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摘要： 综合运用体内实验和多种体外实验模型,初步分析了土荆皮总二萜酸(total diterpene acid,TDA)的代谢情况。在口服和静脉注射给药实验中,使用HPLC-UV和HPLC-ESI/MSn方法在大鼠血、尿、粪和胆汁样品中都检测到主要代谢产物土荆皮丙2酸(pseudolaric acid C2,PC2),还可检测到脱甲氧基脱乙酰氧基土荆皮乙酸(demethoxydeacetoxypseudolaric acid B,DDPB),以及推测为土荆皮丙2酸的葡萄糖苷(PC2G)的代谢产物,原形药物中的土荆皮丙酸(pseudolaric acid C,PC)、土荆皮甲酸(pseudolaric acid A,PA)、土荆皮甲酸葡萄糖苷(pseudolaric acid A O-β-D glucopyranoside,PAG)、土荆皮乙酸葡萄糖苷(pseudolaric acid B O-β-D glucopyranoside,PBG)和脱乙酰基土荆皮甲酸(deacetylpseudolaric acid A,DPA)也可以检测到。实验表明,TDA的代谢与肠内菌无关,胃蛋白酶和胰蛋白酶不是主导TDA代谢的因素,在胃、肠道的pH环境下TDA也是稳定的。TDA在体外全血孵育模型中的主要代谢产物是PC2、DDPB和PC2G,证明TDA在体内的代谢转化反应主要是在血液中完成的,并且主要归结于血浆酯酶对酯键的水解以及葡萄糖苷化反应。这一发现首次初步阐明了TDA在体内的代谢途径,对于明确土荆皮的有效物质基础、体内活性形式及其作用机制都具有非常重要的意义。
关键词: 土荆皮 ；总二萜酸 ；土荆皮乙酸 ；土荆皮丙2酸 ；脱甲氧基脱乙酰氧基土荆皮乙酸
摘要： 目的:通过大鼠肠道菌群体外实验,分析千金子生品和霜品提取物中主要二萜醇酯类成分在大鼠肠道菌群中的代谢情况。方法:建立同时测定千金子素L_(1)、L_(2)、L_(3)、L_(7a)、L_(7b)、L_(8)的HPLC定量分析方法,并用该方法测定千金子生品和霜品提取物中各成分在体外大鼠肠道菌群作用下各个时间点的含量,随后基于UHPLC-Q-Exactive HF,进一步分析千金子制霜前后主要二萜醇酯类成分的体外代谢情况。结果:千金子生品与霜品提取物中千金子素L_(1)、L_(2)、L_(3)、L_(7a)、L_(7b)、L_(8)在体外的代谢产物一致,但代谢速率不同,千金子霜品组在代谢初期代谢速率最大。采用Q-Exactive HF结合Xcalibur软件共分析鉴定出了6个代谢产物,千金子制霜前后提取物中6个二萜醇酯类成分在体外的主要代谢途径为水解和甲基化。结论:千金子生品与霜品提取物能够在大鼠肠道菌群作用下转化为多种代谢产物,该结果为进一步研究其在体内的作用机制提供实验依据。
关键词: 肠道菌群 ；代谢 ；超高效液相色谱串联四极杆-轨道阱质谱法 ；千金子 ；制霜减毒
被引量
3
摘要： 某些藏药植物药中的活性成分同时也是毒性成分,需要在使用中确切了解其作用机制及代谢途径。毒性较大的藏药植物药,其内源性毒性成分主要为生物碱,如乌头类、甲基牛扁碱等二萜生物碱、莨菪烷类生物碱、马钱子碱、士的宁、罂粟碱和苦马豆素等。藏药植物药中具有代表性的内源性生物碱类毒性成分多存在于根、种子和果实中,多因其剧毒或高毒化学物本质,表现出神经毒性和心脏毒性。一般经去烷基、羟基化和水解等Ⅰ相代谢过程及与葡萄糖醛酸、磺酸结合等Ⅱ相代谢过程,产生多种高极性和毒性减弱的代谢产物,排出体外。多种生物碱的中毒剂量与治疗剂量相近,藏药典籍中常采用炒制、奶制、青稞酒制和诃子配伍等减毒后入药。本文针对包括乌头类二萜双酯、莨菪烷和马钱子碱等在内的5类12种生物碱,着重评述其代谢转化、减毒和安全性评价特点,以期为制定藏药植物药内源性毒性成分限量、临床用药和减毒治疗提供全面参考。
关键词: 藏药植物药 ；内源性毒性成分 ；代谢转化 ；减毒
被引量
9
摘要： 综合运用体内实验和多种体外实验模型,分析了土荆皮乙酸(pseudolaric acid B,PB)的代谢情况。在口服和静脉注射给药实验中,使用HPLC和HPLC-ESI/MSn方法在大鼠血、尿、粪和胆汁样品中都检测到去甲基土荆皮乙酸(土荆皮丙2酸,pseudolaric acid C2,PC2),各种样品中几乎都检测不到原形药物,PC2是PB特异性的代谢产物。PB在肠内菌抑制大鼠模型中的代谢情况与正常组一致,说明其代谢与肠内菌无关。在人工胃、肠液中分别孵育48 h均无明显变化,说明胃蛋白酶和胰蛋白酶都不是主导PB代谢的因素,在胃肠道的pH环境下PB也是稳定的。在体外大鼠肝微粒体孵育模型中,PB仅有极少部分被代谢成为脱甲氧基或脱甲氧基脱羧基的产物,说明其代谢也不是由肝微粒体酶主导的。在体外全血孵育模型中,PB在1 h内被逐渐代谢成PC2,并表现出了与孵育时间相关的动力学特点。由此推测土荆皮乙酸一进入血液就被迅速代谢成PC2,以致于在各种样品中都几乎检测不到原形药。这种快速的代谢应该是通过血浆酯酶对PB的C-19酯键的迅速水解而实现的。本文首次初步阐明了PB在体内的代谢途径,对于明确中药土荆皮的有效物质基础、体内活性形式及其作用机制都具有重要意义。
关键词: 土荆皮 ；土荆皮乙酸 ；代谢 ；血浆酯酶 ；水解 ；去甲基土荆皮乙酸
被引量
9
摘要： 目的:研究银杏二萜内酯葡胺注射液在人尿液中的主要代谢产物及其代谢途径。方法:3名受试者静脉滴注银杏二萜内酯葡胺注射液后收集0~6 h的尿样,分别按酸化和不酸化样品处理后,以液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对样品进行分析。采用ACE C_(18)-AR色谱柱(4.6 mm×150 mm,3μm),酸性HPLC条件流动相Ⅰ为乙腈-0.4%甲酸铵水溶液(p H3.2)梯度洗脱,中性HPLC条件流动相Ⅱ为乙腈-水梯度洗脱,流速0.7 m L·min^(-1)。通过比较空白尿样和给药后尿样的总离子流和提取离子流色谱图以及各个色谱峰的保留时间、准分子离子和二级碎片离子,分析银杏内酯A(GA),银杏内酯B(GB)和银杏内酯K(GK)在人体内可能的代谢产物。结果:除原型药外,共鉴定了12个代谢产物,其中GA相关的代谢产物有6个,包括5个Ⅰ相和1个Ⅱ相代谢产物;GB相关的有4个,包括1个Ⅰ相和3个Ⅱ相代谢产物;GK相关的有2个,包括1个Ⅰ相和1个Ⅱ相代谢产物。结论:GA在人体内主要的代谢途径为羟基化和内酯环水解,并可进一步共价结合成硫酸酯;GB主要的代谢途径为羟基化和内酯环水解,并可进一步共价结合成硫酸酯、葡萄糖醛酸苷或谷胱甘肽结合物;GK在人体内主要的代谢途径为甲基化葡萄糖醛酸结合反应。
关键词: 银杏二萜内酯葡胺注射液 ；尿液 ；代谢产物 ；银杏内酯A ；银杏内酯B ；银杏内酯K
被引量
4
摘要： 目的:研究千金子素L1、千金子素L2、千金子素L8、6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯在Caco-2细胞中的代谢产物及途径。方法:100μg/mol千金子二萜类化合物作用于Caco-2细胞3、6、12 h后收集并纯化样品,LC/MS/MS分析鉴定代谢产物。结果:千金子素L1在Caco-2细胞中首先发生酯基水解,然后再被甲基化,最终鉴定得到两个甲基化产物;千金子素L2、千金子素L8及6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯各鉴定出一个酯基水解产物。结论:千金子素L1在Caco-2细胞中主要代谢途径为酯基水解和甲基化;千金子素L2、千金子素L8及6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯在Caco-2细胞中主要代谢途径为酯基水解。LC/MS/MS可以快速、灵敏地鉴定千金子素L1、千金子素L2、千金子素L8及6(17),12(E)-千金二萜醇-5,15-二乙酸-3-苯乙酸酯在Caco-2细胞中代谢产物。
关键词: LC/MS/MS ；千金子二萜类化合物 ；Caco-2细胞 ；代谢产物
被引量
6
【会议论文】 •
会议时间： 2018-07-28
摘要： 深海极端环境使得深海微生物具备不同于陆地和浅海微生物的代谢途径和遗传背景,也使其更容易产生具有特殊化学结构和特殊生理活性的物质,为创新药物研究提供了新的先导化合物来源。我们前期对深海真菌Aspergillus wentii SD-310的代谢产物研究中发现,改变培养条件可使该菌产生化学结构和代谢途径显著不同的次级代谢产物:在静置发酵条件下可产生具有较好抗肿瘤活性的四降二萜类型化合物（图1）,而在动态发酵条件下则产生具有抑菌活性的isopimarane型降二萜类化合物（图2）。
关键词: 二萜类化合物 ；深海真菌 ；生物活性研究 ；Aspergillus wentii SD-310 ；结构鉴定
摘要： 中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)主要危害棉花(Gossypium hirsutum L.)等作物,中黑盲蝽取食诱导的棉花防御反应,以及中黑盲蝽对棉花防御反应的适应性机制是当前棉花害虫防治研究的热点之一。本文综合应用多组学(代谢组学、蛋白质组学、转录组学)手段与分析方法,研究了中黑盲蝽取食诱导的棉花蛋白质组和代谢组发生的变化,并通过多组学联合分析,鉴定了棉花防御反应潜在的分子机制;同时利用转录组测序技术,探究了中黑盲蝽唾液腺中效应蛋白基因,并分析了它们潜在的功能。本研究对于深入探讨昆虫与植物互作关系,明确植物诱导抗虫性的机制,完善害虫综合治理的理论体系具有重要的借鉴意义。主要结果如下:
1.中黑盲蝽取食诱导后棉花代谢组的变化。
