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摘要： 目的研究利托那韦(ritonavir)对人类T细胞白血病病毒1型(human T-cell leukemia virus type-1,HTLV-1)病毒侵染及成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)细胞恶性增殖抑制作用,并探讨其分子机制。方法采用CCK-8和克隆形成实验检测ritonavir对多种ATL细胞增殖的影响;流式细胞术、双荧光素酶报告基因技术、实时定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot检测ritonavir对HTLV-1病毒侵染的影响;流式细胞术检测ritonavir对ATL细胞周期和凋亡的影响。结果Ritonavir能够抑制4种ATL细胞株的增殖及HTLV-1阳性细胞株的克隆性增殖,前者具有明显的量效关系,且对HTLV-1阳性细胞株的抑制作用更明显(P<0.05)。阳性细胞株与JETWT35细胞共培养后立即加入ritonavir,药物可明显下调后者红色荧光蛋白的表达,抑制HTLV-1病毒侵染到受体细胞(P<0.01)。阳性细胞株和Jurkat细胞共培养体系中立即加入ritonavir后,受体细胞中HTLV-1相关病毒基因Tax等mRNA水平均有抑制作用(P<0.01),而12 h病毒侵染完成后再加入ritonavir,则无这些明显影响。Ritonavir剂量依赖性地抑制阳性细胞株ATL-T细胞表面HTLV-1包膜蛋白亚基gp46的表达,从而抑制HTLV-1病毒的产生和侵染(P<0.01)。Ritonavir将细胞阻滞于G1期,并促进细胞凋亡,且HTLV-1阳性细胞株的凋亡率显著高于阴性细胞株(P<0.05或P<0.01)。结论Ritonavir通过降低WT-Luc病毒启动子活力,下调HTLV-1相关病毒基因(Tax、HBZ、Gag、Pol和Env)表达,以及减少阳性细胞表面HTLV-1包膜蛋白亚基gp46表达从而抑制HTLV-1病毒的产生及侵染,并将细胞阻滞于G1期,诱导其凋亡,从多环节有效抑制ATL细胞增殖。
关键词: 利托那韦 ；人类T细胞白血病病毒1型 ；病毒侵染 ；增殖 ；成人T细胞白血病
摘要： 成人T细胞白血病(adultT-cell leukemia,ATL)是一种恶性淋巴系增殖性疾病,是由人类T淋巴细胞白血病病毒1型(human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)感染所致。HTLV-1病毒编码一系列调节基因Tax、Rex、p12、p21和HBZ等。Tax,HBZ等病毒蛋白能调控生物体内多条信号通路,如NF-xB,AP-1,TGF-p/Smad等。NF-κB信号通路的激活在病毒致癌过程中扮演非常重要的角色,它能促进ATL细胞的恶性增殖,诱导ATL的发生。然而,HTLV-1激活NF-κB信号通路的分子机制任未完全阐明。Hippo信号通路最初发现于果蝇体内,在哺乳动物中Hippo信号通路主要调控器官发育和再生。此外,该信号通路通过负调节下游效应元件YAP,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。Hippo通路关键蛋白YAP是一种致癌因子,它与肿瘤的恶性增殖,不良预后存在密切关系。研究发现YAP在多种肿瘤中存在高表达。目前ATL细胞中YAP蛋白的功能尚未有研究。因此本课题主要分析了 Hippo通路关键蛋白YAP在调控白血病细胞恶性增殖中的作用,并探究其分子机制。主要研究内容如下:第一部分:YAP在ATL细胞株中存在高表达研究YAP在ATL细胞中的表达情况,我们通过RT-PCR及Western bolt技术检测了 YAP的mRNA水平和蛋白水平。结果显示,相比于对照细胞株(MOTL-4、Hut78、Jurkat),YAP基因在 ATL 细胞株(ATL-T、ATL-2、MT-1、MT-2、MT-4、TL-Oml)中均呈现不同程度的高表达,同样Western bolt结果表明YAP蛋白在ATL细胞株中也存在高表达。第二部分:YAP促进ATL细胞恶性增殖研究YAP是否具有调控ATL细胞恶性增殖的作用,我们首先利用慢病毒介导的RNA干扰技术,沉默ATL-T和ATL-2细胞中YAP基因的表达,并筛选得到YAP沉默稳定株。随后,我们运用MTT实验、平板克隆形成实验和流式细胞术检测YAP沉默后对细胞增殖与凋亡的影响。结果显示,当YAP沉默后,ATL-T及ATL-2细胞的增殖能力显著下降,同时细胞凋亡率明显提高。为了证实上述结果,我们利用了YAP特异性抑制剂Verteporfin。结果显示在YAP抑制剂处理后,ATL-T及ATL-2的增殖能力同样受到明显的抑制。上述结果表明YAP能促进ATL细胞的恶性增殖,抑制细胞凋亡。第三部分:Tax通过NF-κB信号通路从而激活YAP的功能探究HTLV-1对YAP蛋白的调控作用及其分子机制,我们运用双荧光素酶报告基因实验检测ATL细胞中YAP功能的激活情况。结果显示YAP下游效应原件CTGF-Luc报告基因在ATL细胞中出现了显著的激活,表明ATL中YAP的功能被活化。为了进一步证实该结论,我们采用HTLV-1感染性克隆转染对照细胞Jurkat,以及将Jurkat细胞与HTLV-1阳性细胞ATL-T共培养的方法,研究HTLV-1病毒对YAP蛋白功能的影响。结果显示,HTLV-1病毒能显著激活YAP蛋白的功能。随后,我们分析了病毒蛋白Tax,HBZ在其中发挥的作用。报告基因结果显示Tax具有激活YAP功能的作用,而HBZ无明显作用。运用Tax突变体检测发现,缺失对NF-κB激活能力的Tax-M22突变体无法激活YAP的功能。为了证实该结论,我们采用了NF-κB抑制性质粒IκB(S32A/S36A),研究发现当NF-κB被抑制后Tax对YAP功能的激活也随之消失。以上结果表明Tax能激活YAP的功能,并且该激活作用必须依赖NF-κB信号通路。第四部分:NF-κB/p65对YAP功能的激活作用及其分子机制探究NF-κB/p65对YAP功能的调控,我们首先运用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB/p65能否激活YAP的功能。