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摘要： 目的探讨吐根碱通过胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)促进离体大鼠胰岛组织胰岛素分泌作用。方法分离大鼠胰岛组织进行胰岛素分泌实验,根据实验设计使用不同浓度的吐根碱(2、10、50μmol·L^(-1))、不同浓度葡萄糖(2.8、11.1、16.7 mmol·L^(-1))以及特异性GLP-1R拮抗剂Exendin(9-39)孵育胰岛组织。酶联放射免疫的检测方法测定每组上清液胰岛素分泌量。使用SYBYL-X2.0软件将小分子化合物与GLP-1R(PDB代码:5NX2)进行对接。结果胰岛素分泌实验结果显示在高糖(11.1 mmol·L^(-1))条件下,胰岛素分泌量在吐根碱作用下明显升高,且具有剂量依赖性。低糖(2.8 mmol·L^(-1))条件下,胰岛素分泌量在吐根碱干预下没有明显变化,但在高糖(11.1、16.7 mmol·L^(-1))条件下,胰岛素分泌量在吐根碱作用下明显升高,具有类似GLP-1R激动剂葡萄糖浓度依赖性促胰岛素分泌特点。吐根碱与GLP-1R对接打分是Total Score=6.82,C Score=5,表明吐根碱与GLP-1R有良好的亲和力。当GLP-1R被Exendin(9-39)阻断后,吐根碱促胰岛素分泌作用明显降低。结论吐根碱通过激活GLP-1R发挥促离体大鼠胰岛组织胰岛素分泌作用。
关键词: 胰高血糖素样肽-1受体 ；分子对接 ；2型糖尿病 ；吐根碱 ；胰岛素分泌 ；小分子化合物
被引量
2
会议时间： 2023-11-03
摘要： 研究目的:作为典型的慢性代谢性疾病,2型糖尿病是引发认知功能损害的独立危险因素。大量研究发现,有氧运动可以改善2型糖尿病患者的糖脂代谢,有助于提高认知功能。但是,有氧运动对糖尿病并发认知功能损伤的研究仍缺乏足够的证据,分子机制尚不明确。胰高血糖素样肽1 (glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由肠道L细胞分泌的肠促胰岛素肽,其与受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)结合可以通过抑制食物摄取、刺激胰岛素分泌等机制调节糖代谢稳态。GLP-1R作为糖代谢和胰岛素分泌的重要调控因子也受运动调控。有证据表明,长期有氧运动在上调糖尿病小鼠血清胰岛素水平的同时也促进了海马内GLP-1R的基因表达。然而,在糖尿病状态下运动是否能通过调控GLP-1R及其相关因子来促进认知功能尚缺乏报道。研究目的:本研究通过高糖高脂饮食联合链脲佐菌素小剂量腹腔注射建立2型糖尿病模型,通过八周的游泳运动干预,观察有氧运动对2型糖尿病大鼠认知功能的影响,探索其潜在的调控作用。研究方法:二月龄SD大鼠随机分为对照组和模型组。对照组常规饲养,模型组采用八周的高糖高脂喂养联合链脲佐菌素腹腔注射(30mg/kg)构建2型糖尿病模型。挑选造模成功的大鼠,并随机分为模型对照组和模型运动组,每组15只。对照组、模型对照组不运动,模型运动组进行八周游泳运动(1小时/天,5天/周)。最后一次运动结束后,禁食不禁水12小时,腹腔注射5%的水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉大鼠,心尖采血,4℃静置一晚,收集血清存于负80℃备用。大鼠断头,取出大脑于冰上分离海马,负80℃冻存备用。采用Morris水迷宫实验检测大鼠的认知能力;采用HE染色、Nissl染色、电镜技术观察海马CA1区的病理和超微结构;Elisa法检测血清HbA1c水平;蛋白质印迹法(Western blot)检测海马葡萄糖蛋白转运体(GLUT3)、GLP-1R、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)等蛋白的表达。研究结果:(1)有氧运动提高了糖尿病大鼠的空间认知能力。在120秒的空间探索中,对照组大鼠的活动轨迹遍布四个象限,主要集中于目标象限(第Ⅲ象限);模型对照组大鼠的活动轨迹广泛分布于四个象限,没有明显的目标倾向性;模型运动组大鼠的活动轨迹主要集中于目标象限。相较于对照组,模型对照组大鼠在目标象限活动的路程百分比和穿越平台的次数显著减少(P<0.05 or P<0.01);相较于模型对照组,模型运动组大鼠在目标象限活动的路程百分比以及穿越平台次数显著增加(P<0.05 or P<0.01)。(2)有氧运动缓解了糖尿病大鼠海马CA1区神经元的病理损伤。HE染色显示,对照组大鼠海马CA1区神经细胞排列紧密、形态正常、大小均匀;模型对照组大鼠海马CA1区神经细胞排列疏松、大小不均、部分神经细胞核出现固缩;模型运动组大鼠海马CA1区神经细胞相比M组大小稍均匀、偶有细胞固缩。Nissl染色结果显示,对照组大鼠海马CA1区细胞质内尼氏体较多,染色较深;相比对照组,模型对照组大鼠海马CA1区细胞质内尼氏体减少,染色较浅;与模型对照组相比,模型运动组大鼠海马CA1区神经元细胞质内尼氏体稍增多。(3)有氧运动缓解了糖尿病海马CA1区神经元超微结构的损伤。对照组海马CA1区突触清晰,突触间隙小,突触后致密物多,突触小泡多而且清晰,并且线粒体多、线粒体嵴及边缘清晰;模型对照组海马CA1区出现大量空泡,突触不清晰,突触间隙较宽,突触后致密物少,突触小泡少,线粒体少且不完整;与模型对照组相比,模型运动组海马CA1区突触数量增加,突触后致密物变多,突触小泡多,线粒体增多,线粒体膜及线粒体嵴清晰。(4)有氧运动改善了糖尿病大鼠的糖代谢。大鼠血糖水平模型对照组与模型运动组显著高于对照组大鼠(P<0.001),模型运动组大鼠的血糖水平显著低于模型对照组(P<0.05);血清HbA1c水平模型对照组大鼠显著高于对照组大鼠(P<0.05),模型运动组大鼠显著低于模型对照组大鼠(P<0.01),对照组与模型运动组之间没有统计学差异。海马内GLUT3的表达模型对照组显著低于对照组(P<0.05),模型运动组显著高于模型对照组(P<0.05)。(5)有氧运动上调了糖尿病海马内GLP-1R、PI3K、AKT等蛋白的表达。相较于对照组,模型对照组大鼠海马内GLUT3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白的表达显著降低(P<0.05,P<0.01 or P<0.001),GSK-3β、p-GSK-3β蛋白的表达显著升高(P<0.05 or P<0.001);相较于模型对照组,模型运动组大鼠海马内GLUT3、GLP-1R、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白的表达显著上调(P<0.05, P<0.01 or P<0.001),GSK-3β、p-GSK-3β蛋白的表达显著下调(P<0.05)。研究结论:糖尿病状态导致海马内葡萄糖转运能力下降,诱发了海马组织形态及超微结构的改变,导致认知功能损伤。八周游泳运动可通过激活GLP-1R/PI3K/AKT信号轴,改善2型糖尿病大鼠海马内的葡萄糖转运、CA1区病理形态和显微结构,提高认知功能。
关键词: 有氧运动 ；糖尿病 ；认知 ；胰高血糖素样肽1受体
【会议论文】 • 张艳娇
会议时间： 2019-09-06
摘要： 目的:研究藏药三果汤是否可以通过incretin/cAMP信号通路促进胰岛β细胞增殖,抑制胰岛β细胞凋亡,促进胰岛素分泌,从而达到抗糖尿病的作用。方法:成功复制STZ诱导的糖尿病Wistar大鼠模型后,用阳性药物西格列汀片和藏药三果汤给药,并测定大鼠体重和血糖变化。给药6周后,腹主动脉取血,ELISA法测定血清中GIP、GLP-1和TXNIP水平;取大鼠胰腺组织,Western bolt法检测TXNIP、GLP-1R、c AMP、PKA、P-PKA、AKT和胰岛素等蛋白的表达。结果:与模型组相比,治疗组血糖降低,体重逐渐增加;incretin/cAMP信号通路的相关因子GIP,GLP-1,GLP-1R,c AMP,P-PKA和AKT表达均上调,胰岛素分泌增加,但TXNIP的表达下调。除此之外,与模型组相比,三果汤给药组的胰腺组织中胰岛萎缩程度减轻,胰岛β细胞数目增加。结论:藏药三果汤可诱导糖尿病大鼠胰岛β细胞增殖,减少β细胞凋亡,增加胰岛素分泌。本研究表明,藏药三果汤可能通过增强incretin/cAMP信号通路的活性,影响胰岛β细胞的增殖和凋亡,从而达到抗糖尿病的作用。
关键词: 胰岛β细胞 ；糖尿病 ；三果汤 ；胰岛素分泌 ；信号通路 ；增殖与凋亡 ；incretin/cAMP
被引量
1
摘要： 目的:2型糖尿病(T2DM)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)是两种常见的代谢性疾病,两者之间有很大的关联。胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)是一种七膜跨膜受体,主要分布于胰岛β细胞、中枢神经系统和心血管系统等组织。作为GLP-1的靶向受体,GLP-1R激动剂已成为治疗2型糖尿病的有效药物,也被认为对非酒精性脂肪肝的治疗有一定的潜力。小分子GLP-1R激动剂便于口服,可提高患者用药依从性,但是目前市场上尚无此类药物。本研究分析了京尼平苷(一种已确定的GLP-1R激动剂)的转录组学,结合CMap数据库,确定了一种有GLP-1R激动剂样作用的小分子辛可宁,研究其促胰岛素分泌及降血糖作用与GLP-1R的关系,并就其对NASH的治疗进行探索,为小分子药物的重定位提供了一种可行的思路。方法:(1)分析京尼平苷治疗db/db糖尿病小鼠小肠中的转录组学数据,确定差异表达基因(DEGs)。(2)将DEGs输入CMap数据库,得到有GLP-1R激动剂样作用的小分子。(3)使用SYBYL软件将辛可宁与GLP-1R蛋白进行分子对接,确定其可能的结合位点。(4)胰岛素分泌实验观察不同糖浓度条件下辛可宁对离体大鼠胰岛组织胰岛素分泌的影响。(5)口服糖耐量试验(OGTT)观察口服辛可宁是否降低血糖,及其降糖特点。(6)在大鼠胰岛组织中,观察GLP-1R阻断剂Exendin(9-39)对辛可宁促胰岛素分泌作用的影响。(7)使用GLP-1R敲除小鼠及表达人源化GLP-1R小鼠观察口服辛可宁发挥降糖作用的特点。(8)瘦素基因敲除小鼠(ob/ob小鼠)给予GAN饮食进行NASH模型构建,同时给与不同剂量辛可宁进行预防性给药。(9)每日记录ob/ob小鼠体重及摄食量,观察不同剂量辛可宁给药的影响。(10)血清生化检测分析不同剂量辛可宁给药对ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏损伤是否有改善。(11)肝脏组织切片H&E染色并量化分析不同剂量辛可宁给药对ob/ob-GAN-NASH小鼠脂肪变性、脂肪气球样变、炎性浸润及非酒精性脂肪肝评分(NAS)是否有改善。(12)肝脏切片油红O染色并量化分析不同剂量辛可宁给药对ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏脂肪累积是否有改善。(13)肝脏组织切片天狼星红染色并量化分析不同剂量辛可宁给药对ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏纤维化是否有改善。结果:(1)京尼平苷转录组学数据共筛选出211个DEGs,将其输入CMap数据库后得到与其相关性评分最高的化合物辛可宁。(2)使用SYBYL软件进行分子对接结果显示辛可宁分子与GLP-1R蛋白谷氨酸(GLU)残基、谷氨酰胺(GLN)残基间可形成氢键结合。(3)胰岛素分泌实验结果表明,辛可宁糖浓度依赖性地促进大鼠胰岛组织的胰岛素分泌。(4)OGTT结果说明口服辛可宁可剂量依赖性地降低小鼠血糖。(5)胰岛素分泌实验中加入GLP-1R阻断剂Exendin(9-39)后,辛可宁的促胰岛素分泌作用消失。(6)OGTT中使用GLP-1R敲除小鼠后,口服辛可宁的降血糖作用消失。(7)使用表达人源化GLP-1R小鼠的OGTT结果表明口服辛可宁依然有降糖作用。(8)小鼠日常体重及摄食量观察结果说明辛可宁剂量依赖性抑制ob/ob-GAN-NASH小鼠体重增加及食物摄入量。(9)血清生化检测结果说明辛可宁改善了ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏损伤。(10)肝脏组织切片H&E染色及其量化结果显示辛可宁对ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏脂肪变性、脂肪气球样变、炎性浸润及非酒精性脂肪肝评分(NAS)均有改善。(11)肝脏组织切片油红O染色及其量化结果显示辛可宁可改善ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏脂肪积累。(12)肝脏组织切片天狼星红染色及其量化结果显示辛可宁给药对ob/ob-GAN-NASH小鼠肝脏纤维化有改善。结论:辛可宁可激动GLP-1R发挥促胰岛素分泌、降低血糖作用。在ob/ob-GAN-NASH中,口服辛可宁明显抑制体重增加,抑制摄食,并改善肝脏损伤,改善脂肪积累,进而改善肝脏的纤维化。辛可宁的药物重定位为开发小分子GLP-1R激动剂提供了可行的方法和思路。
关键词: 胰高血糖素样肽-1受体 ；辛可宁 ；药物重定位 ；非酒精性脂肪性肝病 ；2型糖尿病
摘要： 糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以持续的高血糖为基本特征的慢性全身性代谢疾病,是由于多种病因引起的胰岛素抵抗或胰岛素分泌绝对或相对不足而引起血糖升高的代谢紊乱性疾病。胰岛素是胰腺β细胞合成的一种调节血糖的激素,除了降低血糖外,胰岛素还可以抑制胰高血糖素的分泌。SP是速激肽家族的一员,是一个11个氨基酸的肽。SP可以直接发挥作用或与神经激肽1(NK-1)受体结合后发挥其作用。SP也被发现作为中枢神经系统的痛觉敏感神经递质,作为外周组织的损伤信使和免疫调节剂。有研究表明,非肥胖糖尿病(NOD)小鼠注射SP后,胰岛素抵抗,慢性炎症胰岛细胞和糖尿病症状被逆转。GLP-1是一种主要由L细胞分泌的肽类物质,GLP-1在促进胰岛素的合成和分泌中起重要作用,它可以抑制β细胞凋亡,提高细胞的增殖和再生,减少胰高血糖素的分泌,延缓胃排空,减少食物的摄入,促进外周组织和减少肝糖输出,增加对葡萄糖的利用。GLP-1发挥降血糖作用是在较高血糖水平下,而在正常情况下则不起作用。这种葡萄糖浓度依赖的降糖特点显著减少了在降糖过程中低血糖情况的发生,是一种新型安全有效的降糖方式。因此,寻找一种安全有效的提高GLP-1浓度的方法显得尤为重要。在本研究中,我们研究了SP在大鼠胰岛团中的潜在功能。研究表明,SP作用于胰腺神经系统与胰岛α细胞的NK-1受体上。SP可能是治疗糖尿病的一种很有前途的治疗策略。实验材料及方法:第一部分:糖尿病大鼠胰腺内P物质的含量变化及其意义健康SD大鼠,体重200-250 g,高脂高糖喂养后注射STZ建立二型糖尿病大鼠模型。乌拉坦麻醉后分离胰腺,显微解剖其胰腺神经节,免疫荧光双染PGP9.5和SP(Substance P)。比较正常组和糖尿病组胰腺神经节内SP表达的变化。western blot和ELISA检测正常组和糖尿病组胰腺内SP蛋白表达的变化。第二部分:P物质对胰岛调控的研究分离纯化大鼠胰岛团,通过FDA/PI双染来选出最优的SP处理浓度后进行细胞培养。将其放入24孔板中培养,分成4组:空白对照组、SP培养组、L-703,606处理组和L-703,606处理2小时后SP培养组,每孔20-30个胰岛团。用ELISA试剂盒来检测胰岛团胰岛素,GLP-1及胰高血糖素的分泌情况。并制作冰冻切片进行NK-1R及α细胞免疫荧光染色。结果:第一部分:糖尿病大鼠胰腺内P物质的含量变化及其意义糖尿病大鼠胰腺神经节神经元中SP阳性表达的占21.3%±1.7%,与正常大鼠性比较(34.0%±1.2%,n=13)有减少(p<0.05)。糖尿病组SP表达为76.7±11.6%(n=5),对照组SP表达为103±10.7%(n=5),差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组SP含量为1903.3±125.2 pg/ml(n=5),正常组SP含量为2989.72±101.3 pg/ml(n=5),差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:P物质对胰岛调控的研究胰岛团分别用含有SP与不含有SP的培养基培养三天后,收集上清进行Elisa检测。加入SP培养后,SP处理组胰岛素释放量(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,p<0.05)与空白组(2.8±0.3μIU/IEQ,n=5,)比较显著升高,GLP-1分泌量(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5,p<0.05)与空白组(4.3±0.3 pM/IEQ,n=5)比较明显增加,胰高血糖素分泌量(31.2±9.4 pM/IEQ,n=5,p>0.05)与空白组(43.9±11.7 pM/IEQ,n=5)略有减少,但两组间差异没有统计学意义。在加入SP受体NK-1R抑制剂L-703,606后,胰岛素释放量(2.6±0.1μIU/IEQ,n=5,p<0.05)与SP组(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,)比较显著减少,GLP-1分泌量(4.2±0.5 pM/IEQ,n=5,p<0.05)与SP组(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5)比较明显减少,胰高血糖素分泌量(22.8±6.4 pM/IEQ,n=5,p>0.05)与SP组(31.2±9.3 pM/IEQ,n=5)相比略有减少,但两组间差异没有统计学意义。在SP条件下与低糖(2.7Mm)培养环境相比(2.6±0.7 pM/IEQ,n=3),高糖(16.7 Mm)条件下GLP-1分泌量(11.7±2.1 pM/IEQ,n=3,p<0.05)明显增加,且24小时之内分泌量随着时间的延长增加。免疫荧光结果显示胰腺神经系统与胰岛有着密切的联系,且在胰岛α细胞上由NK-1受体的表达。结论:在糖尿病病理状态下,胰腺与胰腺神经节中的SP表达均减少。在胰岛细胞中,SP对胰岛细胞有保护作用且可以促进其胰岛素的分泌,可能的机制是通过作用于α细胞的NK-1受体促进GLP-1的分泌导致。