基于高效液相色谱串联质谱等技术对中黑盲蝽取食棉花前后差异代谢物进行分析,结果表明,共鉴定出496个差异正离子(其中上调374,下调122),可分为11类,分别是萜类、生物碱、苯丙素类、黄酮和异黄酮类、有机酸及其衍生物、酚类及其衍生物、碳水化合物和碳水化合物结合物、脂质和类脂分子、氨基酸肽及其类似物、核苷核苷酸及其类似物、其它类。其中,94个萜类代谢物(上调80,下调14);77个生物碱类代谢物(上调63,下调14);27个苯丙素类代谢物(上调24,下调3);26个有机酸及其衍生物类(上调17,下调9);22个黄酮和异黄酮类代谢物(上调16,下调6);15个酚类及其衍生物(全部上调)含量发生显著变化。说明中黑盲蝽取食诱导了棉花次生代谢反应。另外,中黑盲蝽取食后同样引起棉花的氨基酸(上调19,下调11)、糖类(上调43,下调27)、脂类(上调40,下调18)等初生代谢产物发生变化。KEGG代谢通路分析表明,主要响应中黑盲蝽取食的代谢通路包括倍半萜和三萜生物合成途径(40个,全部上调)、二萜生物合成途径(14上调,6下调)、异喹啉生物碱生物合成途径(14上调,5下调)、托品烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成途径(14上调,5下调)、苯丙烷生物合成途径(16上调,2下调)、单萜生物合成途径(10上调,5下调)、α-亚麻酸代谢途径(14上调,2下调),果糖和甘露糖代谢途径(6上调,8下调)。以上这些结果表明中黑盲蝽取食后,棉花体内多种具有潜在杀虫活性的代谢物含量显著上升,表现出防御反应。
2.中黑盲蝽取食诱导后棉花蛋白组的变化及多组学联合分析。
对中黑盲蝽取食48 h前后棉花的蛋白质组进行了系统分析,与对照相比,共鉴定出1569个差异蛋白,富集到35个代谢通路中,进一步通过代谢组和蛋白质组联合分析发现,α-亚麻酸代谢途径中17个蛋白酶表达量显著增加,仅有2个蛋白酶表达量降低,与该途径中14个代谢物含量显著增加对应;果糖和甘露糖生物合成途径中的19个蛋白酶表达量下调,仅有7个蛋白酶表现上调,与该通路中8个代谢物下调相对应。差异蛋白的编码基因的表达量分析表明,调控α-亚麻酸代谢途径的丙二烯氧化合酶基因(AOS)、磷脂酶A基因(PLA)、乙醇脱氢酶基因(ADH)、烯氧化环化酶基因(AOC)、12-氧苯二甲酸还原酶基因(OPR)的表达量可显著响应中黑盲蝽取食。
3.取食不同食物中黑盲蝽唾液腺转录组的变化及潜在效应蛋白基因的鉴定。
对取食不同食物的中黑盲蝽唾液腺进行转录组测序,共筛选出5类存在显著差异的蛋白酶基因,分别是胰蛋白酶基因、胰脂肪酶基因、多聚半乳糖醛酸酶基因、丝氨酸蛋白酶基因和丝氨酸毒蛋白酶基因。组织表达特异性分析表明,32个多聚半乳糖醛酸酶基因、3个丝氨酸蛋白酶基因、3个丝氨酸毒蛋白酶基因在中黑盲蝽唾液腺(SG)中特异性高表达,并且与其他组织之间存在极显著差异。通过信号肽预测及跨膜结构域分析,鉴定到11个含信号肽概率在99%以上的基因为潜在效应蛋白基因,包括9个多聚半乳糖醛酸酶基因、1个丝氨酸蛋白酶基因和1个丝氨酸毒蛋白酶基因。
综上所述,中黑盲蝽取食诱导了棉花次生代谢反应,也同样引起棉花初生代谢产物发生变化,进一步分析表明棉花体内多种具有潜在杀虫活性的代谢物含量显著上升,表现出防御反应。联合分析表明α-亚麻酸代谢途径可能是棉花响应中黑盲蝽取食的关键代谢途径,其中关键基因AOS、PLA、AOC、OPR可显著响应中黑盲蝽取食。通过转录组分析及生物信息学分析鉴定到11个含信号肽概率在99%以上的基因为潜在效应蛋白基因。
关键词: 棉花抗虫防御反应 ；中黑盲蝽 ；唾液腺 ；关键代谢通路 ；抗虫基因
被引量
2
摘要： 马铃薯作为我国第四大主粮作物,在我国居民生活中扮演着不可或缺的角色。块茎作为其主要可利用部分,决定着最终的产量和质量。因而,马铃薯块茎发育的研究备受关注。马铃薯块茎形成数量的多少与形成时间的早晚关系到最终产量和质量的高低。块茎发育是内外因素综合作用的结果,其中光周期对马铃薯块茎发育的影响尤其明显。本研究以结薯对光周期敏感型品种合作88和不敏感型品种大西洋为试验材料,通过两年盆栽试验,研究了光周期对马铃薯全生育期内植株形态指标、干物质积累与运移的影响;研究了光周期对块茎发育阶段糖类代谢及其相关酶活性、激素水平的影响,以及对该阶段匍匐茎或块茎中关键基因、代谢物和主要代谢通路等的影响,揭示了光周期对块茎发育影响的生理和分子机制。为进一步深入探讨马铃薯块茎发育机理奠定基础,为培育适应不同区域不同光周期优良马铃薯品种提供参考,且对马铃薯种植产业布局提供一定的指导。主要结果如下:
1.长日照促进马铃薯地上部生长发育,大西洋和合作88平均株高分别比短日照条件下高8.46%和12.80%,茎粗分别粗10.26%和16.99%;长日照延迟块茎始成时间,大西洋与合作88分别平均延迟1.5和5天;长日照延长块茎形成持续时间,大西洋和合作88分别延长2和4天。
2.短日照条件下,马铃薯生育期内茎、叶、根、地下茎干物质分配率下降。短日照下大西洋生育期内茎、叶、根、地下茎平均分配率的两年平均值分别比长日照低15.7%、12.2%、31.7%、16.8%;合作88分别低39.3%、8.3%、68.1%、39.8%。短日照条件下块茎干物质分配率提高,大西洋和合作88生育期内块茎平均分配率的两年平均值分别比长日照高20.4%和55.7%。
3.短日照可提高两品种生育期内叶片可溶性总糖、蔗糖、淀粉含量,提高匍匐茎或块茎淀粉含量,提高大西洋叶片果糖含量和合作88葡萄糖含量,降低大西洋叶片和合作88匍匐茎/块茎葡萄糖含量。
从匍匐茎伸长期到块茎始成期,短日照下两品种叶片转化酶、蔗糖合酶活性均降低,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶、淀粉合成酶活性均增加。
从匍匐茎伸长期到块茎始成期,短日照下两品种匍匐茎或块茎果糖1,6-二磷酸酶蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶活性均增加,而转化酶活性均降低;在块茎形成期,短日照提两品种块茎淀粉合成酶活性。
4.短日照降低两品种块茎膨大期块茎GA含量,大西洋降低19.02%,合作88降低25.96%。短日照降低两品种块茎始成期IAA含量,大西洋降低23.95%,合作88降低0.58%。短日照提高大西洋各时期ABA/GA比值,在匍匐茎伸长期、块茎始成期、块茎形成期、块茎膨大期,分别提高0.51%、11.46%、2.69%、57.34%。
5.短日照显著影响马铃薯块茎发育过程中匍匐茎或块茎内基因的表达。在匍匐茎伸长期、块茎始成期、块茎形成期、块茎膨大期,大西洋和合作88长短日照比较组中分别鉴定出769和4461、1916和774、522和1528、1061和2311个差异表达基因。各个时期合作88不同光周期处理间的差异表达基因均多于大西洋,说明合作88对光周期反应更加敏感,块茎发育过程更加复杂。
进行DEGs的GO功能富集和KEGG通路分析发现,两品种的差异基因均主要富集到分子功能条目上,其共同富集通路在匍匐茎伸长期为二萜生物合成、苯丙烷类生物合成、淀粉与蔗糖代谢途径,在块茎始成期为苯丙烷类生物合成、蔗糖与淀粉代谢、DNA复制途径,在块茎形成期为内质网中蛋白质加工、半光氨酸和甲硫氨酸代谢途径,在块茎膨大期为植物激素信号转导、α-亚麻酸代谢途径。
6.短日照处理诱导了马铃薯匍匐茎或块茎内代谢物的差异表达。在匍匐茎伸长期、块茎始成期、块茎形成期、块茎膨大期,大西洋和合作88两个品种的比较组中分别检测出441和273个、299和356个、189和300个254和202个差异代谢物。
差异代谢物的KEGG通路分析发现,两品种代谢产物共富集的主要通路,在匍匐茎伸长期为亚油酸代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、氨基酰-t RNA的生物合成,在块茎始成期为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢和戊糖磷酸途径,在块茎形成期为氨基酰-t RNA的生物合成、ABC转运蛋白、淀粉与蔗糖代谢,在块茎膨大期为精氨酸生物合成、氨基酰-t RNA的生物合成、戊糖磷酸途径、淀粉及蔗糖代谢。
7.转录组与代谢组联合分析发现,两品种差异基因和差异代谢物之间的关系在块茎形成期和块茎膨大期表现一致,前者以正相关为主,后者以负相关为主。但在在匍匐茎伸长期,大西洋差异基因和差异代谢物以正相关为主,而合作88以负相关为主,而在块茎始成期,大西洋以正相关为主,合作88却以负相关为主。
差异表达基因和差异代谢物的KEGG富集分析发现,两品种共同富集的主要通路在匍匐茎伸长期以乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、蔗糖与淀粉代谢为主,在块茎始成期,以淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化为主,在块茎形成期,以戊糖和葡萄糖醛相互转化、氨基酸糖和核苷酸糖代谢为主,在块茎膨大期,以谷胱甘肽代谢、淀粉和蔗糖代谢为主。在整个块茎发育过程中,淀粉与蔗糖代谢通路均显著富集。
关键词: 马铃薯 ；块茎发育 ；光周期 ；碳水化合代谢 ；转录组学 ；代谢组学
