应用最广泛的一类有机磷阻燃剂,具有品种多,价格低廉,阻燃效果好等特点,在家具、纺织品、建筑材料和电子产品中大量使用。由于OPEs主要以掺杂混合而非化学键合方式加入到材料中,其大多数具有半挥发性,因此随着OPEs的广泛使用,越来越多的OPEs释放到环境中。近年来,在水体、大气、室内以及土壤中均检测到多种OPEs的存在,其环境和健康风险亟待评估。目前,针对OPEs的生态毒性研究,主要集中在水生生物(包括斑马鱼、大型潘等)和鸟类,而对土壤生物的研究鲜有报道。本研究采用土壤无脊椎动物赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)作为受试生物,通过滤纸接触法和人工土壤法分析了三类不同取代基类型OPEs对蚯蚓的急性毒性及毒性效应,并利用多组学技术重点研究了其中毒性最大的磷酸三正丁酯(TnBP)对蚯蚓的致毒机制。主要研究内容和结果如下:(1)通过滤纸接触法测定了三种取代基类型的OPEs对蚯蚓急性毒性指标LD50,包括氯代烷基类(磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯TDCP和磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP)、烷基类(磷酸三甲酯TMP和TnBP)和芳基类(磷酸三甲苯酯TCP),结果发现OPEs毒性大小顺序为TnBP>TCP=TMP>TDCP=TCEP。(2)利用人工土壤法分别研究了 TCEP、TCP和TnBP对蚯蚓的毒性效应,结果发现3种OPEs在10 mg/kg暴露浓度下对蚯蚓体重增长无显著影响,但能造成蚯蚓组织的损伤。3种OPEs暴露均可扰乱蚯蚓抗氧化酶系统的稳定,产生氧化应激,在1 mg/kg暴露浓度下即可引起蚯蚓体腔细胞DNA断裂。3种OPEs暴露对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性影响差异不显著。通过计算综合毒性指数IBRv2,三种OPEs的综合毒性效应大小为TnBP>TCP>TCEP,与滤纸法相同。(3)结合转录组学和代谢组学的方法,探究了 TnBP暴露对赤子爱胜蚓肠道损伤的直接作用机制,并选择相应蛋白及基因进行验证。结果显示TnBP可在蚯蚓的肠道组织中积累,影响其结构和消化功能。TnBP使蚯蚓肠道组织内特有的表面活性剂 2-已基-5-乙烷基-呋喃-3-磺酸(2-hexyl-5-ethyl-furan-3-sulfonic acid,HEFS)含量下降,破坏了细胞膜的稳定性;Ca2+-ATPase活性下降使细胞内的Ca2+无法通过Ca2+-ATPase泵出细胞外,导致膜内渗透压升高,进而细胞结构受到破坏。小肠上皮细胞间紧密连接蛋白中的闭合蛋白(occludin)及将跨膜蛋白固定在肌动蛋白细胞骨架上的闭锁连接蛋白-1(Zonulaoccludens-l,ZO-1)表达量显著下调,使细胞间的紧密连接受损。此外,TnBP的暴露明显降低了肠道微生物的多样性,改变了肠道微生物群落结构,显著降低了两种产短链脂肪酸细菌的丰度,引起肠道产短链脂肪酸能力下降,使肠道更易发生炎症反应。(4)通过转录组学和代谢组学的方法,对腹部神经索及头部神经节分别研究,探究了 TnBP暴露对赤子爱胜蚓神经毒性的可能作用机制,并选择相应蛋白含量及基因表达量进行进一步验证。结果发现,TnBP可在蚯蚓神经组织中积累,扰乱兴奋性神经递质谷氨酸的传递,产生兴奋性神经毒性。TnBP使腹部神经索中谷氨酰胺酶的表达量上升,产生大量谷氨酸,并促进突触囊泡对谷氨酸的运输及突触前膜谷氨酸的释放,对谷氨酸受体(GluR)中的离子型受体N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDARs)产生过度刺激,引起神经元产生兴奋性损伤。在此过程中还会导致突触后膜Ca2+堆积,此外Ca2+-ATPase的含量降低,突触后膜的Ca2+无法及时运出胞外,从而引起钙超载,造成神经元的损伤。另一方面,TnBP的暴露会降低蚯蚓头部神经节中谷氨酰胺酶的表达,引起谷氨酸含量降低。Ca2+-ATPase含量的降低使突触后膜Ca2+无法及时运出胞外引起的钙超载,可能是头部神经元损伤的重要原因。此外,Na+/K+-ATPase的下调,使细胞内Na+和Ca2+堆积,引起细胞渗透压失衡,造成神经元损伤。本研究系统地探究了不同取代基类型的OPEs对典型土壤生物蚯蚓的生态毒性效应,并揭示OPEs引起蚯蚓致毒的分子机制,为其污染控制基准和环境评价提供理论支撑。
关键词: 有机磷酸酯 ；赤子爱胜蚓 ；急性毒性 ；肠道损伤 ；神经毒性
被引量
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摘要： 全氟和多氟化合物（per-and polyfluoroalkyl substances,PFASs）作为一类典型的新污染物,在我们国家各种环境介质中陆续被检出,其中土壤和水体环境中的暴露水平甚至高于其它国家,给环境生态和人体健康构成了潜在风险。近年来,典型的长链全氟和多氟化合物全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOAC8)及其盐类已被多个国家明令禁止流通,导致其替代品的生产和使用激增,但是关于PFOAC8替代品的毒理学机制研究较少,目前其最典型的短链替代品六氟环氧丙烷-二聚酸(hexafluoropropylene oxide dimer acid,Gen XC6)生物毒性效应尚不明确。因此,亟需进一步深入研究PFOAC8和Gen XC6的毒性作用机理问题。本工作的主要研究内容与结果如下:
（1）动物体内毒性研究:以模式动物斑马鱼胚胎为实验对象,从胚胎形态、细胞凋亡及其分子水平研究全氟和多氟化合物暴露对动物的毒性作用机制。研究结果表明PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6（v/v,1:1）暴露会导致胚胎生长发育和器官功能障碍,其毒性强弱为:PFOAC8>PFOAC8+Gen XC6>Gen XC6;PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6的毒性效应还会影响胚胎的孵化率、死亡率和畸形率,且PFOAC8+Gen XC6的联合暴露可能具有加性致畸效应,这些生理指标的改变与全氟和多氟化合物碳链长度、暴露浓度、暴露时间成正相关。该研究揭示了PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6暴露导致胚胎生长发育功能障碍的机理:即通过抑制细胞凋亡或自噬相关的基因表达,包括atp1b2b、laptm4b、ctsbb、mt-co2、mt-co3和mt-cyb基因,其中laptm4b和ctsbb基因与人体罹患肿瘤密切有关。
（2）细胞体外毒性研究:以人体肝癌细胞系Hep G2细胞为实验对象,从细胞形态、分子和蛋白水平研究全氟和多氟化合物暴露对细胞的毒性作用机制。研究结果表明:PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6（v/v,1:1）暴露会对人体细胞产生毒性,还会导致Hep G2细胞基因多样性和基因表达水平改变,其毒性强弱可能为:PFOAC8>Gen XC6>PFOAC8+Gen XC6。此外,PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6暴露会在基因水平上引起Hep G2细胞基因功能和信号通路改变,进而影响蛋白互作;其中TNF signaling pathway和Insulin resistance信号通路在对照组（control,CK）vs PFOAC8暴露组中出现显著富集现象。