关键词: SP ；胰岛 ；糖尿病 ；GLP-1 ；胰岛素
被引量
3
摘要： 2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus,T2DM)是一种人类常见的代谢紊乱综合征，是由于异常的胰岛素分泌和/或作用引起，以高血糖为主要特征，并且近年来T2DM发病率呈逐渐上升趋势。大量实验结果表明T2DM患者常伴有不同程度的认知功能损害，如学习和记忆障碍，运动效率降低和注意力下降等。DM相关的认知功能下降因其对DM患者的有害影响而越来越受到关注，然而，预防这种病变的临床干预措施却很少。 利拉鲁肽(Liraglutide)是胰高糖素样肽1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1 )类似物，可以穿过血脑屏障并与大脑神经元中的GLP-1受体(GLP-1R)结合，在神经变性和神经发生中发挥神经营养和神经保护作用。据报道，利拉鲁肽外周给药可刺激神经发生，减少细胞凋亡，在体内和体外研究中都表现出对认知功能和海马突触可塑性的有益作用。同时有研究显示利拉鲁肽能通过AMPK/mTOR通路介导上调自噬相关基因表达，促进自噬空泡形成。综上所述，利拉鲁肽能够作为神经保护剂拥有非常好的应用前景，在神经系统中发挥至关重要的作用。在前期预实验工作的基础上，通过检索和阅读文献，我们推测利拉鲁肽能够改善T2DM大鼠的认知功能障碍，提高大鼠学习记忆能力，减少神经细胞凋亡，激活自噬，改善突触可塑性。其潜在机制可能与PI3K/Akt和AMPK通路的介导有关。为了证明我们的预期结论，本课题将以三部分的实验形式进行相关论述。 第一部分利拉鲁肽对糖尿病大鼠的糖脂代谢影响和神经保护作用 目的：分析糖尿病大鼠认知功能改变，探索利拉鲁肽对糖尿病大鼠的糖脂代谢影响和神经保护作用。 方法：选取SPF级雄性32周龄GKr大鼠30只，Wistar大鼠15只，实验分为三组：对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病+利拉鲁肽治疗组(DM+Lira组)。DM+Lira组以200μg/kg剂量于每天固定时间皮下注射利拉鲁肽(1/日，连续4周)，Control组和DM组分别给予等量的生理盐水。检测指标如下：1)于实验第1天和第28天测量大鼠体重和血脂;2)于第1、7、14、21和28天测量大鼠空腹血糖，于实验第1、14、28天检测大鼠空腹胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR数值;3)应用Morris水迷宫、Y迷宫来检测各组大鼠认知功能水平。4)应用免疫组化染色观察不同组大鼠脑组织海马GLP-1R的表达。 结果： 1.体重和血脂情况：实验第1天，DM组和DM+Lira组GK大鼠体重高于Control组Wiatar大鼠，DM组和DM+Lira组大鼠血清TC、LDL-C和TG均高于Control组;实验第28天与DM组大鼠体重相比，DM+Lira组大鼠体重有所下降，血清TC和LDL-C明显下降，而TG无明显变化;2.大鼠空腹血糖测定：实验第7、14、21天，DM+Lira组大鼠空腹血糖相较DM组有明显下降，逐渐趋于达到正常水平。与Control组相比，DM组空腹胰岛素和HOMA-IR升高，当应用利拉鲁肽治疗14天后，DM+Lira组空腹胰岛素和HOMA-IR有所下降，并维持至28天时;3.行为学实验结果：Morris水迷宫中DM组的大鼠逃避潜伏期比Control组明显延长，DM+Lira组大鼠逃避潜伏期明显缩短;Y迷宫实验结果中与Control组相比，DM组和DM+Lira组大鼠实验中错误次数(EN)显著增加，总反应时间(TRT)延长。利拉鲁肽治疗后，大鼠EN减少，TRT明显缩短;4.GLP-1R在海马组织中的免疫组化实验中的表达 GLP-1R能够在Control组大鼠海马组织广泛表达，DM组大鼠GLP-1R表达量显著低于Control组。当给予利拉鲁肽干预后，大鼠海马GLP-1R表达显著增加。 小结：糖尿病大鼠存在糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗和体重增加，应用利拉鲁肽干预后，显著改善糖脂代谢，减轻胰岛素抵抗，降低糖尿病大鼠体重。行为学实验发现，利拉鲁肽治疗能够改善大鼠认知记忆功能障碍。另外GLP-1R广泛表达于大鼠海马神经细胞，给予利拉鲁肽治疗能够明显增加GLP-1R的表达。 第二部分利拉鲁肽在糖尿病脑损伤中通过PI3K/Akt和AMPK信号通路调控自噬功能和细胞凋亡 目的：探讨利拉鲁肽能否通过PI3K/Akt通路和AMPK通路激活自噬，减少细胞凋亡，改善糖尿病大鼠认知功能。 方法：60只雄性GK大鼠被随机分为六组，10只雄性Wistar大鼠作为对照组，实验分为七组：对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)、利拉鲁肽低剂量组(Lira-L组)、利拉鲁肽高剂量组(Lira-H组)、糖尿病+Lira-H+LY294002组(LY294002组)、糖尿病+Lira-H+CompoundC组(CompoundC组)、糖尿病+Lira-H+LY294002+CompoundC组(LY294002+CompoundC组)。对下列指标进行检测：1)Morris水迷宫试验评估大鼠认知功能情况;2)尼氏染色(Nissl Staining)观察大鼠海马组织神经元结构和损伤程度;3)Western-blot蛋白测定实验28天时各组大鼠脑组织PI3K，totalAkt，p-Akt，totalAMPK，p-AMPK，Caspase-3，Bcl-2,Bax,Beclin-1，LC-3Ⅰ，LC-3Ⅱ蛋白表达情况。 结果： 1.Morris水迷宫实验结果：与Control组相比，DM组大鼠逃避潜伏期时间明显延长，目标象限停留时间缩短，Lira-L组大鼠逃避潜伏期有所缩短，目标象限停留时间有所延长，Lira-H组大鼠逃避潜伏期更加缩短，目标象限停留时间明显延长。当给予LY294002后，大鼠逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间缩短。同样的，给予CompoundC后，DM+Lira-H+CompoundC组大鼠逃避潜伏期延长，目标象限停留时间显著缩短。LY294002和CompoundC双抑制剂组大鼠逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间明显缩短;2.尼氏染色结果：Control组大鼠脑神经元形态基本正常，DM组大鼠神经细胞存在变性坏死，Lira-L组大鼠海马神经元萎缩现象有所减少，Lira-H组大鼠海马神经元缺失明显减少;分别加入LY294002和CompoundC后神经元明显丢失，双抑制剂组大鼠海马细胞萎缩和细胞核裂解现象增多;3.脑组织免疫印迹分析结果：与Control组相比，DM组大鼠脑组织Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值、PI3K、p-Akt/Akt比值、p-AMPK/AMPK比值均有所下降，p-m-TOR/m-TOR比值、Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白有所上升。当给予低剂量利拉鲁肽治疗后，Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值、PI3K、p-Akt/Akt比值、p-AMPK/AMPK比值升高，p-m-TOR/m-TOR比值、Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白表达水平降低。高剂量利拉鲁肽处理后自噬激活、PI3K/Akt和AMPK通路激活效果更强。当分别给予LY294002和/或CompoundC后，Beclin-1、LC3-II/LC3-I比值、p-Akt/Akt比值、p-AMPK/AMPK比值下降，p-m-TOR/m-TOR比值、Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比值升高。 小结:利拉鲁肽改善糖尿病大鼠认知损伤呈剂量依赖性，利拉鲁肽能够通过激活PI3K/Akt和AMPK信号通路，激活自噬，减少细胞凋亡改善糖尿病大鼠的认知功能障碍。 第三部分GLP-1受体激动和自噬激活抑制高糖诱导的大鼠海马神经元凋亡 目的：探索利拉鲁肽对高糖诱导的大鼠海马神经元自噬过程的影响，分析利拉鲁肽能否通过激活自噬过程减轻高糖诱导的大鼠海马神经元凋亡。 方法：选取出生1天的Wistar大鼠进行原代海马细胞培养，给予或不给予梯度利拉鲁肽干预(1，10，100和200mmol/L)在正常葡萄糖(5.5 mmol/L)和高糖环境下(30 mmol/L)分别诱导24、48、72和96小时后，应用CCK8法检测细胞活性，选择最佳药物浓度和最佳作用时间用于后续实验。实验分为五组：正常组(NG组)、高糖组(HG组)、利拉鲁肽高糖干预组(HG+Lira组)、3-甲基腺嘌呤高糖干预组(HG+3-MA组)、利拉鲁肽加3-甲基腺嘌呤高糖组(HG+Lira+3-MA组)。3-甲基腺嘌呤以5mmol/L的浓度加入培养基中。对下列指标进行检测：1)Western-blot蛋白测定Beclin-1、P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2蛋白表达情况;2)实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(real-time qPCR)测定Beclin-1、P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2mRNA表达情况;3)TUNEL法检测各组神经元细胞凋亡情况。4)免疫荧光检测P62与Caspase-8在大鼠脑神经元共表达。 结果： 1.免疫印迹分析结果：与NG组相比，HG组Beclin-1蛋白表达降低，P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2比值升高，HG+Lira组Beclin-1表达水平升高，P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2比值降低。HG+Lira+3-MA组神经元Beclin-1蛋白表达量极低，P62、Caspase-8、Bax/Bcl-2比值升高;2.Real-timeqPCR结果：与NG组相比，HG组Beclin-1mRNA表达下降，P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达增加;HG+3-MA组Beclin-1mRNA表达水平显著下降，而P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达上升。HG+Lira组Beclin-1mRNA表达水平显著升高，而P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达下降;HG+Lira+3-MA组神经元Beclin-1mRNA表达量极低，P62、Caspase-8和Bax/Bcl-2mRNA表达明显增加;3.TUNEL结果显示：NG组中凋亡神经元细胞较少，HG组凋亡神经元数目增多，HG+3-MA组神经元凋亡最多。HG+Lira组神经元凋亡有所减少，HG+Lira+3-MA组神经元凋亡数目显著增加。 4.免疫荧光结果：免疫荧光强度值分析结果显示NG组神经元细胞P62和Caspase-8都有少量表达，P62与Caspase-8在HG组神经元中表达明显增多。P62与Caspase-8在大鼠脑神经元共表达，且随着利拉鲁肽的加入其共表达阳性细胞数明显减少，HG+Lira+3-MA组神经元P62与Caspase-8的表达都激活。 小结:高糖诱导的大鼠海马神经元自噬功能发生障碍，自噬功能激活能够抑制神经细胞凋亡，相反自噬功能受到抑制后，凋亡细胞数目增加。利拉鲁肽可通过激活自噬，抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用，可能与P62与Caspase-8相结合发挥作用有关。 结论：高糖能够使大鼠海马神经元自噬功能发生障碍，自噬功能激活能够抑制神经细胞凋亡，利拉鲁肽可通过激活自噬，抑制神经元凋亡，发挥神经保护作用。
关键词: 糖尿病 ；认知功能障碍 ；利拉鲁肽 ；胰高糖素样肽1 ；神经保护
摘要： 目的:肠道菌群与Ⅱ型糖尿病(T2D)发生发展密切相关。肠道菌群的失调会引起肠渗透性的增加,促使脂多糖等毒性物质透过肠粘膜系统进入血液,引起胰岛素敏感器官的低度炎症及胰岛素抵抗,加速糖尿病进程。益生菌能通过调节肠道菌群发挥抗糖尿病作用。前期研究已初步明确乳源性复合益生菌发酵的驼乳能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖及血脂代谢,其可能与促进胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌有关,但乳源性复合益生菌是否具有抗糖尿病作用以及其可能的抗糖尿病分子机制仍不明确。本研究首先探讨乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学作用;其次探讨乳源性复合益生菌对肠道菌群的影响,最后探讨乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌以及M2极化的分子机制研究。方法:第一部分:以C57BL/Ks小鼠作为正常对照组。以db/db小鼠作为T2D模型组。实验分为正常组、模型组、二甲双胍组、利拉鲁肽组、低剂量及高剂量乳源性复合益生菌组。所有组平行操作干预六周。试剂盒检测各组鼠血糖参数(FBG、OGTT、AUC、Hb Alc、C肽)及血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)参数指标,HE染色观察胰腺、肝脏、附睾白色脂肪组织形态,验证乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学作用。第二部分:提取各组鼠粪便细菌总DNA,琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白仪检测细菌总DNA纯度及浓度,q RT-PCR构建目标菌群标准曲线及检测目标菌群含量,明确乳源性复合益生菌对肠道菌群的调节作用。第三部分(一):1)气相色谱法检测粪便中乙酸、丙酸及丁酸含量,Elisa、q RT-PCR及Western blot分别检测血浆GLP-1含量、GLP-1R基因以及GLP-1蛋白表达,q RT-PCR检测结肠组织前胰高血糖素(GCG)、前激素转化酶1/3(PC1/3)、G蛋白偶联受体43(GPR43)、GPR41m RNA表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过激活短链脂肪酸受体GPR43及GPR41活性,并上调GCG、PC1/3 m RNA表达,诱导GLP-1分泌;2)Western blot及免疫组化法检测胰腺组织炎症因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、NF-κB、p-NF-κB、ICAM-1、VCAM-1)表达,Elisa法检测血清抗氧化物酶(SOD、CAT及GSH/GSSG)活性,免疫组化法检测胰腺组织insulin蛋白表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过抗炎、抗氧化作用改善胰腺功能;3)Western blot及免疫组化法检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K及AKT)表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡。第三部分(二):1)试剂盒检测粪便及血清中脂多糖(LPS)含量,免疫组化法检测结肠炎症因子(ICAM-1、VCAM-1、NF-κB、p-NF-κB)表达,q RT-PCR及免疫组化法检测紧密连接蛋白及黏蛋白(Claudin-1、Occludin-1、ZO-1、Mucin-2)表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过减少LPS生成,抑制炎症因子表达,增加紧密连接蛋白及黏蛋白表达,改善肠屏障功能;2)q RT-PCR检测结肠组织抗氧化酶(CAT、SOD1、GR、GSH-Px等)表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过抗氧化作用抑制结肠氧化应激损伤;3)q RT-PCR及western blot检测M1极化因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ等)、M2极化因子(IL-10、Arg-1、TGF-β等)及TLRs/My D88/NF-κB表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过TLRs/My D88/NF-κB信号通路诱导结肠M2型极化。结果:第一部分:1)乳源性复合益生菌降低FBG、Hb A1c含量,升高C-肽含量及口服葡萄糖耐受能力,具有降血糖作用;2)乳源性复合益生菌降低TG、TC、LDL-C含量,具有降血脂作用;3)HE染色结果显示,乳源性复合益生菌显著改善db/db鼠胰腺、肝脏及脂肪形态。第二部分:1)乳源性复合益生菌显著减少Firmicutes/Bacteroidetes、革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)、大肠埃希菌属(Escherichia coli)含量;2)乳源性复合益生菌对革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及屎肠球菌(Enterococcus faecium)无影响。3)乳源性复合益生菌显著增加db/db鼠产短链脂肪酸菌,包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、柔嫩梭菌属(Clostridium leptum)、普氏菌属(Prevotella);第三部分(一):1)乳源性复合益生菌显著增加丙酸及丁酸含量,上调GPR43、GPR41、GCG、PC1/3m RNA表达,增加结肠GLP-1分泌;2)乳源性复合益生菌抑制炎症因子及黏附分子(NF-κB、p-NF-κB、ICAM-1、VCAM-1)表达,增加血清抗氧化物酶(CAT、SOD、GSH/GSSG)活性,改善胰腺功能;3)乳源性复合益生菌激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡。第三部分(二):1)乳源性复合益生菌减少血清及粪便LPS含量,抑制粘附(ICAM-1、VCAM-1)表达、促进紧密连接蛋白及黏蛋白(Claudin-1、Occludin-1、ZO-1、Mucin-2)表达,改善肠道屏障功能;2)乳源性复合益生菌促进结肠抗氧化物酶CAT、SOD1、GSH-Px m RNA表达,下调i NOS及COX-2 m RNA表达,抑制结肠氧化应激损伤;3)乳源性复合益生菌能抑制TLRs/My D88/NF-κB信号通路,诱导结肠由M1型促炎极化转为M2型抗炎极化。结论:1)乳源性复合益生菌有效降低db/db鼠血糖及血脂,改善胰腺、肝脏、附睾白色脂肪形态,具有抗糖尿病药效学的作用;2)乳源性复合益生菌显著增加产短链脂肪酸菌群及其代谢产物丙酸及丁酸,激活GPR43及GPR41活性,并增加GCG及PC1/3m RNA表达,促进GLP-1分泌;3)乳源性复合益生菌能增加血清抗氧化物酶活性,抑制炎症因子表达,以及激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡,促进胰岛素分泌;4)乳源性复合益生菌显著减少革兰氏阴性菌及其代谢产物LPS含量,增加结肠抗氧化物酶活性,抑制黏附分子表达,上调紧密连接蛋白及黏蛋白表达,改善肠道屏障功能,并通过抑制TLRs/My D88/NF-κB信号通路诱导结肠M2型极化。