摘要： 芪苈强心胶囊是由附子、黄芪、人参、泽泻、丹参、葶苈子、香加皮、红花、玉竹、陈皮和桂枝11味常用中药组成的中药复方制剂,临床上用于治疗慢性心力衰竭,疗效明确,但其体内发挥药效的物质基础尚不清楚。本文利用液相-质谱联用技术对芪苈强心胶囊的化学成分及其在大鼠体内相关外源物进行了快速检识;建立了大鼠血浆中来自不同药味、分属不同结构类型的多成分同时定量分析方法,并对口服芪苈强心胶囊后,大鼠血浆中多个成分的药动学特征进行了研究。本文利用UPLC/Q-TOF-MS技术,对芪苈强心胶囊中的化学成分进行了分析,共检识到入方成分173个,其中44个利用对照品进行了确认。通过与各组方药味提取物比对,发现上述入方成分主要来源于组方药味附子(27个,均为二萜生物碱类)、黄芪(16个,包括黄酮苷以及皂苷)、人参(20个,均为人参皂苷)、泽泻(33个,包括三萜、二萜、倍半萜)、香加皮(24个,包括皂苷、强心苷、低聚糖和香豆素)、丹参(12个,包括酚酸和二萜醌)和葶苈子(16个,包括为黄酮、芥子苷和强心苷),也有少量成分来源于红花(7个)、玉竹(4个)、陈皮(11个)和桂枝(3个)。采用相同的液-质分析条件,对口服芪苈强心胶囊后的大鼠血浆、尿液中的相关外源性成分进行快速分析,共检测到原型成分45个。为了尽可能覆盖主要结构类型,我们选取了 11个代表性原型成分,包括:黄芪甲苷、芒柄花素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、苯甲酰中乌头原碱、丹参酚酸B、丹参酮IIA、杠柳毒苷、泽泻醇A、芥子碱硫氰酸盐和柚皮苷,分别研究这些成分在大鼠体内的代谢途径,共检识到相关代谢产物165个。通过分析11个代表性成分的主要代谢反应及代谢产物质谱碎裂特征,并将检识结果录入自建数据库。最终利用数据库中收集到的质谱信息,在口服芪苈强心胶囊后的大鼠血浆、尿液和粪便中,共检测到相关外源物121个(45个原型和76个代谢物)。其中,在血浆中暴露量相对较大的外源物包括10个原型成分(新乌头原碱、展花乌头宁、宋果宁、附子灵、尼奥林、塔拉乌头胺、芒柄花素、人参皂苷Rb1、泽泻醇A以及新隐丹参酮)以及2个二相代谢物(毛蕊异黄酮葡萄糖醛酸结合物和芒柄花素葡萄糖醛酸结合物)。主要的代谢反应有甲基化、水解、羟基化、还原、硫酸酯化以及葡萄糖醛酸化。随后,利用UPLC-TQ/MS技术,建立了同时测定大鼠血浆中8个成分(芒柄花素、附子灵、尼奥林、宋果宁、塔拉乌头胺、人参皂苷Rb1、杠柳次苷和泽泻醇A)的定量分析方法。利用该方法描绘了口服芪苈强心胶囊内容物后,大鼠血浆中多个成分的药动学特征,同时对暂无对照品的10个外源物,以峰面积-时间变化曲线描绘了其在大鼠体内的动态轮廓。研究发现,单次口服2 g/kg芪苈强心胶囊后,人参皂苷Rb1和泽泻醇A在大鼠体内的暴露量较大,Cmax分别为67.72±9.7 ng/mL和31.15±6.5 ng/mL。芒柄花素、附子灵、尼奥林以及塔拉乌头胺在体内均表现出吸收迅速且暴露量少的特点。附子灵、尼奥林以及塔拉乌头胺的Cmax分别为0.75±0.19ng/mL、0.33±0.09 ng/mL以及0.78±0.12 ng/mL,Tmax均在2h以内。芒柄花素的Cmax为0.97±0.13 mg/mL,Tmax为0.25±0h。杠柳次苷在大鼠体内消除缓慢,t1/2为27.58±12.48 h。相对定量结果显示,(6aR,11aR)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、新隐丹参酮和Tanshinone ⅡA+O+2H2的峰面积较大。展花乌头宁与新乌头原碱Tmax分别为4.33±2.33 h和0.58±0.20 h。芒柄花素葡萄糖醛酸结合物和16,23-氧化泽泻醇B都出现双峰现象,毛蕊异黄酮葡萄糖醛酸结合物在0.42 h有一个吸收峰。Alisol A-H2 和 Alisol A+gluA 的 Tmax 在分别为 2±1.09 h 和 1.3±0.32 h。此外,还考察了单次口服4 g/kg、8 g/kg以及连续三天口服芪苈强心胶囊(2g/kg/d)后,大鼠血浆中多成分药动学特征。结果显示多次给药后人参皂苷Rb1的Cmax较单次同剂量有显著提高,附子类生物碱出现明显的蓄积作用,泽泻醇A的Cmax明显增加并伴随双峰现象。四个生物碱在4g以及8g的剂量下MRT明显增长。本研究较为全面地描述了复方芪苈强心胶囊的化学成分及其在大鼠体内的代谢特征,并对主要吸收入血成分的药动学特征进行了描绘。发现潜在药效物质11个,包括附子中的5个生物碱(新乌头原碱、展花乌头宁、附子灵、尼奥林、塔拉乌头胺)、黄芪中两个异黄酮(毛蕊异黄酮、芒柄花素)的葡萄糖醛酸结合物、人参皂苷Rb1、泽泻醇A、杠柳次苷以及新隐丹参酮。为后续更为深入的药效学研究及临床安全合理用药等提供了科学依据。
关键词: 芪苈强心胶囊 ；化学成分 ；代表结构 ；多成分体内代谢 ；药动学
摘要： 互叶白千层(Melaleuca alternifolia)是桃金娘科的多年生木本植物,原产澳大利亚南纬23.5°以北沿海,中国广泛栽培地区包括云南、广西、广东和福建等省。其根茎叶等器官含有多种挥发性化合物,这些化合物具备抗氧化、抗炎、抗癌等多种药用特性。但目前尚未系统分析互叶白千层精油及其产品的抑菌作用,特别是对白色念珠菌的抑制效果,挥发性活性物质的信息也不够完善;互叶白千层基因组尚未达到染色体级别,且没有完善的代谢组和转录组信息,不利挖掘挥发性活性物质合成关键基因。本论文分析了互叶白千层精油及其产品的抑菌作用和挥发性活性物质;为了更好挖掘互叶白千层挥发性活性物质合成关键的基因,利用高通量、长读长测序和Hi-C辅助技术,组装获得互叶白千层高质量基因组;分析了互叶白千层根茎叶全转录组,通过代谢组和转录组联合分析,挖掘出挥发性活性物质关键合成基因,并对其中4个TPS(Terpene synthase)基因的功能开展研究。研究结果可为互叶白千层优良品种的分子标记筛选提供科学基础。论文的主要研究结果如下: 1.互叶白千层精油及其产品的抑菌作用分析 互叶白千层精油GC-MS检测结果表明5个株系互叶白千层精油质量标志性物质松油烯-4-醇含量均超过30%,其中株系BH最高,达38.44%。精油浓度为3%时,对白色念珠菌的抑菌率达到99.9%。互叶白千层精油产品对冠状病毒的杀灭率高达99.97%。互叶白千层精油抑菌膏、精油妇科用品抑菌凝胶、精油洗衣液、精油抑菌含漱液和精油免洗手消毒液产品均对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌有很高的杀灭率;对真菌白色念珠菌杀灭效果也非常好。综合肉眼观察、显微镜检和CCK法检测结果,确定1.7 mg/m L浓度为互叶白千层精油在48小时内对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC),确定6.8 mg/m L精油浓度为互叶白千层精油在48小时内对白色念珠菌的最低杀真菌浓度(MFC)。 2.互叶白千层根茎叶挥发性化合物分析 互叶白千层根茎叶挥发性化合物中最重要的成分是松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol),占总成分的30-48%,γ-松油烯(Gamma-terpinene)为10-28%,α-松油烯(Alpha-terpinene)为10-28%,1,8-桉叶素(1,8-cineole)≤15%,香茅醇(Terpinolene)≤4%。通过挥发性靶向代谢组共检测出互叶白千层挥发性代谢产物241种,鉴定到82种萜类化合物,二萜3种,倍半萜53种,单萜26种。包括了互叶白千层的标志性和重要特色物质,如松油烯-4-醇、L-α-松油醇和γ-杜松烯等。比较了根、茎和叶之间的差异挥发性代谢物,结果表明,叶与根差异代谢物有200个,叶与茎差异代谢物有174个,根与茎差异代谢物有174个。茎与根相比差异萜类代谢物筛选结果表明,茎与根差异显著排名前20名的差异代谢物是单萜、倍半萜和二萜化合物,其中特别是松油烯-4-醇和L-α-松油醇是互叶白千层特征性组分。叶与根相比差异萜类代谢物中,上调的前20名中倍半萜物质有8个,下调的前10名中单萜物质有9个。 3.互叶白千层基因组测序、拼接和注释与基因组进化分析 基于Pacbio CCS测序和Hi-C辅助组装策略,组装好的互叶白千层基因组大小为332.53 Mb,GC含量为58.44%,组装的scaffold数量为524条,长度均大于2 kb。并且Scaffold的N50长度为1.27 Mb。预测的基因模型数为35,912个,转录本平均长度为1,764 bp,平均基因长度为3,094 bp。经过Hi-C挂载,染色体组装的N50长度为31.72 Mb,完成了染色体水平的基因组组装。BUSCO分析结果表明,99.0%的保守基因在组装的基因组中完整,说明此次互叶白千层基因组的组装结果好。互叶白千层基因组预测36类转录因子,共1481个。互叶白千层与C.citriodora,E.grandis,R.argenea和P.granatum为姐妹种,并聚为桃金娘目内,来源共同祖先。系统发育树分析表明,桉树科的E.grandis和桉树科C.citriodora的物种分化时间约为39.76(38.01-52.10)Mya,晚于互叶白千层的60.50 Mya。互叶白千层收缩基因家族有7,805个,扩张的基因家族有2,315个。对Ks分布的分析表明,互叶白千层近期未发生WGD事件。互叶白千层基因组中涉及特有基因家族的总数为325个,特有基因的总数为2,236个。基因组中共有102个基因家族,302个基因发生了正向选择(Ka/Ks>1,P<0.05)。 4.互叶白千层全转录组分析和活性物质合成关键基因挖掘 互叶白千层根茎叶RNA预测和鉴定结果表明,mRNA为38,490个,lnc RNA为3,379个,mi RNA为371个;circ RNA为361个。其中mRNA差异表达10,783个,lnc RNA差异表达895个,mi RNA差异表达234个和circ RNA差异表达41个。在circ RNA-mi RNA-mRNA网络中,circ RNAs(chr4:2667916|2677732和chr7:9877034|9925767)可以作为stu-mi R156 g-5p、mdm-mi R156i和novel＿mi R＿213的海绵,调控Mab HLH155(BQC-011725)的表达。MSTRG.1121.1和MSTRG.1121.2发挥了核心作用,预测其通过与多个mi RNA连接来调节Ma MAN2(BQC-032951)的表达,mi RNA中参与互叶白千层代谢途径有stumi R156 g-5p、gma-mi R156v和novel＿mi R＿150。通过代谢组和转录组联合分析,在MEP途径中,挖掘鉴定到12个关键基因家族。从MVA通路中,挖掘鉴定到7个关键基因家族。鉴定到的16个TPS基因中有11个与单萜类和倍半萜类具有较高的相关性。我们选择了8个候选基因(Ma TPS2,Ma TPS4,Ma QHS1,Mab HLH155,MSTRG.1121.2;mdm-mi R156i;gma-mi R156v;novide＿mi R213)进行Q-PCR分析,结果表明与RNA-Seq数据具有良好的一致性。 