实验结果显示p65能在YAP基础上显著激活YAP下游效应元件8×GTⅡC-Luc活性,表明p65能激活YAP的功能。随后,我们研究NF-κB/p65对YAP功能激活的分子机制。通过免疫共沉淀技术发现p65与YAP蛋白存在结合。进一步研究发现p65能降低YAP-S127位磷酸化水平,并且降低了YAP与其抑制性调节蛋白14-3-3的结合,从而将YAP从细胞质中释放出来。通过荧光观察GFP-YAP的定位以及细胞核、质蛋白的检测,发现p65能促进YAP的入核。上述结果表明NF-κB/p65通过与YAP结合,抑制了YAP的磷酸化以及与14-3-3蛋白的结合,从而促进YAP的入核,最终激活了 YAP的功能。综上所述,本课题发现了Hippo信号通路关键蛋白YAP能促进成人T细胞白血病细胞的生长,并揭示了病毒蛋白Tax及NF-κB/p65激活YAP蛋白功能的分子机制。该研究不仅丰富了成人T细胞白血病发生机制,也为成人T细胞白血病的临床治疗提供一个全新的思路与策略。
关键词: 成人T细胞白血病 ；Hippo信号通路 ；YAP蛋白 ；细胞增殖 ；分子机制
摘要： 人类T细胞白血病病毒1型(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)是成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)的致病病原。HTLV-1病毒除了编码病毒结构基因gag、pol和env外,还编码一系列调节基因Rex、p12、p13、p30、Tax和HBZ等。其中Tax蛋白是HTLV-1病毒编码的最为重要的蛋白,它能参与调控细胞内的多条信号通路,如TGF-β/Smad,AP-1,NF-κB,AKT,Wnt等,从而促进肿瘤的发生。然而Tax蛋白调控ATL细胞恶性增殖促进ATL发生的分子机制尚未完全阐明。Hippo/YAP信号通路最初发现于果蝇体内,在哺乳动物中Hippo/YAP信号通路各个组分高度保守,主要具有调控胚胎发育,器官大小的作用。在肿瘤发生过程中,肿瘤细胞通过多种调控机制促进Hippo通路下游YAP蛋白的过表达,同时抑制Hippo通路功能,最终促进细胞的恶性增殖。据此,我们推测在ATL细胞中Tax蛋白是否同样通过调控Hippo/YAP信号通路,从而影响了成人T细胞白血病的发生呢?为了证实这一推测,本课题主要分析了Tax蛋白对Hippo/YAP信号通路的调控作用,进一步研究了该调控功能的潜在分子机制及生理意义。主要研究内容如下:第一部分:Hippo/YAP信号通路在ATL细胞株中受到抑制为了探究Hippo/YAP信号通路在ATL细胞株中的激活情况,我们对Hippo/YAP信号通路下游关键蛋白YAP的蛋白水平,基因水平,细胞核内定位及下游靶基因的表达情况进行检测分析。首先通过RT-PCR及Western Blot实验发现相对于对照组细胞(PBMC、PHA刺激后的PBMC细胞),ATL细胞株(ATL-T、ATL-2、MT-4、MT-2、MT-1、TL-Om1、ED)中YAP基因及蛋白均存在不同程度的高表达。随后我们进行了免疫荧光分析,结果显示相对于对照细胞株(Jurkat、Hut-78),ATL细胞株(ATL-T、ATL-2)中YAP蛋白主要分布在细胞核内。最后,我们实验结果显示在ATL细胞株中YAP下游与细胞增殖相关的靶基因,例如CTGF、cyr61、RASSF4、TIMP1存在异常表达。上述结果表明Hippo/YAP信号通路在ATL细胞株中受到抑制。第二部分:Tax促进YAP蛋白表达并激活其转录激活活性为了探究HTLV-1对Hippo/YAP信号通路及其关键蛋白YAP的调控作用,我们首先检测了HTLV-1关键蛋白Tax和HBZ对YAP蛋白表达的影响。运用HTLV-1感染性克隆实验发现HTLV-1病毒,尤其是HTLV-1编码的Tax蛋白可以促进YAP蛋白的表达,而HBZ则无任何作用。随后,我们进一步分析了Tax促进YAP表达的分子机制。我们克隆了YAP启动子及其突变体,运用双荧光素酶报告基因实验发现Tax能够激活YAP启动子活力,突变体分析发现Tax对YAP启动子的激活作用主要靶向YAP启动子-158至+117区域。进一步研究发现,Tax可以显著激活YAP介导的下游效应元件8×GTIIC-Luc的活性。以上结果证明Tax可以激活YAP的表达及功能,从而抑制Hippo/YAP信号通路。第三部分:Tax通过蛋白结合激活YAP蛋白功能的分子机制为了研究Tax调控Hippo/YAP信号通路的分子机制,我们首先通过免疫共沉淀实验发现Tax蛋白可以和YAP蛋白结合,且免疫荧光实验结果证实二者共定位在细胞核内。为了进一步分析两者的结合位点,我们运用YAP及Tax突变体进行免疫共沉淀分析,结果显示YAP蛋白主要通过YAP(1-174)或YAP(204-233)或YAP(263-292)结构域参与与Tax蛋白的互作。而Tax蛋白主要通过其(99-319)结构域介导与YAP蛋白的结合。进一步免疫荧光及Co-IP实验分析YAP在细胞内的定位,发现Tax可以促进YAP蛋白的入核,而Tax并不能抑制YAP与14-3-3的结合。随后我们通过免疫共沉淀实验发现Tax抑制了YAP与上游LATS1激酶的结合,并降低了YAP S127位磷酸化水平。此外我们运用Western Blot实验检测了Tax对YAP蛋白半衰期的影响。CHX及泛素化实验结果显示Tax可以抑制YAP蛋白的泛素化降解,并维持YAP蛋白的稳定性。以上结果表明Tax可以与YAP结合,且Tax可以抑制YAP与LATS1的结合以及YAP S127位磷酸化,从而促进了YAP的入核。此外,Tax还提高了YAP蛋白的稳定性,最终激活了YAP的转录激活功能。第四部分:YAP蛋白促进HTLV-1病毒侵染及ATL细胞的小鼠成瘤为了研究Tax是否可以通过调控Hippo/YAP信号通路影响ATL的发生,我们构建了高表达YAP和沉默YAP的稳定细胞株。研究发现沉默YAP可以显著抑制ATL-T细胞的恶性增殖。通过病毒侵染实验发现高表达YAP的ATL细胞株中HTLV-1病毒的侵染能力明显增强。高表达YAP的ATL-T细胞中,YAP下游与细胞生长、迁移正相关的基因,例如CTGF,FGF-1,C-MYC,NRP-1,HSPG出现明显上调。而RASSF4,TIMP1,BMP2等与细胞生长,迁移负相关靶基因,出现明显下调。