关键词: 乳源性复合益生菌 ；Ⅱ型糖尿病 ；肠道菌群 ；GLP-1 ；M1/M2极化
被引量
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摘要： 目的:罗氟司特作为第一个正式应用于临床治疗的磷酸二酯酶4抑制剂,对慢性阻塞性肺疾病的治疗有积极作用。从药理作用来看,罗氟司特能够抑制细胞内磷酸二酯酶4的活性,从而增加细胞内第二信使cAMP的含量,进而发挥包括抗炎作用在内的一系列生物学功能。最新的研究发现罗氟司特能够降低伴有糖尿病的COPD患者的空腹血糖和糖化血红蛋白水平,并减轻患者体重,可以更好的维持体内葡萄糖的稳态。进一步的研究提示罗氟司特可能通过增加血浆GLP-1而促进胰岛素分泌。基于以上的研究背景,我们考虑到一方面细胞内cAMP浓度的改变可能会明显影响机体胰岛素的产生,而罗氟司特能够增加细胞内cAMP含量,另一方面胰岛β细胞作为一种电兴奋细胞,其分泌胰岛素的功能与细胞膜离子通道的兴奋性有密切关系,因此,本课题着重探索了罗氟司特对胰岛β细胞电生理学和胰岛素分泌的影响,以及对胰岛β细胞生存、增殖的影响,进一步探讨了发挥这些效应可能的信号转导通路和调控机制,为罗氟司特可能有效的预防和治疗糖尿病提供理论依据和实验支持。方法:1.大鼠胰岛组织和β细胞的分离和培养。分离大鼠胰腺组织后给予胶原酶P在37℃水浴中消化大鼠的胰腺,并以密度梯度离心法获得大鼠胰岛,并进一步消化分离为胰岛β细胞,用于进一步的实验。2.通过胰岛素分泌实验观察罗氟司特对大鼠胰岛组织的胰岛素分泌的影响。分别给予不同浓度和剂量的葡萄糖和罗氟司特进行干预,观察其对胰岛素分泌的影响。3.通过全细胞膜片钳实验探讨罗氟司特对β细胞动作电位、电压依赖性钾通道、电压依赖性钙通道的通道电流的影响。应用全细胞膜片钳技术,观察给予不同浓度的罗氟司特和特异性信号通路阻断剂应用后对β细胞动作电位、电压依赖性钾通道、电压依赖性钙通道的影响。4.应用Ca2+特异的荧光染料Fluo-4AM孵育胰岛β细胞,通过酶标仪检测罗氟司特对β细胞的特异性荧光强度的影响,反映了罗氟司特对细胞内钙离子浓度变化的影响以及引起这种变化的相关信号转导机制。5.应用CCK-8法检测了罗氟司特对高糖高脂以及毒胡萝卜素诱导的胰岛INS-1细胞和CHO-Kv2.1细胞增殖生存的影响,并探讨了罗氟司特影响β细胞增殖、生存的可能机制。6.应用C57BL/6小鼠和db/db糖尿病模型小鼠的胰岛β细胞,探讨了罗氟司特对整体动物状态下胰岛素分泌以及病理状态下电压依赖性钾通道等电生理学变化的影响。结果:1.在低葡萄糖浓度（2.8mmol/L）条件下,不同剂量的罗氟司特（100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L）均没有明显影响胰岛素分泌,而在较高葡萄糖（8.3m M）情况下,罗氟司特（200nmol/L、300nmol/L）明显地促进了大鼠胰岛的胰岛素分泌。表明罗氟司特能剂量依赖性的促进大鼠胰岛的胰岛素分泌。2.在低葡萄糖（2.8 mmol/L）条件下,罗氟司特（200nmol/L）没有明显地影响胰岛素分泌,而在较高葡萄糖（8.3mmol/L）和高葡萄糖（16.7mmol/L）的情况下,罗氟司特（200nmol/L）均明显地促进了大鼠胰岛的胰岛素分泌。表明罗氟司特能葡萄糖浓度依赖性的促进胰岛素分泌。3.罗氟司特抑制了胰岛β细胞的电压依赖性钾（Kv）通道,并延长了β细胞的动作电位时程（APD）。4.罗氟司特增加了β细胞内的钙离子浓度,但是并没有明显激活β细胞的电压依赖性钙通道（VDCC）。5.Kv通道在罗氟司特调控的大鼠胰岛素分泌中发挥了重要作用。6.通过应用CHO-Kv2.1细胞,发现罗氟司特并不是直接抑制Kv通道。7.罗氟司特通过AC/cAMP/Epac信号转导通路抑制了Kv通道电流,并促进了胰岛素的分泌。8.罗氟司特通过抑制Kv通道,延长动作电位时程而增加了细胞内Ca2+浓度。9.罗氟司特能够改善高糖高脂诱导INS-1细胞的细胞活力,发挥对INS-1细胞的保护作用。10.罗氟司特通过抑制Kv通道发挥了改善高糖高脂和毒胡萝卜素（Thapsigargin）诱导的INS-1细胞的细胞活力,发挥对INS-1细胞的保护作用。11.罗氟司特不能改善高糖高脂诱导CHO-Kv2.1细胞的细胞活力,对CHO-Kv2.1细胞的保护作用不明显。12.罗氟司特能够增加C57BL/6小鼠的血胰岛素水平,进而降低了C57BL/6小鼠的血葡萄糖水平。13.罗氟司特能够抑制db/db糖尿病小鼠的电压依赖性钾通道,并促进db/db糖尿病小鼠的胰岛素分泌。结论:1.罗氟司特能够剂量依赖性和葡萄糖依赖性的促进大鼠的胰岛素分泌。2.罗氟司特通过AC/cAMP/Epac信号通路抑制了Kv通道,最终促进了胰岛素分泌。3.罗氟司特没有影响电压依赖性钙离子通道,而是通过抑制电压依赖性钾通道,延长了动作电位时程,增加了细胞内钙离子浓度,最终促进了胰岛素的分泌。4.罗氟司特能够改善高糖高脂和毒胡萝卜素诱导的INS-1细胞的细胞活力,具有对胰岛β细胞的保护作用。5.罗氟司特能够改善C57BL/6小鼠的葡萄糖代谢,也促进了db/db糖尿病小鼠的胰岛β细胞的胰岛素分泌。
关键词: 罗氟司特 ；胰岛素分泌 ；电压依赖性钾(Kv)通道 ；cAMP直接激活的鸟苷酸交换蛋白(Epac) ；磷酸二酯酶(PDE)
摘要： 前言:目前随着人们生活方式的改变,肥胖症、糖尿病等代谢性疾病的发病率逐年上升,而这些疾病都有共同的发病基础“胰岛素抵抗”。因此,有关胰岛素抵抗方面的研究一直是内分泌界的研究热点。目前的观点认为:胰岛素抵抗的原因是胰岛素信号转导通路的缺陷。既往关于胰岛素抵抗的研究多集中在肝脏、骨骼肌、脂肪等胰岛素作用的外周组织,而近年来的研究表明,胰岛β细胞除了分泌胰岛素,本身也存在胰岛素信号转导通路,胰岛β细胞本身的胰岛素信号转导通路对维持其数量、生长、分泌功能均起重要作用,而胰岛β细胞本身的胰岛素信号转导通路的缺陷将导致β细胞功能的紊乱,最终参与肥胖症、糖尿病以及其他代谢紊乱性疾病的发生。增食欲素A（orexin A）和增食欲素B（orexin B）是1998年由两组科学团队发现的下丘脑神经肽,通过激活两种G蛋白偶联受体而发挥作用,分别为增食欲素受体1（orexin receptor 1,OX1R）和增食欲素受体2（orexin receptor 2,OX2R）。其中OX1R是首先被发现的,且与orexin A有较高的亲和性。越来越多的研究表明,orexin系统在包括中枢神经系统及多种外周组织中均有表达。大量的资料显示,orexin A及其受体参与多种生理功能的调节,包括摄食、睡眠-觉醒、生长、生殖、应激、能量代谢平衡及内分泌等。最近的研究表明,orexinA及其受体还参与细胞增殖与凋亡的调控。1999年,有学者发现大鼠胰腺组织有orexin A、OX1R的表达,说明orexin A及其受体OX1R参与胰岛细胞功能的调节。已有多个实验证实orexin A可在体内、体外影响胰岛素的分泌,但结论并不一致,且机制尚不清楚。另外,关于orexin A及其受体OX1R对胰岛细胞增殖、凋亡的影响鲜见报道。本研究通过高脂饮食喂养建立胰岛素抵抗肥胖大鼠模型,应用高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验证实模型的建立,观察orexin A及其受体OX1R,胰岛素受体后信号转导通路IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt在胰岛素抵抗肥胖大鼠体内的表达改变,观察orexin A及其受体OX1R对胰岛β细胞胰岛素分泌、细胞的增殖与凋亡的调节,orexin A及其受体OX1R对体外培养的INS-1细胞IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt等胰岛素受体后信号通路蛋白表达水平的影响,及orexin A及其受体OX1R对体外培养的胰腺癌细胞增殖的影响,探讨orexin A及其受体OX1R对胰岛β细胞功能的调节作用及其可能的分子机制。实验方法:1、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠中的表达研究选择8周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只,随机分为2组:正常对照组（NC组）、高脂饮食组（HF组）。NC组予以普通颗粒饲料、HF组予以高脂饲料,饲养8周。8周后,各组大鼠称取体重,每组随机选取5只进行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验验证胰岛素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心脏取血,分别进行血糖、血脂、胰岛素、orexin A水平测定。处死大鼠后,摘取肾周及附睾周围脂肪组织称重,留取胰腺组织,应用免疫组化检测胰腺组织OX1R定位表达,分离提取胰岛细胞,应用实时定量PCR检测胰岛细胞胰岛素受体后信号转导通路（IRS-1、IRS-2/PI3K/AKT）mRNA的表达情况。western-blot技术检测胰岛细胞OX1R蛋白表达。采用SPSS 13.0统计软件进行分析统计,P<0.05表示有统计学意义。2、Orexin A及OX1R干预胰岛β细胞增殖、凋亡和分泌功能的研究体外培养大鼠INS-1细胞,分别加入不同浓度的orexin A和/或OX1R特异性抑制剂（SB334867）和/或PI3K特异性拮抗剂（LY 294002）进行干预,western-blot技术检测细胞OX1R蛋白表达;放免法测定培养液中胰岛素分泌浓度;MTT法检测细胞增殖;凋亡试剂盒检测细胞凋亡。3、Orexin A及OX1R调节胰岛β细胞内IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt信号通路的研究体外培养大鼠INS-1细胞,分别加入10-8M的orexin A和/或SB334867进行干预,western-blot检测IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt总蛋白及磷酸化蛋白的表达。4、Orexin A及OX1R对胰腺癌细胞增殖的影响研究体外培养PANC 1细胞,western-blot检测OX1R表达,加入orexin A和/或SB408124,CCK-8检测细胞增殖。实验结果:1、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠中的呈规律性表达（1）胰岛素抵抗肥胖大鼠体重及内脏脂肪变化喂养至8周时,HF组大鼠体重较NC组明显升高,内脏脂肪与体重百分比显著高于NC组。（2）胰岛素抵抗肥胖大鼠血清生化指标的变化HF组大鼠血清TG、TC、LDL-C均显著高于NC组,HDL-C均显著低于NC组,FBG水平有所升高,但是无显著性差异。（3）胰岛素抵抗肥胖大鼠血清胰岛素的变化HF组大鼠FINS较NC组明显升高,但GIR明显降低。（4）胰岛素抵抗肥胖大鼠胰岛细胞胰岛素受体后信号转导通路的变化实时定量PCR结果显示:HF组大鼠胰岛细胞胰岛素信号转导通路IRS-1、IRS-2/PI3K/AKT mRNA表达较NC组明显减少。（5）胰岛素抵抗肥胖大鼠体内orexin A及OX1R的变化ELISA结果显示:胰岛素抵抗肥胖大鼠体内orexin A水平较NC组明显升高。免疫组化结果显示:大鼠胰腺组织有OX1R免疫阳性细胞表达,HF组胰腺细胞OX1R阳性染色颗粒较NC组明显减少。Western-blot结果显示:HF组大鼠胰岛细胞OX1R蛋白表达较NC组明显减少。2、Orexin A及OX1R干预胰岛β细胞增殖、凋亡和分泌功能（1）Orexin A对INS-1细胞OX1R蛋白表达的影响不同浓度的orexin A均可诱导INS-1细胞OX1R蛋白的表达,其中10-10M和10-8M组效应具统计学意义。（2）Orexin A对INS-1细胞胰岛素分泌水平的影响不同浓度的orexin A均可促进INS-1细胞基础及高糖刺激后的胰岛素分泌,其中10-88 M浓度时的orexin A刺激胰岛素分泌效应最显著。加入OX1R特异性抑制剂后,orexin A对INS-1细胞胰岛素分泌的刺激作用受到抑制。加入PI3K特异性拮抗剂后,orexin A促进胰岛素分泌的作用受到部分抑制。（3）Orexin A对INS-1细胞增殖的影响10-10M和10-8M的orexin A均可诱导INS-1细胞增殖,效应有统计学意义,OX1R特异性抑制剂可抑制这种作用。加入PI3K特异性拮抗剂后,orexin A促进胰岛细胞增殖的作用受到部分抑制。10-6M浓度orexin A组则未观察到显著效果。（4）Orexin A对INS-1细胞凋亡的影响10-10M和10-8M浓度的orexin A可显著减少INS-1细胞凋亡,而10-6M浓度的orexin A不具有这样的作用,同样加入OX1R特异性抑制剂可抑制这种凋亡保护作用。加入PI3K特异性拮抗剂后,orexin A减少胰岛细胞凋亡的作用亦受到部分抑制。3、Orexin A及其受体1调节胰岛β细胞内IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt信号通路的研究（1）培养液中加入10-8M orexin A可使IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt磷酸化蛋白表达水平上调,总蛋白表达水平无明显改变。（2）培养液单独加入OX1R特异性抑制剂SB334867后,INS-1细胞IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt磷酸化蛋白表达水平无明显变化,但其可抑制orexin A的作用。4、Orexin A及OX1R对胰腺癌细胞增殖的影响研究（1）PANC 1细胞中OX1R表达升高。（2）加入Orexin A后PANC 1细胞增殖增加,但OX1R特异性抑制剂SB408124可抑制orexin A的作用。结论:1、高脂饮食诱导的肥胖大鼠体内存在胰岛素抵抗病理特性;胰岛细胞胰岛素受体后信号转导通路受损。2、胰岛素抵抗肥胖大鼠体内血浆orexin A水平升高,其受体OX1R在胰腺组织蛋白表达水平显著降低,说明其可能参与胰岛细胞功能的调节。3、orexin A通过OX1R及PI3K通路调节胰岛β细胞分泌功能,并促进胰岛β细胞增殖、抑制细胞凋亡。4、orexin A通过OX1R正性调节INS-1细胞内IRS-1、IRS-2/PI3K/Akt胰岛素受体后信号转导通路,参与干预INS-1细胞分泌功能及细胞增殖和凋亡的调节。5、OX1R在胰腺癌细胞中高表达,orexin A通过OX1R调节PANC 1细胞增殖。
关键词: 胰岛素抵抗 ；肥胖 ；胰岛β细胞 ；orexin A ；OX1R ；IRS-1 ；PI3K
被引量