（3）植物种子毒性研究:以模式植物烟草（Nicotiana benthamiana,N.benthamiana）和拟南芥（Arabidopsis thaliana,A.thaliana）为实验对象,从表型、吸收转运水平和生理生化水平研究全氟和多氟化合物暴露对种子萌发的毒性作用机制。种子萌发实验发现PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6（v/v,1:1）暴露均会对植物种子产生毒性,表现为烟草和拟南芥种子萌发均会受到抑制,其毒性强弱为:PFOAC8>PFOAC8+Gen XC6>Gen XC6。此外,PFOAC8在烟草和拟南芥中的生物累积能力比Gen XC6更强,但Gen XC6具有更强的转运能力,而且全氟和多氟化合物在烟草和拟南芥体内的富集与转化方式也有较大差异。最后,PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6暴露的毒性作用对烟草和拟南芥种子生长发育的生理生化特征有较大影响,且影响程度均与暴露浓度成正相关,其中对抗氧化酶系统的影响最为显著。
（4）植物幼苗盆栽毒性研究:以烟草和拟南芥为实验对象,从植物形态、吸收转运水平、生理生化水平以及超微结构研究全氟和多氟化合物暴露对幼苗生长发育的毒性作用机制。取得如下结果:第一,盆栽实验发现PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6（v/v,1:1）暴露均会对植物幼苗生长发育产生毒性,其毒性强弱为:PFOAC8>PFOAC8+Gen XC6>Gen XC6。第二,PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6在烟草和拟南芥不同部位的转运和积累具有倾向性,如在烟草器官中,PFOAC8和Gen XC6的积累均是在根中最多,种子中最少;而在拟南芥器官中,PFOAC8和Gen XC6的积累也是根中最多,但茎中最少。第三,PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6暴露会引起烟草和拟南芥体内的微量元素、酶活性、生长周期、产量以及不同器官的微观结构发生变化,其变化幅度与全氟和多氟化合物暴露时期、暴露时长以及暴露浓度息息相关。第四,PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6在烟草和拟南芥成熟期种子中的富集,会影响后代种子萌发,可能是产生了隔代毒性效应。
（5）根际微生物毒性研究:以长期受全氟和多氟化合物胁迫的烟草和拟南芥根际微生物为实验对象,从微观水平和分子生物学水平研究全氟和多氟化合物对根际微生物的毒性效应,并对微生物修复污染土壤潜力进行了初步探究。本研究通过全周期盆栽实验发现PFOAC8、Gen XC6和PFOAC8+Gen XC6（v/v,1:1）暴露会对根际微生物产生毒性效应,对微生物群落的物种多样性、物种丰度和物种组成构成了威胁,并且PFOAC8暴露对根际微生物的影响显著强于Gen XC6暴露,说明PFOAC8对根际微生物的毒性作用更大。然后,选取长期受污染的盆栽根际土壤,通过分离与纯化筛选到了三株耐受菌株Rhizobium daejeonense、Streptomyces coeruleofuscus和Sphingomonas mesophila。最终在盆栽实验中通过接种耐受菌株悬浮液,发现接种微生物后,既能促进烟草和拟南芥生长,又能提高其种子产量,还能有效减少PFOAC8在植物体内转运与累积,说明微生物处理具有一定的生态修复潜力;但这些菌株对Gen XC6在植物体内的富集转化影响不明显。
综上所述,本课题研究了全氟和多氟化合物暴露对斑马鱼胚胎、人体细胞和两种模式植物及其根际微生物的毒性效应,从表型、生理生化指标、微观结构以及分子和蛋白水平阐明了全氟和多氟化合物对模式动植物和人体细胞的毒性作用机理,揭露了全氟和多氟化合物暴露对水生动物种群和陆生植物的危害,希望能引起人类对全氟和多氟化合物污染的重视。另外,该研究为人类肿瘤治疗提供了新的靶向,还为微生物修复全氟和多氟化合物污染提供了重要理论依据。
关键词: 全氟和多氟化合物 ；胚胎发育 ；细胞凋亡 ；植物毒性 ；根际微生物
摘要： 溴代阻燃剂(Brominated Flame Retardants,BFRs)是一种应用量较大的化学品,广泛用于印刷电路板及其它聚合材料的阻燃剂中,其作为环境污染物也普遍存在于各种非生物和生物介质中。其中最为典型的BFRs为四溴双酚A(Tetrabrobisphenol A,TBBPA)和多溴联苯醚(Poly Brominated Diphenyl Ethers,PBDEs)。目前,对于TBBPA和PBDEs作用于人体的器官组织毒性有了大量的研究,然而,关于TBBPA和PBDEs对人体呼吸系统毒性研究仍然有限。因此,本研究以TBBPA和BDE209作为BFRs的典型代表,采用人体支气管细胞Beas2B和肺上皮细胞16HBE以及人体血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)作为研究对象,分别从细胞和蛋白两个层面开展了TBBPA和BDE209对人体的呼吸暴露毒性研究。(1)首先从细胞的层面研究了TBBPA对人体呼吸系统细胞Beas2B和16HBE的毒性损伤作用。结果显示,随着TBBPA的暴露浓度从0增加至50μM,两种细胞的存活率均逐渐下降,细胞通透性不断提高。这说明越高浓度的TBBPA对细胞的活力及结构产生更为严重的损伤作用。此外,流式细胞仪分析也表明了细胞在暴露后出现了部分凋亡,且随着浓度的提高,凋亡率也随之提高。然而,在高浓度的刺激下,大多数细胞会直接进入到死亡阶段而没有出现凋亡的过程。进一步,通过基因表达测定分析发现与细胞凋亡相关基因p53、Survivin、bax、bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表达量均出现不同程度的上调,其中24小时的暴露相较于12小时会激发更为强烈的表达上调。两种呼吸系统细胞的Caspase-3、Survivin基因在受到不同浓度的TBBPA暴露刺激后均出现了急剧的表达上调(2～9倍),Caspase-9、bcl-2、bax基因出现了轻微的表达上调(1～6倍),p53基因表达趋于稳定。根据Caspase-9、Caspase-3、bcl-2、bax这四个基因表达的上调,可以推测细胞凋亡的线粒体通路可能被激活。除此之外,bcl-2和bax作为一对相互拮抗的基因,均表现出了相同的表达趋势。一方面bcl-2可以抑制细胞凋亡的进行,与此同时bax的表达也在抑制bcl-2的作用,这表明细胞受到刺激后发生的凋亡也是其细胞内部平衡变化的结果。此外,对暴露过程中细胞胞内活性氧(ROSs)组分、抗氧化性酶SOD和CAT活力进行了测定,结果显示:两种细胞内的ROSs组分和抗氧化性酶的活性均出现明显的提高,表明细胞在TBBPA暴露过程中受到了一定的氧化损伤并出现了氧化应激。进一步,通过对比研究发现Beas2B细胞相较于16HBE细胞对TBBPA具有更强的耐受性。(2)进一步,从蛋白的层面揭示人体HSA受到TBBPA和BDE209的暴露后出现的构型及其潜在的功能影响。光谱实验研究表明,TBBPA、BDE209均能诱导HSA构象变化,HSA的α螺旋含量下降,二级结构变得不稳定,且Trp残基周围疏水性增加。这表明TBBPA和BDE209具有潜在的蛋白毒性作用,可能会导致相关蛋白的功能损伤。其中TBBPA比BDE209的作用要更为显著。此外,对于TBBPA和BDE209与HSA蛋白存在的结合位点进行了理论计算分析,TBBPA在HSA的结合位点附近的氨基酸为ARG484、LEU481、GLU450、VAL344、TRP214、LYS199和LEU198氨基酸残基。BDE209在HSA的结合位点附近的氨基酸为HIS288、ARG257、CYS245、HIS242、LYS199、GLN196、GLU153、TYR150。