5.互叶白千层TPS基因表达及其功能分析 通过hummerseach命令提取出61个初筛TPS基因家族成员,以tbtools提取TPS蛋白序列,用CDD和HMMSCAN功能对TPS序列进行检验,得到60个TPS基因家族成员。挑选在互叶白千层转录组研究中表达差异显著4个TPS基因家族成员,开展了原核表达研究,获得了4个BQCTPS蛋白。为了探明4个BQC重组蛋白催化底物的能力,加入底物、重组蛋白、正己烷,反应后进行GC-MS分析。结果显示重组蛋白BQC2与FPP的反应生成α-柏木烯((-)-ALPHA-CEDRENE);重组蛋白BQC3与FPP的反应体系生成柏木脑(Cedrol)。 综上所述,本论文分析了互叶白千层精油及其产品的抑菌作用和挥发性活性物质,确定了互叶白千层精油对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀真菌浓度(MFC),为互叶白千层精油抗白色念珠菌的产品开发提供科学依据。基于Pacbio CCS测序和Hi-C辅助组装策略,首次完成了互叶白千层染色体水平的基因组组装,为互叶白千层分子生物学研究提供科学基础。分析了互叶白千层根茎叶全转录组,通过代谢组和转录组联合分析,挖掘出一批互叶白千层精油合成途径中关键候选基因,并对其中4个TPS(Terpene synthase)基因的功能开展研究。研究结果可为互叶白千层优良品种的分子标记筛选提供科学基础。
关键词: 互叶白千层 ；挥发性有机化合物 ；关键基因 ；TPS基因 ；抑菌活性
摘要： 植物内生真菌与宿主植物长期共存,进化出了独特的代谢机制。从这些代谢产物中寻找具有药用价值的活性分子,是当前新药及成药前体来源的重要途径。药用植物内生真菌来源于传统药用植物,更有可能产生具有生物活性的代谢产物。其中,杂二萜化合物由于普遍具有抗癌抗肿瘤等活性,受到广泛关注。本文以聚酮-二萜(PK-DTs)杂化分子为目标,从云南梁王山产滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis植株内分离得到的34株内生真菌中筛选了适合我们研究的基因簇:经过基因组测序和生物信息学分析,并与已知杂二萜化合物生物合成途径相关的基因簇进行比对发现,其中一株内生真菌Aspergillus versicolor0312的第19基因簇可能与杂二萜化合物的生物合成途径有关。据此,我们用异源表达策略开展了该基因簇的天然产物研究:在滇重楼内生真菌0312的基因组内鉴定了chevalon E(1)及其氧化衍生物的生物合成基因簇,并在异源表达宿主Aspergillus oryzae NSAR1中成功地重构了该生物合成途径。研究发现,两种细胞色素P450单加氧酶cle2和cle4,能将chevalon E(1)转化为7种新的类似物(2-8),其中具有独特五元内酯环的7和8,是真菌中还从未发现过的萜类结构。随后,通过底物饲喂等策略,我们推测了该基因簇合成天然产物的代谢途径。此外,还发现了同样来源于滇重楼的另一株内生真菌Aspergillus felis 0260中含有类似于合成chevalon E(1)的基因簇,用该基因簇编码的萜烯环化酶基因sre3替换cle7发现,sre3可接受与合成chevalone E相同的底物,但产生了不同结构的环化产物sartorypyrone D(11),因此也验证了该策略挖掘杂二萜化合物的有效性。最后,本研究中的一些化合物(1,2,5–8)协同增强阿霉素(DOX)在乳腺癌细胞中的细胞毒作用。
关键词: 内生真菌 ；杂二萜化合物 ；基因组挖掘 ；生物合成 ；异源表达 ；抗癌活性
被引量
4
摘要： 地衣内生真菌是指存活于健康地衣组织内部而不会引起地衣体任何明显病害症状的一类真菌。地衣是一种绿藻或蓝细菌和两种真菌共生的生命复合体,能忍受干旱、严寒、紫外线等恶劣的极端环境,如此特殊的生存环境有利于地衣内生真菌形成独特的生物代谢途径,更有潜力产生结构类型多样、骨架新颖、生物活性显著的化合物,这对于发现新的药物先导化合物和独特的作用靶点有着重要意义。本文对五株地衣内生真菌的化学成分及其生物活性进行了系统研究。根据前期的生物活性初筛以及化学成分分析结果,选择了Eupenicillium javanicum、Floricola striata、Aspergillus versicolor、Xylaria sp.和 Phialocephala fortinii五株真菌,用大米培养基进行放大发酵,乙酸乙酯提取。其中Phialocephala fortinii的PDB培养基中还加入了组蛋白脱乙酰酶抑制剂伏立诺他(SAHA)进行表观遗传修饰。对五株真菌的粗提物分别采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、ODS柱色谱、中低压柱色谱以及高效液相柱色谱等分离纯化技术进行系统分离,共得到77个化合物,其中新化合物有36个。综合运用核磁共振、X射线单晶衍射、ECD计算、GIAO NMR计算和α,β-不饱和酮的螺旋规则等方法确定了新化合物的平面结构和立体构型。同时,对一些骨架新颖的化合物的生物合成途径进行了合理推导。从地衣内生真菌Eupenicillium javanicum(No.0974a)的次级代谢产物中分离得到了17个化合物,包括16个聚酮类化合物(1-16)和1个2-吡啶酮类生物碱(17),其中1-9为新化合物,6-7是骨架新颖的螺环5/6/5/6/6五环聚酮。对化合物1-5和12-14进行了抗炎活性测试,发现5和13对NO生成有中等强度的抑制作用,IC50值分别为17.00和13.46μM。从地衣内生真菌Floricola striata(No.8938a)的大米发酵产物中分离到了 26个化合物,包括24个对三联苯类化合物(18-41)和2个海松烷型二萜(42-43),其中18-28和42为新化合物。将新发现的三联苯类化合物18-28进行细胞毒活性评价,发现22和23对A2780细胞的生长有显著的抑制作用,IC50值分别为3.4和8.6μM。进一步对22的多药耐药逆转(MDR)活性进行评价,发现22可以通过抑制P-gp介导的药物外排,将耐药肿瘤细胞MCF-7/ADR对阿霉素的敏感度提高了 39倍。从地衣内生真菌Aspergillus versicolor(No.1.310e)的次级代谢产物中共分离得到14个化合物,包括8个二苯醚类化合物(44-51)、3个焦棓酸醚类化合物(52-54)、2个杂色曲霉素(55-56)和1个聚酮类化合物(57)。检测苯基醚类化合物44-54的抗真菌活性,结果对白色念珠菌野生型菌株SC5314无效,只有49对外排泵缺失的DSY654菌株增殖有较为显著的抑制作用,MIC80为4μg/ml。但是化合物44-49和52-53与氟康唑(FLC)联用却能明显增强耐药菌株YEM13对FLC的敏感性。进一步研究发现,活性最好的化合物44是通过抑制药物的能量依赖性外排来实现逆转耐药的。从地衣内生真菌Xylaria sp.(LCSS1a)的次级代谢产物中共得到了 17个化合物,包括4个骨架新颖的异吲哚啉类生物碱(58-61)、2个骨架新颖的angucyclinone类抗生素的衍生物(62-63)、1个倍半萜衍生物(64)、3个3-substituted-3-hydroxy-2-oxindole类生物碱(65-67)、1个聚酮类化合物(68)、1个异苯并呋喃酮类化合物(69)、1个羧基化的蜂蜜曲菌素(70)、1个邻苯二甲酰亚胺类化合物(71)、2个吡咯类生物碱(72-73)和1个喹啉类生物碱(74),其中58-68为新化合物,58-63还具有新颖的结构骨架。利用组蛋白脱乙酰酶抑制剂SAHA对地衣内生真菌Phialocephala fortinii(No.4537d)进行表观遗传修饰,使得该菌株的化学成分有了明显变化,粗提物的细胞毒活性也明显增强。以新出现的紫外吸收为指导,从其次级代谢产物中得到了 3个新的苝醌类化合物(75-77)。通过对比保留时间和紫外吸收,还发现培养基中加入抑制剂之后,苝醌类化合物PhialocephalarinA和B的产量也显著增多。本文通过对五株地衣内生真菌的化学成分和生物活性进行研究,发现了大量结构新颖的次级代谢产物,其中不乏骨架新颖和生物活性显著的化合物。这说明地衣内生真菌是新的活性天然产物的重要来源,有待于继续深入发掘和利用。
关键词: 地衣内生真菌 ；次级代谢产物 ；结构鉴定 ；生物活性 ；表观遗传修饰
被引量
8
摘要： 以酿酒酵母为底盘异源表达萜类化合物合成途径往往会影响其生理和遗传特性,如抑制细胞生长、遗传不稳定等,使得生物合成途径不能有效工作。如何平衡工程细胞生长与产物合成之间的关系是影响产物合成效率的重要问题,本论文针对此问题,以倍半萜花姜酮及二萜13R-泪柏醚（13R-MO）为研究对象,利用合成生物学技术,结合代谢工程调控策略分别从代谢模块构建、代谢模块与代谢模块之间的适配及代谢途径与工程细胞适配等层面构建了可高效合成倍半萜花姜酮及二萜13R-MO的微生物细胞工厂。花姜酮是一种倍半萜天然产物,具有抗肝癌、乳腺癌等生物活性。为了实现其在酿酒酵母中的合成,通过模拟酿酒酵母发酵葡萄糖生产代谢产物过程,调控MVA途径关键基因,建立了“基于底物浓度变化的产物合成自调控策略”,实现了工程细胞生长与α-蛇麻烯合成分段调控,使α-蛇麻烯的产量相较于未调控菌株提高了12.8倍,达到62.86 mg/L,进一步利用过氧化物酶体的区室化优势,将MVA途径中负责转化乙酰-Co A为FPP的8个酶及α-蛇麻烯合酶定位到过氧化物酶体,使α-蛇麻烯的产量达到160 mg/L;共表达8-羟基-α-蛇麻烯合酶CYP71BA1及来源于拟南芥的ATR1可合成113.16μg/L的8-羟基-α-蛇麻烯,进一步通过多拷贝位点表达ICE2（酿酒酵母的III型膜蛋白）,α-蛇麻烯合酶ZSS1,CYP71BA1及ATR1使8-羟基-α-蛇麻烯的产量相较于出发菌株提高了134倍达到15.2 mg/L,在此基础上多拷贝表达醇脱氢酶突变体ZSD1S114A,使工程细胞可以合成20.6 mg/L的花姜酮。13R-MO是cAMP促进剂毛喉素的重要前体,利用“基于底物浓度变化的产物合成自调控策略”,在优化的倍半萜合成酿酒酵母底盘中,通过一步步代谢工程策略成功使FPP代谢流流向GGPP,包括融合内源BTS1p及ERG20F96Cp,截短13R-MO合酶Cf TPS2及Cf TPS3等,构建了可高效合成二萜13R-MO的酿酒酵母底盘,使13R-MO的产量较出发菌株提高了142倍,达到328.15 mg/L。利用5-L发酵罐放大试验,使α-蛇麻烯产量相较于出发菌株提高了352.4倍达到1726.78 mg/L,使13R-MO的产量相较于出发菌株提高了1408倍达到3 g/L,同时首次实现了以微生物为底盘从头合成倍半萜花姜酮并使其最终产量达到40mg/L。本研究构建的酿酒酵母底盘细胞及开发的“基于底物浓度变化的产物合成自调控策略”可同时用于其他倍半萜、二萜甚至四萜等天然产物的合成。