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摘要： 糖尿病是一种发病率呈现持续升高趋势的内分泌疾病,胰岛β细胞凋亡和增殖是糖尿病发病的重要原因之一。研究发现,高糖可通过激活线粒体途径和炎症小体途径等途径诱导胰岛β细胞凋亡,进而抑制胰岛素的分泌,最终导致糖尿病的发生。因此,抑制胰岛β细胞凋亡,对于延缓糖尿病的发生有着很重要的意义。藏药三果汤是一种常用于治疗高原红细胞增多症的方剂,国外研究发现,藏药三果汤可抑制α葡萄糖苷酶来降低人体的空腹血糖。但关于藏药三果汤可通过抑制胰岛β细胞凋亡治疗糖尿病的研究尚无报道。因此本课题对不同剂量的藏药三果汤能否影响肠促胰素（incretin）信号途径调节高糖诱导的胰岛β细胞凋亡和胰岛β细胞增殖进行研究,为藏药三果汤治疗糖尿病的研究与开发提供一定的依据及参考。第一部分藏药三果汤中没食子酸含量测定目的建立测定藏药三果汤水提物中主要成分没食子酸的HPLC方法。方法采用Agilent C18 ZORBAX SB-C18柱（4.6×250mm,5 um）;流动相:甲醇-0.3%磷酸（4:96）;检测波长:273nm;柱温:25℃;流速:1mL/min的色谱条件进行含量测定。结果藏药三果汤水提物中没食子酸的色谱峰与杂质峰分离效果良好,且色谱峰没出拖尾的现象,在0.16-0960μg（r2=0.9997）内线性关系良好,平均含量为13.515mg/g,平均加样回收率为97.15%,RSD为1.78%。结论本方法出峰时间短,流动相组成较简单,重现性良好,测得没食子酸含量较多,也可为藏药三果汤水提物质控提供一定参考依据。第二部分藏药三果汤对糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡与增殖的影响目的探讨藏药三果汤对糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡与增殖的影响。方法给Wistar雄性大鼠单次腹腔注射STZ造模,3 d后测随机血糖,如果随机血糖≥16.7mmol/L,则认为造模成功,灌胃0.43g/kg、0.86g/kg、1.72g/kg剂量的三果汤进行治疗,阳性药选用西格列汀进行灌胃给药治疗,给药6周后,取血、剥离胰腺组织,用ELISA法检测大鼠血清中GLP-1、GIP的水平变化、胰腺组织中cAMP的水平变化,进行HE染色、醛品红-橙黄G染色、缓冲硝酸银染色观察胰岛、胰岛β细胞及胰岛α细胞变化情况,Western blot法测定高糖状态下胰腺组织中TXNIP、GLP-1R、insulin、TCF7L2、AKT的表达变化。结果1.建模成功的糖尿病大鼠给药6周后,测定血清GLP-1、GIP水平及胰腺组织中cAMP的水平,与模型组相比,三果汤给药组血清GLP-1、GIP水平均升高（p<0.01）,三果汤给药组cAMP的水平升高（p<0.01）。3.病理切片结果:（1）HE染色显示:正常组大鼠胰腺组织镜下观察胰岛较大,胰岛细胞较多,处于中央位置;模型组大鼠胰岛萎缩,胰岛细胞数量较少,胰岛与周边细胞界限不明显;（2）胰岛细胞橙黄G染色显示:模型组胰岛β细胞减少,胰岛β细胞胞质内颗粒较少。而阳性组、三果汤给药组胰岛β细胞数量相对较多,胰岛形态也有所恢复。（3）缓冲硝酸银染色显示:模型组胰岛α细胞增多,胞质内颗粒含量较多。而阳性组、三果汤给药组胰岛α细胞数量相对较少。4.Western结果显示:与正常组相比,模型组TXNIP、TCF7L2蛋白表达上调,GLP-1R、insulin、AKT蛋白表达均下调（p<0.01）,给予藏药三果汤灌胃后,与模型组相比,三果汤给药组TXNIP、TCF7L2蛋白表达均下调（p<0.05）,GLP-1R、insulin、AKT蛋白表达均上调（p<0.01）。结论:藏药三果汤可通过抑制TXNIP的表达,提高Wnt/β-catenin通路活性,从而升高血清incretin（GLP-1及GIP）水平,增加细胞内cAMP水平、促进胰岛素分泌、抑制β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖。
关键词: 高糖 ；胰岛β细胞凋亡 ；藏药三果汤 ；Wnt/β-catenin ；肠促胰素
被引量
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摘要： 背景与目的:精神分裂症是一种严重的慢性精神障碍,患者的预期寿命比一般人群短14-20年且死亡率高,其中35%的自然死亡归因于心血管疾病和糖尿病。精神分裂症主要以药物治疗为主,其中以奥氮平(Olanzapine,Ola)为代表的非典型抗精神病药物(Atypical antipsychotic drugs,AAPDs)在临床上使用最为广泛,但是伴随着治疗作用的同时此类药物可引起严重的代谢性副作用,如体重增加、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗和糖尿病,不仅影响患者服药依从性,还会加剧患糖尿病风险甚至导致死亡。所以AAPDs引起的糖代谢性不良反应需要重点关注,阐明AAPDs诱导糖代谢紊乱的机制对于其不良反应的预防和治疗及其临床治疗结局极为重要。GLP1是一种具有多种降血糖作用的新型药理学靶标,可作用于多个靶器官,包括胰腺、胃肠道、大脑等,在维持糖代谢稳态中发挥重要作用。虽然有临床试验表明GLP1R激动剂利拉鲁肽(Liraglutide,Lir)在缓解AAPDs引起的肥胖和糖耐量受损方面具有比二甲双胍更好的潜在优势,但是目前联合用药的临床证据和机制并不充分,干预药物的选择仍存在争议,因此需要更多基础研究来确定干预药物的有效性及相关机制。方法与结果:1.AAPDs对大鼠糖代谢的影响选择AAPDs中临床使用量最多的Ola和治疗青少年精神分裂症的主要药物阿立哌唑(Aripiprazole,Ari)以及上市新药依匹哌唑(Brexpiprazole,Bre)为这部分的受试药物,系统地考察这三种AAPDs的糖代谢副反应程度,初步确定一种代表药物来开展后续的机制探究实验。选取180～200 g SD大鼠随机分为四组:溶媒对照组(Veh)、Ola给药组(Ola,1 mg/kg,oral),Ari给药组(Ari,1 mg/kg,oral),Bre给药组(Bre,0.5 mg/kg,oral),每组12只,雌雄各半,通过训练自主口服给药处理28天,隔天测定大鼠体重和进食,每周测定空腹血糖,给药结束前通过OGTT和ITT分别测定大鼠的葡萄糖耐受和胰岛素耐受情况,给药结束收集大鼠血清及各个组织展开后续检测。结果显示,AAPDs处理后,大鼠体重、血脂(TG、TC、LDL、FFA)和血糖(FBG、GSP)明显升高且雌性较雄性大鼠的体重及血糖增加更明显。用ELISA法测定血清中代谢相关激素水平,发现Ola和Bre显著降低了餐后Insulin和GLP1的水平(P<0.05),进一步通过Pearson相关性分析发现GLP1与体重和血糖呈现显著负相关性,表明GLP1可能在AAPDs介导的葡萄糖和脂质代谢紊乱中起关键作用,可以围绕GLP1进一步开展研究。OGTT和ITT实验证实了AAPDs易引起糖耐量和胰岛素敏感性受损。通过IHC、HE染色和WB、q PCR分析,主要得到如下结果:Ola和Bre均能显著抑制胰腺和小肠GLP1的蛋白和m RNA水平(P<0.05);Ola和Bre处理后胰腺GLP1R、PI3K、IRβ表达降低,引起胰岛功能障碍;Ola和Bre通过干扰肝脏和骨骼肌中IRS1、PI3K、p-AKT和GLUT4的表达,诱导胰岛素抵抗。Ola,Ari和Bre均有引起体重增加,血糖升高,胰岛功能障碍和胰岛素抵抗的风险,但是三者的反应程度不完全一致,Ola引起的体重增加和血糖升高是最显著的,其次是Bre,而Ari引起的代谢紊乱并没有达到统计学意义的显著性。因此我们选择Ola为代表药物进一步深入地去进行机制探究,并在后续研究中选择反应性更强的雌性作为研究对象。2.GLP1参与奥氮平介导的糖代谢紊乱为了进一步确认GLP1是否作为Ola介导糖代谢紊乱的靶标,首先将第一部分实验中Ola处理组雌性大鼠的小肠组织进行转录组学测序。通过差异表达基因分析共发现2870个差异表达基因,相对于Veh组,Ola组显著上调的基因总数为806个,下调基因总数为1683个。接着将所有差异基因进行了GO富集分析和KEGG富集分析,发现差异表达基因主要参与生化代谢途径和信号转导途径,包括脂肪酸合成、延长与分解以及糖酵解/糖异生,经过筛选脂肪酸代谢富集到的5个显著变化基因有:Slc27a2、Cpt1a、Fasn、Acaca、Evol4,糖酵解富集到的显著变化的5个基因分别是:G6pc、Hk2、Pfkm、Adpgk、Glp1。KEGG pathway显示Ola作用后,小肠组织中钙离子信号通路、c AMP信号通路、PPAR信号通路及胰岛素分泌等信号通路发生了显著变化。结合第一部分实验结果及文献调研我们选择了GLP1、PPARγ为兴趣靶点进行后续研究。然后选取42例临床服用Ola的女性精神分裂症患者进行了为期1年的动态观察,考察Ola对患者糖代谢及GLP1、PPARγ表达的影响,进一步明确GLP1在Ola介导的代谢性副反应中的作用以及PPARγ与GLP1的相关性。在基线期(用药前)、用药1个月、用药2个月和用药12个月时对各临床指标(体重、腰臀围、血糖血脂等)进行监测,并采用ELISA法测定患者血清中Insulin、GLP1及PPARγ的表达。结果显示,患者的平均体重、体重指数、腰围及腰臀比在整个服药过程中显著增加(P<0.05);患者服用Ola后血清中TG、LDL、GLU及GSP较基线时显著升高(P<0.001),而血清中HDL、Insulin、GLP1及PPARγ相对于基线水平显著降低(P<0.01)。通过Pearson相关性分析发现患者Insulin含量与GLP1水平呈现极显著的正相关性(r=0.9052,P<0.0001),GLP1与PPARγ具有显著的正相关性(r=0.7324,P<0.0001),确定了GLP1参与了Ola介导的大鼠和精神分裂症患者的代谢性副反应。3.奥氮平通过M1R/PPARγ/β-Catenin通路调控GLP1分泌在确认GLP1可能作为Ola介导糖代谢紊乱的靶标后,选择研究GLP1分泌常用的小肠内分泌STC-1细胞系来开展Ola对GLP1分泌调控的机理研究。首先使用CCK8法筛选Ola的安全浓度,并选择低中高三个浓度梯度(1.25、5、20μM)作用于STC-1细胞。通过ELISA测定发现随着Ola浓度的增加STC-1细胞中GLP1分泌量逐渐减少;通过IF双重染色确定了STC-1细胞中的GLP1主要定位于细胞质而PPARγ定位于细胞核和细胞质中,并且两者荧光强度被Ola剂量依赖性地减少;通过WB及q PCR实验发现Ola能显著抑制GLP1、PPARγ、AMPK、PKC以及TCF4的表达,同时上调FOXO3的表达,并呈现一定的剂量依赖性(P<0.05)。为了进一步考察Ola是否通过PPARγ实现对GLP1的转录调控,我们建立了PPARγ过表达的STC-1细胞模型。结果显示PPARγ过表达质粒转染细胞后,细胞中PPARγ的m RNA与蛋白水平以及GLP1的分泌量发生了极显著的上调(P<0.01)。在PPARγ过表达质粒与Ola(20μM)联合使用时,GLP1的分泌量及m RNA表达量较Ola单用时显著增加(P<0.01),同时伴随着FOXO3的显著下调及TCF4的显著上调(P<0.05)。IF染色显示PPARγ过表达促进了β-Catenin的入核。进一步通过Co-IP实验发现PPARγ与β-Catenin能形成复合物,而Ola处理后能减少与PPARγ复合的β-Catenin的量。上述结果表明Ola可以通过PPARγ介导对GLP1的调控,PPARγ能促进GLP1转录因子β-Catenin入核并与TCF4形成转录复合物发挥对GLP1转录调控的功能,另一方面也能通过抑制FOXO3,减少对TCF4/β-Catenin复合物的竞争性抑制,促进GLP1的转录。接着为了考察Ola的药理靶点M1R是否作为PPARγ的上游靶点发挥对STC-1细胞GLP1分泌调控的直接作用,我们引入了M1R激动剂氯贝胆碱(Bethanechol,Beth)进一步探究Ola抑制GLP1分泌的可能机制。结果显示,M1R激动剂与Ola联用时能恢复Ola对GLP1分泌的阻滞作用(P<0.05)。通过WB和q PCR分析发现M1R激动剂能增加PKC、AMPK的表达,引起PPARγ及下游β-Catenin、TCF4信号的激活,最终缓解由Ola介导的GLP1的蛋白和转录水平的抑制(P<0.05)。此外,钙离子探针染色发现M1R激动剂与Ola联用能显著增加细胞内钙离子浓度(P<0.05),促进GLP1的分泌。4.GLP1类似物利拉鲁肽能有效缓解奥氮平引起的糖代谢异常首先通过动物实验探索GLP1类似物Lir能否有效缓解Ola长期使用引起的糖代谢异常。选取32只180～200 g SD雌性大鼠随机分为四组:空白对照组(Con)、Lir给药组(Lir,0.125 mg/kg,i.p.)、Ola给药组(Ola,1 mg/kg,oral)、Ola与Lir联合给药组(O+L,1 mg/kg Ola,oral;0.125 mg/kg Lir,s.c.)。给药处理42天后,Ola组大鼠的体重、血脂及血糖较Con组明显升高(P<0.05),而Lir与Ola联合处理能降低Ola引起的体重增加和血脂血糖升高;OGTT实验发现O+L可以明显改善Ola引起的糖耐量异常(P<0.05);ELISA分析发现Lir能够回补Ola导致的胰岛素分泌不足;WB实验显示,Lir能上调胰腺中被Ola抑制的PKA、GLP1R、PI3K分子信号,从而缓解胰岛损伤,并且能显著上调PI3K/AKT信号,从而改善肝脏胰岛素抵抗(P<0.05)。上述结果证实了Ola长期给药会引起大鼠糖代谢异常,而联合使用Lir能降低体重增加、血糖升高、胰岛功能损伤和胰岛素抵抗的风险,可以明显改善Ola引起的糖代谢异常。为了进一步研究Lir缓解Ola糖代谢异常的机制,我们选择胰岛β细胞MIN6细胞系,来考察Ola及Lir对β细胞质量及胰岛素分泌的影响。首先使用CCK8法测定Ola对MIN6细胞存活率的影响,结果显示100μM以内Ola能剂量依赖性地减少MIN6细胞的存活率。然后选择低中高三个浓度梯度(5、10、20μM)Ola并同时引入Lir联合作用于MIN6细胞:通过ELISA法发现随着Ola浓度的增加胰岛素分泌量逐渐减少,而Lir联合Ola(20μM)能促进胰岛素的分泌(与Ola单用相比,P<0.05);IF染色显示MIN6细胞GLP1及其受体表达被Ola显著抑制(P<0.05),Lir联用能激活GLP1R而不影响GLP1表达;钙离子探针染色发现Lir联用能显著缓解Ola介导的钙离子水平降低;WB及q PCR实验发现Ola能显著抑制PKA、CREB的磷酸化及胰岛素转录相关基因Creb、Pdx1的表达,而联合Lir处理时上述因子较Ola单药处理时显著增加(P<0.05),说明Lir能逆转Ola对MIN6细胞胰岛素合成的抑制。最后分别构建了GLP1R过表达及沉默的MIN6细胞模型,进一步验证GLP1与Ola对胰岛功能调节的机制。结果显示,与Lir联合处理不同的是,GLP1R过表达质粒联合Ola处理细胞时,被Ola减少的MIN6细胞的胰岛素分泌量并未得到较好的提升。但在GLP1R沉默的模型中发现胰岛素分泌合成显著减少,同时减少的还有GLP1R激活后的下游信号,包括PKA和CREB等信号(P<0.05)。上述结果表明GLP1/GLP1R信号参与Ola介导的糖代谢异常,其中Ola引起GLP1合成减少为关键因素。结论:Ola表现出比Bre和Ari更强的代谢性不良反应,可显著增加SD大鼠的体重及空腹血糖,并且雌性大鼠的变化较雄性大鼠更明显。Ola作用后小肠组织中的差异表达基因主要集中在糖脂代谢生物过程中,通过临床病人样本进一步证实了GLP1和PPARγ可以作为Ola导致代谢性紊乱的候选靶点。通过STC-1细胞实验发现Ola可以通过抑制作用靶点M1R,引起PKC信号通路及PPARγ表达的抑制,从而减少GLP1转录因子β-Catenin的入核及转录复合物β-Catenin/TCF4的形成,最终抑制GLP1转录和分泌。
关键词: 奥氮平 ；糖代谢异常 ；利拉鲁肽 ；胰高血糖素样肽1 ；分子机制
被引量
1