基于结合位点的结果对TBBPA和BDE209与HSA的相互作用进行了理论计算分析,结果表明与实验结果呈现一致,BDE209的结合能(-ΔG结合为6.35 kcal/mol)要低于TBBPA(-ΔG结合为6.78 kcal/mol)。其可能的原因是BDE209没有用于形成氢键的H原子且分子量更大疏水性更强,而TBBPA含有多个H原子且分子量较小、疏水性较弱。因此,TBBPA更容易与HSA蛋白结合,这也与实验结果表现出一致,其中TBBPA能够对蛋白造成更为显著的影响。综上所述,本论文从细胞和蛋白两个层面研究了典型溴代阻燃剂对人体呼吸系统产生的一系列毒性和损伤作用。在受到TBBPA的暴露刺激后,人呼吸系统相关细胞会受到明显的毒性刺激,导致细胞出现过氧化以及胞内氧化应激,并诱导细胞凋亡。此外,在损伤的过程中,细胞的通透性也会增大,增加细胞内物质和污染物的接触风险。并且,TBBPA和BDE209还会与HSA进行相互结合,直接影响蛋白在结构和功能上的变化。本研究揭示了典型溴代阻燃剂对于人体存在的呼吸暴露风险,并为典型毒害污染物对人体呼吸道的暴露和毒害作用机制的研究提供一定的借鉴意义。
关键词: 溴代阻燃剂 ；四溴双酚A ；十溴联苯醚 ；细胞毒理 ；蛋白损伤
被引量
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摘要： 微塑料和有机磷酸酯阻燃剂(OPFRs)均为海洋中的新型污染物,在海洋中分布广泛,并且随着塑料和OPFRs用量的增加,这两种污染物在海洋中的污染程度也逐渐加剧。研究表明,微塑料和OPFRs对海洋生物有毒性作用,对海洋生态系统造成了巨大威胁。并且,在海洋中,微塑料可携带并传输OPFRs,导致两种污染物对海洋生物产生的影响更加复杂多变。海洋微藻作为海洋中的初级生产者,对维持海洋生态系统的稳定具有重要意义,同时,海洋微藻也是毒理学研究中的典型受试物种。已有文献报道,微塑料及OPFRs对微藻有毒性效应,但是大多数涉及微塑料的研究仅限于对生理指标的检测,同时,OPFRs对海洋微藻的毒性研究非常有限。因此,本论文研究了微塑料及典型芳基磷酸酯阻燃剂对海洋微藻的毒性效应及作用机制,并开展了微塑料与OPFRs对海洋微藻联合毒性的评价工作,为评估微塑料及OPFRs对海洋生态系统的影响提供了基础数据及理论支撑。本论文的具体研究内容及重要结论如下:(1)明确了微塑料对杜氏盐藻的生理以及代谢通路的影响。通过聚苯乙烯(PS)和老化聚苯乙烯(A-PS)微塑料对杜氏盐藻的毒性实验,发现PS和A-PS微塑料均抑制杜氏盐藻的生长,并且浓度在50 mg/L及以上的微塑料能诱导藻细胞内生成大量活性氧(ROS),进而对藻细胞造成氧化损伤,却能促进藻细胞色素合成。非靶向代谢组学分析表明,PS和A-PS微塑料显著影响了藻细胞的代谢。代谢通路富集结果说明,PS和A-PS微塑料主要扰乱了藻细胞中与氨基酸相关的代谢途径,尤其是氨基酸生物合成和ABC转运蛋白通路均显著上调,进而促进了杜氏盐藻的氮储存和细胞膜两侧物质的跨膜转运。然而,藻细胞中跨膜运输需要消耗大量能量,过于活跃的跨膜运输会间接抑制藻细胞分裂,导致藻细胞生长缓慢。以上结果从生理和代谢水平上更全面地阐释了微塑料对海洋微藻的毒性效应及致毒机理。另外,通过对比实验结果发现,老化增加了微塑料与藻细胞的相互作用,诱导藻细胞形成了更多的ROS,进而引发了更严重的氧化损伤及更强的氧化应激反应。(2)系统地研究了磷酸-2-乙基己基二苯酯(EHDPP)、磷酸三甲苯酯(TCP)、磷酸三苯酯(TPhP)对牟氏角毛藻在生理和转录组水平上的影响,阐明了相关毒性机制。在实验浓度范围内,OPFRs对牟氏角毛藻的生长抑制作用随浓度增加而增加,并导致藻细胞畸形。生理参数测定结果表明,藻细胞的光合作用受到抑制,主要表现为叶绿素含量下降及光合电子传递受阻。电子传递受阻能诱导藻细胞内产生大量ROS,进而引发藻细胞发生膜脂过氧化,对藻细胞膜的结构和功能造成了不可逆的破坏,如细胞膜通透性增加。深入分析转录组结果发现,EHDPP、TCP、TPhP致使藻细胞内多个调控光合蛋白合成的基因表达水平显著下调,以及调控谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶及甘油磷脂分解酶合成的基因表达水平显著上调。同时,EHDPP、TCP、TPhP均能诱导编码核糖体蛋白及脯氨酸合成的关键基因表达显著下调,导致藻细胞内核糖体的结构和功能被破坏,抑制了蛋白质的合成,并且降低了藻细胞对OPFRs胁迫的抵抗能力。以上结果说明,EHDPP、TCP、TPhP对牟氏角毛藻的毒性机制为光合作用受抑制、氧化损伤及蛋白质合成受阻。另外,通过对比分析三种芳基磷酸酯阻燃剂的结构性质及其对藻细胞的毒性大小,发现疏水性越强的芳基磷酸酯阻燃剂与藻细胞的相互作用就越强,引起的毒性效应也越强。(3)在研究了微塑料和TPhP对微藻的单独毒性的基础上,本文从藻细胞生长、光合作用、氧化应激等方面评估了微塑料及TPhP对牟氏角毛藻和杜氏盐藻的联合毒性效应。PS微塑料抑制牟氏角毛藻的生长,并引发藻细胞内的氧化应激反应,造成严重的细胞膜氧化损伤。在PS微塑料的作用下,藻细胞叶绿素含量没有明显下降,且高浓度的PS微塑料显著促进了叶绿素的合成。另外,低浓度(≤ 0.8 mg/L)的TPhP在短期暴露中能刺激藻细胞生长,高浓度(≥1.6mg/L)TPhP抑制藻生长,并引发藻细胞膜过氧化损伤。除高浓度的TPhP外,TPhP对叶绿素含量及最大光能转化效率均无显著降低作用。通过进一步分析发现,PS微塑料能吸附TPhP,该作用降低了培养基中TPhP的浓度以及PS微塑料与藻细胞之间的相互作用,进而减小了 TPhP对微藻的毒性。根据指数相加和独立作用模型的评价,表明PS微塑料和TPhP对牟氏角毛藻、杜氏盐藻的联合毒性效应为拮抗作用。
关键词: 微塑料 ；有机磷酸酯阻燃剂 ；海洋微藻 ；毒性效应 ；代谢组学 ；转录组学
被引量
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摘要： 有机磷阻燃剂(Organic phosphorus flame retardant,OPFRs)作为传统阻燃剂的替代品已经在家具、电子产品、婴儿用品等日常产品中广泛使用,并且在不同环境介质和生物体中被频繁检出。研究表明,OPFRs不仅能够引起生物体的神经毒性、生殖毒性、心脏毒性和肝脏毒性等,并且还能干扰内分泌系统的正常功能。基于OPFRs在环境中广泛存在以及由此引发的环境及健康风险引起人们的普遍关注。本研究选取了9种常见的OPFRs为主要的研究对象,在评价维甲酸a受体(Retinoidareceptor,RXRa)介导的内分泌效应基础上,研究了OPFRs基于核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)对肝细胞代谢表型的影响;并利用人肝微粒体(Human liver microsome,HLM)分析了典型OPFRs生物转化的潜在机制。主要的研究工作和成果包括以下三部分:(1)对RXRa介导内分泌效应评价:RXRa在维持生物体正常代谢平衡中具有重要功能,本研究以转染了RXRa的中国仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-K1)细胞为体外模型,同时整合分子对接技术,考察了有机磷阻燃剂由RXRa介导的潜在内分泌干扰效应。研究表明:部分OPFRs能通过RXRa受体介导而表现出潜在内分泌干扰效应,效应强弱顺序为TMPP(Ortho-containing trimethylphenyl phosphate)>TPHP(Triphenyl phosphate)>TDBPP(Tris(2,3-dibromopropyl)phosphate)>TNBP(Tri-n-butyl phosphate);分子对接结果显示,TMPP与RXRa受体的结合能打分最高,实验结果有助于丰富磷系阻燃剂内分泌干扰毒理学数据,揭示其潜在的健康风险。