最后,免疫缺陷小鼠实验发现,皮下注射沉默YAP的ED细胞后,小鼠形成实体瘤的大小及重量明显小于注射对照ED细胞的小鼠。基因检测也发现实验组小鼠中YAP下游与细胞生长正相关的靶基因也出现了明显下调。综上所述,本研究发现Hippo/YAP信号通路在ATL细胞中被抑制。HTLV-1编码的Tax蛋白通过与YAP互作抑制了YAP与LATS1的结合,从而抑制YAP S127位磷酸化,促进YAP的入核及功能。同时研究证明Tax可以通过激活YAP启动子的活力进而促进YAP蛋白的表达。此外,Tax还可以抑制YAP蛋白泛素化降解并提高YAP蛋白稳定性。最后,研究发现YAP可以促进HTLV-1病毒的侵染和ATL细胞的成瘤特性。在ATL细胞中过表达或沉默YAP可以影响YAP下游与生长、迁移相关靶基因的表达。本研究发现Tax通过调节Hippo/YAP信号通路促进ATL的发生。揭示了HTLV-1促进ATL发生的新分子机制,为ATL的诊断和临床治疗提供了新的靶点。
关键词: 成人T细胞白血病 ；Hippo信号通路 ；Tax蛋白 ；YAP蛋白
摘要： 成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)是一种由人类T细胞白血病病毒 1 型(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)感染引起的 T 淋巴系统的恶性增殖疾病。HTLV-1是第一个被发现与人类恶性肿瘤相关的逆转录病毒。在ATL发生过程中,HTLV-1编码的病毒蛋白Tax、HBZ发挥重要作用。尽管HTLV-1病毒从发现至今已经有四十多年,但是该病毒与宿主细胞之间相互作用的机制至今仍未完全阐明。当病毒侵染宿主细胞时,细胞会在胞浆中形成一种包含翻译起始复合物以及相关物质的非膜可逆性聚集体,这种可逆聚集体称为应激颗粒(Stress Granules,SGs)。应激颗粒能够影响病毒翻译,促进宿主细胞天然免疫,从而发挥抗病毒的作用。近年来,越来越多的研究从应激颗粒角度来研究病毒与宿主细胞之间的关系。我们之前的研究发现HTLV-1病毒能够动态调控应激颗粒的形成,而Tax在ATL的发生中发挥关键作用。因此本课题猜测,病毒蛋白Tax是否在HTLV-1病毒对SGs的调控中发挥一定功能呢?据此,本课题研究了 HTLV-1病毒蛋白Tax对SGs的形成及其动态变化的调控作用,并进一步探究其分子机制。研究内容及结果如下: 第一部分:HTLV-1病毒Tax蛋白诱导SGs形成 为了探究病毒蛋白Tax能否调控SGs形成,本研究在HeLa细胞株中过表达Tax后,以G3BP1作为SGs标志物运用免疫荧光实验检测SGs的形成。研究结果显示,在过表达Tax 36 h后,胞浆中出现了 G3BP1标记阳性的较大、呈现点状分布的颗粒。为了进一步确认胞浆中形成的颗粒为应激颗粒,本实验使用其他SGs标志蛋白,例如G3BP2、TIA-1、eIF4G进行免疫荧光染色。实验结果显示,在过表达Tax的细胞中形成的颗粒均能被不同SGs标志蛋白所标记,以上结果证明了 Tax可以诱导宿主细胞产生SGs。随后,研究检测了 Tax的表达是否能动态调控SGs的形成。实验结果表明在Tax表达的前期,即12-48 h时,Tax能诱导SGs装配,产生SGs的细胞比例随时间呈现上升的趋势;而在Tax表达后期,即60-72 h时,SGs逐渐解聚直至最后消失,产生SGs的细胞比例减少。以上实验证明Tax能诱导SGs形成,同时对SG形成具有动态调控功能,即前期诱导SGs形成,后期促进SGs解聚。 第二部分:HTLV-1病毒Tax蛋白诱导应激颗粒形成的分子机制 由于Tax动态调控SGs形成的过程比较复杂,本研究只聚焦了 Tax在前期诱导SGs的过程,并进行了深入研究。为了探究Tax诱导SGs形成的分子机制,本研究首先检测了 Tax对于SGs形成的关键蛋白及其磷酸化的影响。文献报道,PKR的磷酸化能够诱导eIF2α的磷酸化,进而诱导SGs的形成。Western Blot实验显示,Tax表达能够显著诱导eIF2α和PKR磷酸化。并且在Tax表达的前期,PKR和eIF2α磷酸化水平上升,表达60 h以后PKR和eIF2α水平显著下降。以上实验证明了 Tax通过PKR-eIF2α级联反应诱导SGs形成及其动态变化。文献表明PKR作为dsRNA的响应因子其磷酸化还可以受上游蛋白PACT和TRBP的调控,其中PACT促进PKR磷酸化,TRBP抑制PKR磷酸化。为了进一步探究Tax对PKR调控的机制,本研究通过免疫共沉淀实验检测了 Tax与PACT和TRBP的结合。结果显示,Tax与PACT和TRBP两个蛋白均有互作,并且Tax能够通过促进TRBP和PACT的异二聚化,从而促进PKR的磷酸化。此外,免疫共沉淀实验还发现Tax可以与PKR结合,而且Tax能促进PKR的自二聚化,进而实现PKR的磷酸化。以上实验证明,,Tax可以通过对于PACT、TRBP以及PKR三者的调控,进而通过PKR-eIF2α级联反应,诱导SGs产生。 第三部分:利用HTLV-1病毒Tax蛋白突变体探究其调控SGs形成的机制 为了进一步探究Tax对于SGs调控的分子机制,本实验利用Tax缺失型突变体探究其对SGs的调控作用。首先,本研究构建Tax截短型突变体TD1、TD55、TD99、TD150、TD254、TD319。随后利用上述突变体通过免疫荧光实验寻找Tax对SGs调控的关键区段。免疫荧光实验结果显示,Tax突变体TD99、TD150几乎丧失了对SGs的诱导作用,而TD1、TD55、TD254突变体仍然能在一定程度上诱导SGs形成。之后本研究通过Western Blot实验发现,Tax的TD99、TD254、TD319突变体相较于野生型而言,对PKR和eIF2α磷酸化水平的诱导显著降低。最后,本研究运用免疫共沉淀实验检测Tax突变体对于PKR二聚化的影响。实验结果表明Tax的TD99和TD150突变体几乎丧失了对PKR二聚化的促进作用,这也和免疫荧光结果基本一致。综合以上结果,本研究发现Tax主要通过氨基酸99-142、150-198区段结构域在促进PKR磷酸化,进而诱导SGs过程中发挥重要功能。 第四部分:表达Tax的宿主细胞通过形成SGs抑制细胞翻译及病毒复制 为了探究Tax对SGs调控的生理意义,本研究通过Puromycin渗入实验检测SGs的形成对于宿主细胞翻译的影响。