摘要： 目的:糖尿病是一种内分泌代谢性疾病,近年来,其发病率显著上升,严重威胁着人类健康。糖毒性诱导胰岛β细胞凋亡是糖尿病发生发展的一个重要因素。由诃子、毛诃子、余甘子组成的藏药三果汤是一种常用于治疗糖尿病的藏药经方,国内多家藏医院应用此方治疗糖尿病患者已取得较好的临床疗效。课题组前期实验表明,藏药三果汤可抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡并促进其增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关联。因此,本实验旨在建立高糖诱导胰岛β细胞凋亡的体内外模型,深入研究藏药三果汤在高糖条件下抑制胰岛β细胞凋亡的作用和机制,并进一步探讨Wnt/β-catenin信号通路在这一现象中的可能机制,以期能够为糖尿病的治疗提供新思路。方法:1.不同产地藏药三果汤的指纹图谱建立及水提取工艺优化采用HPLC法建立20批不同产地藏药三果汤的指纹图谱,并对其相似度进行评价,同时结合HCA、PCA和OPLS-DA等化学模式识别方法以评价20批样品之间的差异。此外,对不同产地藏药三果汤中没食子酸、柯里拉京、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、诃黎勒酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖、诃子酸和鞣花酸这7种酚类化合物进行定量分析,优选出总含量最高的产地。同时,以这7种化合物的总含量为指标,通过正交实验法,考察加水量、提取温度及提取时间对藏药三果汤化合物溶出的影响。2.高糖诱导βTC-6细胞凋亡模型的建立MTT法测定βTC-6细胞的生长曲线,确定细胞最佳接种密度。分别采用MTT法和ELISA法测定不同葡萄糖浓度(11.1、25、38.8、50 mmol/L)对βTC-6细胞增殖和胰岛素分泌的影响,同时加入不同浓度的甘露醇(11.1、25、38.8、50mmol/L),观察渗透压对βTC-6细胞的影响,明确葡萄糖的毒性作用。3.藏药三果汤含药血清通过Wnt/β-catenin信号通路抑制高糖状态下胰岛β细胞凋亡的机制研究不同浓度的藏药三果汤含药血清与高糖状态下的βTC-6细胞联合培养后,采用MTT法检测其对βTC-6细胞增殖的影响;采用QRT-PCR法检测βTC-6细胞中TXNIP、TRX-1、Caspase-3、Caspase-9、β-catenin、GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1、TCF7L2、DKK1 mRNA的表达;采用Western Blot法检测βTC-6细胞中TXNIP、Bax、TCF7L2、DKK1蛋白的表达。4.藏药三果汤通过Wnt/β-catenin信号通路抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的机制研究55只雄性Wistar大鼠分为正常组和造模组,造模组采用单次腹腔注射48mg/kg的链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,正常组注射等剂量的缓冲液。建模成功后,造模组依次分为模型组、藏药三果汤低剂量组、藏药三果汤中剂量组、藏药三果汤高剂量组、阳性药西格列汀组,分别灌胃给药干预8周,并每周监测各组大鼠血糖和体重。ELISA法检测各组大鼠外周血清中INS、GCG、SST、PP、GLP-1水平,HE染色检测各组大鼠的胰岛变化;免疫组化染色检测各组大鼠胰腺组织中INS、GCG、SST、PP、β-catenin的阳性表达;QRT-PCR法检测各组大鼠胰腺组织中β-catenin、GSK-3β、Caspase-3等因子mRNA的表达。5.藏药三果汤对糖尿病大鼠血清代谢组的影响研究采用LC-MS/MS技术对糖尿病大鼠的血清代谢物进行非靶向检测,分析正常组、模型组、西格列汀阳性药组和藏药三果汤高剂量组之间的代谢物差异和联系,并分析其主要代谢途径,初步探讨藏药三果汤改善糖尿病大鼠血清代谢紊乱的机制,为藏药三果汤治疗糖尿病提供进一步的实验基础。结果:1.不同产地藏药三果汤的指纹图谱建立及水提取工艺优化结果显示20批不同产地藏药三果汤样品指纹图谱有19个共有峰,与对照指纹图谱的相似度为0.984～0.996,表明来自不同产地的20批样品之间具有良好的一致性,可以用来综合评价其整体质量。化学计量学结果分析得知,20批不同产地藏药三果汤样品分为两类,即诃子产地为国外,如老挝、泰国、越南的分为一类,诃子产地为中国国内省份的分为一类。通过与对照品比较,指认出7个共有峰,分别为没食子酸、柯里拉京、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖、诃黎勒酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖、诃子酸和鞣花酸,其中OPLS-DA的VIP图筛选出诃子酸、诃黎勒酸、柯里拉京是20批样品产生差异的主要化合物。对20批不同产地的藏药三果汤进行定量分析,发现诃子产地为广西南宁,毛诃子产地为云南大理,余甘子产地为广东普宁组成的三果汤化合物总含量最高,且加水量为30倍量,在90℃的提取温度下提取30分钟为三果汤的最佳提取方法。2.高糖诱导βTC-6细胞凋亡模型的建立绘制生长曲线,确定βTC-6细胞最佳接种密度为6.67×10^4个/m L。葡萄糖浓度为50 mmol/L时对βTC-6细胞抑制率最高,胰岛素分泌显著降低,可诱导细胞高糖凋亡模型。甘露醇浓度对βTC-6细胞的增殖无明显抑制作用,明确了葡萄糖的高糖毒性。3.藏药三果汤含药血清通过Wnt/β-catenin信号通路抑制高糖状态下胰岛β细胞凋亡的机制研究不同浓度的藏药三果汤含药血清与高糖状态下的βTC-6细胞联合培养24小时后,MTT法检测结果显示含药血清可提高高糖状态下βTC-6细胞的存活率;QRT-PCR法结果显示,含药血清可显著下调βTC-6细胞中促凋亡因子TXNIP、Caspase-3、Caspase-9和Wnt/β-catenin信号通路相关调节因子β-catenin、GSK-3β、c-Myc、Cyclin D1等mRNA表达水平,及上调凋亡抑制因子TRX-1、Wnt/β-catenin信号通路抑制因子DKK1和关键效应因子TCF7L2的mRNA表达水平;Western blot法结果显示,含药血清可显著下调TXNIP、Bax蛋白的表达,上调DKK1、TCF7L2蛋白的表达。4.藏药三果汤通过Wnt/β-catenin信号通路抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的机制研究藏药三果汤可降低糖尿病大鼠的血糖并增加体重。ELISA法结果显示,藏药三果汤可显著降低糖尿病大鼠外周血清中GCG、SST、PP和升高INS、GLP-1水平;HE染色结果显示给药组可增加糖尿病大鼠的胰岛面积,且胰岛与周围细胞间的界限更加清晰,其中藏药三果汤中、高剂量组最明显;免疫组化染色结果显示藏药三果汤可增强糖尿病大鼠胰腺组织中INS的阳性表达,减弱GCG、SST、PP及β-catenin的阳性表达;QRT-PCR法结果显示,给药组可下调糖尿病大鼠胰腺组织中β-catenin、GSK-3β和凋亡执行蛋白酶Caspase-3的mRNA表达水平。5.藏药三果汤对糖尿病大鼠血清代谢组的影响研究血清代谢组学分析结果显示,与模型组比较,藏药三果汤给药组共鉴定出210个差异代谢物,其中上调116个,下调94个;与阳性药组比较,有86个差异代谢物,其中上调44个,下调42个。KEGG代谢通路分析结果显示,藏药三果汤治疗糖尿病的主要途径与神经活性配体-受体相互作用、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、氨基酸代谢及甘油磷脂代谢等途径有关。结论:藏药三果汤对高浓度葡萄糖诱导βTC-6细胞凋亡和STZ诱导大鼠胰岛细胞凋亡有一定抑制作用。此方可减少促凋亡因子和增加凋亡抑制因子的表达,从而抑制胰岛β细胞凋亡,对糖尿病治疗具有良好的疗效,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
关键词: 高糖 ；胰岛β细胞凋亡 ；藏药三果汤 ；Wnt/β-catenin信号通路
摘要： 第一部分减重手术对2型糖尿病大鼠胰岛功能的改善作用及机制研究研究背景糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种严重危害人类生命健康的慢性代谢性疾病。2017年,全球糖尿病患者总数已达到4.25亿,其中我国糖尿病负担最重,患者人数达1.14亿,占全球近27%。2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率在过去几十年呈现快速上升的趋势,且新增患者大多集中于中低收入的发展中国家。糖尿病治疗及预防带来了沉重的经济和社会负担,已成为亟待解决的公共卫生问题。2型糖尿病是缓慢进展性疾病,其自然病程往往表现为正常糖耐量一糖耐量受损→T2DM,其中胰岛β细胞功能受损是其发病和病情进展的基础,且往往在发病早期就已经存在。进入失代偿期之后,糖耐量异常则进一步进展为T2DM。越来越多的研究证实,慢性炎症加上糖毒性及脂毒性,是β细胞功能进行性下降的重要发病机制,而NLRP3炎性小体在胰腺慢性炎症进展的病理过程中发挥了重要的作用。NLRP3(Nod-like receptor family pyrin domain containing 3)属于核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族模式识别受体,NLRP3炎性体是由NLRP3、调节蛋白一自噬相关的斑点蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶caspase-1等组成的蛋白复合体。炎性体被激活后能够迅速活化caspase-1,并且进一步切割IL-1β和IL-18前体分子并促进其分泌,进而参与炎症反应。进来许多研究表明,NLRP3炎性小体在T2DM的发生和进展中发挥了重要作用。减重手术(Bariatricsurgery)又被称为代谢手术,该手术设计初衷为治疗病态肥胖,但长期研究提示,减重手术在取得明显减肥效果的同时,还可以有效缓解与肥胖并发的T2DM,更迅速持久地达到治疗效果。目前,减重手术已被美国糖尿病协会(ADA),国际糖尿病联盟(IDF)以及中华医学会糖尿病学分会正式纳入治疗指南。有学者观察到,减重手术后患者胰岛β细胞功能得到改善,但其具体机制不明。研究目的本研究旨在通过以高脂饮食(High fat diet,HFD)联合小剂量链脲霉素(Streptozotocin,STZ)所诱导的T2DM大鼠模型,验证以下假说:(1)十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunal bypass,DJB)可以有效改善T2DM大鼠受损的胰岛功能;(2)位于胰岛巨噬细胞的NLRP3炎性小体在DJB术后胰岛功能改善的机制中发挥重要作用。研究方法本研究首先通过高脂饮食喂养SD大鼠(持续4周)诱导胰岛素抵抗的产生,然后通过腹腔注射链脲霉素(35mg/kg)诱导高血糖,模拟人体T2DM的自然发病过程及代谢特点。建模成功的T2DM大鼠被随机分为假手术组(SHAM)与DJB手术组并分别实施手术。DJB保留了胃的完整性,是目前应用于研究代谢手术不依赖于减重作用的抗糖尿病机制的良好手术模型。术后两组大鼠主要对以下指标进行检测,(1)体重,进食量,及空腹血糖:各组均在相应时间点对相应参数进行记录;(2)糖耐量:在术前及术后时间点分别进行了口服糖耐量实验(Oral glucose tolerance test,OGTT)及腹腔注射糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT);(3)胰岛β细胞功能:通过在体及离体的葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS),以及 β 细胞质量测量、胰腺胰岛素含量等指标进行评估;(4)胰岛炎症反应状况:通过免疫组化,PCR,Western Blot等技术对胰岛巨噬细胞浸润及NLRP3炎性小体通路进行评估;(5)肠促胰岛素:测量各组在相应时间点的胰高血糖素样肽(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)水平;(6)胰岛细胞凋亡:通过 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡。在术后10周时,DJB组大鼠再随机分为三组,进行巨噬细胞重构实验:其中第一组通过腹腔注射提前培养好的野生型巨噬细胞,第二组则通过腹腔注射NLRP3基因敲除的巨噬细胞,第三组则注射等量的生理盐水作为对照。然后对巨噬细胞重构后的DJB大鼠重复上述6项实验指标的检测。研究结果(1)高脂饮食喂养联合低剂量STZ腹腔注射成功诱导了 2型糖尿病SD大鼠模型,模拟了人体T2DM的自然病程。(2)DJB组大鼠与假手术组相比,其进食量及体重在术前及术后各个时间点均无明显差异(P>0.05)。(3)与假手术组相比,DJB可快速有效地降低T2DM大鼠的空腹血糖,并可显著持久地改善T2DM大鼠的糖耐量:术前各组大鼠空腹血糖及糖耐量实验结果并无明显差异(p>0.05),自术后2周起,假手术组大鼠空腹血糖明显高于DJB组(p<0.01);术后2周时,无论OGTT与IPGTT实验均表明DJB组较假手术组糖耐量得到明显改善(p<0.01),4周后则进一步改善。(4)DJB术后大鼠的胰岛分泌功能得到改善:在体实验及离体细胞培养实验均表明,DJB组大鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平较假手术组明显升高(p<0.05);和假手术组相比,与胰腺葡萄糖转运的密切相关的GLUT2及GCK的mRNA表达量在DJB组明显上调(p<0.01)。(5)DJB术后血清GLP-1水平较假手术组明显升高(p<0.01)。(6)DJB术后大鼠胰腺巨噬细胞浸润减轻,NLRP3炎性通路活性下调:免疫组化及PCR结果表明,DJB术后大鼠胰腺巨噬细胞浸润(CD68+)较假手术组明显好转;免疫组化、Western Blot及PCR结果均表明,DJB组大鼠胰腺NLRP3蛋白及mRNA表达量较假手术组显著下调(p<0.01);DJB组大鼠胰腺p65-NFκB蛋白及caspase-1蛋白表达量较假手术组明显降低,胰腺促炎因子IL-1β、IL-18等的蛋白表达及mRNA表达量均较假手术组明显下调,抗炎因子GFB1,IL-10,ARG1的表达量明显上调(p<0.05);(7)通过向DJB术后大鼠腹腔注射野生型巨噬细胞,可重建T2DM状态下的胰腺炎性状态,而腹腔注射NLRP3基因敲除的巨噬细胞后,DJB大鼠胰腺功能未受影响:与腹腔注射生理盐水的对照组相比,腹腔注射野生型细胞的DJB组大鼠,其空腹血糖再次升高,葡萄糖刺激的胰腺分泌功能下降,胰岛体积、β细胞质量、胰腺胰岛素含量均下降,NLRP3及相关促炎因子表达再次升高(p<0.05);而注射NLRP3基因敲除巨噬细胞的DJB大鼠,上述实验指标均较对照组无显著差别。结论DJB可以通过下调T2DM大鼠胰腺巨噬细胞NLRP3炎性小体活性,介导其胰腺功能的改善。第二部分减重手术对2型糖尿病大鼠肾功能的改善作用及机制研究研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最为常见的微血管并发症,是DM病人高病死率及高致残率的主要原因。在世界范围内,糖尿病肾病已成为引起终末期肾脏疾病(End-stage renal disease,ESRD)的首要病因,给社会与家庭带来了沉重的经济负担。在我国,至少有50%的T2DM患者合并不同程度的肾功能不全,随着糖尿病发病率的逐年增高,糖尿病肾病已成为影响我国人民生命健康的重大慢性疾病之一。目前对于糖尿病肾病尚缺乏特异性的治疗手段,传统的治疗策略为综合性防治,包括控制血糖血压,纠正脂质代谢紊乱,以及对于肾素-血管紧张素-醛固酮(Renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)抑制剂的应用,对于终末期的患者,则往往需要依赖透析或行肾脏移植等替代治疗。对于糖尿病肾病的早期预防和诊疗,以及特异性的靶向治疗,已成为近来研究的热点。减重手术作为治疗病态肥胖及糖尿病的有效手段,已被越来越多的应用于临床实践。早在2005年,Ikramuddin等报道一位经保守治疗无效的DN患者,行胃旁路术后2年尿蛋白降至正常水平。随后陆续有临床及动物实验证实,减重手术对于DN可以达到一定的治疗效果。但目前对于减重手术治疗DN效果的相关研究,多为回顾性、小样本研究,且纳入的观察指标相对局限,缺乏系统的随机对照试验。对于减重手术改善DN的机制,目前尚不明确。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200核苷酸单位(nt)的RNA分子。LncRNAs广泛地参与到机体几乎所有的生理病理活动中,其通过在表观遗传水平、转录及转录后水平调控基因的表达,与多种疾病密切相关。肺腺癌转移相关转录本1(Metastasis associated lung adenocarcinoma transcriptl,MALAT1)最初被发现是一种与肿瘤及代谢性疾病相关的lncRNA。近来有研究证实,MALAT1参与调控糖尿病微血管病变的发生发展,但其具体调节机制尚不明确。研究目的通过本研究的开展,我们期待解决以下问题:(1)评估HFD联合低剂量STZ腹腔注射构建的T2DM大鼠模型的肾功能受损情况;(2)验证DJB手术是否能够改善T2DM大鼠受损的肾功能;(3)探究IncRNA MALAT1是否在DJB术后大鼠肾功能的改善机制中发挥重要作用。研究方法动物实验部分:通过高脂饮食喂养(持续4周)联合低剂量STZ注射(35mg/kg)构建2型糖尿病SD大鼠模型,在维持糖尿病状态6周后,将SD大鼠随机分为3组,分别为DJB手术治疗组(DM-DJB),假手术治疗组(DM-sham),以及糖尿病对照组(DM)。然后分别实施DJB手术及假手术,糖尿病对照组不做任何处理,另外选取同龄健康SD大鼠作为空白对照组(CON)。术前及术后各时间点检测并记录各组动物的体重,进食量,及糖耐量水平;同时检测评估各组在不同时间点的尿白蛋白排泄率(Urinary albumin excretion rate,UAER)和肾小球滤过率(Glomerular filtration rate,GFR);并对各组大鼠的肾组织切片进行病理学评估;同时通过PCR技术和(或)ELISA技术检测MALAT1及其调节通路关键因子的表达水平。细胞离体实验部分:我们选用肾小管上皮细胞株HK-2进行离体细胞实验。首先我们在不同葡萄糖浓度梯度的培养基中培养HK-2细胞系,模拟糖尿病肾病状态下的高糖环境,然后siRNA转染沉默MALAT1,并检测与DN发病和进展密切相关的炎性分子以及MALAT1下游通路蛋白的表达水平。研究结果(1)高脂喂养的SD大鼠经STZ腹腔注射诱导后出现明显的体重增长变缓,尿量增加,空腹血糖升高,糖耐量受损等糖尿病症状;STZ注射后第6周,糖尿病组大鼠的肾小球滤过率及尿白蛋白排泄率均明显高于空白对照组(p<0.05),出现了明显的肾功能损伤。(2)大鼠行手术处理过后,与糖尿病对照组及空白对照组相比,DJB组与假手术组在术后两周内出现一过性的体重及进食量下降;其余时间点各组的体重及进食量无明显差异(p>0.05)。(3)与假手术组及糖尿病对照组相比,大鼠行DJB术后其糖耐量水平得到迅速明显地改善(p<0.05),术后两周已与健康大鼠无明显区别。DJB组大鼠血清GLP-1水平较糖尿病对照组及假手术组明显升高(p<0.01)。(4)与假手术组及糖尿病对照组相比,DJB大鼠的肾小球滤过率及尿白蛋白排泄率显著降低(p<0.05),受损的肾功能得到了一定程度的缓解,但仍高于健康的空白对照组。(5)肾脏切片PAS染色观察结果显示,与健康对照组相比,糖尿病组及假手术组的SD大鼠肾小球体积明显增大,系膜基质明显增生,出现了典型的糖尿病肾病的病理学表现;而DJB组大鼠的肾小球水肿及系膜基质增生得到了明显的缓解。(6)与假手术组及糖尿病对照组相比,DJB大鼠肾脏组织中MALAT1及其下游靶点血清淀粉样蛋白抗原3(Serum amyloid A protein 3,
关键词: NLRP3炎性小体 ；胰岛β细胞 ；十二指肠空肠旁路术 ；巨噬细胞 ；2型糖尿病 ；2型糖尿病 ；十二指肠空肠旁路术 ；长链非编码RNA ；MALAT1 ；肾功能
被引量
3