(2)OPFRs对肝脏细胞代谢表型的影响:基于NMR的细胞代谢组学技术探讨了OPFRs对人肝癌细胞(Human hepatocellular carcinoma cell,HepG2)肝脏细胞毒性和代谢紊乱的毒性特征,通过分析细胞内源性化合物代谢模式变化趋势,搭建发生变化的生物学通路网络结构。研究共指认出HepG2细胞中的33个代谢物,通过对NMR谱的主成分分析,发现9种OPFRs均显著影响HepG2细胞代谢表型变化;OPFRs通过上调下调了三羧酸循环过程中相关代谢物水平,明显干扰细胞三羧酸循环代谢通路,从而揭示了OPFRs在细胞代谢层面可能的毒性特征。(3)P450介导的生物转化:细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)酶代谢和生物转化典型磷系阻燃剂TPHP研究,利用HLM孵育体系中细胞色素同工酶降解TPHP实验,得到HLM对TPHP的降解动力学曲线,符合一级反应动力学方程,且实验检测到三种TPHP主要代谢产物,分别是S1(Mono hydroxylated metabolite)、S2(Di-hydroxylated metabolite)和DPP(Dipentyl phthalate)。通过细胞色素同工酶不同亚型抑制剂筛选研究,明确了CYP1A2和CYP2E1是降解TPHP的最主要P450亚型,比CYP2A6、CYP2C9和CYP2D6对降解TPHP的能力更强,而CYP2C19、CYP3A4对TPHP代谢没有催化活性。
关键词: 磷系阻燃剂 ；代谢组学 ；维甲酸受体 ；报告基因 ；生物转化
摘要： 随着溴系阻燃剂（Brominatedflameretardants,BFRs)在全球范围内逐步被禁用，有机磷酸醋阻燃剂（Organophosphorusflameretardants,OPFRs)作为一种新型的替代型阻燃剂的生产和应用随之大幅增加，环境负荷也随之增大。由于使用量的增加以及物理添加的形式可能会导致其在产品的生命周期中易通过挥发、磨损和浸出等方式泄漏到环境中，由此引发的环境污染问题引起人们的广泛关注。目前对于OPFRs的水环境生态毒性研究主要集中于水生动物，而OPFRs对水生植物的生态毒性研究却非常有限。微藻作为整个海洋生态系统的能量流动和物质循环的重要基础，是海洋食物链中海洋浮游动物和其他过滤生物的重要食物资源，也是化学污染物毒性生物测定的标准海洋生物。因此，本研究采用海洋硅藻三角褐指藻QPhaeodactylumtricornutum)作为受试生物，系统地研究三种不同取代基类型的OPFRs(磷酸三丁酯，TBP;磷酸三苯酯，TPhP;磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯，TDCPP)对海洋硅藻三角褐指藻的急性毒性效应，并从生物量、细胞形态、光合活性以及分子水平与一种典型的BFRs(2，2''，4，4''-四溴联苯醚，BDE-47)进行比较毒性的研究;其次，选取其中毒性最大的TBP，揭示其对三角褐指藻产生急性毒性的分子机制。主要研究结果如下： 1、通过细胞计数法测定四种污染物对三角褐指藻的ECm)值，初步评价毒性大小，结果显示四种污染物对三角褐指藻的毒性依次为：TBPgt;TPhPgt;TDCPPgt;BDE-47，表明三种OPFRs都是潜在的环境污染物。 2、从三角褐指藻细胞的超微结构、光合色素含量及叶绿素荧光参数开展比较毒性分析，探讨对微藻的急性毒性效应差异。电镜结果显示，三种OPFRs通过破坏线粒体、叶绿体以及其他细胞器的完整性来抑制微藻的生长及生理代谢，高浓度时，叶绿体受损严重，破坏程度与毒性强弱有关。进一步通过光合生理指标进行不同污染物间的毒性比较，发现：三种OPFRs(TBP、TPhP、TDCPP)在光合色素水平（叶绿素a、叶绿素c、类胡萝卜素）以及叶绿素荧光指数（Fv/Fm、qP、Yield、ETR)水平均表现出不同程度的响应，BDE-47胁迫诱导的变化较小，这与生长曲线的结果相一致。 3、通过RNA-seq技术探究了不同污染物暴露对三角褐指藻转录水平的影响，发现：相同浓度的TBP、TPhP处理组的三角褐指藻中，编码光合作用、叶绿素a和类固醇生物合成、类胡萝卜素生物合成以及光合生物中的碳固定等途径相关酶的mRNA呈现不同程度的下调趋势，且TBP抑制作用更为显著。相同浓度的TDCPP、BDE-47处理组的三角褐指藻中，编码光合作用、叶绿素a和类固醇生物合成以及光合生物中的碳固定等途径相关酶的mRNA呈现不同程度的下调趋势。而卟啉和叶绿素代谢、类胡萝卜素生物合成及碳代谢和卡尔文循环途径相关酶的mRNA下调不明显。转运蛋白将污染物转移以及细胞色素P450的解毒代谢功能可能是BDE-47没有引起藻细胞生长及光合生理指标显著变化的原因。 4、深入研究TBP暴露对三角褐指藻细胞的毒性效应，结果表明，TBP严重抑制三角褐指藻的生长，且呈明显的剂量-效应关系。电镜观察表明，24h的TBP暴露导致三角褐指藻形态发生扭曲，细胞膜破裂，高浓度组藻细胞线粒体受损严重。荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示，TBP可能通过诱导MMP的显著降低并引起三角褐指藻细胞发生凋亡。 5、利用RNA-seq技术研究不同浓度的TBP暴露下的三角褐指藻所涉及的代谢途径，结果表明三个处理组中苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成、真核生物中的核糖体生物发生、RNA转运等途径都是显著富集的通路。其中，低浓度(0.4mgL-1)的TBP处理组中氨酰tRNA合成通路中氨酰tRNA合成酶上调表达，由于其具有参与基因表达调控以及抑制细胞凋亡的功能，因此低浓度处理组的三角褐指藻细胞损伤程度较低。TBP诱导ROS过量产生，上调了三角褐指藻抗氧化、热激蛋白、细胞色素P450解毒途径以及外排转运蛋白基因表达，但当累积伤害超过防御机制的能力时，下调与线粒体能量代谢相关基因表达，最终触动凋亡机制。
关键词: 有机磷酸酯阻燃剂 ；毒性效应 ；三角褐指藻 ；急性毒性 ；氧化损伤 ；转录组
被引量
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摘要： 近年来,火灾的连续发生和蔓延,对人们的生命和财产安全造成了巨大的损失。有机磷系阻燃剂(organophosphate flame retardants,OPFRs)作为多溴联苯(polychorinated biphenyls,PCBs)、多溴联苯醚(poly brominated diphenyl ethers,PBDEs)的替代品,因具有极好的阻燃效果被普遍用到电子、纺织、家装原料、交通运输等行业中,在世界范围内的需求量和使用量大幅度的增加。磷酸三(2-丁氧基)乙酯(Tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBOEP)作为一种典型的有机磷阻燃剂正在被普遍的使用,而且呈现明显的上升趋势。近几年有研究发现,TBOEP具有神经、发育、内分泌干扰、生殖等生物毒性,但是这些研究大多停留在宏观个体水平,其潜在的微观分子机制的相关研究依然匮乏。本研究以成年斑马鱼为受试生物,探究了TBOEP对成年斑马鱼亚慢性暴露后的生殖毒性和内分泌干扰效应。在本研究中,成年的雌雄斑马鱼相互配对地暴露在浓度为0μg/L,5μg/L,50μg/L,500μg/L的TBOEP溶液中,暴露周期为21d。在暴露结束后,我们研究了TBOEP对成年斑马鱼生殖功能的影响,包括雌鱼的累积产卵量的变化,子代胚胎的成活率和孵化率,以及胚胎的卵径等暴露终点指标,并观察了斑马鱼性腺的病理组织学变化。