实验结果表明Tax诱导产生SGs的细胞相较于对照组细胞而言,Puromycin信号更弱,该结果提示Tax诱导产生的SGs能够抑制宿主的翻译。随后利用流式细胞术检测Tax对VSV-eGFP模式病毒复制的影响。结果显示Tax能抑制VSV-eGFP模式病毒的复制。以上研究表明,表达Tax后,宿主细胞会通过形成SGs,抑制细胞翻译和病毒复制。 综上所述,本课题发现了 HTLV-1病毒Tax蛋白表达后可以诱导SGs的形成,并且SGs的形成呈现一定的动态变化,即在Tax表达前期诱导SGs形成,在后期促进SGs解聚。分子机制研究显示,Tax通过诱导PACT和TRBP异二聚化以及PKP二聚化等方式实现PKR和eIF2α磷酸化水平上调,进而诱导SGs的产生。此外,Tax通过99-142和150-198区段氨基酸在诱导SGs的形成方面发挥重要作用。据此本研究推测,HTLV-1病毒感染后,宿主细胞识别病毒Tax蛋白,从而诱导SGs形成。宿主通过SGs抑制细胞内翻译系统,从而实现抑制病毒复制的功能。本课题通过研究Tax对宿主细胞应激颗粒动态变化的调控,为深入研究HTLV-1与宿主细胞之间的相互作用提供新的思路,为揭示ATL的发生机制提供新的线索。
关键词: 人类T细胞白血病病毒1型 ；应激颗粒 ；PKR蛋白 ；Tax蛋白 ；eIF2α
摘要： 人类T细胞白血病病毒1型（Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1）是第一个被发现与人类疾病相关的逆转录RNA病毒,它是导致成人T细胞白血病（Adult T-cell leukemia,ATL）的唯一致病因素。HTLV-1前病毒基因组约为9 kb,其p X区编码了一系列调节蛋白,如p12、p13、p30、p21、Rex、Tax和HBZ等,它们在HTLV-1持续潜伏感染及致癌过程中发挥着重要作用。其中病毒蛋白Tax通过异常调控一些肿瘤相关的信号通路,如NF-κB、AP-1和SRF等,从而促进病毒感染细胞的克隆性增殖,促进病毒复制,引发恶性转化,最终导致ATL的发生。I型干扰素（I-IFN）是机体抗病毒天然免疫反应的关键效应因子。HTLV-1感染后,其编码的Tax蛋白通过多种策略抑制天然免疫的应答,进而帮助HTLV-1逃逸宿主天然免疫系统的检查。但在大多数ATL细胞中,Tax由于具有较高的免疫原性被宿主免疫系统识别后而被快速清除,因而几乎很难检测到Tax的表达。但HTLV-1可在人体内持续潜伏感染数十年之久而不引发免疫反应。因此,HTLV-1可能通过细胞内的其它因子维持了对天然免疫的持续抑制。近年来,Hippo信号通路下游的效应蛋白YAP被研究证明是一个致癌基因。在肿瘤发生过程中,肿瘤细胞通过不同的机制活化YAP,活化后的YAP通过调控肿瘤细胞内的多条信号通路从而影响肿瘤发生的进展。近来的研究表明YAP是机体抗病毒天然免疫反应的负调控因子。据此,我们猜测:HTLV-1感染后是否通过YAP调控天然免疫应答,进而影响了ATL的最终发生呢?为了解答这一猜想,本课题主要探究了Tax通过YAP影响ATL细胞天然免疫应答的分子机制及其具体的生理意义。主要进行了以下几部分的研究: 第一部分:YAP蛋白在HTLV-1阳性细胞株中高表达 Hippo通路YAP蛋白是一个公认的癌蛋白,它的异常表达与许多肿瘤的发生有关。首先,探究了YAP在ATL细胞株中的表达情况,分别选取了两种HTLV-1阴性细胞株（Molt-4,Jurkat）以及六种HTLV-1阳性细胞株（ATL-T,ATL-2,MT-1,MT-2,MT-4,TL-Om1）,随后采用Western bolt以及q RT-PCR检测各个细胞中YAP的表达情况。结果表明,相较于HTLV-1阴性细胞,在HTLV-1阳性细胞株中,YAP在蛋白以及基因水平的表达都有升高。随后检测了YAP下游相关靶基因的表达。研究发现YAP下游与细胞增殖相关的两个靶基因CTGF和CYR61在HTLV-1阳性细胞中均有不同程度的高表达。以上研究结果表明,HTLV-1的感染可促进YAP的表达,并且能激活YAP的调控功能。 第二部分:YAP负调控ATL细胞的天然免疫信号转导 天然免疫是机体抵御外来病原体入侵最为重要的一道防线。研究指出Hippo信号通路的多个核心成分都参与调控了宿主的天然免疫反应,而且最近的研究发现YAP负调控了宿主的抗病毒天然免疫反应。因此,首先利用报告基因实验探究了YAP对ATL细胞中天然免疫应答的影响。结果显示,YAP能显著抑制TBK1,IKKε,RIG-I,STING+CGAS,IRF3诱导激活的天然免疫相关报告基因IFN-β-Luc,ISRE-Luc的荧光素酶活性。同时通过q RT-PCR实验发现,YAP抑制了IFNs诱导的天然免疫信号通路下游ISGs（干扰素刺激基因）的表达,如IFN-β,IFNT1/2。随后在HTLV-1未感染的T细胞中观察到YAP能显著抑制poly I:C激活的天然免疫信号。接下来采用基因过表达/沉默的方式检测了YAP对ATL细胞中天然免疫信号激活的影响。结果显示,当YAP的表达在ATL中升高时天然免疫信号的激活及ISGs的表达均受到抑制。而当沉默YAP后,ATL中受到抑制的天然免疫信号及ISGs的表达均有不同程度的恢复。随后在采用YAP抑制剂VP处理ATL细胞后,天然免疫信号的激活以及ISGs的表达均有升高。综上,被HTLV-1活化后的YAP负调控ATL细胞中的天然免疫应答。 第三部分:Tax通过激活YAP调控天然免疫应答 为了探究HTLV-1感染的阳性细胞中YAP活化的原因。首先通过转染HTLV-1全病毒质粒（p X1MT-M）检测了YAP的表达。研究发现HTLV-1能够促进YAP蛋白的表达。随后通过Western blot检测了HTLV-1编码的关键蛋白Tax和HBZ对YAP表达的影响,结果表明在经Cd Cl2诱导Tax表达的JPX-9细胞中,YAP的表达有明显的升高,而在稳定表达HBZ的Jurkat-HBZ细胞中YAP的表达没有显著的变化。这表明HTLV-1感染后主要是由Tax蛋白引起了YAP蛋白表达的升高。 在第一章的研究中发现HTLV-1的感染能够激活YAP的功能,随后利用含有YAP下游效应元件的报告基因质粒（8XGTII-Luc）探究了Tax对YAP功能的影响。研究发现Tax能在YAP的基础上进一步增强YAP对8XGTII-Luc的激活。