关键词: 酿酒酵母 ；α-蛇麻烯 ；13R-泪柏醚 ；8-羟基-α-蛇麻烯 ；花姜酮 ；代谢工程 ；合成生物学
被引量
2
摘要： 药用植物中的天然产物是创新药物、食品、香料等领域的重要来源。合成生物学的发展使得天然产物可以通过底盘细胞代谢途径的重构而获得,这种获得方法将成为未来天然产物绿色合成生产的趋势。生物合成途径的解析是合成生物学技术制备天然产物的基础,植物次生代谢产物在植物体内分布、合成及代谢调控过程的阐释,有利于植物次生代谢产物生物合成途径中关键酶的挖掘。单一的组学手段难以阐明植物组织中复杂的代谢特征,而现代常用的植物代谢分析手段,如High Performance Liquid Chromatography(HPLC)、Liquid Chromatograph Mass Spectrometer(LC-MS)等,在进行代谢样品前处理时,会引起次生代谢物空间分布特征丢失,难以发现次生代谢物特征空间信息。这些局限制约了药用植物代谢机制、内源性物质生物合成和调控机理等研究领域的发展。因此,开发出能够在植物不同组织中挖掘差异代谢物分布特点的新方法,实现功能代谢物特征的识别、定位和注释,对药用植物次生代谢物质生物合成途径阐释及调控机制研究具有重要意义。 本论文运用植物生理切片、组织化学染色和质谱成像(Mass Spectrometry Imaging,MSI)技术,探究药用植物不同组织的物理表型特征及活性分子的原位空间信息。然后结合超高效液相色谱-质谱联用(Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometer,UPLC-MS)和化学计量学分析方法,确定药用植物中的化学轮廓特点。最后综合代谢组、转录组、蛋白组等多组学技术及生物信息分析方法,从药用植物的代谢特征、基因和蛋白表达谱、信号分子调控机制等多个角度,全面解析药用植物生物合成和分子调控机制。 本论文主要研究内容和结果如下: 1、电喷雾解吸附质谱成像(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging,DESI-MSI)结合多组学技术初步探索丹参和大叶鼠尾草中萜类化合物生物合成的空间分布和分子机制 丹参(Salvia miltiorrhiza)和大叶鼠尾草(Salvia grandifolia W.W.Smith)是唇形科鼠尾草属植物,富含丰富的二萜类化合物,对心血管疾病有良好的治疗作用。前期研究发现丹参酮类成分主要分布在丹参根周皮部位,但是大叶鼠尾草根周皮、木质部、韧皮部也显示为类似丹参酮类的“砖红色”,疑似含有丰富的二萜类成分分布。为了进一步揭示丹参和大叶鼠尾草中二萜类成分及其分布差异,通过代谢组学、转录组学和解吸电喷雾电离质谱成像技术(DESI-MSI)结合初步探索了两个物种中萜类化合物的代谢产物空间分布和潜在的生物合成分子机制。丹参中二萜类成分主要以具有呋喃或二氢呋喃环D结构特征的松香烷型二萜醌成分存在,主要分布在根周皮部位,为丹参酮类生物合成途径的终端产物,如二氢丹参酮I,隐丹参酮,丹参酮IIA。大叶鼠尾草中二萜类成份以三环酚类松香烷型二萜和稀有的七元环萜类成分为主,这些成分除了周皮,韧皮、木质部中也有大量分布,部分为丹参酮生物合成的前体物质,如11-Hydroxy-sugiol,11,20-dihydroxy-sugiol and 11,20-dihydroxy-ferruginoll;另一部分可能为潜在的新颖的二萜类生物合成途径产物,如grandifolia B、7α-Acetoxyroyleanone、salvinon。另外,大叶鼠尾草叶中也富含11-Hydroxy-sugiol等丹参酮生物合成的前体物质,而丹参叶中以酚酸类成分为主。转录组结果进一步揭示了CPS1、KAL1、CYP76AH1、CYP76AK1、CYP76AK5和TIIAS等基因在丹参根部周皮中表达较高,而在根部木质部、韧皮部以及叶片中表达较低,这可能是丹参酮成分主要分布在根部周皮区域的一个重要原因。丹参酮成分生物合成上游途径基因在大叶鼠尾草根部表达较高,而下游途径基因在丹参根部表达较高,这可能是两个物种之间二萜成分积累不同的重要原因。在此,我们描述了两种鼠尾草中二萜类化合物的具体组织分布和空间分布特点,为进一步研究以植物为底盘的合成生物学中二萜类化合物的生物合成酶的发现和验证提供了科学依据。 2、利用多组学对大叶鼠尾草茎的组织特异性研究确定其二萜和酚酸生物合成调控机制 大叶鼠尾草(S.grandifolia)与传统中药丹参同属,其化学成分与丹参相似,前期基于DESI-MSI结合多组学技术对大叶鼠尾草全草的萜类化合物生物合成的空间分布和分子机制进行了初步探索,揭示了大叶鼠尾草全草整体化学成分轮廓和活性成分的组织分布差异,但次生代谢物组织特异性累积的调控机制并不清楚。本研究利用代谢组学、转录组学和蛋白组学等手段对大叶鼠尾草不同部位(周皮、韧皮部和木质部)进行多组学研究。代谢组构建了大叶鼠尾草各组织中明确的化学成分轮廓,初步确定了负离子和正离子模式下的74种代谢物,次生代谢产物主要为酚酸类、丹参酮类、黄酮类、羧酸和萜类成分。与韧皮部和木质部比较发现,大叶鼠尾草周皮中明显聚集大量的丹参酮类四环二萜、三环二萜和酚酸类成分类成分。而在大叶鼠尾草的韧皮部和木质部含有少量的酚酸、三环二萜和C环为七元环的三环二萜类成分,丹参酮类二萜菲醌类成分几乎没有。转录组和蛋白组提供了二萜和酚酸通路中各基因和蛋白的表达情况,蛋白的表达情况与代谢物的分布基本一致,进一步验证了代谢组的结果。在丹参酮合成途径下游,Sm CPS1、Sm CPS4、Sm CPS5、Sm KSL1、Sm KSL2、Sm KSL5、Sm KSL7主要在大叶鼠尾草周皮和韧皮部累积,Sm CPS7、Sm KSL3在木质部大量表达,而相应催化的蛋白在周皮、韧皮部和木质部均有分布。催化丹参酮合成的CYPs基因在大叶鼠尾草周皮和韧皮部大量表达,如CYP76AH1、CYP76AH3、CYP71D373、CYP71D375和Sm TⅡAS,但蛋白却在周皮部位大量积累。在丹酚酸合成途径下游,Sm RAS、CYP98A14、Sm LAC主要在大叶鼠尾草周皮和木质部累积,而相应蛋白均在周皮高积累。大叶鼠尾草茎组织的代谢组学、转录组学和蛋白质组学分析的整合为揭示药用植物中活性化合物(如丹参酮类和丹酚酸类)的组织特异性积累机制提供了深入探究的科学依据,我们的发现可能有助于阐明丹参酮和丹酚酸在丹参及同属植物中生物合成的调控机制,并加速选育活性成分高积累的药用植物。 3、DESI-MSI结合代谢组学揭示灵芝不同生长期子实体化学成分的空间分布 灵芝(Ganoderma lucidum)是药食同源真菌,具有重要的经济和药用价值。目前,灵芝主要代谢产物如灵芝酸等,在灵芝子实体中的空间分布尚不清楚,灵芝在生长发育期代谢产物的变化目前也少有研究。本研究采用解吸电喷雾电离质谱成像技术(DESI-MSI)结合非靶向代谢组学分析,研究了不同生育期灵芝子实体的化学成分空间分布。利用非靶向代谢组学共表征到灵芝中142个化合物,其中119种三萜类成分,11种脂肪酸类成分。例如,在成熟阶段,灵芝酸A、C1、H、F和B分别占总三萜的11.9%、7.5%、5.0%、4.7%和4.1%,(10E,12Z)-9-hydroxy-10,12-octadecadienoic acid、8,11,12-trihydroxy-9-octadecenoic acid和9-KODE分别占总脂肪酸的41.1%、13.9%和9.3%。菌盖中的大部分灵芝酸含量显著高于菌柄,其中灵芝酸B等六个成分极显著,菌盖中灵芝酸主要存在于菌管下层,菌柄中灵芝酸主要分布在皮壳层和菌肉层。随着灵芝的发育,菌柄和菌盖中的大部分灵芝酸成分含量都是逐渐降低的,现蕾期菌柄中的灵芝酸主要分布于皮壳层,随着灵芝逐渐成熟,在菌肉层也有分布。另外,脂肪酸主要累积于开伞期和成熟期菌盖的菌盖中,如Linoleic acid、9-HODE、9-KODE。质谱成像联合非靶代谢组的分析方法为药食用真菌子实体中活性物质的空间分布提供了强有力的工具,本研究进一步明确了灵芝酸在灵芝子实体中的空间动态分布,为灵芝药用部位的合理利用提供依据。
关键词: 质谱成像 ；代谢组 ；转录组 ；蛋白组 ；药用植物