我们还采用ELISA试剂盒检测了鱼体内性激素含量的变化,实时定量PCR(RT-PCR)检查了下丘脑-垂体-性腺-肝脏(Hypothalamic-pituitary-gonadal-liver,HPGL axis)上类固醇合成相关的基因的转录水平的变化。主要结果如下:1.在暴露结束后,TBOEP的暴露显著地降低了雌鱼的平均累积产卵量,在暴露最后一天子代胚胎的孵化率和成活率也显著性降低,同时,卵径也显著性地降低。2.性腺的病理组织学切片观测发现TBOEP暴露后,卵巢中不成熟的卵原细胞和卵黄前期卵母细胞的比例显著性升高,而成熟的卵黄期卵母细胞和排卵前期的卵母细胞比例显著性下降,表明TBOEP明显抑制了卵巢中卵母细胞的成熟;在雄鱼中,精巢中不成熟精母细胞比例显著性升高,成熟的精子细胞的比例显著性下降,表明TBOEP明显阻滞了雄鱼的精子成熟。3.雌鱼和雄鱼血清中雌二醇(E2)的浓度在500μg/L浓度组都显著性的升高,而只有雄鱼血清中的睾酮(T)的浓度在最高浓度组显著性的升高,此外,雌鱼体内的T/E2比值在最高浓度组显著性下降,雄鱼的T/E2比值在最高浓度组显著性升高。4.RT-PCR结果显示,雌鱼和雄鱼HPGL轴上类固醇合成相关的基因在转录水平都受到了显著地影响。其中,雌鱼和雄鱼脑中的基因大多数显著性下调,只有cyp19b在雌鱼和雄鱼脑中都显著性的上调;雌鱼和雄鱼性腺中的基因大多数显著性上调,只有cyp19a在雄鱼性腺中显著性下调;雌鱼肝脏中的基因都显著性的上调。这些结果表明TBOEP可以通过干扰斑马鱼HPGL轴破坏体内的激素平衡,影响卵泡和精子的发育成熟,最终影响生殖功能和后代的发育,具有明显的生殖毒性和内分泌干扰效应。
关键词: 生殖损伤 ；内分泌干扰 ；磷酸三(2-丁氧基)乙酯 ；斑马鱼 ；有机磷阻燃剂
摘要： 随着世界范围内溴代阻燃剂的广泛禁用,有机磷酸酯类阻燃剂的使用量大幅增加,这些阻燃剂作为添加剂加入到人类生产生活各种产品中,经过渗透、磨损逐渐渗入到周围环境中,对人类和野生动物产生危害。科学家们对有机磷酸酯类阻燃剂进行调查研究,在水、土壤、鱼类、鸟类体内检测到了各种浓度范围的有机磷酸酯类阻燃剂,且发现其具有内分泌和甲状腺毒性,但对其神经毒性及其机制的研究尚少。本课题选取磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tris(2,3-dichloropropyl)phosphate,TDCPP)和三(2-羧乙基)磷(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)两种典型有机磷酸酯类阻燃剂为研究材料,以PC12神经元细胞为模型,开展了TDCPP和TCEP的神经毒性研究,并初步探索其可能的神经毒性作用生物分子机制。以NGF刺激分化的PC12细胞为体外培养神经细胞模型,选用暴露浓度为0-75μM的TDCPP和0-400μM的TCEP,分别对PC12细胞进行0-6天的染毒处理。采用倒置显微镜对细胞形态进行观察,利用MTT法对细胞生存率进行测定,运用流式细胞仪对细胞凋亡和细胞内Ca2+改变进行荧光检测;采用Western-Blotting(WB)技术对PC12细胞神经生长相关的关键蛋白(如Ca MK2、GAP43、tubulin、NF-H),以及MAPK信号通路蛋白及其磷酸化水平进行检测和分析。并采用Ca MK2蛋白抑制剂KN93抑制Ca MK2活化后检测MAPK通路磷酸化水平的改变,以期进一步揭示MAPK通路与Ca MK2蛋白磷酸化之间的关系。研究分为三个部分,培养细胞分组及主要研究结果如下:一、TDCPP/TCEP染毒PC12细胞导致其神经毒性检测TDCPP暴露下PC12细胞生存率剂量效应的细胞分组为:正常对照组、TDCPP染毒1μM、5μM、15μM、20μM、25μM、50μM、75μM组共8组,染毒6天;检测TCEP暴露下PC12细胞生存率剂量效应的细胞分组为:正常对照组、TCEP染毒15μM、20μM、40μM、80μM、150μM、200μM、400μM组共8组,染毒6天;为检测染毒后生存率时间效应,染毒浓度为50μM TDCPP,细胞分别持续染毒0-6天,各持续染毒时间段均设有正常对照组,且每组设6复孔。实验中对各组细胞实时观察并拍照记录。检测TDCPP染毒后细胞凋亡率的实验细胞分组为0μM、5μM、15μM、25μM、50μM TDCPP染毒组,染毒时间为持续染毒3天和持续染毒6天,每组设3复孔。显微镜观察结果显示在TDCPP或TCEP染毒作用下,PC12神经细胞的形态均发生改变,神经突触长度变短数量减少,神经细胞间的神经丝连接减少、形成的神经结节也减少,神经细胞变圆变小,生存数量减少;不同染毒浓度的TDCPP/TCEP暴露下,PC12细胞生存率均减少,存在剂量效应关系;不同染毒持续时间的TDCPP暴露下,PC12细胞生存率亦减少,存在时间效应关系;不同浓度和不同染毒时间TDCPP暴露下,PC12细胞凋亡率呈现增多的趋势,且同样存在时间和剂量效应。这些结果均提示了TDCPP/TCEP对PC12细胞具有神经毒性,且表现在发育毒性和细胞毒性两个方面。二、TDCPP/TCEP导致PC12细胞神经毒性的生物标志物实验用PC12细胞以1×105细胞密度接种至6孔培养板中,隔天对细胞进行换液,培养液含终浓度为20μg/L的NGF以刺激分化PC12细胞。培养至细胞铺率达70%后对细胞进行染毒换液。细胞分组为正常对照组、溶剂对照组、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM组;或正常对照组、溶剂对照组、TCEP 40μM、80μM、150μM、200μM组,每组3个复孔,2-3天换一次液,持续染毒6天。分别对各组PC12细胞进行收集,提取蛋白后采用WB技术检测目标蛋白。结果显示OPFRs影响PC12细胞内调节蛋白Ca MK2、GAP43的翻译水平,TDCPP使其表达量相比正常细胞降低约20%-40%,且与TDCPP染毒存在剂量效应关系;TCEP使GAP43表达量相比正常细胞降低约50%,而CAMK2的表达水平呈现增长的趋势。另外,PC12细胞内骨架蛋白tubulin、NF-H的翻译水平在TDCPP作用下最大降幅约为30%,且同样与TDCPP染毒存在剂量效应关系;而TCEP作用下骨架蛋白tubulin翻译水平同样降低约20%-30%,NF-H翻译水平却呈现增多的趋势,最多相比正常组增加约1倍。所以,在OPFRs作用下神经生长相关蛋白翻译水平的改变,可引起神经细胞生长发育受损,损伤神经细胞PC12的正常形态,阻碍其发挥正常功能,从而引起PC12细胞神经毒性,而以上几类与神经相关目标蛋白,可能成为其神经毒性效应主要的生物标志物。三、TDCPP导致PC12细胞神经毒性的可能分子生物机制流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度水平的改变细胞分组为正常对照组、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM组,每组3个复孔,2-3天换一次液,分别持续染毒1-6天;WB检测Ca MK2、MAPK通路蛋白及其磷酸化水平的改变细胞分组为:①持续染毒4天,组别为正常对照组、TDCPP 5μM、15μM、25μM、50μM组,以探究其蛋白磷酸化水平改变与TDCPP染毒的剂量效应关系;②以50μM TDCPP染毒,分别持续染毒1-6天,以探究其蛋白磷酸化水平改变与TDCPP染毒的时间效应关系。为确定Ca MK2与MAPK通路之间关系实验细胞分组为正常对照组、正常对照+KN93处理组、25μM TDCPP染毒组、25μM TDCPP+KN93处理组、50μM TDCPP染毒组、50μM TDCPP+KN93处理组。KN93抑制剂使用浓度为10μM,前处理时间为1小时,实验细胞连续染毒时间为6天。实验结果显示在TDCPP的作用下,PC12细胞内Ca2+稳态受到破坏,随着染毒剂量增加呈现细胞内Ca2+浓度水平增多的剂量效应关系,且随着染毒时间的延长细胞内Ca2+浓度水平同样呈现增多的趋势。