免疫共沉淀实验发现Tax能与YAP发生结合,且主要靶向了YAP的1-174aa片段。这些结果表明Tax不仅能促进YAP的表达而且能够激活YAP的功能。 研究报道HTLV-1编码的Tax蛋白能抑制了天然免疫反应。随后利用报告基因实验验证了Tax对天然免疫的影响。与之前研究结果一致,通过报告基因实验发现Tax显著抑制了IFN-β信号的激活。接下来采用CRISPR/cas-9技术构建了沉默YAP的稳定ATL细胞系。通过报告基因实验发现,在沉默YAP后被Tax抑制的IFN-β信号得到了部分恢复,而在补加YAP后,恢复的IFN-β信号重新被抑制。随后,在使用YAP抑制剂VP处理ATL细胞后观察到,天然免疫信号以及下游ISGs的表达均得到了部分恢复。进一步的机制研究发现,Tax能增强YAP与IKKε的结合,且Tax在YAP的基础上进一步抑制了TBK1与IRF3的结合,进而阻碍了IRF3的活化,最终抑制了天然免疫应答。据此,以上结果表明,Tax可以通过调控YAP进而抑制天然免疫应答。 第四部分:YAP通过抑制天然免疫促进VSV病毒复制 为了进一步探究YAP对抗病毒天然免疫反应的影响。在沉默或过表达YAP的细胞株中采用流式细胞术检测YAP对VSV-e GFP病毒复制的影响。实验结果显示当YAP表达量升高时,VSV的复制增强,当YAP表达量降低时,VSV的复制受到抑制。以上结果表明YAP通过抑制细胞内天然免疫,从而帮助病毒在宿主体内的持续复制。 综上所述,本研究发现HTLV-1编码的病毒蛋白Tax通过活化YAP进而实现了对天然免疫的抑制作用,以促进病毒的复制,进而导致最终ATL的发生。在机制上,Tax通过直接靶向YAP的1-174 aa片段从而激活YAP的功能;且Tax增强了YAP与IKKε的结合,同时在YAP的基础上进一步阻碍了TBK1对IRF3的活化,最终减弱天然免疫上下游信号通路的激活。另一方面,持续活化的YAP维持了HTLV-1病毒对ATL细胞中天然免疫的持续抑制,有助于HTLV-1在宿主体内的持续感染。本研究一方面阐明了Tax通过YAP调控天然免疫的分子机制,同时揭示了ATL细胞中YAP活化及功能激活的诱因,及其在Tax缺失后在天然免疫中的重要调控作用。该研究成果为阐明HTLV-1病毒致癌分子机制提供线索,并为ATL的临床治疗提供新的策略和靶点。
关键词: 成人T细胞白血病 ；人类T细胞白血病病毒1型 ；天然免疫 ；Tax蛋白 ；YAP蛋白
摘要： 背景：
成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia，ATL）是一种与人T细胞白血病病毒Ⅰ（HTLV-Ⅰ）感染直接相关、发生于成人的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，急性期ATL侵袭性极强。ATL的预后不良因素与HTLV-1感染的细胞具有异常强大的无限增殖以及抑制凋亡能力有关，亦与其对传统化疗药物的先天耐药性有关，因此目前迫切需要新的治疗方法改善ATL的不良预后。
JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。很多研究成果都表明，JAK-STAT通路的异常激活在ATL的病理机制中占据着重要的地位。在ATL细胞中普遍存在着JAK-STAT信号通路的持续激活。
热休克蛋白90（HSP90）在ATL细胞内的异常高水平表达被认为与ATL的发病有关。近年来研究表明，ATL细胞内多条信号转导通路相关蛋白均为HSP90的客体蛋白，并通过HSP90的作用被异常激活。正常细胞hsp90低水平表达，不与其他辅助分子伴侣形成复合物，处于非活化状态。但是，在恶性肿瘤细胞中，hsp90异常高水平表达，形成”客体蛋白-hsp90-辅助分子伴侣”的所谓超级分子伴侣复合物结构(辅助分子伴侣包括hsp70,CDC37)，稳定突变或异常活化的癌基因相关蛋白，使之免受泛素-蛋白酶体通路的降解作用，促进肿瘤细胞的异常增殖。
本研究将以上所述作为理论基础，选用HTLV(+)ATL细胞株HUT-102作为研究对象，采用WESTERN-BLOT、免疫共沉淀、流式细胞术等多种现代生物学检测方法，探讨ATL细胞内HSP90与JAK/STAT通路异常持续性激活之间是否存在一定的联系，是怎样的联系，以此希望进一步加深对ATL发病机制的理解，为ATL的靶向治疗研究提供更多的理论依据。
研究内容与方法：
1、细胞培养，使用RP-1640+10%胎牛血清配成完全培养基培养HUT-102细胞，并定期传代、换液。
2、WESTERN-BLOT方法：
2.1检测HUT-102细胞、JURKAT细胞以及外周血单个核细胞（PBMC）内JAK3蛋白、STAT5蛋白、P-STAT5蛋白、HSP90表达。观察各组细胞间蛋白表达量的不同。
2.2稀释不同浓度HSP90特异性抑制剂17-AAG (0-2000NM)作用于HUT-102细胞24、48小时，分别提取各组细胞总蛋白，WESTERN-BLOT检测各组JAK3蛋白、STAT5蛋白以及P-STAT5蛋白表达的变化趋势。
2.3使用1000NM浓度17AAG作用于HUT-102细胞0、3、6、9、12、24小时后提取细胞总蛋白，WESTERN-BLOT检测各组JAK3蛋白、STAT5蛋白以及P-STAT5蛋白表达的变化趋势。
2.4分别设入无刺激组、17AAG+CP690550组、17-AAG组、CP690550组分别刺激HUT-102细胞24h，提取处理细胞总蛋白WESTERN-BLOT检测JAK3蛋白表达情况
3、RT-PCR
将不同浓度（0、125、250、500、1000NM）抑制剂刺激HUT-102细胞24h后，提取细胞总RNA，使用RT-PCR方法检测各组细胞JAK3mRNA的表达情况，GAPDH为设定内参。
4、CCK8
稀释不同浓度17AAG(0、500、1000、2000、4000、5000、8000NM)作用于HUT-102细胞，分别于12、24、48、72小时后CCK8法检测细胞吸光度值，计算细胞存活率。
5、AnnexinV-PI
稀释17AAG浓度至0、250、500、1000、2000NM分别作用于HUT-102细胞，48小时后AnnexinV-PI法结合流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。
6、免疫共沉淀（CO-IP）
