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摘要： 目的:比较Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法、裂解红细胞法和Dextran作用下红细胞自然沉降法四种常用的人中性粒细胞分离方法。方法:取健康人外周静脉血,分别采用以上四种方法进行中性粒细胞分离,对其细胞纯度、回收率、存活率进行比较。结果:Percoll非连续密度梯度离心法与Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离得到的细胞纯度均大于90%,两者间比较无统计学差异(P>0.05);裂解红细胞法和Dextran作用下红细胞自然沉降法分离得到的细胞纯度略低于Percoll非连续密度梯度离心法(P<0.01)与Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(P<0.05)。Dextran作用下红细胞自然沉降法的回收率低于Percoll非连续密度梯度离心法(P<0.01)、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(P<0.01)和裂解红细胞法(P<0.05);Percoll非连续密度梯度离心法回收的中性粒细胞存活率明显高于Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(P<0.05),裂解红细胞法(P<0.01)和Dextran作用下红细胞自然沉降法(P<0.01)。结论:Percoll非连续密度梯度离心法分离中性粒细胞,纯化程度好,回收率高,是一种简单、高效的中性粒细胞分离方法,适于临床和科研中广泛应用。
关键词: 中性粒细胞 ；Percoll非连续密度梯度离心法 ；Ficoll—Hypaque密度梯度离心法 ；裂解红细胞法 ；Dextran红细胞沉降法
被引量
46
摘要： 目的探讨严重烧伤患者休克期肝素结合蛋白(HBP)的变化及其在体外对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和中性粒细胞的影响。方法采用前瞻性观察性研究与实验研究方法。将2020年8—11月南京医科大学附属苏州医院烧伤整形科收治的符合入选标准的20例严重烧伤患者纳入严重烧伤组[男12例、女8例,年龄为44.5(31.0,58.0)岁],同期招募该单位体检中心体检结果正常的20名健康志愿者纳入健康对照组[男13例、女7例,年龄为39.5(26.0,53.0)岁]。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测健康对照组志愿者血浆与严重烧伤组患者伤后48 h内血浆中HBP和组织金属蛋白酶抑制物1(TIMP-1)蛋白表达水平,分别对2组血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达的相关性进行Pearson相关分析。取第4代对数生长期HUVEC进行实验,将细胞按随机数字表法(分组方法下同)分为常规培养的正常对照组(处理下同)与进行相应处理的重组HBP(rHBP)处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中TIMP-1的mRNA表达;将细胞分为正常对照组与进行相应处理的rHBP处理48 h组,采用蛋白质印迹法检测细胞中TIMP-1蛋白表达;将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯rHBP组、单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组(rHBP终物质的量浓度为200 nmol/L,抑蛋白酶多肽终质量浓度为20μg/mL),培养48 h,采用ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平。采用免疫磁珠分选法从前述10名健康志愿者外周静脉血中分离中性粒细胞,将细胞分为正常对照组与加入相应试剂处理的单纯重组TIMP-1(rTIMP-1)组、单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组(rTIMP-1终质量浓度为500 ng/mL,佛波酯终物质的量浓度为10 nmol/L),培养1 h,采用免疫荧光法观测细胞中CD63蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞中CD63蛋白阳性表达率,采用ELISA法检测细胞培养上清液中HBP和髓过氧化物酶(MPO)蛋白表达水平。正常对照组均于适宜时间点进行前述相关检测,细胞实验中各组样本数均为3。对数据行χ^(2)检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、Tamhane T2检验。结果严重烧伤组患者血浆中HBP、TIMP-1蛋白表达水平分别为404.9(283.1,653.2)、262.1(240.6,317.4)ng/mL,均明显高于健康对照组志愿者的61.6(45.0,68.9)、81.0(66.3,90.0)ng/mL(Z值分别为-5.41、-5.21,P<0.01)。健康对照组志愿者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达相关性不强(P>0.05),严重烧伤组患者血浆中HBP和TIMP-1蛋白表达呈明显正相关(r=0.64,P<0.01)。与正常对照组比较,rHBP处理12 h组、rHBP处理24 h组、rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1 mRNA表达水平均显著升高(t值分别为-3.58、-2.25、-1.26,P<0.05)。蛋白质印迹法检测显示,与正常对照组比较,rHBP处理48 h组HUVEC中TIMP-1蛋白表达明显增强。培养48 h,与正常对照组比较,单纯rHBP组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著升高(t=9.43,P<0.05),单纯抑蛋白酶多肽组、rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);与单纯rHBP组比较,rHBP+抑蛋白酶多肽组HUVEC培养上清液中TIMP-1蛋白表达水平显著下降(t=4.76,P<0.01)。培养1 h,免疫荧光法和流式细胞术检测的各组中性粒细胞CD63蛋白表达结果趋势一致。培养1 h,与正常对照组比较,单纯rTIMP-1组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05),单纯佛波酯组、rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显升高(t值分别为2.41、3.82,5.73、1.05、4.16、1.08,P<0.05或P<0.01);与单纯佛波酯组比较,rTIMP-1+佛波酯组中性粒细胞中CD63蛋白阳性表达率及细胞培养上清液中HBP、MPO蛋白表达水平均明显下降(t值分别为5.26、2.83、1.26,P<0.05或P<0.01)。结论严重烧伤患者休克期血浆中HBP表达水平增加;HBP可在体外诱导HUVEC分泌TIMP-1,TIMP-1可降低人中性粒细胞CD63分子表达。
关键词: 烧伤 ；金属蛋白酶1组织抑制剂 ；人脐静脉内皮细胞 ；细胞脱颗粒 ；肝素结合蛋白 ；中性粒细胞
被引量
9
摘要： 目的分析调补肺肾（补肺益肾、补肺健脾、益气滋肾）三方对香烟烟雾提取物（CSE）和脂多糖（LSP）刺激人中性粒细胞释放活性氧（ROS）及弹性蛋白酶（NE）的影响。方法 2014年9月—2015年12月,将常规饲养1周的普通级日本大耳白兔96只按照随机数字表法分为正常组、补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组,24只/组。补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组大耳白兔分别采用补肺益肾方剂、补肺健脾方剂、益气滋肾方剂灌胃,正常组采用等量的0.9%氯化钠溶液灌胃,4组均于第7次灌胃后取腹主动脉血,分离血清,-70℃保存备用。取来自河南中医药大学健康成年男性（年龄20~25岁）志愿者外周血,分离人中性粒细胞。CSE刺激下,将人中性粒细胞分为正常对照组（加20%的正常组兔血清）,CSE模型组（加20%的正常组兔血清＋10%CSE）,补肺益肾血清组、补肺健脾血清组、益气滋肾血清组（分别添加20%相应的含药兔血清＋10%CSE）。LPS刺激下,将人中性粒细胞分为正常对照组（加20%的正常组兔血清）,LPS模型组（加20%的正常组兔血清＋2μg/ml LPS）,补肺益肾血清组、补肺健脾血清组、益气滋肾血清组（分别添加20%相应的含药兔血清＋2μg/ml LPS）。分别采用流式细胞仪和酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测各组ROS活性、NE水平。结果与正常对照组比较,CSE模型组、LPS模型组ROS活性增强,NE水平升高（P〈0.05）。与CSE模型组比较,补肺益肾血清组ROS活性减弱（P〈0.05）,补肺益肾血清组、补肺健脾血清组、益气滋肾血清组NE水平均降低（P〈0.05）。与LPS模型组比较,补肺益肾血清组、益气滋肾血清组ROS活性减弱（P〈0.05）;补肺健脾血清组、益气滋肾组血清组NE水平降低（P〈0.05）。结论调补肺肾三方含药血清对CSE、LPS刺激下人中性粒细胞释放ROS和NE水平均有影响;CSE刺激下,补肺益肾方含药血清降低ROS活性及NE水平的效果最好;LPS刺激下,益气滋肾方含药血清降低ROS活性氧及NE水平的效果最好。
关键词: 中草药 ；调补肺肾三方 ；人中性粒细胞 ；活性氧 ；弹性蛋白酶
被引量
7
摘要： 目的:观察右美托咪定(Dex)对离体培养的人中性粒细胞(PMN)凋亡率和呼吸爆发功能的影响。方法:取健康人外周静脉血,血浆-Percoll不连续密度梯度离心法分离出PMN,分为对照组,1 ng/m L Dex组,10ng/m L Dex组和100 ng/m L Dex组,离体培养24 h,取培养2 h和24 h的PMN悬液,检测caspase-3活性、PMN凋亡率和呼吸爆发功能。结果:与对照组比较3种不同浓度的Dex与PMN孵育2 h,PMN的caspase-3活性、PMN凋亡率和呼吸爆发功能没有统计学差异;孵育24 h,与对照组比较,1 ng/m L Dex组PMN caspase-3活性、PMN凋亡率和呼吸爆发功能没有差异,而10 ng/m L Dex组和100 ng/m L Dex组PMN caspase-3活性增强、凋亡率增加和呼吸爆发功能下降;与10 ng/m L De组比较,100 ng/m L Dex组PMN caspase-3活性增强、凋亡率增加和呼吸爆发功能下降。结论:临床常用剂量的Dex(血药浓度<1 ng/m L)不影响PMN的凋亡率和呼吸爆发功能,不影响机体的抗感染能力;而大剂量的Dex与PMN孵育一定时间(>24 h)可促进PMN凋亡,降低其呼吸爆发功能。
关键词: 右美托咪定 ；中性粒细胞 ；凋亡 ；呼吸爆发
被引量
1
摘要： 目的：观察免疫活性细胞的相互作用及其对FNF－α生成的影响。方法：分离人中性粒细胞（polymorphonuclearleukocytes，PMN）并与PMA刺激分化为单核细胞样细胞的U937细胞在不同条件下共同培养。结果：在LPS作用下U937细胞可产生大量TNF－α。PMN在相同条件下并不产生INF－α。将PMN与U937细胞共同培养可抑制U937细胞TNF－α的生成。PMN的抑制作用呈数量依赖性。将两种细胞共处于同一培养体系中并用0．4μm的滤网分开使其不能直接接触，U937细胞产生TNF－α的能力恢复至无PMN时的85％以上。一氧化氮供体硝普钠可轻微提高U937细胞产生TNF－α的能力。但提高的幅度在有或无PMN存在的条件下均相同，与无硝普钢的对照组比较无明显差异（P＞0．05）。经鼠诱导型一氧化氮合酶基因转染的U937对细胞表达一氧化氮合酶的活性，所产生的内源性一氧化氮对PMN的抑制作用无影响。结论：提示PMN并非TNF－α生成细胞。PMN对单核细胞TNF－α的生成有抑制性调节作用。这种抑制作用的机制可能与一氧化氮信息传导通路无关。
关键词: 休克 ；感染性休克 ；中性粒细胞 ；吞噬细胞 ；TNFα
被引量
12