摘要： 目的:胰腺作为分泌胰岛素的最主要腺体,是人体内的重要消化器官,可以参与糖、脂肪、蛋白质等多种生命必需物质的代谢,是机体物质代谢系统的核心组成。当胰腺发生病变时,可以引起糖尿病、胰腺癌等胰腺相关疾病的发生。本文围绕糖尿病和胰腺癌这两个疾病将实验分为两个部分。糖尿病是由于胰岛素分泌减少所引起的一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。据2019年末国际糖尿病联合会统计,全球共有约4.63亿糖尿病患者,其中中国糖尿病人数约为1.164亿人,居全世界首位。由于糖尿病所导致的高血糖、高游离脂肪酸可以加强氧化应激的发生,氧化应激又可以直接损伤β细胞导致胰岛素分泌减少,从而促进糖尿病的发生,因此,糖尿病与氧化应激是相互关联、相互影响的。SP是一种神经肽物质,其与胰腺相关病症关系密切,可以缓解胰岛炎症病变,使胰岛素敏感性增强。NK-1受体是SP的最主要受体,已经发现NK-1受体可在胰岛α细胞上表达,而在胰岛β细胞上不表达。GLP-1是一种可以由胰岛α细胞分泌的肽类物质,其可以通过与胰岛β细胞上的GLP-1受体结合从而在胰岛素的合成和分泌中发挥重要作用。本课题第一部分主要是通过构建氧化应激诱导的胰岛细胞损伤模型,结合离体胰腺灌流的实验,研究SP对胰腺的保护作用及其机制,为预防治疗糖尿病开辟新的道路。胰腺癌是高度恶化的肿瘤,胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）作为胰腺癌的一个病理类型,占胰腺癌的85%以上。由于PDAC发病较为隐匿,侵袭性极高,其治疗方面目前仍面临着巨大的挑战。人们迫切需要了解PDAC的分子病理学机制,鉴定关键信号传导途径,筛选新的治疗靶点。近年来,随着高通量测序技术的出现,为肿瘤生物标志物的筛选提供了便利条件。本课题第二部分主要是通过生物信息学分析来研究PDAC的潜在生物标记物和治疗靶点。方法:第一部分:1、SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的作用健康雄性SD大鼠,胆管注入胶原酶Ⅴ（1mg/mL）提取大鼠胰岛团进行培养。我们把实验分为三组:空白对照组、H2O2处理组、SP预处理后H2O2处理组,通过FDA/PI染色检测培养后的细胞活率;将培养后的胰岛团制备冰冻切片,用TUNEL试剂盒检测其细胞凋亡情况,免疫荧光染色检测胰岛素表达情况;将培养后的细胞上清液收集,用ELISA试剂盒来检测胰岛素分泌情况。2、SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤保护作用的机制为了确定SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的保护作用是否是通过与NK-1受体的结合所引起的,我们使用NK-1受体阻滞剂进行进一步研究。我们把实验分为五组:空白对照组、H2O2处理组、SP预处理后H2O2处理组、SP伴NK-1受体阻滞剂预处理后H2O2处理组,NK-1受体阻滞剂预处理后H2O2处理组。通过FDA/PI染色检测细胞活率;用ELISA试剂盒来检测胰岛素、GLP-1分泌情况。由于NK-1受体是在胰岛α细胞上表达,在胰岛β细胞上不表达,而GLP-1受体在胰岛β细胞表达并且GLP-1可由α细胞分泌,为了进一步研究SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的作用是否与GLP-1有关,我们使用GLP-1受体阻滞剂进行进一步研究。我们把实验分为五组:空白对照组、H2O2处理组、SP预处理后H2O2处理组、SP伴GLP-1受体阻滞剂预处理后H2O2处理组,GLP-1受体阻滞剂预处理后H2O2处理组。之后通过FDA/PI染色检测细胞活率并用ELISA试剂盒来检测胰岛素分泌情况。3、SP对大鼠离体胰腺的影响分离胰腺,结扎胰腺周围血管,构建胰腺离体灌流模型,经腹主动脉依次灌注5.6 mmol/L葡萄糖溶液、不同浓度（10-99 mol/L、10-66 mol/L）的SP溶液,收集门静脉流出液,ELISA试剂盒对流出液中GLP-1的含量进行测定。对离体胰腺进行灌注5.6 mmol/L葡萄糖溶液或10-66 mol/L的SP溶液后,提取胰腺组织匀浆液,ELISA试剂盒检测灌流后胰腺组织中GLP-1的含量。第二部分1、差异表达基因的筛选从GEO数据库筛选出三个mRNA表达谱GSE15471、GSE62165、GSE28735作为研究对象,均用GEO2R分析胰腺导管腺癌组织和正常胰腺组织之间的差异表达基因（DEGs）,调整后P值<0.05,|log2（fold-change）|≥1作为筛选的标准。使用维恩图对三个数据集上调或下调的DEGs分别取交集,筛选出共同上调或下调的DEGs。2、DEGs的功能分析使用DAVID在线数据库对DEGs进行基因本体论（GO）和KEGG富集分析,从而研究共同DEGs主要富集的生物学过程、分子功能、细胞组分以及分子信号通路。3、核心基因的筛选以及预后分析通过STRING数据库构建DEGs的PPI网络,并利用Cytoscape分析PPI网络中基因的连接度,从而筛选核心基因。使用Kaplan Meier-plotter在线软件进一步对核心基因进行生存分析以探讨核心基因对PDAC患者的预后意义。结果:第一部分1、SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的作用结果发现,与对照组相比,加入H2O2处理后,细胞活率明显下降（P<0.01）,细胞凋亡率明显增加（P<0.01）,胰岛细胞内胰岛素表达量明显下降（P<0.01）,胰岛素释放量明显减少（P<0.01）;而与H2O2组相比,给予SP处理可以导致胰岛细胞活率增加（P<0.01）,细胞凋亡率明显减少（P<0.01）,胰岛细胞内胰岛素表达量增加（P<0.01）,胰岛素释放量也增加（P<0.05）。以上结果都表明SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤具有保护作用。2、SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤保护作用的机制联合施用NK-1受体阻滞剂发现,SP对氧化应激胰岛细胞活力的保护作用在施用NK-1受体阻滞剂后被抑制（P<0.05）;SP对氧化应激胰岛细胞胰岛素释放量的促进作用也可以被NK-1受体阻滞剂抑制（P<0.05）。此外,使用ELISA试剂盒检测GLP-1含量发现,与对照组相比,H2O2处理可以减少胰岛分泌GLP-1（P<0.01）;SP则可以增加H2O2刺激下胰岛细胞GLP-1的分泌（P<0.05）;联合施用NK-1受体阻滞剂处理细胞可以引起SP组胰岛细胞分泌GLP-1含量下降（P<0.05）。以上结果表明SP对胰岛氧化应激损伤的保护作用是通过激活NK-1受体实现的,并且SP可以通过激活NK-1受体调节GLP-1的释放。联合施用GLP-1受体阻滞剂发现,SP对氧化应激胰岛细胞活力的保护作用在施用GLP-1受体阻滞剂后被抑制（P<0.01）;SP对氧化损伤胰岛细胞胰岛素释放量的促进作用在施用GLP-1受体阻滞剂后也可以被抑制（P<0.01）。以上结果表明SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤保护作用与GLP-1的作用有关。3、SP对大鼠离体胰腺的影响与灌注5.6 mmol/L葡萄糖溶液的对照组相比,灌注不同浓度(10-99 mol/L、10-6mol/L)的SP溶液都可以使GLP-1分泌升高,差异均有统计学意义（P<0.05;P<0.01）。与仅灌流5.6 mmol/L葡萄糖溶液的对照组相比,灌流10-66 mol/L SP溶液后,胰腺组织中GLP-1的含量发生增加,差异有统计学意义（P<0.01）。第二部分1、差异表达基因的筛选三个GEO数据集GSE15471、GSE62165、GSE28735中,我们分别得到1552、3750、412个DEGs,分别包括1374、2507、256个上调基因和178、1243、156个下调基因。对三组差异基因用维恩图取交集,结果显示,在所有DEGs中,共鉴定出170个共同上调的DEGs,54个共同下调的DEGs。2、DEGs的功能分析通过GO富集分析发现,224个DEGs参与的生物学过程主要有胶原分解代谢过程、细胞外基质分解、蛋白水解等;细胞组分主要富集于细胞外基质、蛋白质细胞外基质等;分子功能主要富集于丝氨酸型内肽酶活性、钙离子结合等。KEGG富集分析发现,DEGs主要富集于ECM-受体相互作用、粘着力、蛋白质消化吸收等通路。3、核心基因的筛选以及预后分析基于PPI网络中基因的连接度鉴定出十二个核心基因（COL1A1、COL3A1、COL5A2、COL6A3、FN1、ITGA2、MMP1、MMP9、TOP2A、ALB、EGF、POSTN）。Kaplan Meier-plotter分析12个核心基因的表达量与胰腺导管腺癌患者总生存率的关系,结果显示MMP1、MMP9、ITGA2、TOP2A、POSTN这五个核心基因的高表达与PDAC患者不良预后有关（P<0.05）。结论:1、SP对H2O2诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤具有保护作用,这种保护作用的机制为SP通过与α细胞上的NK-1受体结合,促进α细胞分泌GLP-1,GLP-1再通过与胰岛β细胞上的GLP-1受体结合,从而改善胰岛细胞的功能。2、本研究通过生物信息学分析发现5个核心基因MMP1、MMP9、ITGA2、TOP2A、POSTN可能作为PDAC新的预后标志物和PDAC的可行性治疗靶点。
关键词: 氧化应激 ；胰岛 ；胰腺导管腺癌 ；生物信息学分析
被引量
1
摘要： 目的:从甜味受体的角度阐明玉竹多糖的降血糖机理,为玉竹多糖及玉竹的临床应用、质量评价提供实验依据,为降血糖机理研究提供新的视角。方法:1.玉竹多糖的制备及表征采用水提醇沉法制备粗多糖,再利用透析膜去除小分子物质得到纯化多糖;在此基础上,采用苯酚-硫酸法测定纯化多糖中多糖的含量,采用考马斯亮蓝G-250法测定其中蛋白质的含量,采用HPLC-ELSD法测定其中低分子糖的含量,对玉竹多糖的纯度及杂质进行表征;采用PMP柱前衍生-HPLC法分析玉竹多糖中单糖的组成,采用红外光谱法分析玉竹多糖中的官能团结构,进一步对玉竹多糖的结构进行表征。2.玉竹多糖对甜味受体的影响以HuTu-80细胞为模型,探索玉竹多糖对甜味受体T1R2、T1R3的影响。首先采用RT-PCR方法,验证HuTu-80细胞中甜味受体T1R2、T1R3的表达;确证后,再以玉竹多糖干预HuTu-80细胞,一定时间后加入葡萄糖启动甜味受体信号通路,然后采用ELISA方法测定细胞内c AMP及细胞外GLP-1的浓度,采用激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+的荧光强度,采用q PCR法检测甜味受体T1R2、T1R3的表达,从细胞模型的角度,探索玉竹多糖对甜味受体的影响。3.玉竹多糖降血糖作用机理的研究在确证玉竹多糖对甜味受体存在作用的基础上,接下来以整体动物模型,从甜味受体的角度阐明玉竹多糖降血糖作用机制。采用“高脂高糖饮食喂养+STZ”方法建立糖尿病大鼠模型,考察玉竹多糖对糖尿病大鼠的体重、空腹血糖、血脂的影响;采用苏木素-伊红染色法,研究玉竹多糖对糖尿病大鼠胰腺、肝脏组织形态学的影响;采用口服葡萄糖耐量实验,研究玉竹多糖对糖尿病大鼠糖耐量的影响。在此基础上,进一步进行胰岛素释放实验,采用ELISA方法测定GLP-1的浓度,采用q PCR方法,研究玉竹多糖对T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5、SGLT-1、GLUT-2基因m RNA表达的影响,从甜味受体的角度阐明玉竹多糖降血糖的作用机制。结果:1.玉竹多糖的制备与表征对玉竹纯化多糖进行表征,结果显示,玉竹多糖的纯度为88.29%,蛋白质含量为0.19%,且不含有葡萄糖、木糖、鼠李糖、果糖、蔗糖等低分子糖;单糖组成分析结果显示,玉竹多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等5种单糖组成,其摩尔比为21.08:2.31:14.13:3.32:0.41;红外光谱分析结果显示,玉竹多糖是一种含有羧基、β型糖苷键、吡喃环结构,可能含有α型糖苷键的多糖。2.玉竹多糖对甜味受体的影响RT-PCR结果显示,HuTu-80细胞内存在甜味受体的表达。玉竹多糖与HuTu-80细胞共孵育48 h后,加入葡萄糖后,与正常对照组比较,玉竹多糖低、高剂量组c AMP、GLP-1的浓度显著增加（P<0.05）;激光共聚焦结果显示,与正常对照组比较,玉竹多糖低、高剂量组HuTu-80细胞内钙离子的荧光强度增加;同时,与正常对照组比较,玉竹多糖低、高剂量组HuTu-80细胞中甜味受体T1R2、T1R3基因m RNA表达显著增加（P<0.05）。以上结果表明,玉竹多糖可促进甜味受体的表达,增强葡萄糖启动的甜味受体信号通路强度。3.玉竹多糖降血糖作用机理研究肠道甜味受体信号通路启动后一个主要效应是促进GLP-1的分泌,进而降血糖。因此,在以上实验的基础上,进一步采用糖尿病整体动物模型研究玉竹多糖的降血糖作用。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠体重明显减轻（P<0.05）,空腹血糖明显上升（P<0.05）,同时TG、TC、LDL-C的含量显著上升（P<0.05）,HDL-C含量明显下降（P<0.05）。给予玉竹多糖后,与模型组比较,玉竹多糖中、高剂量组显著增加了糖尿病大鼠的体重（P<0.05）,降低了空腹血糖水平和TG、TC、LDL-C浓度（P<0.05）,且玉竹多糖高剂量组还显著增加了糖尿病大鼠HDL-C的浓度（P<0.05）。病理学结果显示,与正常组相比,模型组大鼠胰岛严重萎缩变形,胰岛细胞边界消失;给予中、高剂量的玉竹多糖后,胰岛面积明显增大,结构趋向完整,边界清晰;同时,给予中、高剂量的玉竹多糖后,大鼠肝细胞内液态积聚减少,且受损细胞数量减少。口服葡萄糖耐量实验结果显示,与正常组比较,模型组大鼠的血糖曲线下面积显著增大（P<0.05）;给药玉竹多糖7周后,玉竹多糖中、高剂量组大鼠血糖曲线下面积明显降低（P<0.05）。再研究玉竹多糖降血糖的作用机制。玉竹多糖对GLP-1含量影响结果显示,与正常组比较,模型组大鼠血清中GLP-1含量显著降低（P<0.05）;玉竹多糖治疗后,玉竹多糖中、高剂量组大鼠血清中GLP-1含量明显增加（P<0.05）;胰岛素释放实验结果显示,模型组大鼠血清胰岛素含量在各个时间点均显著低于正常组（P<0.05）,血清中胰岛素含量低水平持续增长,未出现胰岛素分泌高峰;给药玉竹多糖后,与模型组比较,玉竹多糖中、高剂量组血清胰岛素含量在各时间点均明显高于模型组（P<0.05）,且均在第1 h时出现胰岛素分泌高峰。以上结果表明,玉竹多糖可促进GLP-1分泌,进而促进胰岛素的分泌。在此基础上,进一步研究玉竹多糖对甜味受体信号通路的影响。结果显示,与正常组比较,模型组大鼠T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5基因m RNA表达均显著下降（P<0.05）,SGLT-1、GLUT-2基因m RNA表达明显增加（P<0.05）;给药玉竹多糖后,与模型组比较,玉竹多糖中剂量可明显促进T1R3、TRPM5基因m RNA的表达（P<0.05）,玉竹多糖高剂量可明显促进T1R2、T1R3、α-gustducin、TRPM5基因m RNA的表达（P<0.05）,而玉竹多糖对SGLT-1、GLUT-2的m RNA表达无明显影响。以上结果表明,玉竹多糖可通过增强甜味受体信号通路,发挥降血糖作用。结论:玉竹多糖通过促进甜味受体T1R2、T1R3及信号分子α-gustducin、TRPM5的表达,增强甜味受体信号通路,在葡萄糖的介导下,促进GLP-1分泌增加,进而促进胰岛素的分泌增加,发挥降血糖作用。
关键词: 玉竹多糖 ；降血糖 ；甜味受体
被引量
7