Ca MK2和MAPK通路蛋白磷酸化水平增加,其中Ca MK2的磷酸化呈现明显的时间和剂量效应;JNK和p38蛋白磷酸化水平增多表现相似的变化趋势,存在明显的剂量效应;Erk1/2蛋白磷酸化水平增多则存在明显的时间效应。另外TDCPP染毒的PC12细胞中,MAPK通路磷酸化水平增多可以被Ca MK2磷酸化抑制剂部分抑制,提示了MAPK信号通路与Ca MK2蛋白之间存在相互作用关系,暴露于TDCPP下的PC12细胞内MAPK信号通路部分被直接激活,部分由Ca MK2的磷酸化引起。由此,第二信使Ca2+、关键蛋白Ca MK2和MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平的改变,可能成为典型有机磷酸酯类阻燃剂TDCPP暴露所致PC12细胞产生神经毒性效应的生物分子作用机制。综上,可得出如下结论:TDCPP/TCEP可引起PC12细胞神经毒性,调节蛋白Ca MK2、GAP43和骨架蛋白tubulin、NF-H可能成为其重要的生物标志物,而信号通路参与调节其神经毒性,细胞内Ca2+浓度水平增多、Ca MK2磷酸化、MAPK信号通路激活可能成为TDCPP引起PC12细胞神经毒性的生物分子机制。本课题实验研究结果将丰富以TDCPP/TCEP为典型有机磷酸酯类阻燃剂的神经毒性的基础理论知识,并为OPFRs所致神经毒性评价提供了基础数据支持。
关键词: 有机磷酸酯类阻燃剂 ；PC12细胞 ；钙依赖性钙调蛋白激酶2 ；促分裂原活化蛋白激酶
被引量
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摘要： 细胞色素P450酶催化转化是多数外源化合物在生物体内代谢消除的重要途径。P450酶代谢转化能够起到解毒作用,使污染物极性增强,促进其排泄过程;然而,反应过程的中间体或产物可能易与生物大分子(如蛋白质、核酸)结合产生毒性增强效应。因此,研究P450酶的代谢反应机制对评价有机污染物的生物转化归趋、毒理效应和健康风险具有重要意义。基于活体动物和试管实验等传统方法探究P450酶代谢转化过程面临动物伦理、耗时费力、依赖设备、化学标准品缺乏等困境,难以捕捉和定性高活性反应中间物种,难以满足数量巨大且不断增长的有机化学品生态风险评价的客观需求。因此,有必要发展外源化合物的P450酶代谢转化路径和产物的预测方法。随着量子化学理论方法的快速发展以及计算机性能的高速提升,计算模拟已成为解决上述问题的重要手段,在预测有机物的理化性质、环境转化路径和产物分布、动力学等方面具有优势。已有P450酶催化反应机制的研究主要集中于常规化学底物(如烷烃、苯等)、内源激素、药物分子等。相比之下,种类众多且结构各异(烷基、芳基、卤代)的环境有机污染物的P450酶代谢转化机制仍有待揭示。本研究采用计算模拟方法,考察了 P450酶活性中心(Compound Ⅰ)催化典型阻燃剂和多环芳烃类污染物的代谢转化机制,揭示了 Compound Ⅰ催化转化多溴联苯醚(PBDEs)生成二羟基化(di-HO-PBDEs)和多溴二苯并二噁英(PBDD)产物的分子机制,预测了典型有机磷系阻燃剂(OPFRs)被Compound Ⅰ代谢转化的路径和产物,阐明了多环芳烃(PAHs)被Compound Ⅰ代谢活化反应特征及其与P450酶的结合模式,具体研究内容和结论如下:(1)采用量子化学密度泛函理论(DFT)计算,以2,2',4,4'-四溴联苯醚(BDE-47)为模型化合物研究了 PBDEs被Compound Ⅰ催化转化的机制,发现PBDEs首先被Compound Ⅰ氧化产生羟基化产物(HO-PBDEs)。苯环碳原子π加成是反应的限速步骤,PBDEs未取代碳原子是优势反应位点,且低溴代PBDEs更容易反应。与PBDEs羟基化机制不同,di-HO-PBDEs需要以HO-PBDEs为先导底物,通过Compound Ⅰ催化的HO-PBDEs酚羟基摘氢和羟基反弹机制生成。二羟基化过程不涉及环氧化物中间体,解释了环氧化物水解酶对反应结果无影响的实验现象。计算发现仅有异环di-HO-PBDEs(OH连接醚键邻位和间位碳原子)能进一步代谢成PBDD:di-HO-PBDEs与Compound Ⅰ发生酚羟基摘氢反应,生成的二酮中间体经芳基双自由基偶联机制生成HO-PBDD。产物结构已被PBDEs大鼠肝微粒体代谢实验证实。(2)基于DFT计算和分子对接方法,以磷酸三苯酯(TPHP)、三(2-丁氧乙基)磷酸酯(TBOEP)和三(1,3-二氯-2-异丙基)磷酸酯(TDCIPP)为模型化合物,预测了 OPFRs被Compound Ⅰ代谢转化的机制。发现TPHP发生苯环羟基化,TBOEP和TDCIPP发生烷烃羟基化。OPFRs的代谢反应活性具有结构依赖性,反应由易到难的次序为:烷基取代(TBOEP)>芳基取代(TPHP)>氯烷基取代(TDCIPP)。TPHP苯环羟基化产物与TBOEP/TDCIPP烷烃羟基化产物的二次代谢反应机制各有差异,预测的主要产物与他人试管实验的结果相符。揭示了 TPHP经质子穿梭形成para-HO-TPHP及OPFRs经O-脱烷基/芳基反应生成相应的二酯类产物(DPHP,BBOEP,BDCIPP)的新机制。还发现磷酸二酯类产物的进一步代谢过程受到分子解离形态的影响,离子化使得DPHP和BDCIPP反应活性增强,但显著降低BBOEP的反应活性。(3)基于DFT计算和分子对接方法,研究了 Compound Ⅰ催化16种美国环保局优先控制PAHs的代谢反应,并考察了人CYP1A2酶与PAHs的结合过程。发现Compound I与16种PAHs芳烃碳原子的π加成反应具有位点选择性。在五种可能产物(环氧化物、四面体加和物、环己烯酮、N-质子化中间体和羟基化产物)中,环氧化物是主要的中间产物。发现6种致癌性PAHs(窟、茚并[1,2,3-c,d]芘、苯并(g,h,i)芘、二苯并(a,b)蒽、苯并(a)芘和苯并(a)蒽)K区碳原子与Compound Ⅰ的π加成反应能垒和显著小于其他区域,容易生成K区环氧化物,与前人代谢实验结果一致。分子对接计算发现PAHs与CYP1A2的结合作用主要取决于PAHs的环数目和疏水性(Kow)。6种致癌性PAHs的M区原子与CYP 1A2活性中心距离最近,阐明了双区理论中M区最容易被代谢的原因。
关键词: 计算毒理学 ；细胞色素P450酶 ；多溴联苯醚 ；有机磷系阻燃剂 ；多环芳烃
被引量
5
摘要： 多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs),作为一种添加型溴代阻燃剂,由于其优良的阻燃性能,多年来被广泛应用于多种商业产品中,如家具、塑料、油漆、纺织品、电子产品等。这类物质在生产、使用和处理过程中极易释放进入环境,对生态安全和人体健康构成潜在的威胁。羟基化多溴联苯醚(Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers, HO-PBDEs)和甲氧基化多溴联苯醚(Methoxylated polybrominated diphenyl ethers, MeO-PBDEs)是两类PBDEs的衍生物,近年来也在各种环境介质中被大量检出,目前它们的来源尚没有形成统一认识。
本论文以PBDEs、HO-PBDEs和MeO-PBDEs为目标化合物,致力于解决如下问题：首先,长三角地区是我国最大的经济圈,它受PBDEs及其衍生物污染状况如何,不同水域内PBDEs及其衍生物又具有怎样的污染特征?其次,目前关于PBDEs及其衍生物的毒性研究往往集中一种或者几种毒性终点指标,如果从整个生物体的角度来进行评价,其致毒机理又如何?另外,PBDEs衍生物与二嗯英物质结构的相似性,它是否也具有芳烃受体(Aryl hydrocarbon receptor, AhR)活性,能否对人体健康造成危害?