摘要： 目的:探讨单个中性粒细胞中白介素-8β型受体(IL-8Rβ)mRNA的表达丰度。方法:采用倍比稀释相对定量单细胞RT-PCR方法分离纯化人外周血中性粒细胞并提取总RNA,针对IL-8RβmRNA设计引物,进行RT-PCR确认IL-8Rβ在中性粒细胞中的基因表达并优化反应条件。收集单个中性粒细胞胞内容物或完整细胞,以相同引物进行RT反应,再将后者所得的cDNA倍比稀释后,与前者共同经过两轮PCR扩增,并将最终产物以BamHI内切酶酶切鉴定产物的特异性。结果:IL-8RβmRNA在人中性粒细胞中有大量表达,单个中性粒细胞中亦能扩增出特异性的IL-8Rβ目的条带,并且将单个细胞内mRNA稀释104倍后仍可扩增出目的条带,BamHI内切酶酶切反应证实为目的产物。结论:人中性粒细胞表达IL-8RβmRNA,mRNA倍比稀释单细胞RT-PCR方法确认其丰度远高于一般mRNA含量,且此方法可在单细胞水平比较细胞内mRNA的丰度。
关键词: 白介素-8β型受体 ；单细胞RT-PCR ；相对定量 ；中性粒细胞
摘要： 目的比较免疫磁珠法和密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的可靠性。方法用免疫磁珠法和密度梯度离心法分别分离中性粒细胞,使用血球计数仪结合显微镜鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力。结果免疫磁珠法与密度梯度离心法分离中性粒细胞纯度分别为(98.76±0.53)%,(92.34±1.57)%,回收率分别为(90.01±2.24)%和(82.20±2.17)%,两种方法分离后中性粒细胞活力分别为(95.60±2.30)%,(94.20±3.11)%。结论免疫磁珠法分离人中性粒细胞纯度及回收率均好于密度梯度离心法,但分离后细胞活性二者差异不大。
关键词: 白细胞分离术 ；免疫磁化分离 ；密度梯度离心法
被引量
4
摘要： 目的了解急性支气管肺炎患儿血浆人中性粒细胞多肽1-3(HNP 1-3)水平及其在病原判断中的参考价值。方法88例急性支气管肺炎患儿,分离其急性期和恢复期血浆,应用ELISA法检测HNP 1-3、白细胞计数、中性粒细胞计数和hs-CRP,并进行比较。结果急性期血浆HNP1-3为(257.0±150.6)ng/ml,明显高于恢复期的(215.6±10415)ng/ml(t=2 12,P<0.05),且血浆HNP1-3水平与白细胞总数、中性粒细胞计数和hs-CRP均明显相关(r=0.283、0.275、0.273,均P<0.01)。结论 88例急性支气管肺炎患儿急性期血浆HNP1-3水平明显升高,且与白细胞总数、中性粒细胞总数和hs-CRP相关,可能对细菌性感染的诊断有参考价值。
关键词: 支气管肺炎 ；人中性粒细胞多肽 ；儿童
被引量
2
会议时间： 2014-10-18
摘要： 背景及目的:托法替尼(Tofacitinib,CP-690550)是以JAK3激酶为靶点的抗炎药物,临床结果显示其可有效地治疗类风湿性关节炎(RA)等自身免疫性疾病。作为首个口服的类似TNFα拮抗剂的药物,将来可能成为治疗RA的常用药物。感染性疾病是长期使用免疫抑制剂常见副作用。本研究的主要内容就是利用白色念珠菌感染模型考察CP-690550是否存在的诱发真菌感染的副作用效应,为临床研究进行初步探索。实验方法结果:将健康人外周血中分离得到的中性粒细胞在炎性细胞因子环境与调理后的白色念珠菌共培养2h后,涂布琼脂培养板,计算菌落数以考察中性粒细胞的体外杀菌能力。炎性细胞因子(IFNγ,TNFα等)可加强中性粒细胞的杀菌能力。在杀菌体系中加入CP-690550干预,发现其并不影响中性粒细胞杀菌能力;但在加入炎性细胞因子的体外杀菌体系中,CP-690550可抑制IFNγ、TNFα对中性粒细胞杀菌能力的增强作用。进一步利用FITC标记的zymosan以及FITC标记的白色念珠菌为探针,考察CP-690550对人中性粒细胞以及炎性因子环境下的吞噬功能的影响,结果表明IFNγ与TNFα均可增强中性粒细胞的吞噬作用,而CP-690550可抑制其增强效果。白色念珠菌刺激中性粒细胞所产生的氧化爆发也是杀伤真菌的重要因素,可利用罗丹明123作为探针检测细胞氧化爆发的强度,结果表明CP-690550可抑制IFNγ与TNFα刺激的氧化爆发。进一步利用小鼠白色念珠菌感染模型考察CP-690550体内对小鼠真菌清除的影响。尾静脉接种10～7白色念珠菌,同时每8h腹腔注射一次15 mg/kg CP690550,24h后取脏器考察脏器中的真菌载量,结果表明CP-690550不影响小鼠急性期对白色念珠菌清除作用。每天腹腔注射15 mg/kg CP-690550,观察感染小鼠的生存情况,结果显示CP-690550可显著缩短小鼠生存期。结论:实验结果提示CP-690550不影响人中性粒细胞的杀菌作用,但抑制感染后炎性因子对中性粒细胞杀菌作用的增强作用,缩短小鼠白色念珠菌感染模型的生存期。因此,本研究提示RA患者长期使用CP-690550可能存在诱发白色念珠菌体内感染的潜在风险。
关键词: 托法替尼 ；中心粒细胞 ；白色念珠菌
摘要： 背景和目的中性粒细胞是人体外周血中含量最高的白细胞,是固有免疫重要的组成部分。中性粒细胞的缺失会造成严重的感染、昏厥、免疫力低下、高热和寒战等症状。从造血发生角度看,中性粒细胞属于髓系细胞之一,来源于粒系-单核系祖细胞(granulocyte-monocyteprogenitors,GMPs)。多项研究表明 GMPs 是一群具有高度异质性的细胞。尽管已有研究表明在人类骨髓中存在单一潜能的中性粒细胞祖细胞,其表面分子为Lin-CD71highCD117high CD34midCD49dmidCD15lowCD66blow或Lin-CD38+CD71+CD66b+CD15+CD49d+CD11b-。但是,从 GMPs 分化生成 CD66blow/+的单一潜能的中性粒细胞祖细胞过程中细胞表型和中性粒细胞谱系决定过程中细胞转录谱的变化尚不清楚。同时,在这个过程中起调控作用的信号通路也不明确。本研究基于α-硫辛酸(alpha-lipoicacid,ALA)建立的一种可诱导的人中性粒细胞分化缺失模型来研究人类中性粒细胞谱系决定及相关调控机制。研究方法1.利用人脐带血造血干祖细胞(hematopoieticstemandprogenitorcells,HSPCs)和含有 SCF、GM-CSF、IL-3、IL-6、FLT-3L、G-CSF、TPO 等 7 个细胞因子的有血清培养基建立体外人类中性粒细胞和单核细胞的分化体系。通过添加ALA,流式检测其对中性粒细胞和单核细胞分化的影响。2.已知ALA可通过降低ROS水平维持造血干细胞的功能。为确认ALA抑制人中性粒细胞分化是否也与ROS有关,通过在培养基中添加常用抗氧化剂NAC、NAD、VE、VC、GSH和氧化剂双氧水(H2O2),流式检测以上小分子化合物对人脐带血HSPCs向中性粒细胞分化的影响。3.利用流式检测±ALA对人脐带血HSPCs分化CD115-GMPs(Lin-CD34+CD38+CD123+CD45RA+)和 CD115-Lin-CD34-CD38+CD123+CD45RA+的影响;分选CD34high CD115-、CD34midCD115-和 CD34-CD115-通过在培养的起始和第 5 天±ALA,流式检测ALA抑制中性粒细胞生成的阶段。4.流式分析中性粒细胞相关造血祖细胞CD371表达情况,并利用CD371、CD115和CD34分选中性粒细胞祖细胞并通过体外向髓系诱导分化,确定人类中性粒细胞谱系分化的基本路径。5.利用单细胞转录组测序技术(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)分析体外来源中性粒细胞谱系分化的转录谱特征,并结合流式细胞术找到中性粒细胞谱系特异性的表面分子。6.通过对成人骨髓细胞进行scRNA-seq,分析验证体内与体外中性粒细胞谱系分化在转录水平是否具有一致性。7.利用ALA对NbP1和NbP2处理48小时后进行转录组测序,通过DESeq2分析差异表达基因并与正常的NbP1、NbP2、NbP3转录谱进行比较,筛选得到人类中性粒细胞谱系分化的潜在调控基因库。通过PCCL过表达载体和plKO.1基因敲低载体,构建不同基因的过表达和shRNA表达载体,并通过体外HSPCs分化体系和体内移植找到调控中性粒细胞生成的关键基因。8.为了研究中性粒细胞分化过程中的ELK1不同转录本(full-length transcript:L-ELK1,short-lengthtranscript:S-ELK1)是如何被剪接的,首先通过RNA-pulldown和蛋白质谱分析寻找与ELK1 RNA结合的剪接因子。随后通过plKO.1对该剪接因子进行敲低,分析其对中性粒细胞谱系分化的影响和对L-ELK1、S-ELK1蛋白表达的影响。9.通过在CD34+HSPCs中过表达L-ELK1和S-ELK1进一步确定L-ELK1和S-ELK1对人类中性粒细胞分化的影响。10.利用过表达L-ELK1和S-ELK1的NbP1进行转录组测序,进一步确定L-ELK1和S-ELK1调控的信号通路。研究结果1.ALA可以特异性阻断人脐带血CD34+HSPCs体外向中性粒细胞的分化。2.ALA抑制HSPCs向中性粒细胞分化并不是通过ROS信号通路。3.ALA严重抑制CD115-CD34high、CD115-CD34mid向中性粒细胞分化,但不能抑制CD115-CD34-向中性粒细胞分化。说明人类中性粒细胞谱系决定是在CD34high向CD34-分化过程中逐渐发生的,同时ALA抑制人类中性粒细胞分化发生在早期CD34+向CD34-分化过程中。4.中性粒细胞来源于CD371+GMPs,且中性粒细胞基本分化路径为由CD115-CD371+CD34high经 CD115-CD371+CD34mid 到 CD115-CD371+CD66b-过程。5.测序结果显示中性粒细胞命运决定的过程中没有明显上调的转录因子,转录后调控可能发挥着重要作用。而CD15在GMPs已开始表达,利用CD15进一步确定Lin-CD73/CD1c/CD1 16/CD115-CD38+CD123+CD45RA+CD371+细胞群中人中性粒细胞分化的三个阶段:CD34+CD15-中性粒细胞偏好性祖细胞1(neutrophil-biased progenitor 1,NbP1)、CD34midCD15mid NbP2 和 CD34-CD15+NbP3。6.测序结果验证了体内与体外中性粒细胞分化路径具有一致性,同时也解析了体内中性粒细胞谱系分化过程中的转录谱特征。7.ELK1是调控中性粒细胞生成的关键基因,敲除ELK1后人类中性粒细胞分化受阻,其表型和添加ALA相同。8.SF3B1是调控L-ELK1和S-ELK1表达的关键剪接因子。同时,ALA可以增强与SF3B1与ELK1 RNA的结合。SF3B1-ELK1信号通路在人类中性粒细胞谱系分化中起关键调控作用。9.过表达L-ELK1后人类中性粒细胞分化被阻滞在CD34-CD15+NbP3阶段。同时,敲低L-ELK1后中性粒细胞分化受阻,单核细胞比例显著上升。而过表达S-ELK1可少量增加中性粒细胞生成,敲低S-ELK1则使中性粒细胞生成明显减少。10.L-LKE1和S-ELK1调控的是酶颗粒合成和运输的不同阶段相关基因。L-ELK1上调酶合成(CTSS、CTSB、CSTB、HEXB、FUCA1、PRCP等)和内质网对高尔基体转运相关基因(COPA、COG6、GOLGB1、BET1、LMAN1、USO1、VAPA、BET1等),而S-ELK1上调高尔基体转运相关基因(SEC24A、SEC23IP和KIF3A)、催化反应和酶成熟相关基因(LTN1、TRIM37、TRIM71、LOXL1等)。研究结论我们通过ALA建立了可诱导的人类中性粒细胞体外分化缺失模型,并通过该模型解析了 GMPs向中性粒细胞谱系分化的基本过程。同时也找到了调控中性粒细胞谱系分化的关键调控信号通路,即SF3B1-ELK1信号通路。
关键词: 中性粒细胞 ；单核细胞 ；谱系决定 ；ALA ；ELK1 ；SF3B1