将JAK3抗体、磁珠与HUT-102细胞总蛋白内JAK3蛋白相结合，将磁珠-蛋白-抗体复合物沉淀后去除磁珠跟抗体，WESTERN-BLOT检测沉淀蛋白内是否含有HSP90蛋白。
结果
1、HSP90蛋白在正常人PBMC以及细胞株HUT-102、JURKAT中均有表达。但正常人HSP90蛋白表达量显著低于两种T淋巴肿瘤细胞株，JAK3/STAT5蛋白几乎不表达。与JURKAT细胞相比，HUT-102细胞内HSP90、JAK3、STAT5以及P-STAT5蛋白表达量显著增高。
2、CCK8结果显示,随着17AAG浓度的增加以及孵育时间的增长，细胞存活率逐渐下降。其中17AAG浓度在0-2000NM之间时下降最明显，在浓度达到2000NM以后细胞存活率达到最低值并趋于平稳。从时间上分析结果显示，随着孵育时间的延长，17AAG对细胞的抑制作用逐渐加大，至48h时细胞抑制率达到最大，而后到72h时，与48h相比结果无明显差异（P>0.05）
3、使用流式细胞仪分析细胞凋亡。Annexin V-FITC（+）PI（-）为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC(+)PI(+)为晚期凋亡细胞。结果显示使用17-AAG后肿瘤细胞HUT-102的早期凋亡细胞所占比例增加。着17-AAG浓度的上升，HUT-102细胞凋亡率逐渐增加。
4、与未刺激组相比，刺激组JAK3与P-STAT5蛋白表达明显下降（P<0.05）。随着抑制剂浓度的增加，这种抑制强度随之增加。各浓度（125-2000NM）抑制剂作用细胞48h时，P-STAT5蛋白几乎检测不出。同样条件下，检测总STAT5蛋白发现，各刺激组与非刺激组总STAT5蛋白表达之间无显著差异（P>0.05）。
5、同一浓度水平下，随着抑制剂作用时间增长，JAK3蛋白表达水平逐渐降低，至24h时几乎检测不出。而P-STAT5蛋白水平在1000NM浓度的17-AAG作用≥4h后均检测不出。但HUT-102细胞总STAT5蛋白表达水平并未随抑制剂作用时间的变化而有所增减（P＞0.05）。
6、使用RT-PCR方法检测不同浓刺激下细胞JAK3mRNA表达情况。各刺激组细胞JAK3mRNA并未随着抑制剂17-AAG浓度的增加而明显变化，（P>0.05）。
7、根据CO-IP结果显示，使用JAK3抗体沉淀天然构象蛋白，WESTERN-BLOT除可检测到JAK3蛋白沉淀外，同时也检测出小部分HSP90蛋白的沉淀。
8、使用CP690550与17-AAG共同刺激细胞，结果显示单独组中17-AAG对JAK3蛋白抑制作用强于CP690550。而与17-AAG/CP690550单独刺激组相比，两种抑制剂共同刺激组对细胞JAK3蛋白过表达的抑制作用更强。
结论
1JURKAT、HUT-102细胞内HSP90蛋白表达量较正常外周血单个核细胞明显升高。HUT-102细胞内JAK3/STAT5通路异常持续活化。
2、证明JAK3为HSP90客体蛋白。
3、17-AAG可抑制JAK3/STAT5信号通路持续活化，呈时间、剂量依赖作用。
4、17-AAG可抑制HUT-102细胞增殖，并诱导细胞凋亡。
5、JAK3抑制剂CP690550与17AAG在HUT-102细胞内可能存在协同作用。
关键词: HSP90 ；JAK/STAT信号转导 ；17AAG ；HUT-102细胞
被引量
2
摘要： 成人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)是一种恶性增殖性淋巴系肿瘤,由人类T细胞白血病1型病毒(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)感染引起。关于其发病的分子机制仍未完全阐明,因此深入探究ATL发生机制,尤其是白血病细胞恶性增殖的机理并以此寻找治疗手段成为该领域的重点。越来越多的研究表明,一类新的肿瘤调控因子长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)在肿瘤的生长、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。LncRNA是基因组中不能编码蛋白质的RNA,其转录本大于200个核苷酸。ANRIL(Antisense noncoding RNA in the INK4 Locus)是一种长链非编码 RNA,己广泛报道ANRIL与肝癌、胃癌、食管癌等肿瘤的发生密切相关,但其在ATL中的表达和功能尚不清楚。为了探究ANRIL在ATL中的作用,本研究从细胞、分子机制及体内三个水平研究ANRIL在调控ATL增殖和凋亡中的作用及其分子机制。具体内容如下:第一部分:ANRIL在ATL中异常高表达首先,本研究运用RT-PCR技术检测7种ATL细胞株MT-1、MT-2、MT-4、C8166、ATL-2、ATL-T、TL-Om1 及对照组 HTLV-1 阴性细胞株 Jurkat 中ANR见的表达情况,结果表明在ATL细胞中ANRIL呈现异常高表达,qRT-PCR也证实了ANRIL在ATL中表达异常。综上,我们从分子水平充分验证了ANRIL在ATL细胞中异常高表达。第二部分:ANRIL对ATL细胞恶性增殖的影响为了研究ANRIL对ATL细胞恶性增殖的影响并研究其分子机制,本文应用慢病毒介导的基因沉默技术敲低ANRIL基因。首先,构建shANRIL载体,利用HEK-293FT细胞包装获得对照组慢病毒及ANRIL沉默的重组慢病毒,分别感染ATL-T及ED细胞,经筛选后获得ATL-T和ED的对照组稳定株和ANRIL沉默稳定株。通过qRT-PCR确认ANRIL沉默,之后运用MTT实验、平板克隆实验检测细胞增殖情况,结果表明ANRIL沉默能抑制ATL-T及ED细胞的增殖;流式细胞术检测发现ATL细胞中ANRIL沉默能诱导ATL-T及ED细胞凋亡。此外,本研究还运用流式细胞术检测细胞周期的变化,结果显示,沉默ANRIL后ED细胞周期发生阻滞,细胞主要滞留在G1期。第三部分:ANRIL沉默抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡机制探究为了探究ANRIL沉默后引起ATL细胞凋亡的分子机制,首先运用蛋白印迹法检测ATL细胞株中ANRIL沉默后Caspase蛋白家族表达情况,结果表明ANRIL沉默可引起Caspase-3、-7、-9蛋白表达水平下调,并出现激活型的蛋白剪切带,PARP蛋白发生切割;促凋亡蛋白AIF表达量升高。