基于以上内容,我们开展工作,研究结果概括如下：
1)对海洋(黄海)和内陆河湖(长江和太湖)两种典型水生生物样品内13种PBDEs和34种PBDEs衍生物进行定量分析。结果显示,黄海生物样品内∑PBDEs浓度(浓度范围：1.8至2.3×101ng/g脂重,均值：11.8ng/g脂重)比长江鱼体内∑PBDEs浓度(1.8至1.4×102ng/g脂重,均值：67.8ng/g脂重)低5.76倍,这一结果表明长江内生物受PBDEs的污染程度高于海洋生物。另外,本研究仅在海洋生物样品和长江刀鱼(洄游鱼类)体内检出有PBDEs衍生物,长江刀鱼是一种长期生活在长江入海口的洄游鱼类,会季节性地从黄海洄游至长江产卵,这一结果支持"MeO-PBDEs和HO-PBDEs主要由海洋生物产生”的报道。对2009-2012年间太湖梅梁湾湖区三种底栖生物样品(太湖白虾、鲤鱼和昂刺鱼)PBDEs浓度进行分析,结果显示太湖水体生物样品内∑PBDEs浓度在0.87-195.17ng/g脂重之间,中位数和均值分别为26.07ng/g脂重和38.61ng/g脂重；三种生物相比较,白虾体内∑PBDEs浓度最低,其浓度范围为6.26-49.11ng/g脂重(均值：18.48ng/g脂重),鲤鱼次之,其浓度范围为0.87-39.56ng/g脂重(均值：21.12ng/g脂重),昂刺鱼最高,其浓度范围为22.79-195.17ng/g脂重(均值：76.23ng/g脂重)；不同年份生物样品内∑PBDEs浓度无显著性差异。与其他国家和地区相比较,长三角地区水生生物PBDEs浓度处于较低水平,PBDEs衍生物浓度则与其他国家和地区相当。
2)建立了涵盖大肠杆菌体内大部分基因组的活细胞芯片技术,并比较了PBDEs及其衍生物的生物毒性,揭示了其分子致毒机制。首先,采用大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)对34种PBDEs衍生物的细胞毒性进行评估,结果显示HO-PBDEs在一定浓度下会对大肠杆菌的生长产生抑制作用。综合考虑化合物的细胞毒性数据、环境检出率以及化合物间结构差异,选择了3种典型化合物(BDE-47、6-HO-BDE-47和6-MeO-BDE-47),采用包含1800多个绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)修饰启动子的E. coli K12菌株,对其分子致毒机制进行评价。三种化合物中6-HO-BDE-47在一定浓度下可以抑制大肠杆菌生长,其半效应浓度(Median lethal concentration, LC50)为22.52±2.20mg/L。观察细胞毒性最大的6-HO-BDE-47暴露于大肠杆菌4h后的基因表达情况,发现分别有65(异常表达倍数大于2)和129(异常表达倍数大于1.5)个基因有异常表达,并求算6-HO-BDE-47的转录终点指标,无观察效应转录浓度(Noobserved transcriptional effect concentration, NOTEC)和半转录效应浓度(Median transcriptional effect concentration, TEC50),分别为0.0438和0.580mg/L,较传统的毒性终点指标LC50分别敏感514倍和39倍。通过KEGG数据库分析,6-HO-BDE-47主要通过代谢通路、磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶和酰胺-tRNA来干扰大肠杆菌正常生命活性。将受6-HO-BDE-47暴露异常表达的基因分别暴露于不同浓度的6-MeO-BDE-47和BDE-47后,绝大部分基因没有出现异常表达现象,可见三种物质对大肠杆菌的致毒机制不同。
3)采用稳定转染萤火虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的大鼠肝癌细胞(H4IIE-luc)对PBDEs衍生物的芳烃受体活性进行研究,并对其基于芳烃受体活性的潜在健康风险进行了评估。所测试的34种PBDEs衍生物中,有19种能激活芳烃受体,最大响应值的百分比(以2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)为阳性参照)在5.0%-101.8%之间,相对效力因子(Respective2,3,7,8-TCDD potency factors, RePH4IIE-luc)在7.35×10-12-4.00×104之间,有些化合物的毒性当量因子甚至与单邻位取代PCBs相当(TEFWHO＝3×10-5)。相同取代位HO-PBDEs所能诱导芳烃受体活性高于MeO-PBDEs,可见HO-官能团可以诱导更大的芳烃受体活性。同时,本研究根据野外鱼样体内PBDEs衍生物的浓度和每种物质对应的RePH4IIE-luc值计算了每一种生物样品的毒性当量值(TCDD equivalents, PBDEs analoguesTEQH4IIE-luc)结果显示,仅考虑PBDEs衍生物的芳烃受体活性,本研究中所涉及鱼样的analoguesTEQH4IIE-luc均低于欧盟和美国环保局所指定的标准,风险熵值低于0.005,PBDEs衍生物在目前浓度水平下不会对人体健康构成威胁,但考虑这类物质可以随食物链在人体内蓄积,其潜在健康风险仍需进一步研究。
关键词: 三重四级杆质谱 ；大肠杆菌 ；毒理基因组学 ；二噁英活性
被引量
12
摘要： 卤代有机污染物(OHPs)是一类化学结构中含有卤原子的有机污染物,大多数OHPs都具有持久性、生物富集性和毒性、以及长距离迁移性等持久性有机污染物(POPs)属性,是环境研究领域最为关注的环境污染物之一。一些OHPs,如多氯联苯(PCBs)和某些多溴联苯醚(PBDEs),已先后被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》(也称POPs公约)的控制名录中。现有关于OHPs生物富集和生物转化的研究大多以水生生物为主,对OHPs在陆生生物中的富集转化机制和影响因素的认识极其匮乏,且很少研究探讨不同生理过程中的生物富集规律、以及不同化合物的生物转化机理。本论文以国际环境界高度关注的多种OHPs化合物为目标污染物,它们涵盖了已列入POPs公约的PCBs和PBDEs,作为PBDEs替代品的德克隆(DP)、1,2-双(2,4,6-三溴苯氧基)乙烷(BTBPE)和十溴二苯乙烷(DBDPE),以及目前仍被工业界广泛使用的六溴环十二烷(HBCD)、2-乙基己基-四溴苯甲酸(TBB)、2,3,4,5-四溴-苯二羧酸双(2-乙基己基)酯(TBPH)和磷系阻燃剂(PFRs)等,以电子垃圾拆解区自然生长的鸡和小鸡胚胎作为研究对象,在调查电子垃圾拆解区域污染状况的基础上,深入探讨了OHPs从环境介质向鸡体内的富集、消化道吸收和组织分配等多个生理过程中的迁移和转化;系统研究了OHPs从母体到鸡蛋的传递特征、在鸡胚胎发育过程中的变化、以及在鸡胚胎器官形成时的分配行为。通过上述研究,我们发现肝脏的生物转化作用可能对OHPs的富集模式产生多方面的影响,因此,本论文还初步开展了BDE 47、BDE 99和HBCD的肝微粒体代谢研究,探索OHPs的肝脏代谢机理。主要的研究结果如下:本研究中电子垃圾拆解区的室内灰尘和鸡蛋中的各种OHPs浓度和人体外暴露评估值都处于国内外报道值的较高范围。灰尘中PBDEs、BTBPE、DBDPE、DP、HBCD、TBB、TBPH、PFRs的浓度分别为685-63300、28-3870、1160-45400、103-3460、22-1660、7.5-311、49-7120、2180-33100 ng/g。鸡蛋中PBDEs、BTBPE、DBDPE、DP、HBCD、TBB、TBPH、PFRs的浓度分别为230-1280、nd-263、0.54-22、68-741、34-318 ng/g lw和nd-0.062、nd-0.46、1.39-2.15ng/g ww。其中BDE 209、DBDPE、DP、磷酸三苯酯(TPh P)和磷酸三氯丙基酯(TCPP)是最主要的污染物。不同地区样品的OHPs组成有差异,反映不同拆解区电子垃圾的拆解强度和拆解类型的不同。当地居民对PCBs、PBDEs和DP的外暴露主要通过食用鸡蛋,而对DBDPE和PFRs的暴露途径主要是摄入室内灰尘。表土是鸡体内OHPs的主要来源,表土贡献了鸡的胃食糜中78%的PCBs和90%以上的其他OHPs。