摘要： 背景:孢子丝菌病是中国北方地区常见的真菌病,主要通过接触芦苇和玉米秆时感染球型孢子丝菌引起。孢子丝菌病临床表现多样,包括皮肤播散型、真菌血症、内脏器官播散型、固定型和皮肤淋巴管型,固定型和皮肤淋巴管型是最主要的两种类型。尽管伊曲康唑是治疗孢子丝菌病的首选治疗方案,但治疗花费较高,副作用较大。局部温热也被用于皮肤淋巴管型及固定型孢子丝菌的治疗。对于不能安全接受其他治疗方案的患者,如孕妇和哺乳期妇女,局部热疗是治疗固定型孢子丝菌病较好的选择。尽管局部温热被推荐用于固定型及皮肤淋巴管型孢子丝菌病的治疗,但尚缺乏随机安慰剂对照试验或与其他治疗方法的比较试验,以评估该疗法的有效性和安全性。尤其是一些孢子丝菌病患者有自愈性,更需要证据明确局部热疗是否有效。在孢子丝菌病患者皮损的真皮层及皮下组织有化脓性及肉芽肿性炎症反应,组织病理学检查发现常伴有小脓肿。中性粒细胞是主要的浸润细胞之一,但中性粒细胞在孢子丝菌病的发病机制中的作用尚不清楚。有报道在一些孢子丝菌病的病灶组织中观察到中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成。NETs是染色质的修饰形式,保持着核小体间隔的周期性,颗粒状蛋白以球状形式与NETs相结合结合。许多真菌,比如构巢曲霉、白色念珠菌、杜氏假丝酵母及新型隐球菌都表现出对NETs的敏感性,然而仍不清楚NETs是否有杀伤球形孢子丝菌的作用。本研究旨在评估热疗在孢子丝菌病小鼠模型中的治疗作用,并初步探讨中性粒细胞及NETs是否与孢子丝菌的清除有关。报道如下。材料与方法1、实验对象人中性粒细胞分离自10个健康志愿者的静脉血。静脉血的采集及随后的实验获得中国医科大学附属第一医院机构审查委员会批准,并符合赫尔辛基宣言。球形孢子丝菌菌株来源于一个固定型孢子丝菌病患者,并经ITS测序鉴定为球形孢子丝菌。孢子丝菌病小鼠模型为6-8周周龄、体重19-20g,经皮下注射0.1ml 108/ml的球形孢子丝菌酵母细胞的1周后的BALB/C雌性小鼠。2、温热治疗方案孢子丝菌病小鼠模型治疗方法:采用定制的温热仪器及水球,加热小鼠皮损至41℃。加热期间,用温度计监测小鼠皮肤温度,温度波动于40-41℃。小鼠每天温热治疗30分钟,连续治疗4周。而对照组小鼠不进行温热处理。细胞温热:水浴锅调整至实验设定的温度(37℃和41℃)后,将细胞接种于24孔板中,将24孔板放于水浴锅的水面加热30分钟,30分钟后将细胞重新放于37℃培养箱中培养。3、温热处理后皮损的变化观察并记录治疗前及每治疗1周后小鼠皮损的变化,比较两组皮损宽度的变化。4、免疫组化检测组织中中性粒细胞细胞外诱捕网的形成小鼠温热治疗治疗1周后,处死留取皮疹组织。将组织切片黏附于多聚赖氨酸包被的载玻片上,进行免疫组化染色(SP法),通过检测弹性蛋白酶来观察中性粒细胞细胞细胞外诱捕网是否形成。5、糖原染色检测温热处理对皮损中孢子数量的影响小鼠造模1周后,温热治疗1周后及温热治疗3周后,处死小鼠并留取皮损组织。将组织切片(3um)黏附于载玻片上,用高碘酸-雪夫试剂染色,苏木素复染,在40倍物镜下随机选取多个视野,计数视野内脓腔中孢子的数量,测量脓腔的面积,并计算单位像素面积下脓腔中孢子的数量。6、免疫荧光检测中性粒细胞细胞外诱捕网的形成采用免疫荧光的方法检测中性粒细胞与孢子在不同温度条件下共培养时,中性粒细胞细胞外诱捕网的形成情况。计数中性粒细胞和NETs的数量,并计算NETs的百分率。7、杀伤实验将不同处理后的孢子培养液涂布平板,计数不同组间的集落形成单位数量。计数并比较各组14天后的集落形成单位的数量。8、统计学分析采用SPSS 22软件对数据进行统计分析,利用GraphPad Prim软件进行统计作图。利用Office 2016软件绘制统计表,数据表示为均数±标准差。用重复测量方差分析对治疗期间皮疹的宽度变化的进行统计分析。用Fisher确切概率法比较温热组和对照组小鼠皮损的清除率。温热治疗第三周时,小鼠皮损脓腔中单位像素面积的孢子数量不满足正态分布,因此采用Mann-Whitney test,数据用中位数表示。温热治疗第一周时,小鼠皮疹脓腔中单位像素面积的孢子数量满足正态分布,采用独立样本t检验,但数据仍用中位数表示。采用独立样本t检验来评估体外实验时,不同处理后球形孢子丝菌的存活状态及细胞外诱捕的形成率的差异,数据表示为均数±标准误。P<0.05表示差异具有统计学意义。实验结果:1、温热对孢子丝菌病小鼠皮损的影响温热组小鼠与对照组小鼠的皮疹直径的差值(皮疹宽度差值=治疗前皮疹宽度-治疗期间的皮疹宽度)随着治疗时间的延长不断增大,P<0.05;且温热组小鼠皮疹宽度的差值与对照组小鼠皮疹宽度的差值在治疗期间不同,P<0.05,温热组小鼠皮疹宽度的差值高于对照组小鼠,即皮疹消退比对照组小鼠快。温热组治疗停止后2周及3周后痊愈率均高于对照组,P<0.05。2、温热对皮损组织中孢子数量的影响两组小鼠的孢子均局限于皮疹脓腔内。尽管温热组小鼠及对照组小鼠皮疹脓腔中单位像素面积的孢子数量都随治疗时间延长明显下降,但是温热组小鼠及对照组小鼠皮疹脓腔中单位像素面积的孢子数量没有明显的差异,P>0.05。3、温热对中性粒细胞细胞外诱捕网形成的影响温热组小鼠和对照组小鼠皮损组织中都可见大量细胞外诱捕网形成。中性粒细胞与孢子在41℃、37℃共培养后,都可以见到细胞外诱捕网的形成,但是细胞外诱捕网形成的率没有差异。4、温热及中性粒细胞对孢子存活状态的影响当酵母细胞与中性粒细胞在41℃和37℃条件下共培养后,两组集落形成单位的数量无明显差异。当酵母细胞在41℃和37℃条件下培养后,两组集落形成单位的数量无明显差异。当酵母细胞在41℃条件下和中性粒细胞共培养后,与没有中性粒细胞时相比,两组集落形成单位的数量无明显差异。当酵母细胞在37℃条件下和中性粒细胞共培养后,与没有中性粒细胞时相比,两组集落形成单位的数量无明显差异。用佛波酯诱导的中性粒细胞细胞外诱捕网和孢子共培养后,与中性粒细胞和孢子共培养及加入佛波酯的孢子培养液相比,集落形成单位的数量均没有明显差异。表明体外实验条件下,41℃温热不能杀伤球形孢子丝菌的酵母相细胞,也不能促进中性粒细胞杀伤球形孢子丝菌的酵母相细胞。结论:1、球形孢子丝菌感染的小鼠皮疹具有自愈的能力,但是温热治疗能缩短小鼠皮损的清除时间。2、尽管温热治疗小鼠孢子丝菌病有效,但温热不能直接促进孢子丝菌病小鼠皮损中的孢子的杀伤,也不能提高中性粒细胞对孢子丝菌的杀伤作用。3、球形孢子丝菌酵母细胞可以诱导中性粒细胞NETs的形成。4、温热治疗孢子丝菌病,不依赖于NETs的形成。
关键词: 温热 ；球形孢子丝菌 ；孢子丝菌病 ；中性粒细胞细胞外诱捕网
摘要： 【研究背景】闭塞性细支气管炎（bronchiolitis obliterans,BO）是一种累及细支气管为主的炎性损伤所致的慢性气流受限综合征,病理主要表现为细支气管的部分或完全闭塞,主要见于重症肺部感染或急性肺损伤后所致的细支气管炎性损伤后持续咳嗽、喘息、呼吸困难,常规平喘治疗无效,严重影响儿童的生长发育,并可发生严重的并发症,致死、致残率极高。根据BO所致的病因不同,可分为感染后闭塞性细支气管炎（postinfectious bronchiolitis obliterans,PIBO）、移植后BO及有毒为物质吸入后BO等,其中儿童以PIBO最为常见,多继发于严重的下呼吸道感染。PIBO发病机制尚未完全明确,目前有认为重症肺部感染后大量的炎症细胞浸润与细胞因子高分泌引起免疫活性细胞和细胞因子作用于损伤的气道黏膜上皮细胞,进而诱发的慢性进行性炎性损伤;小气道持续损伤与反复炎症刺激,气道上皮细胞增生及组织迷行修复,成纤维细胞大量增殖致过度纤维化,形成恶性循环,最终导致小气道纤维性的部分或完全闭塞。中性粒细胞为人体最多的炎症细胞,是机体抵御外来微生物入侵的第一道防线。在急性感染后及肺移植后期.体内CD4+,CD8+T淋巴细胞识别体内抗原,启动细胞免疫应答,杀伤组织细胞（或者肺泡、气道上皮）。机体在识别过程中CD4+T淋巴细胞能分泌大量的细胞因子、黏附分子以及多种趋化细胞因子[(包括IL-6、IL-8、IL-17和γ-干扰素（IFN-γ）等],诱导B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞活化增殖。其中,活化T淋巴细胞分泌细胞因子（IL-6、IL-17和IFN-γ等）和活化气道上皮细胞分泌多种细胞因子[募集中性粒细胞和巨噬细胞的IL-18和单核细胞趋化蛋白（MCP-1）等]在PIBO的发生过程中起着关键作用。中性粒细胞的聚集链接了一系列气道上皮的损伤。感染发生后,中性粒细胞是固有性免疫系统中重要效应细胞,它可藉助Fc受体及补体受体通过吞噬、脱颗粒、ADCC（抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用）发挥其杀伤功能;激活状态下,中性粒细胞还能产生大量的超氧阴离子和活性氧（reactive Oxygen species,ROS）,这些产物具有较高的反应性,与细菌的细胞膜、核酸分子及蛋白质发生氧化还原反应,一方面发挥了对病原微生物的杀伤作用;另一方面机体异常的、持续的免疫状态可造成中性粒细胞过度趋化或持续激活,清除病灶延迟,其呼吸爆发的产物ROS及依赖于ROS的中性粒细胞脱颗粒产物可对正常组织及细胞造成损伤死亡;ROS还可上调一些细胞因子及粘附分子的表达水平,放大炎症效应。此时中性粒细胞的耗氧量激增,可达正常消耗量的2～20倍,其过程称为呼吸爆发。文献报道在慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）患者气道内存在持续的慢性气道炎症,中性粒细胞在肺内聚集增多的同时伴有清除延迟和继发性坏死增加,组织细胞的坏死引起大量趋化因子释放,募集更多中性粒细胞,使炎症持续;同时滞留的中性粒细胞可进一步导致气道黏液纤毛清除功能障碍而增强炎症反应。中性粒细胞呼吸爆发产生的ROS对于气道上皮炎性损伤及异常修复所致的气道重构同样是清除、修复、损伤的结果。抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA）是针对中性粒细胞和单核细胞胞浆成分的自身抗体。ANCA的靶抗原众多,其中髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）及蛋白酶-3（proteinase-3,PR3）是临床上最常见靶抗原,与之相对应的特异性抗体MPO-ANCA、PR3-ANCA亦是最具临床意义的抗体。在致炎因子刺激后,中性粒细胞胞浆内的PR3、MPO转移到细胞膜表面,与MPO-ANCA及PR3-ANCA相结合形成抗原-抗体复合物,激活中性粒细胞,产生活性氧及释放脱颗粒产物,参与炎症反应。本课题组前期研究在国际上首次提出了BO患儿血清中MPO-ANCA及PR3-ANCA异常升高,患儿ANCA水平随病情的改善逐渐降低。既往有文献报道,BO患者中诱导痰及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中中性粒细胞比率增加,BALF中蛋白氧化产物增加,有中性粒细胞趋化因子白介素-8（Interleukin-8,IL-8）增多;上述指标经抗炎治疗后PMN减少,IL-8降低、氧化产物减少,病情改善。基于以上研究,我们推论ANCA与PIBO存在一定的相关性,中性粒细胞是PIBO患儿气道炎性损伤的优势表型细胞,ANCA可能通过介导中性粒细胞呼吸爆发参与了PIBO的气道炎症,这些假设有待更多的临床与基础实验验证。【研究目的】本研究旨在:1、验证PIBO患儿中气道存在以中性粒细胞为主的炎症反应;2、探讨ANCA变化水平与PMN呼吸爆发程度的相关性;3、建立中性粒细胞与气道上皮细胞共培养体系,探讨ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性。本研究分三部分第一部分PIBO患儿肺泡灌洗液中细胞学分类的优势表型PIBO的发病机制尚未完全明确,目前认为气道上皮的损伤再修复为PIBO的启动因素,其中多种炎症细胞及炎症介质参与了气道上皮的损伤。肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）细胞学分类计数是气道疾病常用的检查方法,可评估气道局部炎症,但因为有创检查,难以重复;高渗盐水诱导痰细胞学检查普遍认为可反应气道疾病,BALF和诱导痰所取的气道分泌物所进行的细胞学分类结果有相似性,因此,通过检测PIBO患儿BALF行细胞分类检查,评估气道炎症细胞表型。【研究目的】确立PIBO患儿BALF细胞学分类中的优势细胞表型。【研究方法】收集2010年1月2017年12月在我院住院诊断符合PIBO诊断、首次入院的、未经全身激素治疗、经支气管镜取BALF的PIBO患儿52例及5～7岁经高渗盐水雾化取诱导痰的正常健康儿童35例,行细胞学分类检查,分析气道分泌物细胞分类的优势表型。统计学方法:参数成正态分布时数据以~χ±s示;非正态分布参数以中位数及四分位数间距（IQR）表示,参考值范围以95%可信区间（95%CI）表示;计数资料用频数（百分数）表示;正态分布结果比较分析采用双侧独立样本t检验;非正态分布结果比较分析采用Mann-Whitney检验与Kruakal-Wallis检验,P<0.05为有统计学意义。【研究结果】1、52例PIBO患儿（男:女=44:8）及35例健康正常儿童（男:女=18:17）纳入研究,一般情况见表1。PIBO组BALF中以PMN为主,其Median（IQR）、95%CI分别为0.878（0.354）、0.679～0.817。