细胞生长相关基因如E2F1及C-Myc的表达下调,KLF2表达上调。ATL细胞中NF-κB通路持续激活。为了研究ANRIL是否参与调控NF-κB信号通路,本文运用双荧光素酶报告基因实验检测ANRIL对NF-κB信号通路的影响。实验结果显示,ANRIL单独不能激活NF-κB信号通路,但ANRIL能够促进Tax介导的NF-κB信号通路。p65是经典NF-κB途径中的重要成员蛋白。同样运用双荧光素酶报告基因实验,检测结果发现ANRIL和EZH2均可增强p65介导的NF-κB信号通路,同时表达ANRIL、EZH2和p65后呈现更显著的NF-κB信号通路激活。因此,ANRIL、EZH2和Tax(或p65)三者协同激活NF-κB信号通路。综上,ANRIL主要通过调控凋亡相关蛋白的表达以及肿瘤发生的信号通路从而影响肿瘤细胞生长和凋亡。第四部分:小鼠成瘤实验为了从体内层面进一步证实ANRIL的作用,本文运用了小鼠成瘤模型进行探究。选用ANRIL沉默效果较好的shANRIL#1 ED细胞及对照组ED细胞分别皮下注射小鼠,三周后将小鼠处死,取皮下瘤组织标本观察并实验。结果显示,注射shANRIL#1 ED细胞的小鼠瘤体的大小和质量均小于对照组,表明ANRIL沉默后瘤体形成能力明显降低。将肿瘤组织取出一部分用于提取RNA后逆转录成为cDNA,并检测与肿瘤发生相关基因的表达情况,结果表明注射shANRIL#1 ED细胞小鼠组织中E2F1、KLF2及C-Myc的表达均下调。综上所述,本研究证实了ANRIL在ATL中异常高表达,并验证了ANRIL具有促进ATL细胞的增殖和细胞周期进程、抑制细胞凋亡的作用。小鼠体内实验进一步证明了 ANRIL具有促进肿瘤发生的作用。本课题为丰富成人T细胞白血病发生机制提供依据,为ATL的治疗提供新的靶点,也为未来成人T细胞白血病的临床治疗提供一个全新的思路与策略。
关键词: 成人T细胞白血病 ；ANRIL ；增殖 ；凋亡
摘要： 人类T细胞白血病病毒I (HTLV-1)能够引起成人T细胞白血病(ATL)和热带痉挛性下肢瘫痪或HTLV-1相关脊髓病(TSP/HAM)。HTLV-1 Tax蛋白在病毒复制和疾病进程中起着关键性作用。它能够激活T细胞增殖相关的调控因子,干扰DNA修复以及使细胞抵抗细胞周期停滞和细胞凋亡,从而使HTLV-1逃脱机体免疫系统的杀伤。Tax激活宿主细胞内的CREB/ATF和NF-kB对其生物学功能至关重要。尤其是Tax与NF-kB的相互作用,能够使细胞抵抗FasL和TRAIL诱导的细胞凋亡,还能激活大量细胞因子的表达,而且Tax对T细胞的转化也与其活化NF-kB的能力密切相关。
TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员,由于它能够诱导肿瘤细胞的凋亡而对大部分正常细胞没有毒副作用,因此,TRAIL可能成为基于细胞凋亡原理和具有良好临床应用前景的新型肿瘤治疗药物。此外,越来越多的证据表明TRAIL在机体的天然免疫和适应性免疫中也起着重要作用。
本论文研究了HTLV-1 Tax在TRAIL诱导的细胞凋亡和自噬中的作用及其分子机制。我们首先发现Tax可以抑制TRAIL及抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体(AD5-10)诱导的细胞凋亡；其抗细胞凋亡的分子机制研究发现,Tax不仅可以上调细胞凋亡抑制蛋白c-FLIP的表达,而且能够上调细胞自噬的水平；抑制c-FLIP表达或抑制细胞自噬都能削弱Tax的抗凋亡活性,增强细胞对TRAIL的敏感性；Tax的突变体M22不能上调c-FLIP的表达,也不能促进细胞自噬；Tax对c-FLIP和自噬的调节依赖于其活化IKKa/β/γ复合物的能力,抑制IKKa/β表达对Tax诱导的c-FLIP表达和细胞自噬都有抑制作用,而抑制p65和过表达IkBα-DN只能抑制Tax诱导的c-FLIP的表达,而不能抑制细胞自噬,说明Tax对c-FLIP的调节通过Tax-IKK-NF-KB途径,而Tax对自噬的调节则只依赖于IKK,不依赖于NF-kB;我们还发现,TRAIL可引起Tax降解,抑制细胞自噬或抑制c-FLIP表达可促进TRAIL诱导的Tax降解。
综上所述,Tax可以通过上调c-FLIP的表达和激活细胞自噬,共同抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡,提示Tax的调节细胞凋亡和自噬的生物学功能在HTLV-1相关疾病(ATL和TSP/HAM)的发生发展中可能起重要作用,为抑制HTLV-1感染的宿主细胞自噬的治疗策略研究开辟了新的方向。
关键词: 人类T细胞白血病病毒Ⅰ ；Tax蛋白 ；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 ；细胞FLICE抑制蛋白 ；细胞凋亡 ；细胞自噬
摘要： 白血病为造血干细胞功能紊乱，可引起患者出血、淋巴肿大、骨骼疼痛等症状的恶性克隆性疾病。白血病在我国发病率较高，并有逐年增长趋势。成人T细胞白血病(adultT-cell leukemia，ATL)作为一种特殊类型的淋巴白血病，是与人类T细胞白血病病毒1(human T cell leukemia/lymphoma virus，HTLV-1)感染有关、发生于成人体内的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，严重威胁人类健康。目前，ATL的常见治疗方法如结合化疗、分子靶向药物、异基因骨髓干细胞移植等，因其存在毒副作用大、特异性差、有并发症等不足，使得白血病患者的治愈情况不容乐观，且预后效果极差，因此，寻找新的治疗方法尤为必要。 光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)为氧气依赖型的光活化作用物理疗法，因具有创伤小，特异性高，并发症少，能保护容貌等优点，被应用于肿瘤的治疗中。传统光敏药物血卟啉等衍生物（haematoporphyrin derivative，HPD），因易发生机体过敏，皮肤细胞中代谢速率较缓等不足而达不到根治肿瘤效果。