摘要： 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上广泛种植的优质豆科牧草,蛋白质含量高适口性好,可作为动物饲料,又可提高土壤肥力,利用价值较高,但过高的土壤盐度影响紫花苜蓿的生长发育。为了探讨紫花苜蓿的耐盐机理,本研究测定NaCl胁迫后紫花苜蓿根系和叶片生理生化指标,选取紫花苜蓿根系进行了转录组测序和代谢产物检测,分析了 NaCl胁迫对紫花苜蓿根系生理、转录和代谢的影响。通过转录组和代谢组联合分析,解析了紫花苜蓿响应NaCl胁迫的关键代谢途径,发掘关键差异基因和差异代谢产物并研究其相关性,选取候选基因尝试利用VIGS体系进行功能验证,从而深入揭示紫花苜蓿适应盐胁迫的分子机制,为紫花苜蓿耐盐机理的研究提供新见解。主要研究结果如下:1、NaCl胁迫24h内紫花苜蓿根系和叶片内渗透调节物质含量均显著高于胁迫处理前,根系抗氧化酶活性的增加较叶片显著。当NaCl胁迫1h时,紫花苜蓿根系过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等指标未发生显著变化,NaCl胁迫6h或24h时则显著上升;在NaCl胁迫1h时转录和代谢物未发生显著变化,而NaCl胁迫到6h和24h时发生显著变化。表明胁迫1h时,由于时间较短紫花苜蓿尚未对NaCl胁迫作出应答,而胁迫6h和24h涉及的变化与紫花苜蓿耐盐性相关,且根系在24h内对NaCl胁迫的响应强于叶片,叶片中渗透调节物质可能先于抗氧化酶参与防御反应。2、紫花苜蓿根系转录和代谢产物的KEGG共富集分析发现,NaCl胁迫6h和24h时共富集到异黄酮生物合成、类黄酮生物合成、ABC转运蛋白、花生四烯酸代谢、黄酮和黄酮醇生物合成、二萜生物合成和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解等7条代谢途径。此外,差异基因(DEGs)还富集到植物激素信号转导、类胡萝卜素生物合成、玉米素生物合成等途径,差异代谢产物(DAMs)还富集到α-亚麻酸代谢和花青素生物合成途径。表明类黄酮合成和植物激素合成与转导途径参与6h和24h时紫花苜蓿对NaCl胁迫的适应过程。3、在NaCl胁迫1h或6h时,大部分类黄酮合成基因和茉莉酸(JA)合成与转导基因均显著上调,赤霉素(GA)产物积累量呈现先减少后增加的趋势,GA转导途径中主要基因在6h时显著下调,脱落酸(ABA)含量在NaCl胁迫下无显著变化,6h和24 h时转录因子ABF2表达量显著上调。此外,6种类黄酮化合物(二氢槲皮素、二氢杨梅素、花葵素、木犀草素、甘草素和甘氨酸)、3种GA产物(GA1、GA4和GA9)和2种JA产物((+)-7-异甲基茉莉酮酸酯和茉莉酸甲酯)在NaCl胁迫24h时显著升高。表明NaCl胁迫初期类黄酮合成相关酶基因上调,导致类黄酮积累量在NaCl胁迫24h内逐渐增加,从而缓解NaCl胁迫对紫花苜蓿的伤害。在植物激素合成与转导途径中,紫花苜蓿则通过调节GA含量、提高JA产物含量、增强ABA转录因子的表达来提升NaCl胁迫的防御能力。4、DEGs和DAMs关联分析发现,二氢槲皮素与β-环羟基化酶(LUT5)、ABA响应元件结合因子2(ABF2)、蛋白质磷酸酶PP2C(PP2C)和ABA受体PYL2(PYL)基因显著相关;木犀草素与PP2C和光敏色素相互作用因子4(PIF4)基因显著相关;(+)-7-异甲基茉莉酮酸酯与黄酮醇合成酶(FLS)基因显著相关,这表明类黄酮与三种植物激素存在相互作用,共同参与紫花苜蓿盐胁迫适应过程。5、挑选关联网络中MsABF2和MsFLS基因,选用TRV沉默体系,使用抽真空法和萌发种子浸泡法侵染紫花苜蓿,结果发现沉默2周后两种方法侵染的紫花苜蓿幼苗叶片均未发生白化,并且叶片中MsPDS基因和根系中MsABF2与MsFLS基因表达量均未显著降低,表明沉默未成功,这可能与病毒沉默载体、沉默片段选择、沉默侵染方法和侵染后的培养温度有关。
关键词: 紫花苜蓿 ；代谢组 ；NaCl胁迫 ；转录组 ；VIGS
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摘要： 植物产生大量的代谢产物调节生长发育和环境适应性。独脚金内酯(SLs)作为一种重要植物激素,在植物的生长发育、调控株型、响应非生物胁迫等方面具有重要作用,但独脚金内酯对水稻氮素代谢等代谢途径的调控及其分子机理仍有待阐明。本研究利用水稻独脚金内酯合成突变体d10和信号转导突变体d14进行了转录组和代谢组联合分析,从代谢组和转录组角度揭示了独脚金内酯合成突变体和信号转导突变体对水稻代谢的调控及其分子基础。主要结果如下:1.本研究利用HPLC-ESI-MS/MS系统对d10,d14和WT进行代谢组分析,共检测到996种代谢物,其中179种代谢物在独脚金内酯突变体中的含量较在野生型中均有显著差异,这些差异代谢物主要是类黄酮、脂质、酚胺和氨基酸。2.本研究对d10,d14和WT进行了转录组测序,在两个突变体中鉴定到490个共同差异表达基因。KEGG通路富集分析表明,大多数差异表达基因富集在次级代谢产物的生物合成、二萜生物合成以及氨基糖和核苷酸糖代谢途径。3.通过代谢组学与转录组学联合分析,我们发现独脚金内酯合成或信号途径缺失总体上抑制了类黄酮、氨基酸和脂质的积累,且相关基因表达量也发生显著变化。在d10和d14中,6种二萜类植物抗毒素的含量显著提高,萜类化合物合成基因簇及其上游转录因子WRKY45的表达也显著高于野生型。4.公开数据表明,独脚金内酯下游转录因子IPA1可能直接调控多个代谢途径的关键基因,包括萜类、类黄酮、氨基酸和脂质合成途径。酵母单杂交、双荧光素酶及转基因实验表明,IPA1可以结合到谷氨酰胺合成酶基因OsGS1的启动子上,并且正调控OsGS1表达。同时,本研究还发现IPA1能激活OsNRT1.1B,OsNAA,OsASN1等氮素代谢关键基因。这说明IPA1对于独角金内酯调控水稻代谢具有重要作用。本研究解析了独脚金内酯对水稻多种代谢途径的调控作用,揭示了IPA1在独脚金内酯调控氮素代谢等途径的作用机制,并提供了独脚金内酯参与水稻免疫的新见解,也为水稻遗传改良奠定了理论基础。
关键词: 水稻 ；独脚金内酯 ；代谢组 ；转录组 ；氮素代谢
摘要： 茶尺蠖作为茶园重要食叶害虫,其发生世代数多、繁殖快、容易暴发成灾,严重影响着茶树正常生长发育、茶叶的产量和品质。选育抗茶尺蠖的茶树品种可以从根本上解决茶尺蠖取食为害的问题。本研究通过对茶树叶片表型结构观察和叶片对茶尺蠖幼虫生长发育的影响,选取‘上梅州’作为抗虫品种（RG）和‘平阳特早茶’作为感虫品种（SG）进行虫害后茶树转录组测序和代谢产物分析,探究抗性品种对茶尺蠖产生抗性的分子机制,挖掘茶树关键抗性基因和次生代谢物,并对关键抗性基因家族进行生物信息学分析和表达模式分析,克隆了关键抗性基因并对其进行烟草的遗传转化。主要研究结果如下:1.通过观察‘上梅州’（MZ）、‘碧云’（BY）、‘龙井长叶’（LC）、‘九龙茶’（GL）、‘蓝山苦茶单株’（LS）、‘龙井43’（LJ）、‘白毫早’（BH）、‘茴香茶’（HX）、‘大方贡茶’（DF）、‘福云六号’（FY）、‘浙农113’（ZN）、‘平阳特早茶’（PY）这12个茶树品种叶片的内部结构,MZ、BH、HX、DF、GL、ZN这六种茶树叶片具有2～3层紧密排列的栅栏组织,而PY、FY、LC、LJ、LS、BY这六种茶树的栅栏组织有2层细胞组成,且排列松散。12种茶树叶片喂养茶尺蠖幼虫,发现幼虫对MZ、BY、DF和HX这五个品种的取食量明显少于PY,且幼虫增重量和取食量呈正相关。MZ叶片喂养的幼虫体重最轻,体积最小;PY叶片喂养的幼虫体积最大,生长状况最好。GL、PY品种的幼虫化蛹数比较高,HX、BY和MZ品种的幼虫化蛹数较低。在取食选择试验中,1龄幼虫对MZ和LJ有很大的选择性;2龄幼虫对MZ和FY具有较大的取食倾向性;3龄幼虫对LS、GL和HX具有倾向性,对MZ倾向性较小。幼虫对MZ的选择随着龄期的增加变小,对PY的取食选择随着龄期增加变化幅度不大。计算幼虫的取食选择指数,发现PY的取食选择指数最大,MZ的取食选择指数小于PY。因此,综合叶片解剖结构、幼虫食叶量和虫增重、幼虫取食选择和取食选择指数、以及化蛹数和死亡数,选取‘上梅州’（MZ）作为抗虫品种（RG）和‘平阳特早茶’（PY）作为感虫品种（SG）进行后续的研究分析。2.通过对茶尺蠖为害后的RG和SG代谢产物进行分析,分别找到了75和74个差异表达代谢物。这些代谢物主要包括类黄酮、氨基酸及其衍生物、脂肪酸、核酸及其衍生物。相较于对照植株,虫害后的茶树植株中类黄酮代谢途径活跃且代谢物含量增加。表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）和儿茶素（C）在RG中水平显著增加,同时山奈酚、花翠素、槲皮素、原花色素和原花青素在SG中水平显著增加;茉莉酸（JA）作为植物响应害虫侵害的重要植物激素,在RG中被大量诱导合成,而在SG中只有茉莉酸的羟基化衍生物被发现;虫害后,RG代谢中果糖的水平受到了显著抑制,而在SG中果糖含量呈极显著增加;RG中水杨酸（SA）含量很低,而在SG中SA被显著诱导合成。在差异代谢物富集代谢通路中,RG和SG的差异代谢物主要参与了类黄酮生物合成途径和苯丙烷类生物合成途径,可见这两个途径在茶树抗茶尺蠖反应中起着重要作用。3.RG和SG的对照处理和虫害处理的挥发物种类和释放量存在差异。茶尺蠖幼虫取食为害后,RG和SG的两个处理中挥发物的种类和释放量变多变大,其中β-Myrcene、E-3,7-dimethyl-1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol、α-Cyclopentene、α-Farnesene、Squalene、（2Z）-2-Pentenyl acetate、4-Methyl tetradecane等萜烯类化合物和（E）-2-Hexenal、（E）-3-Hexen-1-ol、（Z）-2-Hexen-1-ol脂肪酸类衍生物的释放量显著增加。虫害后的植株中,β-Myrcene、E-3,7-dimethyl-1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol、α-Cyclopentene、α-Farnesene、Squalene、（2Z）-2-Pentenyl acetate、4-Methyl tetradecane、（E）-2-Hexenal、（E）-3-Hexen-1-ol、（Z）-2-Hexen-1-ol的释放量RG要多于SG,且差异显著。其中,α-Farnesene、Squalene、（E）-3-Hexen-1-ol、（Z）-2-Hexen-1-ol等萜烯类化合物和脂肪酸类衍生物在虫害后的RG植株中释放量显著增加。4.