随后是M,其Median（IQR）、95%CI分别为0.038（0.216）、0.082～0.199,EOS及L仅为0.01（0.028）、0.014～0.039;0.020（0.042）、0.030～0.126,PMN比率较M、L、EOS高,差异有显著性（P<0.01）;健康正常患儿诱导痰中以M为主,其Median（IQR）、95%CI分别为0.823（0.172）、0.650～0.815,随后是PMN,其Median（IQR）、95%CI分别为0.138（0.185）、0.156～0.320。EOS及L仅为0.003（0.008）、0.002～0.026;0.013（0.012）、0.001～0.0186。M比率较PMN、L、EOS高,差异有显著性（P<0.01）;2、PIBO组BALF中PMN比率较健康正常对照组诱导痰中PMN比率明显升高,差异显著（P<0.01）,L比率较健康正常对照组明显升高,差异有显著性（P<0.05）;PIBO组M比率较健康正常对照组明显降低,差异有显著性（P<0.01）。【研究结论】PIBO患儿气道以中性粒细胞为优势细胞表型。基于此,拟开展后续的研究以验证ANCA是否介导了中性粒细胞炎性反应。第二部分ANCA与中性粒细胞呼吸爆发的相关性我们推测,在PIBO中,ANCA介导中性粒细胞呼吸爆发损伤了气道上皮细胞。但ANCA刺激中性粒呼吸爆发的必要条件尚未清楚,故本研究拟从细胞层面上研究ANCA介导中性粒细胞呼吸爆发的条件,选择鼠来源的ANCA单克隆抗体刺激中性粒细胞,按浓度梯度增加ANCA浓度,探讨中性粒细胞呼吸爆发程度与ANCA刺激浓度及时间的相关性;筛选出ANCA最佳刺激浓度和刺激时间,应用于第三部分的共培养实验。【研究目的】从细胞层面上研究ANCA介导中性粒细胞呼吸爆发的条件,探讨中性粒细胞呼吸爆发程度与ANCA刺激浓度及时间的相关性;筛选出ANCA最佳刺激浓度和呼吸爆发产物MPO最高浓度对应的最佳刺激时间,应用于第三部分实验。【研究方法】1、选择鼠来源的ANCA单克隆抗体（Anti-MPO/Anti-PR3）刺激中性粒细胞,按（0.5μg、1.5μg、2.5μg、5μg）浓度梯度增加ANCA刺激浓度,与阴性对照组（PMN组）及阳性对照组（PMA组）行流式细胞检测,比较三组间荧光强度,确立ANCA刺激中性粒细胞产生呼吸爆发的最佳浓度。2、应用最佳浓度ANCA（Anti-MPO/Anti-PR3）以不同时间段（1h、2h、4h）刺激中性粒细胞,生成产物1、产物2及产物3,检测产物中代表性呼吸爆发脱颗粒产物MPO的水平。【研究结果】1、0.5μgAnti-MPO组及（0.5μg、1.5μg、2.5μg）Anti-PR3组MIF数值较PMN组差异无显著性（P<0.05）;1.5μg及2.5μg Anti-MPO组MIF数值较PMN组明显升高,差异有显著性（P<0.05）,但较对照组流式图上未见明显峰移。5μg Anti-MPO组及Anti-PR3组较PMN组峰后移近1个数量级,Anti-MPO组与Anti-PR3组MIF的数值分别为（1787.33±198.34）、（1254.33±37.82）均高于PMN组（1050.33±90.01）,差异有统计学意义（P<0.05）;提示ANCA单克隆抗体（Anti-MPO/Anti-PR3）在一定浓度下才能刺激中性粒细胞呼吸爆发,其中5μg是最佳刺激浓度。2、5μg Anti-MPO以1h、2h、4h的不同时间段刺激中性粒细胞,其呼吸爆发产物1、产物2、产物3中MPO生成量分别为（66.78±2.77）ng/m L、（33.05±7.39）ng/mL、（21.92±4.00）ng/m L较PMN组（25.23±0.93）ng/m L明显增多,差异有显著性（P<0.01）,其中1h MPO产生量最多,组间比较均有显著性差异（P<0.05）。【研究结论】1、5μg ANCA（Anti-MPO/Anti-PR3）刺激中性粒细胞可以产生呼吸爆发,为最佳刺激浓度,因已达到实验要求,故不再探索更高浓度;2、Anti-MPO刺激中性粒细胞最佳刺激时间为1h,产生呼吸爆发的代表产物MPO浓度最高;推测在ANCA可介导中性粒细胞呼吸爆发损伤气道上皮细胞进而参与了PIBO的进程。第三部分ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性研究本部分研究拟在第二部分体外实验的基础上,构建人中性粒细胞呼吸爆发产物与人小气道上皮细胞共培养体系,予ANCA单克隆刺激中性粒细胞呼吸爆发产物刺激气道上皮细胞,检测上皮细胞IL-6、IL-8炎症指标,探索ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性。【研究目的】建立中性粒细胞与气道上皮细胞共培养体系,探讨ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性。【研究方法】本研究分9组,分为（1）:产物1+气道上皮细胞;（2）产物2+气道上皮细胞;（3）产物3+气道上皮细胞;（4）(TNF+中性粒细胞)+气道上皮细胞;（5）Anti-MPO+气道上皮细胞;（6）TNF+气道上皮细胞;（7）产物1;（8）产物4;（9）PBS+气道上皮细胞（空白对照组）。?至（8）组应用ELISA法检测培养上清液中IL-6及IL-8的水平,
关键词: 中性粒细胞胞浆抗体 ；中性粒细胞呼吸爆发 ；感染后闭塞性细支气管炎 ；儿童
被引量
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摘要： 近几十年来,典型的气道炎症疾病如慢性肺阻塞(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、哮喘和肺纤维化的患病率急剧上升。常用药物如糖皮质激素(地塞米松)等具有较强的毒副作用。因此,开发具有一定疗效且安全无副作用的中草药或功能食品,将是一条有效的防治呼吸道炎症的途径。本文对具有平喘止咳效果的中草药进行筛选,最终聚焦于银杏。在中国古代,银杏(Ginkgo biloba)的叶和种子就有用于治疗喘咳的记载。其中,《本草纲目》记载,银杏叶主治温肺益气,定喘咳;《中国药典》中记载,银杏敛肺平喘,用于治疗肺虚咳喘等症状,归心、肺经。但现代研究有关银杏对气道炎症作用的报道较少。本研究主要探讨银杏治疗气道疾病的效果及其物质基础,并阐明活性物质的作用机制。首先,比较不同的银杏提取物对卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏小鼠的抗气道炎症的效果,再利用HPLC-MS和虚拟筛选技术寻找银杏中潜在的抗气道炎症活性成分;研究探讨了银杏中活性成分如何作用于气道炎症的相关靶点,阐明了活性成分对气道炎症中相关通路的影响;其次,对有效提取物的安全性进行评价,最后对活性成分的制备工艺进行了研究,取得的主要研究结果如下:(1)采用卵清蛋白致敏小鼠,造模后小鼠各炎症因子指标大幅度上升。观察不同银杏提取物(银杏叶乙醇提取物,银杏果乙醇提取物,标准银杏叶提取物,银杏叶乙酸乙酯提取物,银杏黄酮提取物以及银杏内酯提取物)对气道炎症模型小鼠的效果。以肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的炎症因子等为参考指标,结果表明,银杏叶乙酸乙酯提取物能明显降低BALF中炎症因子的浓度,在各类提取物中效果最佳。(2)采用HPLC-MS分析发现,银杏叶乙酸乙酯提取物中主要成分为白果黄素、银杏黄素、异银杏黄素和紫杉双黄酮这四种银杏双黄酮。动物试验显示:除去银杏双黄酮后,银杏叶乙酸乙酯提取物的抗气道炎症活性明显下降,说明银杏叶乙酸乙酯提取物中的抗气道炎症的活性成分主要为银杏双黄酮。利用Pharm Mapper预测四种银杏双黄酮在人体内对肺部疾病的潜在作用靶点,发现其可能的作用靶点主要为人中性粒细胞弹性蛋白酶(Human neutrophil elastase,HNE)。粒细胞弹性蛋白酶是一种强力的中性粒细胞趋化剂,能导致炎症细胞在肺部募集与浸润,同时引起气道黏液蛋白的高表达,在气道炎症的发生过程中起着重要的作用。利用Auto Dock进行虚拟对接,结果显示,银杏黄素与HNE自由结合能为-6.69 kcal/mol,目前唯一上市的HNE抑制剂西维来司钠为-5.36 kcal/mol。虚拟筛选结果表明,银杏双黄酮是一种良好的HNE抑制剂。进一步利用荧光色谱和圆二色谱对银杏黄素在体外抑制HNE的活性进行评价,银杏黄素与HNE结合后能导致HNE蛋白荧光淬灭,其IC50为40.8 nmol/L。圆二色谱观测到银杏黄素与HNE蛋白结合后HNE的蛋白构象发生改变。以上实验表明,银杏双黄酮在体外具有抑制HNE的生理活性。(3)采用细胞模型和动物模型对银杏双黄酮抗气道炎症机理进行研究,发现银杏双黄酮能减少由HNE导致的A549细胞中黏液蛋白5AC(Mucin 5AC,MUC5AC)基因的高表达,能抑制HNE处理A549细胞后p38与Akt通路的磷酸化,从而抑制IL-8m RNA的表达。对银杏双黄酮进行纯化,以卵清蛋白致敏小鼠为模型进行灌胃试验。结果显示,随着银杏双黄酮灌胃剂量增加,与中性粒细胞弹性蛋白酶相关的指标IL-8、黏液蛋白(MUC5AC)的表达以及中性粒细胞数目均减少。以上结果表明,银杏双黄酮能抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的活性,使气道黏液蛋白分泌减少、炎症因子IL-8降低,从而减轻肺部炎症细胞浸润,达到抑制气道炎症的效果。(4)对银杏叶乙酸乙酯提取物进行安全性评价(50 mg/kg·bw;500 mg/kg·bw;2000 mg/kg·bw),发现小鼠肝肾相关的指标均正常,LD50大于2000 mg/kg,表明银杏叶乙酸乙酯提取物未发现急性毒性。(5)对标准银杏叶提取物(EGB761)的提取工艺进行研究,发现银杏双黄酮成分在EGB761中被完全剔除,这也解释了中医古籍记载银杏有止咳平喘功效而现代文献却很少报道EGB761具有抗气道炎症作用的原因。因此,本文研发了一条全新的银杏资源高值化利用技术及工艺,该技术在不改变原有标准银杏提取物(EGB761)提取工艺的同时,还能同步提取得到高含量的银杏双黄酮提取物,四种银杏总双黄酮含量为87.31%,总双黄酮的收率为56.92%。综上,本文主要研究发现了银杏中抗气道炎症的活性成分,并阐明其作用机制,同时,还研发了活性成分的制备工艺,为后续进行银杏资源高值化利用,开发防治气道炎症的功能食品和药品提供了重要理论和实验依据。
关键词: 银杏 ；银杏双黄酮 ；分子对接 ；中性粒细胞弹性蛋白酶 ；黏液蛋白5AC ；急性毒性 ；同步提取
被引量
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摘要： 目的:真菌感染严重威胁人类健康。据报道,每年因侵袭性真菌感染死亡人数约为150万,近年来发病率呈上升趋势。ICU患者真菌感染风险较高,其中白色念珠菌是最常见的致病真菌,死亡率高达40%。侵袭性真菌感染的诊断和治疗具有挑战性,临床症状不典型且不易与其他感染区分,早期诊断困难。未能及时治疗可能导致脓毒症,增加治疗难度。目前临床常用的抗真菌药物种类有限且副作用较大,长期或大量使用可能导致真菌耐药性增加,进而增加严重感染风险。因此,免疫系统对人体抵抗真菌感染至关重要。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是ICU常用的镇静药,研究证明具有免疫调节作用。然而,目前尚无相关研究表明DEX是否会影响抗真菌免疫。本研究的目的是验证DEX在抗真菌免疫中的作用,并阐明相关机制。 方法: 1.RAW264.7、BMDM、小鼠中性粒细胞、THP-1巨噬细胞和人中性粒细胞经DMSO/DEX预处理后,与白色念珠菌共培养3h,平板计数法评估真菌的存活情况。 2.DEX预处理的人中性粒细胞与灭活白色念珠菌共培养后,检测细胞活性氧以及NETs的生成。对比对照组与DEX预处理组中上述指标的差异。 3.WB检测灭活白色念珠菌感染后中性粒细胞的自噬,抑制自噬后检测DEX对免疫细胞杀伤白色念珠菌的影响,以及细胞活性氧和NETs的生成。 4.WB检测DEX对白色念珠菌诱导中性粒细胞ERK信号通路激活的影响,抑制ERK后检测DEX对自噬和中性粒细胞杀伤白色念珠菌能力的影响。 5.尾静脉注射白色念珠菌构建感染小鼠模型,指定时间检测DEX对小鼠体重以及真菌负荷的影响。 6.提取MIMIC数据库中侵袭性真菌感染患者,倾向性评分匹配(propensity score matching,PSM)后比较对照组与DEX组死亡率以及住院时间的差异,对侵袭性白色念珠菌患者进行亚组分析。 结果: 1.DEX降低了免疫细胞对白色念珠菌的杀伤能力; 2.DEX抑制中性粒细胞ROS和NETs的生成; 3.DEX通过激活自噬抑制ROS、NETs和真菌杀伤; 4.DEX增强ERK信号通路的激活; 5.DEX处理的小鼠感染白色念珠菌症状更严重; 6.DEX延长了MIMIC数据库中侵袭性念珠菌感染患者的住院时间。 结论: 1.DEX抑制抗真菌免疫。 2.可能的机制是DEX通过激活ERK信号通路增强自噬,进而抑制ROS和NETs的生成,最终导致免疫细胞对白色念珠菌的杀伤能力降低。