摘要： 研究背景:随着居民生活水平的提高,糖尿病在我国的发病率逐年提升,已然成为当前社会最主要的健康杀手。糖尿病是遗传因素和环境因素共同影响而引起的疾病,造成其病情恶化的最主要原因为胰岛β细胞的损伤和数目的减少。近年来发现,肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）在局部胰腺组织中存在表达,更重要的是在糖尿病时RAS激活,致使其主要的效应物质,血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）水平升高,而后者的过表达会引起胰岛功能紊乱和胰岛β细胞凋亡增加,但其具体机制尚不明确。越来越多的研究证实,慢性炎症反应是导致糖尿病发生发展的重要因素。NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物,在各种病原刺激下发生活化,随后继续激活Pro Caspase-1,使其裂解为Caspase-1 p10活性片段,后者通过促进成熟的IL-1β的分泌而诱发细胞炎症损伤。关于NLRP3炎性小体的活化机制众说纷纭,但氧化应激引发ROS生成增多,进而促进TXNIP过表达或与NLRP3结合增多是其最主要的激活途径。因此,本研究旨在探讨Ang Ⅱ发挥胰岛β细胞损伤作用是否通过TXNIP-NLRP3炎性小体通路而实现。目的:1.使用Ang Ⅱ刺激正常大鼠胰岛组织,观察其对胰岛β细胞分泌胰岛素水平的影响;2.Ang Ⅱ孵育正常大鼠胰岛及INS-1胰岛β细胞,观察其对胰岛细胞凋亡及NLRP3炎性小体表达的影响;3.探究Ang Ⅱ影响NLRP3炎性小体表达的具体机制。方法:1.动物实验:构建糖尿病大鼠模型,分离胰岛并检测Ang Ⅱ水平;2.离体实验:（1）分离正常大鼠胰岛组织,使用Ang Ⅱ刺激,ELISA法检测胰岛素分泌量;（2）Western Blot检测Ang Ⅱ对胰岛凋亡及NLRP3炎性小体表达的影响;（3）CCK-8检测不同浓度(0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-55 mol/L)及不同作用时间（0、6、12、24、48 h）的Ang Ⅱ对INS-1胰岛β细胞存活率的影响;（4）流式细胞术及Western Blot检测Cleaved Caspase-3/Caspase-3,探究Ang Ⅱ对INS-1胰岛β细胞凋亡的影响;（5）Western Blot检测Ang Ⅱ作用下INS-1胰岛β细胞NLRP3炎性小体、TXNIP、ChREBP、AT1R的表达情况;（6）RT-PCR检测Ang Ⅱ对INS-1胰岛β细胞TXNIP、ChREBP的mRNA水平的表达影响;（7）IF/ICC法观察Ang Ⅱ处理对INS-1胰岛β细胞TXNIP、ChREBP及AT1R的表达影响。结果:1.糖尿病鼠胰岛组织中Ang Ⅱ含量升高分离糖尿病鼠胰岛,ELISA实验检测胰岛中Ang Ⅱ含量的结果显示,T1DM组Ang Ⅱ水平显著上调（P<0.01,n=7）;T2DM组的Ang Ⅱ含量也明显升高（P<0.01,n=7）。（见图1）2.Ang Ⅱ对原代胰岛的功能及蛋白表达的影响2.1 Ang Ⅱ可以降低胰岛β细胞的胰岛素分泌水平检测胰岛功能显示,Ang Ⅱ组葡萄糖刺激的胰岛素分泌指数降低（P<0.05,n=6）,说明Ang Ⅱ造成胰岛功能受损。（见图2A-C）2.2 Ang Ⅱ可以诱导胰岛细胞凋亡Western Blot结果表明,与对照组相比,Ang Ⅱ组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高（P<0.01,n=6）,提示Ang Ⅱ诱导胰岛细胞凋亡增加。（见图2D）2.3 Ang Ⅱ可以激活胰岛细胞NLRP3炎性小体与对照组相比,Ang Ⅱ组的NLRP3、ASC、Caspase-1的活性片段p10的蛋白表达均升高（P<0.01,n=6;P<0.01,n=6;P<0.05,n=6）,培养液中IL-1β的分泌增多（P<0.01,n=6）,说明Ang Ⅱ可引起NLRP3炎性小体的激活。（见图2E、F）3.Ang Ⅱ诱导INS-1胰岛β细胞存活率下降CCK-8结果显示,随着Ang Ⅱ作用浓度的升高,INS-1胰岛β细胞存活率逐渐下降,在1×10-6mol/L时作用显著（P<0.01,n=6）;给予INS-1胰岛β细胞孵育Ang Ⅱ不同时间,发现随着Ang Ⅱ作用时间的延长,细胞存活率逐渐降低,Ang Ⅱ作用24 h时细胞活力显著下降（P<0.01,n=6）。（见图3）4.Ang Ⅱ促进INS-1胰岛β细胞凋亡流式细胞术结果显示,Ang Ⅱ组细胞凋亡率相比对照组升高（P<0.05,n=6）。Western Blot方法检测Caspase-3及Cleaved Caspase-3,Ang Ⅱ组CleavedCaspase-3/Caspase-3比值升高（P<0.05,n=6）。（见图4）5.Ang Ⅱ通过NLRP3炎性小体诱导INS-1胰岛β细胞凋亡与对照组相比,Ang Ⅱ组NLRP3、ASC的蛋白表达均上调（P<0.05,n=6）,Caspase-1的活性成分p10片段表达明显升高（P<0.05,n=6）,细胞培养上清的IL-1β分泌量显著升高（P<0.01,n=6）。（见图5A、B）NLRP3炎性小体的活化抑制剂MCC950(1×10-5mol/L),抑制了NLRP3炎性小体的活化后,Caspase-1 p10片段蛋白表达显著下调（P<0.01,n=6）、细胞上清中IL-1β分泌量也显著减少（P<0.01,n=6）。同时,与Ang Ⅱ组相比,MCC950+Ang Ⅱ组Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著降低（P<0.01,n=6）。说明Ang Ⅱ可通过激活NLRP3炎性小体诱导INS-1胰岛β细胞凋亡。（见图5C、D）6.TXNIP介导Ang Ⅱ诱导的NLRP3炎性小体的表达及胰岛β细胞凋亡Ang Ⅱ刺激INS-1胰岛β细胞引起TXNIP的mRNA和蛋白水平表达上调,且具有浓度依赖性和时间依赖性,在1×10-6mol/L时升高程度显著（P<0.01,n=6）;Ang Ⅱ作用24 h时TXNIP表达升高的程度明显（P<0.05,n=6）;Ang Ⅱ(1×10-6mol/L,24 h)处理INS-1胰岛β细胞,免疫细胞化学染色后发现,Ang Ⅱ组胞质内TXNIP表达增多。（见图6A-E）通过TXNIP shRNA感染INS-1细胞,抑制TXNIP的表达后可见,与Scramble shRNA+Ang Ⅱ组相比,TXNIP shRNA+Ang Ⅱ组NLRP3、ASC、Caspase-1 p10蛋白表达显著下调（P<0.01,n=6）,Cleaved Caspase-3/Caspase-3显著降低（P<0.01,n=6）,上清IL-1β含量降低（P<0.01,n=6）。提示,TXNIP参与介导了Ang Ⅱ活化NLRP3炎性小体及INS-1细胞凋亡。（见图6F-I）7.ChREBP参与Ang Ⅱ诱导INS-1细胞凋亡Ang Ⅱ刺激INS-1细胞后,与对照组相比,Ang Ⅱ组ChREBP的mRNA和蛋白表达水平均上调（P<0.05,n=7）。免疫荧光结果显示,Ang Ⅱ组ChREBP表达高于对照组,且从细胞质内表达变为细胞核内表达,提示ChREBP被Ang Ⅱ激活,并且表达增多。（见图7）8.AT1R介导Ang Ⅱ引发的NLRP3炎性小体活化及INS-1胰岛β细胞凋亡Western Blot结果显示,Ang Ⅱ组AT1R蛋白表达水平相比对照组明显升高（P<0.05,n=6）。免疫荧光结果示,Ang Ⅱ组AT1R红色荧光明显多于对照组。（见图8A、B）使用AT1R特异性的抑制剂替米沙坦预处理INS-1细胞1 h(1×10-5mol/L),TM+Ang Ⅱ组细胞活力明显增强（P<0.01,n=6）,Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值低于Ang Ⅱ组（P<0.05,n=6）。说明AT1R介导Ang Ⅱ降低INS-1细胞活力以及诱导细胞凋亡的过程。（见图8C、D）为进一步探究AT1R在Ang Ⅱ引起NLRP3炎性小体活化和TXNIP表达升高过程中的作用,我们观察了替米沙坦作用后NLRP3炎性小体、TXNIP、ChREBP的表达情况。结果显示,与Ang Ⅱ组相比,TM+Ang Ⅱ组NLRP3、ASC蛋白表达下调（P<0.05,n=6）、Caspase-1 p10片段表达降低（P<0.05,n=6）、细胞培养上清中IL-1β含量明显减少（P<0.01,n=6）;同时,TXNIP的mRNA和蛋白水平均明显降低（P<0.01,n=6）、ChREBP mRNA和蛋白水平上调也被替米沙坦抑制（P<0.05,n=6）。综上所述,Ang Ⅱ通过AT1R发挥影响INS-1细胞的下游作用。（见图8E-J）结论:1.Ang Ⅱ可以抑制胰岛素分泌,促进胰岛β细胞凋亡;2.TXNIP-NLRP3炎性小体通路介导Ang Ⅱ诱发的INS-1胰岛β细胞凋亡增加;3.AT1R介导Ang Ⅱ引发的NLRP3炎性小体活化及INS-1胰岛β细胞凋亡。
关键词: Ang Ⅱ ；NLRP3炎性小体 ；TXNIP ；AT1R
被引量
1
摘要： 目的:研究西格列汀联合HMS55522对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响和胰岛素分泌的研究。
方法:200只健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后,随机挑选30只为正常对照组（normal control group,NC）,给予基础饲料喂养,剩余大鼠采用高糖高脂饲料喂养8周后,一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,40mg/kg）,经连续两次测定空腹血糖值≥8.0 mmol/L并伴有多饮多食多尿、体重减轻等症状的确定为2型糖尿病大鼠模型。本实验符合要求的大鼠有128只。从正常对照组大鼠和糖尿病大鼠中随机选取10只,禁食12小时以上,2%戊巴比妥钠麻醉后心脏采血并处死。测定大鼠胆固醇（cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、胰岛素（insulin,INS）、胰高血糖素样肽-1（glucagon-like polypeptide-1,GLP-1）、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4,DPP-4）、胰高血糖素（glucagon,GC）水平。将建模成功的大鼠随机分成4组,每组20只。分别为糖尿病组（type 2 Diabetes Mellitus,DM）、西格列汀治疗组（Sigliptin treatment group,SIT）、HMS5552治疗组（HMS5552 treatment group,HMS5552）、联合用药组（Combined administration treatment group,SIT+HMS5552）。NC组和DM组大鼠给予生理盐水灌胃,SIT组大鼠给予30mg/kg西格列汀灌胃,HMS5552组大鼠给予30mg/kg HMS5552灌胃,SIT+HMS5552组大鼠给予西格列汀30mg/kg+HMS5552 30mg/kg灌胃,每天一次,持续4周,期间每周称量大鼠体重并调整给药量,4周后,所有大鼠禁食12小时以上,进行口服糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）,分别于0min,15min,30min,60min,90min,120min 6个时间点进行血糖测定,次日戊巴比妥钠麻醉后采血并处死动物。测定TC、TG、FINS、GLP-1、DPP-4、GC数值并观察其变化;取心肌、肺、肝脏、胰腺、肾脏、脑、小肠、脂肪、皮肤、骨骼肌共10种组织,一部分置于液氮中保存备用,一部分福尔马林固定。HE染色观察胰腺组织形态变化;免疫组织化学染色观察胰腺前激素原转化酶1/3（PC1/3）、GLP-1、INS的分泌情况;实时荧光定量PCR法检测大鼠胰腺组织中GLP-1、GLP-1R、c AMP、PKA、CREB、PDX-1、INS m RNA水平表达,蛋白印迹法检测胰腺组织中GLP-1、GLP-1R、c AMP、PKA、P-PKA、CREB、P-CREB、PDX-1、INS蛋白水平表达。
结果:
1)一般情况:NC组大鼠毛色光亮顺滑,活动灵敏,体重随着进食周期的增加而增加,相较于NC组,DM组体重增加更为明显;STZ注射后,DM组大鼠伴有“三多一少”等症状,后期随着病程加重,大鼠毛色呈现出暗黄、竖立,活动迟缓、嗜睡等相关症状;药物治疗后,各个治疗组的大鼠精神状态有所改善。
2)OGTT试验结果:NC组大鼠进食后血糖在15分钟左右可以达到峰值,2小时后基本恢复正常;相比于NC组,DM组大鼠初始血糖水平较高,进食后在90分钟左右出现峰值,2小时后血糖水平未能恢复到初始血糖值;各个治疗组大鼠初始血糖值较DM组有明显下降,血糖峰值左移。对曲线下面积进行分析比较,△AUC0-120结果显示,与DM组相比,各个治疗组的曲线下面积减少,具有统计学意义（P<0.01）,SIT组与HMS5552组相比差异具有统计学意义（P<0.05）,单独给药组分别与SIT+HMS5552组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。
3)血清学结果显示:（1）生化指标:药物治疗前,与NC组相比,DM组大鼠TC、TG水平明显增加,药物治疗后,各治疗组血脂水平有不同程度的改善,SIT和SIT+HMS组相比,SIT+HMS组治疗后大鼠TC变化差异具有统计学差异（P<0.01）,HMS5552和SIT+HMS组相比,SIT+HMS组治疗后大鼠TG、TC具有统计学意义（P<0.05）;（2）FBG、FINS和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）:与NC组大鼠相比,DM组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平明显升高,药物治疗后,各个治疗组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平降低（P<0.01）,HMS5552组与SIT+HMS5552组相比,FBG、HOMA-IR具有统计学意义（P<0.01）;（3）GLP-1水平:药物治疗前,与NC组相比,DM组大鼠GLP-1水平降低,药物治疗后,单独治疗组GLP-1水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,SIT+HMS5552组与DM组相比,GLP-1水平明显升高,具有统计学意义（P<0.01）;（4）DPP-4水平:药物治疗前,与NC组大鼠相比,DM组大鼠DPP-4水平升高,药物治疗后,各治疗组DPP-4水平降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;（5）GC水平:药物治疗前,与NC组大鼠相比,DM大鼠GC水平降低,具有统计学意义（P<0.01）,药物治疗后,与DM组相比,各个治疗组GC水平仍降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,与HMS5552组相比,SIT+HMS5552组GC水平降低具有统计学意义（P<0.05）。
4)胰腺HE染色结果:NC组大鼠胰岛形态呈规则的圆形或椭圆形,细胞核分布均匀,DM组大鼠胰岛组织形态出现不规则变化,细胞核固缩,药物治疗后,各个治疗组胰岛组织形态和细胞核固缩现象均有所改善。
5)胰腺免疫组化染色结果:（1）PC1/3染色:与NC组相比,DM组PC1/3表达显著降低,药物治疗后,各个治疗组的PC1/3表达均有增加（P<0.01）,SIT+HMS5552组与SIT组相比差异具有统计学意义（P<0.01）,SIT+HMS5552组与HMS5552组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）GLP-1染色:与NC组相比,DM组表达明显减少,药物治疗后,各个治疗组GLP-1分泌增加（P<0.01）;（3）INS染色:NC组胰岛素分布广泛,几乎分布于整个胰岛组织内,DM组胰岛素分泌与NC组相比显著减少,各个用药组治疗后胰岛素分泌增加,差异具有统计学意义（P<0.01）,相较于SIT组,SIT+HMS5552组治疗后INS水平增加（P<0.05）,相较于HMS5552组,SIT+HMS5552组治疗后INS水平增加更明显（P<0.01）。
6)RT-PCR结果:与NC组相比,DM组大鼠胰腺组织GLP-1、GLP-1R、cAMP、PKA、CREB、PDX-1、INS的m RNA表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,药物治疗后,与SIT组相比,SIT+HMS5552组GLP-1、GLP-1R、PKA、CREB、INS增加具有统计学意义（P<0.05）,PDX-1增加具有统计学意义（P<0.01）,与HMS5552组相比,SIT+HMS5552组GLP-1、c AMP、PKA、CREB、PDX-1、INS增加具有统计学意义（P<0.01）。
7)Western-blot结果:与NC组相比,DM组大鼠胰腺组织内PKA、CREB蛋白表达相同,GLP-1、GLP-1R、P-PKA、P-CREB、PDX-1、INS蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P<0.01）,药物治疗后,与SIT组相比,SIT+HMS5552组GLP-1、GLP-1R、P-PKA、P-CREB、INS增加具有统计学意义（P<0.05）,PDX-1增加具有统计学意义（P<0.01）,与HMS5552组相比,SIT+HMS5552组GLP-1、P-PKA、P-CREB、PDX-1、INS增加具有统计学意义（P<0.01）,GLP-1R增加具有统计学意义（P<0.05）。
结论:
1.西格列汀联合HMS5552对糖尿病大鼠糖脂代谢的调节优于单独用药;
2.西格列汀联合HMS5552对糖尿病大鼠胰岛素分泌有促进作用,作用与GLP-1R/c AMP信号通路有关。
关键词: T2DM ；HMS5552 ；西格列汀 ；胰岛素 ；胰高血糖素样肽-1
摘要： 1.背景与目的
2型糖尿病是一种代谢性疾病，病理过程是由胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对不足逐渐发展成为胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗，以至于人体不能有效利用胰岛素，使患者体内的胰岛素处于一种相对缺乏状态；典型症状是“三多一少”，即多尿、多食、多饮及消瘦；主要特征是慢性血葡萄糖水平增高；主要原因是胰岛素作用缺陷和/或胰岛素分泌紊乱；长期的高血糖水平对胰岛β细胞产生毒性作用，继发引起脂代谢紊乱，影响心脏、肾脏、肝脏及神经等功能，导致心脑血管并发症、糖尿病肾病、糖尿病肝病、神经病变以及周围血管病变等多种并发症。因此促进胰岛素分泌，降低血糖水平成为治疗2型糖尿病的重要策略。
可卡因-苯丙胺转录调节肽(cocaine and amphetamine regulated transcript，CART)是一种重要的内源性神经肽，广泛分布在大脑和胃肠系统中，参与调节食物摄入量、体重、感知觉、中枢神经、自主神经系统以及内分泌等多种生理功能。研究表明人类CART基因定位于染色体5q13–14，此区域已证明是一个肥胖易感位点，这一发现进一步证明CART参与了进食调节及在人类肥胖症中参与了能量平衡的作用。人类CART基因突变使得其代谢率降低，发生2型糖尿病的几率更高。在CART基因敲除小鼠体内发现其β细胞形态有所改变，葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)功能受到抑制，体重明显增加，胰岛功能减退，提示CART可能具有维持正常胰岛功能的作用。CART除了在胰腺内分泌细胞表达外，同时在胰腺神经纤维和胰腺神经节胞体中也有广泛表达。大鼠胰腺组织中的副交感神经能刺激胰岛素分泌，因此CART在胰腺副交感神经中的表达提示CART不仅能调节胰岛内分泌细胞功能，还参与调节副交感神经调控的胰岛功能。CART作为一种新型的内源性神经肽，具有活性高、毒副作用低和耐受性好等优点，因其具有控制胰岛功能，调节胰岛素分泌的特点成为治疗2型糖尿病的热点研究药物。侧脑室(LV)周围连接着各种重要核团，是脑脊液循环的重要枢纽，在临床应用和动物试验中将侧脑室给药作为常用给药途径。因此我们在本课题中选择侧脑室给药作为给药途径，注射CART后研究其对胰腺组织中胰岛素的调节作用，并对机制进行了初步研究。