本研究利用Illumina HiSeq2500测序平台对虫害后RG和SG的六个文库（CsP1、CsP2、CsP3、CsM1、CsM2和CsM3）进行测序,共得到了704,798,092条高质量的reads,获得了342961个unigenes,它们的长度介于201～15022 bp,平均长度594bp,N50长度为834 bp。注释到的unigenes有18456条,占所有unigenes的5.38%。93667（27.31%）条unigenes被成功进行了GO注释;51793（15.1%）条unigenes被注释到了KOG的26个类群中。获得14260条差异表达基因（padj<0.05）,其中7587条表达上调基因,6673条表达下调基因。茶尺蠖为害后,RG中的碳水化合物（淀粉和蔗糖,果糖和甘露糖）代谢和氨基酸（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐,半胱氨酸和蛋氨酸）代谢都比SG中活跃。另一方面,在RG中与类苯丙烷（二萜、类倍半萜和三萜类化合物生物合成）相关的代谢途径都很活跃且代谢物含量升高。相较于SG,RG的茉莉酸合成途径基因FAD7A-1、LOX2.1和JMT的表达量都很高;参与类黄酮生物合成途径的酚类和花青素生物合成的限速酶,PAL和LDOX在RG中表达量升高。另外,催化萜烯类化合物合成的关键酶类,萜烯合酶基因（TPS03、TPS04和TPS21）在RG中的表达量同样上升。7587条上调表达基因主要和脂类修饰、细胞表面受体信号通路、木质部发育和转运（离子跨膜转运、碳水化合物转运和修饰氨基酸转运）有关,同时也参与了磷酸化作用、代谢进程（己糖、氧化还原辅酶、木质素、类苯丙烷和类异戊二烯代谢）、防御反应（气孔关闭调节、对植食性昆虫防御反应和对其他生物的防御反应）和植物激素信号传导（脱落酸、细胞分裂素和茉莉酸）。蛋白互作网络分析中,997条基因成功映射到了拟南芥上,其中59个TFs和44个PKs被发现分别与894个节点和24294个边缘关联紧密。蛋白网络分析发现6个TFs（MYB308/108、WRKY41/75、NAC062、和MYC4）与61个其它基因相互作用紧密,33个PKs（LRR-RLK、Ser/Thr kinase、CDPK、和MAPK家族）和271个其它基因相互作用紧密。5.从茶树各个组织的转录组中,筛选得到149条NBS编码序列。这些NBS蛋白序列又被分为7个种类CC-NBS-LRR（52）、TIR-NBS-LRR（3）、CC-NBS（25）、TIRNBS（3）、NBS（20）、NBS-LRR（40）和RPW8-NBS（6）。经过生物信息学分析和基因表达量分析,选取Cs4100（CsNBS-1）和CS187031（CsNBS-2）进行全长克隆和烟草的遗传转化。6.CsNBS-1和CsNBS-2基因序列全长分别是3696 bp和3718 bp,都属于CNL类型,ORF区域分别长2748 bp和2706 bp,分别编码915和901个氨基酸。采用农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化,一共得到41株卡纳霉素抗性的阳性植株。
关键词: 茶树 ；茶尺蠖 ；转录组 ；代谢组 ；HIPVs ；NBS类抗性基因 ；转基因
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摘要： 附子（Aconiti lateralis radix.Praeparata.）为毛茛科乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根,因其附生于母根乌头之上,如子附母,故名附子,收录于《神农本草经》中。基于寒湿致病者适用的原则,对于阳气衰微导致体内寒邪滋生的状况,以及诸如剧烈汗出、重度喘息、突发性中风等急症,均需依赖附子以实现病情逆转。附子有大毒,主要有毒成分乌头类生物碱,能够影响心脏功能及中枢神经系统等,造成机体严重损伤,入药内服,须炮制以减毒。《本草纲目》记载蜂蜜具有解毒,润燥,以及调和百药之功效,蜂蜜减中药之毒在民间已有千年历史。民间常把附子与蜂蜜配伍服用,以减其毒,但尚缺乏标准化的蜂蜜炮制附子的工艺,且对蜂蜜炮制生附子后其毒性物质分布的改变、毒性评价及毒理机制研究较少。因此,本文以蜜附子为研究对象,利用LC-MS分析技术对其乌头类生物碱化学成分进行系统剖析,在此基础上,通过UPLC-DAD建立多指标毒效成分的含量测定方法,对其进行全面质量评价,并结合急性和长期毒性实验相关生化指标评价其毒性。基于老年阳虚证小鼠模型,利用LC-MS代谢组学研究平台揭示蜜附子的减毒机制。以下是本研究的核心内容: 1.通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱（UPLC-Q-Orbitrap-MS）技术,结合自建附子属植物乌头类生物碱化学成分数据库及以及mzcloud在线资源数据库,建立了快速且全面的分析方法,用于解析附子药材的化学组分及其代谢轮廓特征。通过比对化合物的保留时间、精确分子量以及MS/MS碎片离子信息,共初步鉴定出70个生物碱类成分,包括12个双酯型二萜生物碱（DDAs）,20个单酯型二萜生物碱（MDAs）,37个醇胺型二萜生物碱（ADAs）和1个其他类生物碱。并对生物碱的二级质谱裂解规律进行解析和归纳。同时,通过使用超高效液相色谱-二极管阵列检测技术（UPLC-DAD）,建立了一种快速定量分析方法,用于测定附子中六种主要的毒性和功效成分。应用此方法,对生附子及其经过蜂蜜处理的不同煎煮时间样品进行了成分含量的比较分析,结果表明:蜂蜜能够有效降低附子毒性成分,经蜂蜜煎煮后毒性大的DDAs成分含量降低,并转化为毒性较小的MDAs。 2.采用急性毒性实验对附子生品及蜂蜜炮制品的毒性进行评价。根据毒效乌头类生物碱成分含量实验结果,选择毒性相对较小的煎煮60 min的生附子和蜜附子水煎液。结果显示生附子水煎液半数致死量(LD50)为51.78 g生药/kg,蜜附子水煎液最大给药量（MFD）为80 g生药/kg,并通过毒性症状、体重、脏器系数及病理学切片结果从表观上可知经蜜制后毒性显著降低;随后运用自然衰老的小鼠作为阳虚生物模型,进行蜂蜜减毒机制研究。生化指标血清雌二醇（E2）、睾酮（T）、环磷酸腺苷（c AMP）、环磷酸鸟苷（c GMP）水平结果显示实验小鼠造模成功,并初步证明了老年小鼠具有阳虚病症。不同分组水煎液对老年阳虚小鼠的长期毒性通过毒性症状、体重、脏器系数及组织病理学切片初步分析,并从生化指标肌酸激酶（CK）、肌钙蛋白（c Tn T）和三磷酸腺苷（ATP）进一步探讨并验证。结果显示,与MO组相比低剂量蜜附子组没有明显统计学差异,蜜附子中剂量组和生附子低剂量组表现为较轻微毒性,而蜜附子高剂量组和生附子中剂量组显示有显著毒性。 3.基于老年阳虚小鼠模型结合代谢组学技术对蜂蜜缓解附子毒性机制进行研究。基于UPLC-Q-Orbitrap-MS技术的代谢组学平台,对生附子水煎液处理前后的阳虚小鼠的内源性极性代谢物进行轮廓分析,利用OPLS-DA模型筛选与毒性相关的潜在生物标志物,对差异性代谢物进行KEGG通路富集分析,并绘制相关的代谢通路。共筛选到51种可作为毒性潜在生物标志物的差异积累代谢产物,主要包括氨基酸、有机酸、脂肪酸及胆汁酸类,重点涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、三羧酸循环、脂肪酸代谢等代谢通路。生附子可通过干预以上代谢途径,使大部分代谢物与模型组水平产生差异,蜜附子对这些代谢物均有显著回调作用,涉及脂质过氧化、氧化应激,炎症反应相关。从代谢组学层面对蜜附子缓解阳虚证的毒性机制进行初步阐述,深入探讨蜂蜜缓解附子毒性机制,同时为蜜附子产品的开发提供理论依据。 本文旨在为蜂蜜减轻附子毒性提供理论依据,为开发附子炮制品提供新思路。
关键词: 生附子 ；蜜附子 ；乌头类生物碱 ；代谢组学 ；液质联用 ；阳虚证
摘要： 微生物种类极其繁多，代谢途径多样，其代谢产物具有化学结构新颖、结构种类丰富多样、生物活性广泛、成药性好的特点，是寻找药用先导化合物极其重要的资源宝库。时至今日，人们仍然不断从微生物特别是丝状真菌的代谢产物中发现结构新颖的化合物，这些结构独特的代谢产物为新药研发提供了持续稳定的物质基础。为了寻找结构骨架新颖、生物活性良好的药物先导物，本研究以土壤真菌为研究对象，开展次级代谢产物的化学成分及生物活性研究，其主要内容包括：目的菌株的筛选和鉴定、代谢产物的分离和结构鉴定、单体化合物的活性筛选评价研究。 目的：从土壤真菌代谢产物中发现结构骨架新颖、生物活性良好的次级代谢产物，为微生物创新药物研发奠定物质基础。 方法： 1．利用分离自湖北神农架、北京五虎台长城及云南鸡足山土壤样品的10株真菌小规模发酵的次级代谢产物进行蛋白酪氨酸磷酸化酶（PTPs）活性抑制实验及人源肿瘤抗增殖实验进行活性筛选，结合HPLC-PDA化学筛选，确定了次级代谢产物丰富、生物活性良好、浸膏提取率较高的三株真菌F01ZB1707、NCC3968、NCC2294作为本课题的研究对象。利用传统菌株鉴定方法及现代分子生物学技术将3株目标菌株初步鉴定为曲霉Aspergillusgorakhpurensis、焦曲霉Aspergillusustus和球孢木生红曲霉Xylogonesphaerospora。对三株真菌进行大规模发酵及次级代谢产物的系统分离并对部分单体化合物进行了体外生物活性评价。 2．采用有机溶剂分级萃取的方法对三株真菌的大规模发酵培养物进行粗提取。采用一系列色谱分离技术如硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱、反相中压柱色谱以及制备高效液相色谱对三个粗提取物的化学成分进行系统分离，得到单体化合物。综合应用现代光谱学和波谱学技术(IR、UV、LC-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、NOESY、OR、ECD、量子化学计算等)来鉴定化合物的结构。 3．对部分次级代谢产物单体化合物利用PTPs模型和4种人源肿瘤细胞进行体外活性评价。其中PTPs抑制活性采用比色法，肿瘤细胞增殖抑制活性测定采用MTT法。 结果：1.