关键词: 右美托咪定 ；白色念珠菌 ；中性粒细胞 ；自噬 ；ERK ；MIMIC-IV数据库
摘要： 研究背景糖尿病足是指糖尿病患者踝关节以下的皮肤及其深层组织破坏,常合并有不同程度的末梢血管病变和神经病变,导致下肢感染、溃疡和（或）深部组织破坏的一种疾病。糖尿病足作为糖尿病最常见、最严重的慢性并发症,为患者甚至社会带来严重的负担。创面恢复通常会经历止血、炎症、增殖和重塑四个过程,这个复杂的过程被很多因素所影响,而糖尿病创面因为其高血糖导致的微环境变化愈合可能更难。中性粒细胞对损伤反应过度也是糖尿病足创面延迟愈合的一个重要原因,它可能导致组织的反复损伤,引起慢性炎症。炎症是创面愈合需要经历的一个典型过程,而中性粒细胞被早期募集到伤口床,它对损伤的过度反应可激活中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps,NETs）。NETs可以存在于患者血清或者创面组织中,具有DNA网状结构和组蛋白3、弹性蛋白酶等构成。高血糖微环境也进一步刺激中性粒细胞生成NETs,持续存在或沉积过多的NETs可导致组织损伤和细胞毒性损伤从而延缓糖尿病创面愈合,故抑制NETs生成可促进创面愈合。有报道提示人羊膜上皮细胞可调节炎症反应和促进新生血管生成促进创面愈合,也可通过外泌体分泌促进成纤维细胞和内皮细胞的生物学功能。那人羊膜上皮细胞运用于创面治疗时是否通过抑制NETs生成促进创面愈合却鲜有报道。研究目的1.明确糖尿病足患者血清NETs的含量水平。2.细胞实验:提取人羊膜上皮细胞、人中性粒细胞并鉴定;建立体外NETs模型;收集24小时和48小时人羊膜上皮细胞的条件培养基干预NETs,观察其对NETs的作用。3.探究人羊膜上皮细胞对糖尿病大鼠创面愈合的影响,并探究其机制是否与抑制NETs生成相关。研究方法本文主要通过人体研究糖尿病患者和糖尿病足两类人群、细胞实验、动物实验进行了探讨。1.人群研究:收集糖尿病患者53人、糖尿病足患者53人,抽取外周静脉血分离血清,利用Pico Green与ds DNA结合发出荧光检测520/480 nm荧光值,得出血清ds DNA含量,并比较两组ds DNA含量差异。2.细胞实验:1)收集足月剖宫产术中胎盘钝性分离羊膜,通过二次胰蛋白酶消化法提取人羊膜上皮细胞,用免疫荧光法检测细胞角蛋白19（Cytokeratin19,CK19）表达,流式细胞学分析仪检测SSEA-4、CD29、CD105、CD45的表达来鉴定人羊膜上皮细胞的纯度;2)抽健康成年人的外周静脉血分离人中性粒细胞并用流式细胞仪检测CD11b的表达鉴定其纯度,然后用25n M PMA体外诱导NETs,同时通过检测ds DNA含量、Sytox Green荧光观察NETs形态;3)收集24小时和48小时人羊膜上皮细胞的条件培养基,用其干预NETs。对照组用25n M PMA刺激NETs生成,用高糖DMEM干预;24h CM-h AECs组用25n M PMA刺激NETs生成,同时用已经收集保存完好的无血清培养24小时的人羊膜上皮细胞培养基（24h CM-h AECs）干预;48h CM-h AECs组用25n M PMA刺激NETs生成,同时用已经收集保存完好的无血清培养48小时的人羊膜上皮细胞培养基（48h CM-h AECs）干预;空白对照组（Blank）未用PMA刺激,用高糖DMEM干预。用Sytox Green荧光、免疫蛋白印迹检测NETs相关蛋白中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）、组蛋白3（Citrullinated histone 3,Cit-H3）的表达观察其对NETs的作用。3.动物实验:1)选取6-8周的SD大鼠,腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导糖尿病模型,造模成功的标准是连续一周尾部静脉血糖≥16.7mmol/L;2)在大鼠背面做10mm×10mm的正方形标记,局部消毒后然后沿着标记线小心剪去全层皮肤直达皮下筋膜建立糖尿病大鼠创面模型,将人羊膜上皮细胞混悬液局部注射在创面皮肤周围皮下,观察创面第5天、第10天的愈合率,并通过免疫蛋白印迹法检测第5天、第10天的创面组织NE、Cit-H3的表达。研究结果1.糖尿病足患者血清ds DNA浓度明显高于无糖尿病足的糖尿病患者[1067.68（924.06,1258.83）vs 966.72（839.19,1083.18）,P=0.0011]。糖尿病足患者人群中行ds DNA浓度影响因素的相关性分析发现ds DNA浓度与Wagner分级成正相关（r=0.463,P=0）,Wagner分级越高,ds DNA浓度越高,这提示ds DNA浓度越高,糖尿病足可能越严重。2.我们体外成功分离人羊膜上皮细胞,流式细胞仪检测高表达SSEA-4、CD29,不表达CD45、CD105,免疫荧光检测CK19表达阳性,提示人羊膜上皮细胞纯度高。3.体外成功分离人中性粒细胞,流式细胞学分析CD11b阳性表达率99.7%,并用不同浓度PMA刺激中性粒细胞120分钟,通过Sytox Green荧光显示NETs的形态,镜下可观察到绿色网状和丝状结构为NETs,NETs模型成功诱导。且根据PMA浓度的增加,NETs生成逐渐增多,但是浓度至75n M PMA之后NETs生成量稍有下降后逐渐趋于平衡,NETs生成量不随浓度增加而增加。4.分别设置对照组（CTL）、24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组、空白对照组（Blank）四个组,通过Sytox Green染色结果显示对照组与空白对照组比较,对照组NETs生成明显增多,且有统计学差异（P<0.0001）,这提示NETs体外模型建立成功。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组与对照组比较NETs明显减少,且有统计学差异（P<0.0001）。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组两组比较,48h CM-h AECs组抑制NETs更明显,且具有统计学差异（P=0.0225）。按上述方案分组分别提取每个组的ds DNA通过Pico Green与ds DNA结合发出的荧光值计算出ds DNA浓度。结果提示对照组比空白对照组ds DNA浓度明显升高,且有统计学差异（P=0.0001）。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组与对照组比较ds DNA浓度明显降低,且有统计学差异（P=0.006、P=0.0002）。24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组两组ds DNA浓度无统计学差异。5.通过ELISA检测24h CM-h AECs组、48h CM-h AECs组发现TSG-6含量比对照组升高。6.人羊膜上皮细胞可促进糖尿病大鼠创面愈合,第5天、第10天创面愈合率明显高于对照组。免疫蛋白印迹试验检测提示人羊膜上皮细胞治疗组第5天、10天创面组织NETs相关蛋白Cit-H3、NE的表达明显减少,提示人羊膜上皮细胞可能通过抑制NETs生成促进糖尿病创面愈合。研究结论本研究证实糖尿病足患者血清ds DNA含量明显升高。人羊膜上皮细胞可能通过抑制NETs生成而促进糖尿病创面愈合。同时发现抑制NETs可能与TSG-6相关,这也为治疗糖尿病创面提供新的治疗策略和治疗靶点。
关键词: 人羊膜上皮细胞 ；创面愈合 ；糖尿病 ；中性粒细胞胞外诱捕网
被引量
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摘要： 目的:探讨不同浓度香烟烟雾提取物浓度在体外对外周血中性粒细胞生成中性粒细胞外诱捕网(NETs)的影响,吸烟相关慢性阻塞性肺疾病患者较正常人对烟草烟雾刺激外周血中性粒细胞产生NETs敏感性的异同及红霉素的干预作用。方法:招募平均年龄在64岁的稳定期COPD患者及健康自愿者各10名,分离纯化其外周血中性粒细胞后进行刺激分组:(1)分别使用0.1%、0.3%、0.5%、1%及2%浓度的香烟烟雾提取物(CSE)对正常人中性粒细胞进行刺激,利用荧光DNA定量法观察各浓度CSE刺激下中性粒细胞发生NETosis的情况;(2)使用PMA、CSE分别对COPD组及正常人组其进行刺激,应用免疫荧光染色法观察各组NETs的生成情况及CSE诱导生成NETs的形态特征及组成结构;应用荧光DNA定量法对各组中性粒细胞的NETs生成情况进行定量;(3)对正常人外周血中性粒细胞在固定使用0.1%CSE进行刺激的前提下,分别用浓度为1μg/mL、5μg/mL及10μg/mL的红霉素对其进行干预,利用荧光DNA定量法定量各浓度红霉素干预下对烟草烟雾诱导中性粒细胞发生NETosis化的抑制情况;(4)在固定使用0.1%CSE对COPD组病人外周血中性粒细胞进行刺激的前提下同时应用10μg/mL的红霉素进行干预,用荧光DNA定量法定量各组经红霉素干预后NETs的生成情况。结果:(1)0.1%-0.5%CSE组刺激人中性粒细胞产生NETs浓度(526.1±182.7ng/ml、424.8±103.1ng/ml、381.2±82.2ng/ml)较正常对照组(299.8±72.0ng/ml)增高,P<0.05;1%CSE及2%CSE刺激组NETs形成浓度(362.1±117.5ng/ml、351.8±117.6ng/ml)较正常组(299.8±72.0ng/ml)而言差异不明显,P>0.05;(2)荧光DNA染色示经香烟烟雾刺激诱导中性粒细胞所产生的NETs较正常对照组增多,共染提示NETs上含有NE、CITH3,它们随DNA网状结构一同释放出胞外;在无任何刺激的情况下,正常人生成NETs的浓度(265.7±74.1ng/ml)与COPD组(323.8±79.7ng/ml)相比并无明显差异,P>0.05;在PMA刺激下,COPD(433.5±98ng/ml)与正常组(314.5±74.1ng/ml)生成的NETs量相较下明显增高,差异具有统计学意义,P<0.05;在CSE的刺激下,COPD组(439.7±121.8ng/ml)对比正常组(333.3±84.2ng/ml)NETs生成的量具有统计学差异,P<0.05;(3)在1μg/ml红霉素干预下生成的NETs-DNA含量(282.2±117.8ng/ml)较正常组(364.8±145ng/ml)比较并无明显差异,P>0.05;5μg/ml红霉素组(248.9±86ng/ml)及10μg/ml红霉素组(257.4±90.3ng/ml)相较正常组(364.8±145ng/ml)比,NETs的释放量明显减少,差异具有统计学意义,P<0.05;(4)在正常人组中加入10μg/ml红霉素(249.2±82.5ng/ml)及DPI干预(251.5±67.7ng/ml)的CSE刺激组相较刺激对照组(333.3±84.2ng/ml)而言,NETs的释放量都有所减少,差异具有统计学意义,P<0.05;同样的,COPD组中红霉素干预组(337.9±75.4ng/ml)及DPI干预组(303.4±44.6ng/ml)的NETs-DNA浓度也比单纯刺激组(439.7±121.8ng/ml)低,差异具有统计学意义,P<0.05。结论:(1)CSE能够刺激诱导人中性粒细胞产生NETs,不同浓度CSE刺激所产生的NETs量呈先增高后降低趋势;(2)CSE诱导的人外周血中性粒细胞产生的NETs与既往认知的NETs一样,同样存在NE、CITH3组分;COPD患者中性粒细胞经CSE刺激后较正常人更容易NETosis化;(3)红霉素与烟草烟雾诱导的网状网存在剂量-效应关系。(4)红霉素治疗CSE刺激诱导COPD中性粒细胞所产生的NETosis进程有抑制作用。
关键词: 慢性阻塞性肺疾病 ；中性粒细胞外诱捕网 ；香烟烟雾 ；红霉素
被引量