2.研究内容
2.1第一部分：侧脑室注射CART对2型糖尿病大鼠血中TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量影响
2.2第二部分：侧脑室注射CART对2型糖尿病大鼠FBG、空腹胰岛素、血糖药时曲线下面积(AUC)、血清胰岛素药时曲线下面积以及组织胰岛素影响
2.3第三部分：侧脑室注射CART对2型糖尿病大鼠胰腺组织INS mRNA影响
2.4第四部分：大鼠胰腺组织中CART和INS定位及侧脑室注射CART干预前后对胰腺组织中CART和INS表达影响
2.5第五部分：CART对2型糖尿病大鼠胰岛INS-1细胞胰岛素分泌的影响
3.方法
3.1动物分组和建立2型糖尿病大鼠模型将健康SD雄性大鼠禁食12小时后，剪尾取血并测定FBG小于10mmol/L者，按照随机数字法分成6组：⑴正常组；⑵正常/LV注射ACSF组；⑶正常/LV注射CART组；⑷2型糖尿病组；⑸2型糖尿病/LV注射ACSF组；⑹2型糖尿病/LV注射CART组。将糖尿病组、糖尿病/LV注射ACSF组和糖尿病/LV注射CART组大鼠使用高糖高脂饲料喂食4周，禁食12小时后，以40mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)进行腹腔注射，用于建立2型糖尿病大鼠模型。72小时后采用剪尾取血测定其FBG大于16.7mmol/L者，即为2型糖尿病造模成功。
3.2侧脑室注射ACSF/CART及血液中TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量检测在确定造模成功24小时后，将空腹的正常/LV注射ACSF组、正常/LV注射CART组、糖尿病/LV注射ACSF组和糖尿病/LV注射CART组分别麻醉后，使用脑定位仪并结合大鼠脑图谱对侧脑室进行定位、开孔，分别注入0.2nmol ACSF/CART。24小时后采用腹主动脉取血，测定其TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量。
3.3观察侧脑室注射CART干预前后对各组大鼠口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，血糖值和胰岛素药时曲线下面积的影响采用OGTT法检测CART干预前后FBG、空腹胰岛素、血糖值AUC和血清胰岛素AUC含量，并比较各组之间血糖值和胰岛素药时曲线下面积变化。
3.4观察侧脑室注射CART干预前后对大鼠胰腺组织中胰岛素的影响采用ELISA法测定使用CART干预前后大鼠胰腺组织中胰岛素含量。
3.5观察侧脑室注射CART干预前后对大鼠胰腺组织中INS mRNA影响采用荧光定量PCR观察各组大鼠在CART干预前后胰腺组织中INS mRNA表达变化
3.6观察大鼠胰腺组织中CART和INS定位及侧脑室注射CART干预前后对胰腺组织中CART和INS表达影响采用免疫荧光分析胰腺组织中CART和INS定位，并比较CART干预前后CART和INS表达变化。
3.7观察大鼠INS-1细胞使用CART和GLP-1干预后胰岛素含量变化培养胰岛INS-1细胞，用ELISA法测定CART和GLP-1干预后细胞分泌胰岛素含量。
4.结果
4.1检测侧脑室注射CART干预前后各组大鼠血中TC、TG、HDLC、LDLC和HbA1C含量2型糖尿病大鼠血中TC、TG、LDLC和HbA1C与正常对照大鼠相比均有显著上升(P<0.05)；2型糖尿病大鼠采用CART干预后，血中TC与糖尿病大鼠相比有显著改善(P<0.05)。
4.2侧脑室注射CART干预前后对各组大鼠口服葡萄糖耐量试验(OGTT) FBG、空腹血清胰岛素、血糖AUC和血清胰岛素AUC影响通过采用OGTT试验将各组大鼠使用CART干预前后FBG、空腹血清胰岛素、血糖AUC和血清胰岛素AUC进行比较表明：CART干预后FBG明显降低(P<0.05)，空腹胰岛素含量显著增加(P<0.05)，但不能达到正常水平，2型糖尿病大鼠中FBG和空腹胰岛素与正常对照大鼠相比有显著性差异(P<0.05)；2型糖尿病大鼠在CART干预前后血糖值AUC和胰岛素AUC改变不明显，提示CART干预后24小时内只是改变了FBG，促进了胰岛素分泌，并没有改变其糖尿病性质。
4.3侧脑室注射CART干预前后对大鼠胰腺组织中胰岛素的影响通过采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠注射CART干预前后胰岛素含量表明：2型糖尿病大鼠注射CART干预后胰腺组织中胰岛素含量与糖尿病模型相比明显上升(P<0.05)，尤其是正常对照大鼠采用CART干预后胰岛素含量有显著性提高(P<0.05)，提示CART能够提高胰腺组织中胰岛素含量。
4.4侧脑室注射CART干预前后对大鼠胰腺组织中INS mRNA的影响通过采用荧光定量PCR法测定各组大鼠使用CART干预前后胰腺组织中INS mRNA表达量表明：2型糖尿病大鼠注射CART干预后胰腺组织中INS mRNA表达量与糖尿病大鼠相比明显上升(P<0.05)。尤其是正常对照大鼠在CART干预后胰腺组织中INS mRNA表达量有显著性提高(P<0.05)，提示CART能够促进胰腺组织中胰岛素分泌。
4.5大鼠胰腺组织中CART和INS定位及侧脑室注射CART干预前后对胰腺组织中CART和INS表达影响采用免疫荧光分析对胰腺组织中CART和INS定位及CART干预前后CART和INS表达变化表明：CART和INS均在胰岛β细胞中表达，使用CART干预后胰腺组织中CART和INS表达均有所增强，提示侧脑室注射CART可能促进胰腺组织中CART增强，并进一步促进了胰岛素分泌。
4.6CART对2型糖尿病大鼠胰岛细胞胰岛素分泌的影响采用ELISA法测定由CART和GLP-1干预后的胰腺INS-1细胞所分泌胰岛素含量表明：CART和GLP-1均能明显刺激INS-1细胞分泌胰岛素(P<0.05)，其中GLP-1效果更加显著(P<0.05)。
5.结论
5.1本研究采用高糖高脂饮食/腹腔注射大剂量STZ诱导空腹血糖上升和脂类代谢紊乱，成功建立大鼠2型糖尿病模型。在2型糖尿病大鼠侧脑室注射CART24小时后能够明显降低其FBG和TC，提高空腹胰岛素含量，但血糖ACU及血清胰岛素AUC未有明显改变，表明CART能够促进胰岛素分泌，降低空腹血糖，改善TC代谢，但并不能改变其糖尿病本质。
5.2大鼠侧脑室注射CART干预后组织中胰岛素含量及INS mRNA表达量明显上调，表明CART能够促进β细胞胰岛素分泌，并且在β细胞未受损情况下效果更加显著。
5.3免疫荧光分析表明CART和INS在大鼠胰腺组织β细胞中表达，并且采用CART干预后CART和INS表达明显增强，表明侧脑室注射CART能够上调胰腺组织中CART并进一步促进胰岛素分泌，提示CART可能具有促进胰岛素分泌作用。
5.4采用CART和GLP-1干预胰岛INS-1细胞后，胰腺细胞分泌胰岛素含量明显增加，其中GLP-1增加效果比CART更加显著。
关键词: 可卡因-苯丙胺转录调节肽(CART) ；2型糖尿病 ；侧脑室 ；胰腺 ；血糖总胆固醇 ；甘油三酯 ；胰岛素
被引量
3
摘要： [背景]糖尿病患者数逐年增加,已经成为危害公共健康的重大难题,其发病的中心环节是胰岛β细胞数目减少和功能受损。目前糖尿病的主要治疗方式为药物治疗和胰腺移植。由于环境等因素的影响,移植后的外源性胰腺并不能很好地发挥调节血糖的作用,因此胰岛β细胞的内源性增殖成为人们关注的焦点。目前有研究发现胰腺外分泌细胞(胰腺导管细胞和胰腺腺泡细胞)以及胰腺外细胞(肝脏细胞)可以转化成为胰岛β细胞。在一些β细胞极端受损的糖尿病动物模型中,研究者观察到α细胞转化成为β细胞的现象,为糖尿病的治疗带来了新的思路。既往研究认为GLP-1有促进β细胞增生并抑制其凋亡的作用,但其具体机制尚不明确。有研究表明GLP-1作用于细胞表面的GLP-1受体,通过PI3K/Akt/FOX01信号通路增强PDX-1的反应性,PDX-1在维持β细胞形态功能中起到重要作用,并能促进非β细胞向β细胞转化。由此我们推测GLP-1通过细胞表面GLP-1受体激活细胞内PI3K/Akt/FOXO1信号通路,调节PDX-1、MafA、MafB等转录因子的表达,继而促进α细胞跨谱系转化为β细胞。[目的]本课题拟建立单次大剂量STZ诱导重度β细胞损伤的糖尿病大鼠模型,通过观察GLP-1干预后大鼠胰岛中内分泌细胞数目的变化,探讨GLP-1能否促进大鼠胰岛β细胞原位再生及其可能的机制。应用GLP-1受体抑制剂和PI3K酶抑制剂对糖尿病大鼠干预后,检测PI3K/Akt/FOXO1信号通路相关信号因子转录水平和蛋白表达水平,探讨GLP-1能否通过PI3K/Akt/FOX01信号通路促进α细胞转化成为β细胞。[内容]内容分为以下三大部分:第一部分GLP-1促进STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛β细胞原位再生目的探讨GLP-1能否促进胰岛β细胞的原位再生。方法单次大剂量注射STZ建立糖尿病大鼠模型,将空腹血糖值大于28mmol/L的SD大鼠纳入研究,并将其分为五组:正常对照组、糖尿病模型组、GLP-150μg/kg干预组、GLP-1100μg/kg干预组、GLP-12000μg/kg干预组。每周监测各组大鼠血糖、体重变化;ELISA法检测C肽、胰岛素水平;大鼠胰腺切片insulin/gucagon双重免疫染色观察内分泌细胞数目变化。统计学方法为one-way ANOVA,P<0.05差异具有统计学意义。结果与糖尿病模型组相比,GLP-1干预后糖尿病大鼠的血糖水平减低、体重下降;C肽、胰岛素水平上升;胰岛素分泌细胞数目呈GLP-1剂量依赖型增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论GLP-1能够促进β细胞原位再生。第二部分GLP-1通过驱动胰岛内α细胞转分化为β细胞促进胰岛的原位再生及功能重建目的探讨GLP-1促进β细胞原位再生的可能机制。方法分组同第一部分,对大鼠胰腺冰冻切片行insulin/glucagon、insulin/amylase、insulin/Pan-CK双重免疫荧光染色,对大鼠胰腺石蜡切片行PCNA免疫组化染色。统计学方法为one-way ANOVA,P<0.05差异具有统计学意义。结果GLP-1干预后,糖尿病大鼠胰岛中出现insulin/glucagon双阳性细胞,数目随GLP-1干预剂量增加而增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。大鼠胰腺切片中未观察到insulin/amylase、insulin/pan-ck双阳性细胞;PCNA免疫组化结果无明显差异(P>0.05),且染色区域均位于α细胞分布区域。结论GLP-1促进β细胞的原位再生来自于α细胞的转化,无胰腺腺泡细胞或导管细胞的转化,也无α细胞的自我复制。第三部分GLP-1及其受体经PI3K/Akt/FOXO1通路上调PDX-1表达促进α细胞转分化为β细胞目的探讨GLP-1通过其受体经PI3K/Akt/FOXO1通路增强转录因子PDX-1、MafB的表达,下调MafA的表达,继而促进α细胞转分化为β细胞。方法建立糖尿病大鼠模型后,将SD大鼠分为7组:正常对照组、糖尿病模型组、GLP-1 50μμg/kg 干预组、GLP-1 100μg/kg 干预组、GLP-1 200μg/kg 干预组、GLP-1与GLP-1受体拮抗剂exendin(9-39)共同干预组、GLP-1与PI3K酶抑制剂 LY294002 共同干预组。RT-PCR 检测 GLP-1R、AKT、PDX-1、MafA、MafB、Foxol的mRNA表达结果;Western blot检测大鼠胰岛中GLP-1R、PDX-1、MafA、MafB、Akt的蛋白表达结果。结果PCR结果显示:糖尿病模型组的GLP-1R、Akt、PDX-1、FOXO1、MafA、MafB的表达较正常组明显下降。GLP-1干预后,GLP-1R、Akt、PDX-1、FOXOl MafA的mRNA表达量明显上升,MafBmRNA表达量下降,呈剂量依赖型。exendin(9-39)抑制 GLP-1 受体后,GLP-1R、Akt、PDX-1、Foxol、MafA 的mRNA表达量较GLP-1 100μg/kg干预组下降,而MafB表达量上升。LY294002抑制 PI3K 酶后,GLP-1R、Akt、PDX-1、Foxol、MafA 的 mRNA 表达量较GLP-1100μg/kg干预下降,而MafB表达量上升。Western blot结果与PCR结果相似,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论GLP-1通过GLP-1受体及其下游的PI3K/Akt/FOXO1通路增强转录因子PDX-1、MafA的表达,下调MafB的表达,进而促进α细胞向β细胞转化。
关键词: β细胞 ；α细胞 ；转分化 ；GLP-1 ；PDX-1 ；PI3K/Akt/FOXO1通路
被引量
2
摘要： 目的：胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide1,GLP-1)是一个含有30个氨基酸残基的肠道激素,进餐后在食物刺激下,由回肠和结肠粘膜层的L细胞分泌,能够以葡萄糖依赖的方式刺激胰岛素分泌,抑制胰高血糖素分泌来调控血糖,GLP-1的生物学作用通过与胰岛β细胞的GLP-1受体(GLP-1R)结合产生。GLP-1受体广泛分布于各种组织器官(胰腺、肺脏、心脏、血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、肾脏、胃肠道、中枢神经系统、周围神经系统),GLP-1通过GLP-1R发挥作用。GLP-1是一种对许多组织具有抗氧化保护作用的肠道激素。内源性GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase DPP-IV)降解,在血液中的半衰期只有1-2min。利拉鲁肽是一种人GLP-1长效类似物,与天然GLP-1有97%的同源性,它在天然GLP-1的分子结构上更换了一个氨基酸,并增加了一个16碳棕榈酰侧链。不仅保留天然GLP-1的功效,而且由于存在脂肪酸侧链,其分子不易被DPP-4降解,并能与白蛋白结合从而增加代谢稳定性。利拉鲁肽是GLP-1酰化类似物,可以在皮下注射部位吸收。2009年在欧洲和日本允许使用,2010年美国FDA批准使用。利拉鲁肽作为新的降糖药物已广泛应用于临床,越来越多的证据表明,利拉鲁肽具有多种降糖外的作用,如保护血管内皮细胞、减少糖尿病肾脏的炎症因子的表达等。最新研究显示,利拉鲁肽可显著减少糖尿病大鼠肝脏内脂质的含量,减轻糖尿病鼠肝脏脂肪变。FGF-19、FGF-21是新的脂肪因子,分别主要由肠道和肝脏细胞分泌。研究证实这两种因子对糖脂代谢,尤其是肝脏脂肪代谢起着极其重要的作用。本研究旨在探讨利拉鲁肽是否可通过影响FGF-19. FGF-21的水平,是否继而通过激活AMPK能量代谢相关信号通路,调节肝脏脂肪代谢关键酶的表达,最终实现对糖尿病大鼠非酒精性脂肪肝病的保护作用。
方法：采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ建立糖尿病脂肪肝病动物模型,检测利拉鲁肽对糖尿病大鼠血糖、血脂、胰岛素抵抗的影响,应用ELISA方法监测血FGF-19、FGF-21的水平的变化；计算肝脏指数、HE和油红染色观察肝脏形态学变化和肝脏内脂质蓄积的情况；分析糖尿病大鼠血FGF-19、FGF-21的水平与糖尿病大鼠血生化、肝脏指数、肝脏内脂肪含量的相关性；采用Real-timePCR技术和Westernblot技术检测利拉鲁肽对肝脏FGF-19、FGF-21转录激活因子CREBH、PPAR-α的表达影响情况；进而检测利拉鲁肽对AMPK信号通路关键基因和脂代谢关键酶基因的表达水平。
结果：1.利拉鲁肽可显著降低糖尿病大鼠血糖、血TG、TC水平和显著改善大鼠体重、肝脏指数。
2.糖尿病组大鼠肝脏脂肪样变明显,利拉鲁肽可显著降低大鼠肝脏炎性活动指数和脂肪含量,减轻糖尿病大鼠非酒精性脂肪样病变。
3.利拉鲁肽可显著升高血FGF-19、FGF-21的水平。
4.血FGF-19、FGF-21水平与糖尿病大鼠肝脏指数、肝脏内脂肪蓄积成都成反比。
5.糖尿病大鼠肝脏CREBH、PPAR-α的表达显著降低,而利拉鲁肽可明显增加糖尿病大鼠肝脏CREBH、PPAR-α的表达。
6.利拉鲁肽可促进糖尿病大鼠肝脏FGFR的表达。其中利拉鲁肽促进FGFR1的表达增加量达57%、FGFR3增加49%,、FGFR4增加82%而对FGFR2的表达无明显增加。
7.利拉鲁肽可上调AMPKα1以及p-AMPK的表达,而对AMPKa2表达的影响无统计学差异。
8.利拉鲁肽可明显促进糖尿病大鼠肝脏脂肪酸p氧化关键酶CPT-1mRNA的表达,显著抑制脂肪合成关键酶FAS、SREBP-1、HMGR mRNA的表达。
9.利拉鲁肽可显著提高糖尿病患者血FGF19、FGF21的水平、改善糖尿病患者肝脾比值(L/S)。
结论：利拉鲁肽可通过升高糖尿病大鼠血FGF-19、FGF-21水平,上调肝脏FGFR的表达水平,激活AMPK信号通路,调节糖尿病大鼠肝脏脂代谢关键酶的表达水平,从而对糖尿病肝脏非酒精性脂肪肝病起着保护作用。
关键词: 糖尿病 ；利拉鲁肽 ；非酒精性脂肪肝 ；胰岛素抵抗 ；碱性成纤维细胞生长因子19 ；碱性成纤维细胞生长因子21
被引量
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