在鸡进食后,低卤代化合物能更有效地被消化道吸收,BDE 209、DP、DBDPE等高log KOW和高分子量化合物的浓度从胃食糜到肠消化物到粪便一直升高(如DBDPE:胃食糜22 ng/g dw;肠消化物131 ng/g dw;粪便252 ng/g dw)。OHPs在血清、脂肪和脑组织中的富集模式不同于其他组织,如血清中的DP浓度(371 ng/g lw)显著性高于肝脏、脂肪、胃和性腺四种组织(17.4-96 ng/g lw);脂肪中的PBDEs浓度(157 ng/g lw)显著低于肝脏、肌肉和心脏组织(1240-1660 ng/g lw)。可能是因为OHPs在进入鸡体内后,会在大多数血液灌注充足的组织中迅速达到平衡分布,其浓度和组成都很相似,而OHPs到达脂肪的速度较慢,且会在脂肪中持续富集。由于血脑屏障的作用,只有BDE 47和一些PCBs单体能较为容易地穿透屏障,在脑组织中被频繁检出。OHPs的子代传递过程中,污染物的血液运输、在卵黄中的沉积和蛋清包裹等过程对鸡蛋中OHPs的组成模式没有显著影响,OHPs在鸡蛋中也不发生降解。比较OHPs在母体不同组织和鸡蛋之间不同的分布模式后,发现污染物(PCBs和HBCD)的手性特征能更好地解释子代传递模式,即污染物可能大部分都来源于鸡的脂肪,在脂肪的分解代谢和肝脏中卵黄蛋白的合成过程中,污染物只是简单的传输过程,鸡体内脂肪的OHPs模式能更好地反映其子代的OHPs初始污染。在胚胎发育过程中,OHPs的浓度、组成和手性的改变发生在孵化的最后7天,DBDPE比其他化合物更加持久(雏鸡肌肉和肝脏中保留了胚胎中1.5%-3%的PCBs、PBDEs、HBCD,9%-14%的DP和BTBPE,48.6%的DBDPE),可能是因为DBDPE难以被代谢。另外,PCBs和HBCD的手性变化说明雏鸡对于这些化合物的生物转化的手性选择性与成鸡并不相同。雏鸡的肝脏比肌肉更倾向于富集高log KOW值的污染物。鸡和猫体内的细胞色素P450酶可以催化代谢BDE 47、BDE 99和三种HBCD同分异构体并生成羟基代谢产物,BDE 47被鸡和猫肝微粒体代谢生成的主要产物分别是NIH位取代的4'-OH-BDE 49(17 pmol,占代谢产物总量的40%)和间位取代的5-OH-BDE 47(534 pmol,占代谢产物总量的68%),但BDE 99的代谢产物浓度低于检测限;HBCD的代谢产物是羟基化和脱溴还原联合作用的结果,没有单一的脱溴产物,同时也未观察到HBCD同分异构体的转化和对映异构体的转化现象。PBDEs和HBCD在生物体内的代谢机理和种间差异仍需要更进一步的研究。
关键词: 卤代有机污染物 ；消化道吸收 ；组织分配 ；子代传递 ；胚胎发育 ；体外代谢
被引量
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摘要： 随着世界科技的革新和材料科学的发展，越来越多的新型化合物被合成并应用到人们的日常生活当中，这些材料在为人们生活带来便利的同时也对对环境造成了不同程度的危害。以往的毒理学研究中，人们大多关注环境污染物或药物对成体细胞的影响，然而近年来的研究显示，细胞发育的过程往往比成体细胞更为敏感，因此对发育毒性的研究应当受到重视。 本文首先以持久性有机污染物F-53B和PFOS为例，借助干细胞毒理学研究系统，结合转录组分析技术对二者的发育毒性进行了较为详细地研究。PFOS在2009年已被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》。F-53B作为PFOS的替代物，广泛应用于电镀工业中，用来抑制剧毒酸雾的产生。但由于毒性不明确，其生产和使用并未被限制。目前已经有一些研究显示F-53B和PFOS暴露会对神经和心脏的发育造成不良影响，但证据较为匮乏。 使用小鼠拟胚体分化模型，研究了F-53B和PFOS对胚胎早期发育过程的影响。实验结果显示，非致死浓度的F-53B和PFOS处理会干扰外胚层标志基因Fgf5、Krt14、中胚层标志基因T、Mesp1和内胚层标志基因Sox17的表达，暗示F-53B和PFOS对于胚胎发育早期的各种过程均有影响。 F-53B和PFOS处理能够抑制拟胚体分化过程中外胚层的分化，而外胚层可以分化出神经系统，因此使用小鼠胚胎干细胞单层神经分化模型进一步研究了F-53B和PFOS是否可以影响神经分化。发现在神经外胚层分化过程中，F-53B和PFOS处理会抑制神经外胚层标志基因Sox1、Sox3、神经前体标志基因Nestin、Pax6以及神经突标志基因Map2的表达。另外，处理组中MAP2蛋白的表达水平以及MAP2阳性细胞也减少，说明F-53B和PFOS会靶向影响神经分化过程。 随后，我们按照胚胎发育过程中脏器出现的先后顺序进行器官毒性研究，心脏作为最先出现的器官，需要重点关注。以人胚胎干细胞心脏分化系统为例研究了F-53B和PFOS对中胚层的影响。通过对细胞形态的观察、荧光定量PCR和免疫染色实验，发现F-53B和PFOS处理在不导致细胞死亡的情况下会降低TNNT2和NKX2.5等心肌相关标志基因的表达，造成TNNT2和NKX2.5阳性细胞的减少，还会导致心脏分化末期出现一种“鹅卵石”状的细胞。借助转录组测序技术和免疫荧光染色实验，成功鉴别了“鹅卵石”状细胞的类型是WT1阳性的心外膜细胞。随后对F-53B和PFOS的心脏发育毒性进行数据挖掘，发现F-53B和PFOS均会影响WNT、IGF、BMP和FGF通路相关基因，并且F-53B和PFOS的心脏发育毒性可能部分源于二者对WNT通路的过度激活。 对心脏发育毒性的研究显示，转录组测序技术在干细胞毒理学研究中能够提供大量的毒性效应和毒性机制相关信息。更进一步地，我们对其他典型环境污染物的转录组数据进行了深度挖掘。期待从中发掘各种不同类别环境污染物的毒性效应和分子机制，并从中总结出规律，为接下来的研究提供线索。 在对内分泌干扰物类环境污染物的研究中，卤代阻燃剂类化合物肝脏毒性测序数据的挖掘显示，三种化合物对肝脏分化基因表达的影响:TCBPA＞TBBPS＞TBBPA。限定性内胚层阶段，三种化合物均影响FZD10、FOXB1、IGSF10和NPTX1的表达，暗示限定性内胚层分化被干扰，并且与中内胚层发育相关的WNT通路也被干扰。肝母细胞阶段，三种化合物处理均抑制肝脏代谢相关基因，说明肝脏分化被抑制，并且TCBPA下调的基因还包括PPAR通路相关靶基因和RXRG受体，暗示TCBPA可能在肝母细胞阶段影响了PPAR通路从而影响了肝脏分化。 对卤代阻燃剂的神经外胚层发育毒性的数据挖掘结果显示，神经外胚层分化过程中五种卤代阻燃剂影响的基因数目:TBBPS＞TCBPA＞BDE-209＞TBBPA＞BDE-47，其中TBBPS和TCBPA均能显著抑制前脑和中脑发育相关基因的表达，BDE-209会抑制中脑发育相关基因的表达，说明上述三种化合物都具有抑制神经分化的作用。TBBPS处理还会抑制LEFTY1、WLS、WNT8B、NODAL和HES3等发育相基因的表达，暗示如果分化实验继续进行，可能能够观察到更明显的神经毒性效应。 对双酚类化合物胚胎发育毒性数据的挖掘显示，三种双酚类化合物影响的基因数目:BPS＞BPF＞BPA。在分化的早期，双酚类化合物显著促进中胚层标志基因T、中胚分化相关基因Shh和Hox家族基因的表达，同时抑制神经前体标志基因Pax6的表达，说明三种双酚类化合物异常促进中胚分化，同时抑制神经分化。分化后期双酚类化合物处理会促进心脏标志基因Tnnt2、Myh6、平滑肌标志基因Tagln、Cnn2和胞外基质相关胶原蛋白基因的表达，暗示心脏和平滑肌分化被促进。有趣的现象是双酚类化合物处理倾向于激活拟胚体分化过程中基因的表达，虽然抑制的基因数目很少，但仍显示出双酚类化合物的致毒机制与其他环境污染物不同。 综上所述，本文利用胚胎干细胞毒理学模型研究并证实了F-53B和PFOS的胚胎发育毒性、神经发育毒性和心脏发育毒性。借助转录组测序技术重点研究了F-53B和PFOS对心脏发育的毒性效应和致毒机制，发现F-53B和PFOS处理会干扰心脏发育中不同细胞类群的比例，促使一部分细胞分化成心外膜细胞，而这种影响部分是由于F-53B和PFOS干扰了WNT信号通路造成的。随后对多种典型环境污染物的数据进行挖掘，验证了在不同分化过程中卤代阻燃剂和双酚类化合物处理产生的发育毒性效应，并且在分析结果中发现了许多关键信号通路相关分子，为进一步揭示上述化合物的致毒机制提供了线索。
关键词: 环境污染物 ；胚胎干细胞 ；神经发育毒性 ；心脏发育毒性