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摘要： 目的: 自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是免疫异常介导的靶向肝细胞的肝脏实质炎症。根据患者生化指标(总胆红素、转氨酶)的不同,常分为慢性表现AIH、急性表现AIH。临床上可见隐匿起病、体检发现肝功能异常,或因肝硬化原因不明就诊的慢性表现AIH患者。此外,也常见到肝功能急剧恶化、出现明显黄疸、甚至快速进展为肝衰竭的急性表现AIH患者。但目前国际上对于急慢性表现AIH的分型标准、治疗后应答以及预后,尚没有完全统一的阐述。本研究拟从发病时间、生化指标、肝纤维化病理分期、影像学四个方面来探讨不同分型AIH的临床特点,并比较不同分型AIH在治疗、预后方面的差异。而关于AIH的发病机制,目前尚未完全阐明,可能与遗传易感性、环境因素触发、免疫耐受破坏等相关。现有研究更多关注的是T淋巴细胞(Th1细胞、调节性T细胞等)相关的适应性免疫在AIH中发挥的作用。我们既往的研究已发现AIH患者肝脏有较多中性粒细胞浸润,而中性粒细胞作为固有免疫细胞中数量最多的一类,其在AIH中是否发挥致病作用目前尚无明确阐述。因此本研究拟进一步求证中性粒细胞是否参与AIH致病,并探索其可能的致病机制。 材料和方法: 本研究筛选了 2012年7月至2019年12月至本中心就诊并怀疑AIH的患者208名,按照严格的入组标准(包括发病时间、肝功能指标、肝脏病理S分期、有无影像学肝硬化)进行病例纳排,并按急慢性标准将这些患者分为四型(急性AIH、慢加急性AIH、早期慢性AIH、进展期慢性AIH)。首先比较四组患者基本信息、生化指标、肝脏病理炎症分级、血浆细胞因子等差异,然后根据随访结果比较组间免疫抑制治疗后的应答差异,并在不同时间点描绘各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、免疫球蛋白G(IgG)的变化探索组间生化缓解模式的差异。并根据组间比较的差异进行比例风险(COX)回归分析,预测影响AIH完全生化缓解(fullbiochemicalremission,FBR)的危险因素。最后总结复发、死亡患者所属的AIH分型、治疗特点以及死亡原因。 进一步的基础研究中,首先进行中性粒细胞相关标志物CD66b(人中性粒细胞表面经典标志物,一种糖基磷脂酰肌醇关联蛋白)、CD177(主要表达于不同发育阶段的中性粒细胞,一种糖基磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白),以及血浆Luminex液相芯片检测出的差异细胞因子IL-10的人肝脏免疫组化染色。然后根据已检测到的血浆差异细胞因子,进行重组细胞因子体外处理中性粒细胞,探索可能影响AIH患者体内中性粒细胞存活的细胞因子。随后进行刀豆蛋白A(ConA)小鼠造模形成实验性自身免疫性肝炎(EAIH),通过检测造模小鼠的肝功能、肝脏病理表现证实模型的可用性。然后使用Ly6G(小鼠中性粒细胞表面经典标志物,一种糖基磷脂酰肌醇关联蛋白)中和抗体、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等治疗性干预措施进行体内实验探索中性粒细胞在EAIH中的作用。接着从造模小鼠肝脏提取中性粒细胞进行荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)、蛋白质免疫印迹(WB)等实验探索中性粒细胞参与调控EAIH可能的信号通路。同时我们还通过多功能酶标仪检测人血浆、小鼠血清细胞游离DNA(cfDNA),通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血浆α干扰素(IFN-α),通过流式检测人外周血中性粒细胞活性氧(ROS)释放等进行信号通路上下游相关分子的探索。最后,结合qPCR实验中发现的ConA造模小鼠肝脏里中性粒细胞高表达的基因,我们使用Toll样受体9(TLR9)杂合突变鼠、白介素-6(IL-6)基因敲除鼠进行造模求证中性粒细胞调控AIH可能的信号通路;并结合其他研究提及的CD177+中性粒细胞与部分炎症疾病的相关性,我们使用CD177基因敲除小鼠造模进一步求证CD177+中性粒细胞与AIH炎症是否相关,及其在AIH炎症中所起的作用。同时,本研究前瞻性地收集了 AIH患者治疗前的外周血中性粒细胞进行流式细胞学及qPCR检测,然后进一步分选正常人和AIH患者外周血CD177+、CD177-中性粒细胞进行mRNA测序。测序后通过GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行基因功能、通路的富集分析,比较两种细胞在功能、信号通路方面的差异;并通过韦恩图找出疾病及健康状态下两种细胞均存在差异的基因交集,再通过聚类分析选出差异基因交集中两种细胞表达差异最明显的基因进行qPCR验证,从而进一步明确CD177+、CD177-中性粒细胞在AIH中的作用是否不同。 结果: 本研究最终纳入AIH确诊患者133名,其中慢加急性AIH患者占64.7%,进展期慢性AIH占24.1%,急性AIH仅占9%,而早期慢性AIH只占2.2%。四种分型的AIH患者在发病时间、影像学肝硬化、血小板、肝功能、凝血功能、NUDT15基因型、肝脏病理炎症分级等临床指标方面存在明显的统计学差异。血浆细胞因子IL-10在急性AIH患者中明显升高(P<0.01),IFN-γ也有升高趋势(P=0.07)。在44.3个月的中位随访时间中,四组AIH患者的FBR率虽没有统计学差异,但我们发现急性AIH和早期慢性AIH患者在随访结束时均已实现FBR,而具体的生化缓解时间在四组患者之间其实有所不同。急性AIH组患者在治疗3月后的FBR率为66.7%,明显高于慢加急性组(32.6%)、进展期慢性组(21.9%);而在治疗后6月,急性AIH组患者的FBR率为75%,明显高于进展期慢性组(31.3%),上述两个时间点的差异均具有统计学意义(P=0.02、P=0.04)。早期慢性AIH组患者治疗3月后的FBR率与急性AIH组相同,但由于该组病例数少,因此与其他组相比无统计学差异。而本研究中已实现FBR的患者,无论其属于哪种分型的AIH,实现FBR所需的时间均未超过3年。COX回归分析结果显示IgG、NUDT15杂合突变、切换二线治疗是影响FBR的独立危险因素。预后相关事件总结发现,死亡、肝移植病例均来自慢加急性AIH组和进展期慢性AIH组。 进一步,结合我们既往发现的AIH患者肝脏存在中性粒细胞浸润的现象,我们进行了AIH患者肝脏中性粒细胞相关标志物的免疫组化,结果显示AIH患者肝脏CD66b、CD177阳性细胞比例较正常肝脏更高(P=0.01、P=0.05);而结合患者血浆中已发现的差异细胞因子IL-10,进行人肝脏IL-10免疫组化,结果也显示AIH患者肝脏IL-10阳性比例较正常肝脏更明显(P<0.01)。随后的细胞因子体外处理中性粒细胞实验中可见IL-10刺激后的中性粒细胞凋亡减少(P<0.05),IFN-γ处理后也有相似趋势(P=0.09)。然后使用ConA小鼠造模成功模拟AIH,进一步通过腹腔注射Ly6G中和抗体消耗小鼠体内的中性粒细胞后再进行小鼠ConA造模,发现其肝功能较单纯造模组明显改善(P<0.05);而小鼠腹腔注射G-CSF后再进行ConA造模,其生存情况变差、肝功能也较单纯造模小鼠有更差的趋势。然后提取ConA造模小鼠肝脏中性粒细胞进行的信号通路研究发现,造模鼠肝脏中性粒细胞的TLR2、TLR9、JUN、IL-6、IRF7等基因的转录水平较ConA肝脏、对照肝脏增高。检测发现造模小鼠血清、AIH患者血浆cfDNA均明显升高(P<0.01),患者外周血中性粒细胞ROS释放在生化缓解后明显减少(P<0.05),而作为IRF7下游炎性细胞因子之一的IFN-α,它在AIH患者外周血中性粒细胞中的转录水平明显增高(P<0.01),并在患者治疗前的血浆中有升高趋势,在患者FBR后的血浆中有下降趋势。此外,除了免疫组化结果显示患者肝脏CD177阳性细胞比例较正常肝脏增高外,人外周血中性粒细胞流式分析结果也显示AIH患者CD177+中性粒细胞比例较健康对照更高(P<0.05)。于是进一步敲除小鼠IL6、CD177基因以及使用TLR9基因杂合突变小鼠分别进行造模,发现IL6基因敲除鼠以及TLR9基因杂合突变鼠C onA造模后肝脏炎症减轻,而CD 177基因敲除鼠造模后肝脏炎症明显加重。随后分选AIH患者以及健康对照的外周血CD177+、CD177-中性粒细胞进行mRNA测序、分析及qPCR验证,结果显示患者体内两种细胞存在G-蛋白偶联受体活性等分子功能差异,而在健康对照体内两种细胞的差异主要在于颗粒构成等结构上;通过基因聚类分析找出了无论是在患者还是健康对照中均存在的两种细胞的基因表达差异,即CD177+中性粒细胞在CEBPE、IL1RL1、ARL4C、HRASLS5、UTG2B11基因的转录水平上较CD177-中性粒细胞表达更低,扩大样本进行qPCR验证的结果也与测序一致。 结论: 本研究发现慢加急性AIH是AIH最主要的疾病分型,而不伴肝纤维化的早期慢性AIH十分少见。四种分型的AIH在临床特征上有所差别,且各型AIH的生化缓解模式并不相同。急性AIH、早期慢性AIH实现FBR更快,预后可能更好。进一步的基础研究证实了中性粒细胞参与AIH致病,并可能通过TLR信号通路、ROS释放发挥调控作用。此外,CD177+中性粒细胞在AIH患者以及EAIH中均有增多,敲除小鼠CD177基因后行ConA造模发现肝脏损伤加重,故推测CD177+中性粒细胞在肝脏炎症中起保护性作用。
关键词: 自身免疫性肝炎 ；分型 ；治疗应答 ；中性粒细胞 ；CD177
摘要： 研究背景幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种定植于人胃部的革兰氏阴性螺旋状杆菌,目前全世界一半以上的人口感染或携带有此细菌。持续的H.pylori感染可引起多种胃部疾病,如慢性胃炎、胃溃疡,更严重的是,它是胃腺癌的重要致癌因子,会显著提高患胃腺癌的风险。H.pylori感染造成如此严重疾病后果的机制尚还不完全清楚,可能跟多种因子相关。过往研究发现H.pylori毒力因子引起的胃部抑制性免疫微环境使细菌不能被有效清除,而临床慢性胃炎的疾病基础就是细菌在胃粘膜持续的定植造成炎症慢性化。组织蛋白酶C（Cathepsin C,CtsC）又名二肽基肽酶I（Dipeptidyl peptidase I,DPPI）,是一种在溶酶体内具有外半胱氨酸蛋白酶活性的组织蛋白酶,它是调节免疫细胞中多种丝氨酸蛋白酶活化的核心调节酶。被CtsC激活的丝氨酸蛋白酶可以被分泌到局部微环境中发挥促炎作用,所以CtsC在多种炎症性疾病中发挥着重要的炎症调节作用。研究发现,在不同的疾病模型中CtsC的作用不同,去除CtsC,一方面能有效为避免过度炎症提供保护机制,另一方面则失去了清除病原体的能力。目前H.pylori感染的胃粘膜中CtsC的表达及其作用还未见报道,因此,研究CtsC在H.pylori感染中的表达调控及其病理生理作用有助于阐明H.pylori持续感染和相关慢性炎症的机制。研究目的1.研究H.pylori感染对胃粘膜CtsC表达的影响及其表达变化的细胞类型;2.探讨H.pylori感染对胃上皮细胞CtsC表达的调控机制;3.探究CtsC在H.pylori感染微环境中的功能;4.阐明CtsC在H.pylori感染中激活中性粒细胞及发挥宿主防御作用的机制。研究方法1.H.pylori感染对胃粘膜及胃上皮细胞CtsC表达的影响研究收集H.pylori感染患者及未感染者的胃黏膜及外周血标本。14C呼吸实验、快速尿素酶检查、实时荧光定量PCR（real-time PCR,RT-PCR）16S rDNA检测以及血清H.pylori抗体检测用于确定H.pylori感染。RT-PCR检测cagA,根据检测结果将H.pylori感染标本分为cagA+及cagA-组。H.pylori NCTC 11637菌株（WT H.pylori）和cagA突变的H.pylori NCTC 11637菌株（ΔcagA）用于SPF级C57小鼠灌胃,模拟cagA+及cagA-H.pylori感染,并在指定时间取小鼠胃粘膜组织。分别分离各组人和小鼠的胃粘膜,RT-PCR、免疫组化及Western blot检测CtsC的表达。从未感染者分离的原代胃粘膜用于体外WT H.pylori及ΔcagA刺激实验,RT-PCR、ELISA及蛋白芯片用于分析CtsC的表达和分泌。人和小鼠胃粘膜分别使用CtsC和EpCam（CD326）抗体进行免疫荧光共染。另外,分别用WT H.pylori、ΔcagA及H.pylori 26695在不同细菌浓度及时间点刺激胃上皮细胞系（AGS,GES-1,HGC-27）及人原代胃上皮细胞,RT-PCR检测组织蛋白酶家族各蛋白mRNA表达,而Western blot及ELISA检测CtsC蛋白水平。2.H.pylori感染对胃上皮细胞CtsC表达的调控机制研究利用各种常用的信号通路阻断剂（PP2、U0126、SP600125、SB203580、Wortmannin和AG490）处理AGS细胞后,再经WT H.pylori或ΔcagA刺激,Western blot检测CtsC蛋白水平及各关键信号分子的磷酸化,RT-PCR及ELISA检测CtsC的mRNA及蛋白分泌。