金丝桃素(Hypericin，HYP)作为光动力疗法的新型光敏药物，是从天然草药贯叶金丝桃(Hypericu-mperforatum L.)中提取的最具生物活性的萘苯二蒽酮类化合物，具有暗毒性低、光毒性强，对肿瘤选择性强而作用健康组织损伤小等优势。近年来还发现金丝桃素具有明显的抗病毒作用。目前HYP的光学性质已得到了深入的研究，有些已经应用于临床并取得可观的科研成果与医学效果，具有非常广阔的PDT临床应用前景。然而目前，国内外大多数关于HYP作为光敏剂介导的PDT疗法(HYP-PDT)研究主要局限于食道癌，皮肤癌，肝癌，大肠癌等实体瘤方面，有关白血病方面的研究还相对较少，且具体杀伤机制尚未明确。本研究以HTLV-1病毒感染的ATL细胞和未感染的白血病细胞为实验对象，通过体外实验研究金丝桃素对白血病细胞的增殖抑制作用，同时分析其具体分子作用机制，为白血病的治疗以及金丝桃素的进一步开发利用提供一定的理论依据和实验基础。主要内容如下: 第一部分:光敏化金丝桃素对多种白血病细胞具有极明显的生长和增殖抑制作用 首先，一定药物浓度的HYP配合光照作用多种白血病细胞24 h后，MTT法检测细胞生长活力并计算分析半致死浓度(IC50)。数据表明，单独的光照或金丝桃素作用下，OD值无明显变化;而光活化的金丝桃素作用细胞后，随药物浓度加大，OD值逐渐变小，即可以反应出细胞生长活力受到抑制。统计分析可知，光活化金丝桃素作用ATL-T、MT-2、C8166、TL-Om1、Molt4、Jurkat、Hut78细胞株的IC50分别为:52.98、52.86、43.02、37.88、32.26、18.16、11.12 ng/mL。综上结果表明，光敏化金丝桃素对多种白血病细胞皆具有极明显的小剂量杀伤作用，并呈现出浓度依赖效应。 然后平板克隆形成实验进一步检测HYP-PDT对细胞增殖的影响，结果表明，光活化金丝桃素处理ATL-T细胞后，实验组克隆形成率明显降低。 第二部分:HYP-PDT引起细胞凋亡，周期阻滞 为了观察HYP-PDT对细胞形态的影响，不同药物浓度的HYP光激活后作用ATL-T和TL-Om1细胞24 h，显微镜观察显示，随HYP浓度加大，细胞开始皱缩、变圆缩小，数量减少，并出现凋亡小体。进一步用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染ATL-T细胞，发现随药物浓度的增加，细胞从贴壁的梭形开始变圆脱落，视野内橘黄色荧光增多。以上结果表明HYP-PDT能够引起细胞形态变化，诱导细胞发生凋亡。 光活化后的HYP作用ATL-T细胞24 h，AnnexinⅤ/PI荧光双染色流式细胞仪分析发现，100 ng/mL的HYP可使26.16％的ATL-T细胞发生凋亡，200 ng/mL的HYP让凋亡比率提升至50.05％，400 ng/mL的HYP甚至可使97.04％的细胞发生凋亡。30，50，100ng/mL HYP作用TL-Om1细胞24 h，结果发现实验组细胞凋亡率分别为20％，54％，93％。以上结果提示，HYP可以显著诱导ATL细胞发生凋亡。 此外，流式细胞术分析显示光活化的金丝桃素引起TL-Om1和ATL-T细胞在G2/M期滞留，Western blot实验表明HYP-PDT处理后细胞内CyclinB1含量的增高可能与G2/M期滞留相关。 第三部分:HYP-PDT引起细胞凋亡机制探究 为了探究HYP-PDT引起ATL细胞凋亡的分子机制。首先运用Caspase广谱型抑制剂Z-VAD-FMK处理ATL细胞后，MTT法检发现Caspase抑制剂能显著减弱HYP引起的细胞的杀伤作用，然后进一步利用Western blot蛋白印迹法检测Caspase蛋白家族表达情况，结果表明HYP明显引起Caspase-3，-7，-9蛋白表达水平下调，并出现激活型的蛋白剪切带。细胞凋亡多数涉及线粒体的损伤，因此我们利用JC-1染色流式上机分析了光活化金丝桃素对ATL细胞线粒体膜电位的影响。结果发现，在终浓度50，100，200 ng/mL光活化HYP作用ATL-T细胞24 h后，线粒体膜电位下降比率分别为12.27％，27.42％，52.52％。同样明显的变化趋势也出现在HYP-PDT作用的TL-Om1细胞中，即10，20，30 ng/mL HYP作用可引起TL-Om1细胞线粒体膜电位下降比率分别为4.53％，28.47％,55.88％。 进一步用蛋白免疫印迹检测凋亡通路有关蛋白。显影结果表明，促凋亡蛋白Bax，Bad，AIF蛋白表达量上调，Bid出现明显剪切活化带，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显下调以及细胞色素C蛋白丰度变高;P53蛋白表达上调且P53蛋白磷酸化（ser-15位）水平降低，PARP蛋白表达下调并出现激活型切割带;并进一步利用报告基因实验分析Bax启动子活力以及P53转导通路是否激活，结果发现金丝桃素能够明显引起Bax基因启动子活力上升，P53凋亡信号通路被明显激活。 以上结果提示，金丝桃素光动力作用通过引起凋亡相关蛋白表达异常以及凋亡信号通路激活，诱导ATL细胞发生凋亡。 第四部分:金丝桃素光敏化作用能够抑制HTLV-1关键致病基因的表达 为了研究金丝桃素是否通过影响引起白血病的病毒基因表达来抑制细胞增殖，我们运用PCR检测细胞中Tax、HBZ的表达，结果显示;金丝桃素处理后，ATL-T和TL-Om1细胞中HBZ表达均有下调，而Tax表达无明显变化。同时我们通过细胞转染3'-LTR-Luc质粒（病毒基因编码的片段），荧光素酶报告基因分析启动子活性，结果显示:金丝桃素处理组病毒基因片段3'-LTR-Luc表达下调。为了进一步验证金丝桃素对病毒的影响，我们将ATL-T细胞（HBZ、Tax阳性）与Jurkat细胞（HBZ、Tax阴性，转染了WT-Luc质粒）共培养，报告基因检测结果显示:WT-Luc表达下调。以上结果提示，金丝桃素能够引起HTLV-1病毒编码基因的表达下调从而抑制ATL细胞的生长。 综上所述，本研究证实光活化金丝桃素通过引起细胞凋亡、周期阻滞以及抑制病毒基因表达，从而抑制白血病细胞的增殖。本课题将为金丝桃素的开发利用以及白血病的治疗提供一定的实验基础，也为未来成人T细胞白血病的临床治疗提供一个全新的思路与策略。
关键词: 成人T白血病 ；金丝桃素 ；细胞凋亡 ；药理作用