三株目标真菌F07ZB1707、NCC3968和NCC2294初步鉴定为曲霉Aspergillusgorakhpurensis、焦曲霉Aspergillusustus和球孢木生红曲霉Xylogonesphaerospora。 2.从三株土壤真菌发酵提取物中分离得到了81个单体化合物（含22个新化合物）并全部阐明了结构，其中包括6个甾体（1,3,7,8,74,75）、6个四环三萜（2,4-6,14,15）、1个二萜（32）、3个蒽醌（23,31,53）、10个生物碱（含4个二酮哌嗪类(10,57,60,69)、2个吲哚类(71,77)、2个酰胺类生物碱（19,20,80,81）、2个杂环生物碱（80,81）），8个常见苯环衍生物、1个大环内酯类衍生物、4个不饱和脂肪酸、4个不饱和脂肪酸甘油酯、1个丁二酸甲酯、33个芳香聚酮类衍生物（含5个山酮、24个色原酮衍生物）及源自真菌固体培养基中的4个异黄酮类化合物。本研究共发现22个新化合物（包含1个甾醇、4个萜类、4个生物碱、2个山酮、11个聚酮类），这些新化合物的发现进一步丰富了土壤真菌代谢产物库，为寻找药物先导化合物奠定了物质基础。81个单体化合物具体鉴定结果如下：(22E)-5α,8α-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(1)、Lanosterol(2)、Ergosta-5,7,22-triene-3β-ol(3)、23,24,25,26,27-Pentanorlanost-8-en-3β,22-diol(4)、Euphol(5)、AspergorakhinB(6*)、24-Ethyl-5α-cholest-ane-3β,5,6β-triol(7)、AspergorakhinA(8*)、Vanillicacid(9)、cyclo-(L-Try-L-Pro)(10)、AspergorakhinK(11*)、(7S)-2-(Hydroxymethyl)-3-(1-hydroxypr-opyl)phenol(12)、(2S)-7-Hydroxy-2-(2-hydroxypropyl)-5-methylchromone(13)、AspergorakhinC(14*)、AspergorakhinD(15*)、Dibutylphthalate(16)、3-(2,6-Dihydroxyphenyl)-4-hydroxy-6-methylisobenzofuran-1(3H)-one(17)、AspergorakhinI(18*)、AspergorakhinM(19*)、AspergorakhinN(20*)、AspergorakhinL(21*)、LeptosphaerinD(22)、Isorhodoptilometrin(23)、AspergorakhinO(24*)、MangrovamideK(25)、MangrovamideJ(26)、AspergorakhinF(27)、AspergorakhinH(28*)、AspergorakhinJ(29*)、AspergorakhinG(30*)、DemethylmacrosporineI(31)、AspergorakhinP(32*)、Syringicacid(33)、2,4-Dichlorobenzoicacid(34)、1-(4-Hydroxyph-enyl)-3-methoxypropan-1-one(35)、Fidaxomicin(36)、(8E,10E)-12-hydroxy-7-oxo-8,10-octadecadienoicacid(37)、8-Hydroxy-(9Z,12Z)-octadecadienoicacid(38)、Linoleicacid(39)、(R)-2,3-Dihydroxypropyl-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate(40)、(S)-2,3-Dihydroxypropyl-(9Z,12Z)-Octadeca-9,12-dienoat-e(41)、AspergorakhinE(42*)、5-Hydroxymethyl-furaldehyde(43)、(R)-6-Hydroxymellein(44)、(3R)-Methoxy-6,8-dihydroxy-3-methyl-3,4-di-hydroisocoumarin(45)、5-Dimethyl-7-hydroxychromone(46*)、4-Hydroxy-5-propionyl-1,3-di-O-methylpyrogallol(47)、XylogosphinA(48*)、XylogosphinB(49*)、Nectriapyrone(50)、4,8-Dihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one(51)、XylogosphinC(52*)、Emodin(53)、3(ζ)-Hydroxy-octadeca-4(E),6(Z),15(Z)-trienoicacid(54*)、(2S)-α-(9′Z,12′Z,15′Z)-Octadecatrienoicacidmonoglyceride(55*)、(2S)-1-Linoleoylglycerol(56)、cyclo(S-Pro-S-Leu)(57)、Lachnumfuran(58*)、Bis(2-ethylhexyl)phthalate(59)、cyclo(R-Pro-R-Phe)(60)、(3R,4S)-(+)-5-Chloro-4,6,8-trihydroxybenzopyranl-one(61)、Genistein(62)、XylogosphinD(63*)、Genitein(64)、Piceol(65)、Daidzein(66)、5-Methoxydaidzein(67)、Methylhydrogensuccinate(68*)、cyclo(Pro-Pro)(69)、3-Methoxy-2-methyl-4H-pyran-4-one(70)、(1H-Indol-3-yl)oxoacetamide(71)、5-(Undeca-3'',5'',7''-trien-1''-yl)furan-2-ol(72)、CarnemycinE(73)、(22E)-5a,8a-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(74)、5α,8α-Epidioxy-23-methyl-(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β-ol(75)、CarnemycinB(76)、(2S)-3,3-Bis(3''-indolyl)propane-1,2-diol(77)、Pyrolin(78*)、Apocynin(79)、AspergustinA(80*)、AspergustinB(81*)。 3.抗肿瘤活性筛选发现2个化合物(6,8)对4种人源肿瘤细胞株具有增殖抑制活性，甾体类化合物8对4种肿瘤细胞具有中等的抗增殖活性，尤其是对人源肺癌肿瘤细胞A549表现出明显的抗增殖活性，其IC50值为6.75μM;化合物6对HeLa、A549肿瘤细胞表现出较弱的抗增殖活性，IC50值范围为61.9-83.4μM。 4.蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)体外抑制活性的筛选中发现化合物8对PTP1B及SHP1表现出非常强的抑制活性，其IC50值分别为0.57,1.19μM，其活性分别约为阳性对照Na3VO4的2倍和3.7倍;化合物8对CathepsinB同样表现出良好的抑制活性，IC50值为8.18μM，其活性略逊于阳性对照亮肽素;化合物6对SHP1及TCPTP表现出明显的抑制活性，其IC50值分别为6.18μM和7.50μM。化合物11对PTP1B表现出一定的选择性抑制活性，其IC50值为12.06μM，但对其他3种PTPs及CathepsinB，没有表现出明显的抑制活性。不饱和脂肪酸甘油酯类化合物56对PTP1B表现出良好的选择性抑制活性，其IC50值为10.55μM，而对其他三种PTPs的抑制活性很弱，IC50值范围在42.23-94.55μM。化合物72对CD45表现出良好的选择性抑制活性，其IC50值达到5.13μM，而对其他三种PTPs活性明显降低，IC50值范围在33.37-111.16μM。化合物78对TCPTP表现出良好的选择性抑制活性，其IC50值可达0.56μM，对PTP1B、SHP1的IC50值分别为16.01，12.08μM，而对CD45没有表现出抑制活性。对羟基苯乙酮类化合物79仅对SHP1表现出较强的抑制活性，其IC50值分别为21.59μM，而对其他三种酶并没有表现出抑制活性。 结论： 本研究以三株土壤真菌为研究对象，对其发酵提取物进行了系统的化学成分研究和部分单体化合物的生物活性评价，共分离并鉴定了81个单体化合物，包含22个新化合物，分别为1个甾醇（8）、4个萜类（6,14,15,32）、4个生物碱（19,20,80,81）、2个山酮（21,24）、11个聚酮类衍生物（11,18,27-30,42,48,49,52,63），这些新化合物的发现，进一步丰富了土壤真菌的代谢产物库，为寻找药物先导化合物奠定了物质基础。生物活性评价发现化合物8对人源肺癌肿瘤细胞A549表现出明显的抗增殖活性，并且对PTP1B及SHP1表现出极强的抑制活性，其IC50值分别为0.57,1.19μM,具有成为PTP抑制剂先导化合物的潜力。发现了4个具有PTPs选择性抑制活性的化合物（56,72,78,79），不饱和脂肪酸甘油酯类化合物56对PTP1B表现出良好的选择性抑制活性，具有开发为PTP1B选择性抑制剂的潜力，本研究首次发现这类化合物可以作为PTP1B酶抑制剂先导化合物。
关键词: 土壤真菌 ；次级代谢产物 ；化学成分 ；生物活性
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