双荧光素酶报告基因分析H.pylori刺激后,CtsC启动子区全长及各截短序列的启动子活性变化,以及ΔcagA和各信号通路阻断剂对CtsC启动子活性的影响。通过RT-PCR和ELISA检测H.pylori感染后人和鼠胃粘膜、AGS细胞TGF-β1表达,并对H.pylori感染患者胃粘膜中CtsC和TGF-β1表达进行相关性分析。在加入TGF-β1中和抗体或TGF-β受体阻断剂,或者用ERK阻断剂U0126、STAT3阻断剂AG490预处理的情况下,使用WT H.pylori和TGF-β1单独或协同刺激AGS细胞;或者使用WT H.pylori感染的AGS细胞上清再去刺激AGS细胞,最后通过Western blot检测EKR和STAT3的磷酸化,通过RT-PCR及ELISA分析CtsC的表达及分泌。3.CtsC在H.pylori感染微环境中的功能研究在H.pylori感染患者胃粘膜标本中分析CtsC表达与H.pylori定植的相关性。在H.pylori感染的小鼠模型中每周腹腔注射重组活性CtsC,并在指定时间取胃粘膜组织及外周血。小鼠胃粘膜中H.pylori定植量通过RT-PCR测定16S rDNA来计算确定,以细菌数/ng基因组DNA来表示。收集胃粘膜及外周血细胞进行流式细胞表面分子及pHrodo染色,分析小鼠胃粘膜及外周血各主要免疫细胞的比例,中性粒细胞的活性（CD11b,CD62L）及吞噬细菌的能力（pHrodo）。4.CtsC在H.pylori感染中激活中性粒细胞及发挥宿主防御作用的机制研究通过每周给H.pylori感染小鼠模型腹腔注射Ly6G中和抗体以及fMLP来去除或激活小鼠的中性粒细胞。RT-PCR检测16S rDNA检测来计算小鼠胃中的H.pylori定植量,流式细胞仪确定Ly6G中和抗体去除中性粒细胞的效果。另外,体外分别用活性CtsC或其前体酶原proCtsC刺激新鲜人中性粒细胞;或者用SUMO泛素化抑制剂银杏酸、NF-κB抑制剂BAY11-7082及NEMO siRNA预处理后,再用活性CtsC刺激人中性粒细胞。中性粒细胞的活性（CD11b,CD62L）、吞噬细菌能力（pHrodo）以及活性氧产生（ROS）用流式细胞仪进行检测,而SUMO泛素化及磷酸化的NF-κB通路各信号分子用Western blot进行检测。此外,将人新鲜中性粒细胞用不同浓度的活性CtsC进行刺激,分析中性粒细胞体外杀菌活性的差别。研究结果1.H.pylori感染对胃粘膜及胃上皮细胞CtsC表达的影响研究在H.pylori感染患者的胃粘膜中CtsC表达显著降低,而且在cagA+H.pylori菌株感染较cagA-H.pylori菌株感染降低更明显。动物实验也同样发现cagA+H.pylori感染56天的小鼠胃粘膜中CtsC表达显著降低,而cagA-H.pylori菌株感染的小鼠中下降不明显。CtsC在人和小鼠胃粘膜中均在CD326阳性的上皮细胞中高表达,说明胃上皮细胞是CtsC在胃中的重要来源。H.pylori刺激后,各胃上皮细胞系（AGS,GES-1,HGC-27）及人原代胃上皮细胞CtsC表达均显著下调,且WT H.pylori刺激比ΔcagA刺激下调更明显。而且在AGS细胞中,CtsC表达随WT H.pylori感染细菌量及感染时间增加而降低。同时,使用H.pylori 26695菌株刺激AGS细胞同样也观察到CtsC的表达降低。2.H.pylori感染对胃上皮细胞CtsC表达的调控机制研究WT H.pylori刺激AGS细胞能显著增加ERK及STAT3的磷酸化,而ERK及STAT3信号通路抑制剂可以部分消除WT H.pylori引起的CtsC降低。而且,通过抑制Src来阻断cagA磷酸化,可以引起下游ERK磷酸化的降低及CtsC的升高,但是对STAT3的磷酸化没有影响。此外,WT H.pylor刺激可以引起AGS细胞CtsC启动子活性降低,且显著低于ΔcagA刺激组。通过阻断Src,ERK,STAT3信号通路均能显著恢复由WT H.pylori引起的低CtsC启动子活性。TGF-β1在H.pylori感染的人胃粘膜中表达增加,且与CtsC的表达呈显著负相关。同样,H.pylori感染的小鼠胃粘膜及AGS细胞中TGF-β1表达也显著上调。将TGF-β1和H.pylori共同作用于AGS细胞,发现两者在下调CtsC表达方面有明显的协同作用。抑制ERK及STAT3信号通路同样能消除TGF-β1引起的CtsC表达下调。而且,H.pylori刺激的AGS细胞培养上清也能引起其他AGS细胞CtsC表达下调。用抗体中和TGF-β1,或者化学阻断TGF-β受体都能有效抑制CtsC的下调。3.CtsC在H.pylori感染微环境中的功能研究在人胃粘膜中,CtsC表达与H.pylori的定植量呈负相关。腹腔注射活性CtsC能显著增加中性粒细胞的活性,并降低小鼠胃粘膜的细菌量,但是对外周血及胃粘膜各种免疫细胞的比例没有影响。4.CtsC在H.pylori感染中激活中性粒细胞及发挥宿主防御作用的机制研究通过腹腔注射Ly6G中和抗体消除中性粒细胞能显著增加小鼠胃粘膜H.pylori的定植数量,且Ly6G中和抗体能取消活性CtsC引起的小鼠胃粘膜H.pylori的定植减少;而注射fMLP激活中性粒细胞则发挥抑制小鼠胃粘膜H.pylori的定植的作用。体外CtsC刺激实验结果显示,活性CtsC能激活人中性粒细胞,并促进中性粒细胞NEMO的SUMO泛素化,NF-κB p65的磷酸化。但是,SUMO泛素化抑制剂、NF-κB抑制剂以及NEMO siRNA均能抑制活性CtsC引起的NF-κB信号通路激活及其下游的中性粒细胞活化。体外杀菌实验结果也显示活性CtsC杀灭H.pylori的能力呈中性粒细胞数量和CtsC浓度依赖。结论1.H.pylori感染能诱导胃粘膜及胃上皮细胞中CtsC表达降低;2.H.pylori与TGF-β1协同作用通过Src/ERK及JAK/STAT3信号通路发挥下调胃上皮细胞中CtsC表达的作用;3.活性CtsC激活中性粒细胞并减少H.pylori在胃粘膜的定植;4.活性CtsC通过激活中性粒细胞NF-κB信号通路发挥抗H.pylori的宿主防御作用。意义本文发现了一种慢性胃炎发生发展的新机制。H.pylori通过降低胃上皮细胞CtsC表达,进而抑制中性粒细胞活化及杀灭细菌作用,使H.pylori在胃粘膜持续感染。此结果为解释在慢性胃炎中H.pylori如何逃避中性粒细胞清除提供了新的见解,从而为治疗幽门螺杆菌感染提供了有价值的思路。
关键词: 幽门螺杆菌 ；组织蛋白酶C ；中性粒细胞 ；cagA ；胃上皮细胞
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摘要： 背景与目的:成人社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)是全球发病率及死亡率最高的疾病之一,CAP管理指南建议使用风险分层工具评估疾病的严重程度及预后,以使重症患者尽早入住重症监护病房,降低人群死亡率,节约医疗资源。目前CAP常用的风险分层方式为临床评估法及评分表评估法,前者依赖临床医生主观判断而带有个人局限性,可重复性差,后者如PSI评分(Pneumonia severity index,PSI)操作复杂且缺少预测远期死亡率的准确性。生物标志物是能够影响或预测疾病发生率与转归的可测量物质,有预后、预测、诊断、药效、安全、监测等功能,作为有预测功能及采集简便的可重复性检验,可在一定程度上弥补现有CAP风险分层工具的不足。生物标志物降钙素原(Procalcitonin,PCT)、粒淋比(Neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)、人中性粒细胞载脂蛋白(Human neutrophil lipocalin,HNL)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)被广泛用于反映机体的炎症状态,已成为较为成熟的炎症标志物。有研究表明上述生物标志物单独或联合应用对CAP严重程度及预后有一定预测价值,但存在争议。本文旨在探究NLR、HNL、IL-6、PCT在CAP严重程度及预后方面的评估价值,为临床评估CAP患者风险分层提供新思路。资料和方法:本论文为回顾性研究,选取2022年1月到2023年1月在中日联谊医院呼吸内科、重症医学科住院且明确诊断为CAP的成年患者120例,收集患者性别、年龄、心脑血管病史等一般资料;症状、体征、疾病转归等临床资料;HNL、IL-6、PCT、血常规、血糖、离子、肾功能、血气分析、胸部CT等实验室检验与影像资料,统计每例患者的PSI评分、CURB-65评分。按照CURB-65评分将患者分为3个亚组,低危组(0-1分),中危组(2分),高危组(≥3分),分析NLR、HNL、IL-6、PCT在各组间是否有差异性表达。选出其中有差异性表达的生物标志物,通过研究其与PSI评分的相关性反映其与肺炎严重程度的相关性。从而筛选出对CAP患者严重程度有一定预测价值的生物标志物。依据出院后30天内病情转归情况分为死亡组(35例)和幸存组(85例),分析两组间NLR、HNL、IL-6、PCT及其他可能影响CAP死亡率的因素的表达差异,找出两组中有差异性表达的指标,进一步行多因素二元logistic回归,排除混杂因素的基础上筛选出CAP患者30天死亡率的独立预测指标。对各生物标志物、评分分别进行受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线分析,并将其中预测价值最大的生物标志物与另外3个生物标志物分别联合,计算ROC曲线下面积(Area under curve,AUC),与评分的AUC比较,探求生物标志物组合形式下的预测价值。结果:1.患者血清PCT、HNL、NLR、IL-6水平在低危、中危、高危组中逐渐升高。PCT在低危组中表达水平低于中危组(P=0.025)和高危组(P<0.001),而在中危组与高危组间表达无显著差异(P>0.05)。HNL在高危组中表达水平高于中危组(P=0.003)和低危组(P<0.001),而在中危组与低危组间表达无显著差异(P>0.05)。NLR在高危组中表达水平显著高于中危组(P=0.02)和低危组(P<0.001),而在中危组与低危组间表达无显著差异(P>0.05)。IL-6在高危组中表达水平高于低危组(P=0.003),在中危组与低危组,中危组与高危组间均无显著差异(P>0.05)。2.血清HNL、PCT、NLR、IL-6水平与PSI评分存在正相关(r=0.493,P<0.001;r=0.481,P<0.001;r=0.406,P<0.001;r=0.245,P=0.008)。3.IL-6、HNL、PCT、NLR在死亡组中高于幸存组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.NLR每升高1单位,CAP患者30天死亡率增加约7.3%(OR1.073,95%CI 1-1.15,P=0.049,标准误0.036,约登指数3.88),约登指数优于其他生物标志物。5.几种生物标志物中,NLR预测CAP患者30天死亡率的AUC最大0.822(95%CI 0.737-0.883,P<0.001),与PSI差异无统计学意义(P>0.05),当取8.2为临界值时,特异度70.2%,敏感度82.9%;IL-6、HNL、PCT预测CAP患者30天死亡率的AUC均小于PSI,差异有统计学意义(P<0.05)。6.IL-6+NLR组AUC 0.868(P<0.001,95%CI 0.787-0.920,特异度71.4%,敏感度90.9%)。NLR+HNL组AUC 0.863(P<0.001,95%CI0.787-0.920,特异度71.1%,敏感度91.2%)。PCT+NLR组AUC 0.840(P<0.001,95%CI 0.762-0.901,特异度67.9%,敏感度91.4%)。联合组的AUC与PSI相比均无统计学差异(P>0.05)。结论:1、HNL与CAP严重程度呈正相关,有望成为预测CAP严重程度的生物标志物。2、NLR是CAP 30天死亡率的独立预测指标,可能成为预测CAP预后的生物标志物。3、NLR与HNL或IL-6或PCT联合应用可提高后者对CAP患者30天死亡率的预测效能,NLR与IL-6联合时预测CAP 30天死亡率的价值最高,有望成为CAP预后评估指标。
关键词: 社区获得性肺炎 ；生物标志物 ；PSI ；CURB-65 ；严重程度 ；死亡率
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摘要： 目的:血管中血液的正常流动对维持机体的正常供血、供氧具有非常重要的意义。通常情况下,血管内无血液凝固和血栓形成;一旦血管内有血栓形成,就将导致机体组织器官的缺血、缺氧甚至损伤。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞(neutrophil,PMN)在适宜刺激条件下释放到胞外的一种纤维网格样结构。NETs主要由PMN释放的细胞DNA和胞浆蛋白组成,其中含量最多的蛋白是组蛋白(histone),其次是中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)。最近有越来越多的文献认为,NETs参与血管内血栓的形成,与脓毒症、自身免疫性疾病、糖尿病甚至肿瘤等疾病密切相关。因此,研究NETs参与疾病发生的分子机制、寻找有效的治疗手段具有重要意义。白蛋白(albumin,ALB)是血管中含量最高的蛋白质,在维持机体内环境中发挥重要作用,具有维持血浆胶体渗透压和血容量、运输和结合药物或内源性物质以及抗氧化的作用,临床上用于失血性休克、肝硬化伴腹水水肿、成人呼吸窘迫综合征、恶性肿瘤等治疗。我们实验室偶然发现,在无血清培养基中PMN可以释放NETs,但是在加入血清后NETs生成受到抑制,提示血清中存在某种具有抑制NETs生成的成分。我们知道,血管中有着大量的PMN,但在正常生理状态下却很少有NETs生成,如果自发生成大量的NETs,则可造成血管栓塞甚至休克、DIC。基于我们的上述发现,我们推测血管中应该存在对NETs生成具有精密调控作用的物质,但是该物质及其参与的调控机制尚不清楚。为此,我们设计了一系列实验开展血浆中具有抑制NETs生成的物质基础以及分子机制的研究,旨在阐明血管内抑制NETs生成的物质基础及调控机制。方法:一、人中性粒细胞的分离与NETs的检测1健康人中性粒细胞(PMN)的分离:采取健康人外周静脉血,采用人中性粒细胞分离液试剂盒分离中性粒细胞。2中性粒细胞培养基体系:将100%DMEM培养液作为标准PMN培养基体系,加于35mm激光共聚焦培养皿中;培养基体系中PMN细胞终浓度为5.0 × 105/ml。3中性粒细胞的鉴定:采用瑞氏染色和台盼蓝实验鉴定分离后的细胞种类及PMN的存活率。4NETs的检测:将PMN在CO2培养箱(37℃、5%CO2)中孵育 2h 后,加入 DNA 染料 sytox 绿/sytox 橙色[sytox green/sytox orange,培养基中终浓度为5 mM(后面涉及的浓度均为培养基中的终浓度)],并在激光共焦显微镜下观察绿色/红色荧光情况,采用ZEN widefield软件进行平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)的测定(后续实验中均采用此方法进行NETs的检测,方法不再赘述)。二、血清抑制NETs生成作用的再确认与成分筛选1确认血清对NETs的作用:检测在标准PMN培养基体系、含有10%胎牛血清(FBS)、10%人血清(HBS)的标准PMN培养基体系中NETs的生成量。2血浆成分的超滤:使用不同分子量规格(3 kDa、30 kDa、50 kDa、100 kDa)的超滤离心管对人血清进行超滤,获得不同分子量段的人血清组分。3各分子量段血浆组分对NETs作用的确认:将不同分子量段人血浆组分加入标准PMN培养基体系中培养2 h,检测各个分子量血浆组分实验组中NETs的生成量,初步确认具有抑制NETs作用的血浆组分的分子量范围。三、血浆中具有抑制NETs生成作用的蛋白质成分的筛选与确认1血液中蛋白的选取:通过复习文献在有抑制NETs作用的血浆组分分子量范围中选取血液中常见且重要的蛋白,并在该蛋白的生理浓度范围内选取某一值作为实验生理浓度。2血液蛋白对NETs生成的影响:将上述选取的蛋白以10%实验生理浓度加入标准PMN培养基体系,检测对NETs作用的影响;分析有NETs抑制作用的蛋白中最常见且重要的蛋白,将其作为主要研究对象。四、抑制NETs关键蛋白酶后白蛋白对NETs作用的研究1抑制MPO后白蛋白对NETs作用:将MPO抑制剂(终浓度为100 nM)加入含 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。2抑制NE后白蛋白对NETs作用:将NE抑制剂(终浓度为100 nM)加入含 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准 PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。3抑制PAD4后白蛋白对NETs作用:将PAD4抑制剂(终浓度为 100 nM)加入含 BSA(0.5mg/ml、1.5mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。五、抗人血清白蛋白抗体对白蛋白抑制NETs作用的影响1抗人血清白蛋白抗体与人白蛋白的预孵:配置200 μg/ml HSA,将抗人血清白蛋白抗体加入200 μg/ml HSA溶液,放入CO2培养箱(37℃、5%CO2)过夜。2检测孵育抗体后对白蛋白抑制NETs的影响:将4种PMN培养基体系(无白蛋白,抗人血清白蛋白抗体,200 μg/ml HSA,200 μg/ml结合抗体的HSA)进行NETs检测。六、氧化或还原状态的牛血清白蛋白的抗NETs作用1氧化状态的BSA的制备:将BSA(40mg/ml)与H2O2(45mM)在室温孵育1h,将孵育后的BSA进行冻干,获得氧化状态的BSA。通过BCA蛋白浓度测定法测定氧化状态BSA浓度,并将其浓度调整为 40 mg/ml。2还原状态的BSA的制备:将BSA(40 mg/ml)与胱氨酸(17mM)在37℃孵育24 h后,采用PD-10脱盐柱脱去残留的胱氨酸;将柱流出液进行冻干,获得还原状态的BSA。通过BCA蛋白浓度测定法测定还原状态BSA浓度,并将其浓度调整为40 mg/ml。3氧化或还原状态的BSA对NETs的影响:对氧化或还原状态BSA(4 mg/ml)加入标准PMN培养基体系进行NETs生成量的检测,并与正常的BSA结果进行比较,确定氧化或还原状态的BSA对NETs的影响。七、脂多糖和大肠埃希菌存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用1 脂多糖存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用1.1 LPS存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用1.1.1低浓度LPS存在情况下实验生理浓度BSA抑制NETs的作用:将 LPS(终浓度:20ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml、160 ng/ml)加入含有生理浓度BSA(40mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。1.1.2高浓度LPS存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:将 LPS(终浓度:160ng/ml,320ng/ml,640ng/ml)加入含有 BSA(40 mg/ml,5mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。1.2 LPS存在情况下BSA抑制NETs的量效关系:将LPS(终浓度:320 ng/ml)加入含有 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的PMN培养基体系中,检测NETs的生成量。2大肠埃希菌存在情况下牛血清白蛋白抑制NETs的作用2.1 EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用2.1.1高浓度EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:将高浓度EC(2.9×107)加入含有不同浓度BSA(0.16mg/ml,0.5 mg/ml,1.5 mg/ml,4.5mg/ml,40mg/ml)的 PMN 培养基体系中,检测 NETs生成量的变化。2.1.2低浓度EC存在情况下不同浓度BSA抑制NETs的作用:由于之前实验中EC浓度过高,于是降低EC浓度进行实验,将EC(2.5×105)加入含有不同浓度 BSA(0.16mg/ml,0.5 mg/ml,1.5mg/ml,4.5 mg/ml,40 mg/ml)的PMN培养基体系中,检测NETs生成量的变化。2.2 EC存在情况下BSA抑制NETs生成的动态观察:将50 μl EC(5.0×106)加入含有BSA(1.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,在三个时像点(30min、60min、120min)进行NETs观察以检测EC是否会影响NETs的生成速率。八、Ca2+浓度与Ca2+通道阻断剂对白蛋白抑制NETs作用的影响1有Ca2+和无Ca2+培养基对NETs的生成的影响:PMN分别在有钙PMN培养基体系和无钙PMN培养基体系中孵育,观察NETs生成情况。2不同Ca2+浓度对NETs生成的影响:将有Ca2+、无Ca2+ DMEM作为基础养基,配置成含有不同Ca2+浓度(0%、0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%)的PMN培养基体系,将PMN在上述浓度培养基中孵育2 h,观察NETs生成情况的差异。3钙离子通道阻断剂对NETs生成的影响3.1 2-氨乙氧基二苯酯硼酸(2-APB)对HSA抑制NETs作用的影响:将2-APB(终浓度为5μM)加入含有HSA(1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。3.2维拉帕米对NETs生成的影响:将维拉帕米(终浓度为10 μM)加入标准PMN培养基体系中,检测NETs生成量。九、牛血清白蛋白对中性粒细胞胞内总活性氧和线粒体活性氧水平的影响1BSA对PMN胞内总活性氧(ROS)水平的影响1.1 PMN内ROS水平的检测:将PMN加入含10%BSA的标准PMN培养基体系,并于CO2培养箱(37℃、5%CO2)孵育20min,在培养基体系加入ROS荧光探针DCFH-DA(10 μM)并孵育30 min后取出,轻轻吹打使贴壁的PMN脱落,将其避光收集至1.5ml EP管内,采用流式细胞仪检测ROS活性氧探针的荧光强度。1.2不同种类蛋白对PMN内ROS的影响:标准PMN培养基体系中分别加入 B SA(4 mg/ml)、HSA(4 mg/ml)、apo Al(0.14 mg/ml)、HDL(0.3 mg/ml),采用流式细胞仪检测ROS活性氧探针的荧光强度。2 BSA对PMN内线粒体活性氧(mitoROS)水平的影响2.1 PMN内mitoROS水平的检测:将含10%FBS的标准PMN培养基体系,并于CO2培养箱(37℃、5%CO2)孵育20min,在培养基体系加入mitoROS荧光探针MitoSOX Red并孵育30 min后取出,轻轻吹打使贴壁的PMN脱落,将其避光收集至1.5 ml EP管内,采用流式细胞仪检测mitoROS活性氧探针荧光强度。2.2线粒体呼吸链干扰剂对白蛋白抑制NETs生成的影响:呼吸链干扰剂中抗霉素A(antimycin A)是mitoROS生成抑制剂,鱼藤酮(rotenone)是mitoROS生成促进剂。在标准PMN培养基体系中分别加入2 μl抗霉素(终浓度为20 μM)、5 μl鱼藤酮(终浓度为10μM),通过检测mitoROS荧光探针及NETs生成量的变化,进一步明确mitoROS在NETs生成中的作用。2.3不同种类蛋白对PMN内mitoROS水平的影响:标准PMN培养基体系中分别加入BSA(终浓度为4 mg/ml)、HSA(终浓度为4 mg/ml)、apo A1(终浓度为 0.14 mg/ml)、HDL(终浓度为 0.3 mg/ml),采用流式细胞仪检测荧光探针的荧光强度。十、自噬干扰剂对白蛋白抑制NETs作用的影响1自噬抑制剂对白蛋白抑制NETs作用的影响:将3-MA(终浓度为 1 mM)加入含有 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)的标准PMN培养基体系中,观察NETs生成情况。2自噬激动剂对白蛋白抑制NETs作用的影响:将RAPA(5 mM)加入含有 3 种不同浓度的 BSA(0.5 mg/ml、1.5 mg/ml、4.5 mg/ml)PMN培养基体系中,
关键词: 中性粒细胞胞外诱捕网 ；血清 ；白蛋白 ；自噬 ；钙离子
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