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摘要： 通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺反应将透明质酸(hyaluronic acid,HA)和4-羧丁基三苯基溴化膦((4-carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide,TPP)分子连接到聚乙二醇-氨基(PEG-NH_(2))修饰过的黑色素纳米颗粒(melanin nanoparticles,MNP)表面,设计合成了一种具有双靶向能力的黑色素纳米颗粒(MNP-TPP-HA),赋予了黑色素的双靶向能力。体外三维(3D)多细胞肿瘤球荧光成像和活体肿瘤光声成像实验表明MNP-TPP-HA具有优异的肿瘤靶向穿透能力。
关键词: 双靶向 ；黑色素 ；光声成像 ；穿透能力
被引量
1
摘要： 目的:NIR-Ⅱ FI（1000-1700 nm）能够提供更深的组织穿透能力（?10 mm）,更高的信噪比和更好的时空分辨率。光声成像是近年来一种新兴的无创成像手段,整合了传统光学成像卓越对比度和超声成像高时空分辨率的优势。NIR-Ⅱ FI和PAI相结合为开发用于临床疾病成像、靶向治疗、疗效评估以及预后监测等的多模态探针提供了新策略。黑色素是一种广泛存在于人体的内源性色素,具有生物相容性好、可降解、化学结构易于修饰、光保护作用、金属离子螯和能力以及抗氧化等特性,因此广泛应用于包括生物成像、光热治疗、生物传感、诊疗一体化、抗感染和组织工程等生物医学领域中。本研究的目的是利用NIR-Ⅱ小分子荧光染料对人体内源性黑色素纳米颗粒（MNPs）进行标记,构建一种新型生物相容性好,且集NIR-Ⅱ荧光成像、光声成像和光热治疗于一体的多功能纳米探针MNPH2,首先对该纳米探针的基本表征和性能进行研究,随后探索其作为一种双模态造影剂及诊疗一体化制剂在干细胞示踪与肿瘤诊疗中的应用。方法:1.NIR-Ⅱ小分子荧光染料H2标记仿生黑色素纳米颗粒,构建多功能纳米探针MNPH2,并对其基本表征和性能进行研究。1.1利用仿生MNPs与NIR-Ⅱ荧光小分子染料H2化学反应获得MNPH2多功能纳米探针。1.2对MNPH2的TEM、FT-IR、稳定性、DLS、Zeta电位以及UV-Vis-NIR光吸收波谱等基本表征进行研究。1.3研究MNPH2的体外NIR-Ⅱ荧光成像、PA成像和光热转化性能。1.4通过体外溶血实验和大剂量活体注射对MNPH2的生物安全性进行评估。2.MNPH2标记hUMSCs后活体内长期NIR-Ⅱ FI/PAI双模态示踪并实现治疗急性肝损伤过程的可视化和疗效评估。2.1 CLSM、NIR-Ⅱ荧光显微镜和FCM分析hUMSCs对MNPH2的摄取能力（即MNPH2体外标记hUMSCs的能力）。2.2 CCK-8实验分析MNPH2对hUMSCs增殖活性的影响,成骨、成脂诱导分化实验分析MNPH2对hUMSCs分化能力的影响。2.3对MNPH2标记的hUMSCs行体外NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像。2.4 MNPH2标记的hUMSCs经皮下注射移植入活体后长期行NIR-Ⅱ FI/PAI双模态示踪观察。2.5 MNPH2标记的hUMSCs经静脉注射移植入急性肝损伤小鼠后行可视化治疗和疗效评估。3.MNPH2对喉癌行NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导光热治疗的诊疗一体化研究。3.1 CCK-8实验评估MNPH2对Hep-2细胞的增殖活性影响,NIR-Ⅱ荧光显微镜和CLSM观察Hep-2细胞对MNPH2的摄取能力,Calcein-AM/PI活死细胞双染分析MNPH2对Hep-2细胞的光热毒性。3.2构建喉癌活体肿瘤模型,并对其进行活体NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像。3.3评估荷喉癌裸鼠在NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导下肿瘤光热治疗的效果。结果:1.通过简单的一步法合成了具有良好生物相容性、NIR-Ⅱ FI和PAI以及光热转化性能的多功能纳米探针MNPH2。1.1 H2末端具有-COOH,在EDC/NHS的催化作用下与MNP-PEG末端的-NH2发生脱水缩合,形成酰胺键后连接起来,且每个MNP-PEG分子能够结合22个H2分子。1.2 MNPH2具有良好的水溶性和生理稳定性;TEM图像中MNPH2颗粒呈类圆形,大小一致,分布比较均匀;MNPH2的FT-IR光谱图中有酰胺键的吸收峰存在,证明了MNP-PEG与H2成功连接;MNPH2的水合粒径为33 nm,zeta电位为-13.3m V;UV-Vis-NIR吸收光谱显示MNPH2在近红外区有特征吸收峰,波峰位置处于768 nm。1.3 MNPH2具有良好的NIR-Ⅱ荧光和PA成像性能,且荧光信号和光声信号均随溶液浓度的增高逐渐增强,两者具有良好的相关性;MNPH2还显示出优良的光热转化效率和光热稳定性。1.4溶血实验结果表明MNPH2不会引发红细胞破碎导致溶血;大剂量MNPH2注射入小鼠活体后无明显的肝肾功能异常发生,且主要脏器的HE染色无异常病理学改变。2.MNPH2作为NIR-Ⅱ FI和PAI探针,实现活体内对hUMSCs的长期双模态示踪,以及hUMSCs治疗小鼠急性肝损伤过程的可视化和疗效评估。2.1 CLSM和NIR-Ⅱ荧光显微镜结果证明hUMSCs能通过简单的共培养方式将MNPH2颗粒摄取入细胞质内;FCM定量分析结果表明共培养4小时后,hUMSCs对MNPH2的摄取能力高达98.57%。2.2 CCK-8结果表明当MNPH2的浓度低于800μg/m L时,不会影响hUMSCs的增殖活性;成骨、成脂诱导分化实验证明hUMSCs经MNPH2标记后并不会影响其分化潜能。2.3 MNPH2成功标记hUMSCs后能够实现细胞在体外的NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像,且细胞数量越多,信号越强。2.4 MNPH2体外标记的hUMSCs经皮下注射移植入小鼠活体后,移植部位会发出NIR-Ⅱ荧光和PA信号,且信号随时间延长而逐渐减弱,至示踪第21天基本消失。2.5 MNPH2标记的hUMSCs经静脉注射移植入急性肝损伤小鼠后,NIR-Ⅱ FI和PAI都表明绝大多数细胞定植于损伤的肝脏组织内,并于注射后6小时细胞数量最多;NIR-Ⅱ FI也表明部分hUMSCs可经由肝-肠轴代谢排出体外。治疗过程中小鼠体重、血清学和组织病理学指标均表明hUMSCs能对小鼠急性肝损伤疾病发挥良好的治疗效果,且非瞬时作用。3.MNPH2作为诊疗一体化制剂用于活体喉癌的NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导的光热治疗。3.1 CCK-8结果表明MNPH2不会对Hep-2细胞的增殖活性产生影响;但若加以激光照射,MNPH2会释放热能杀伤细胞,导致细胞活性大幅度下降,且MNPH2孵育浓度越高,细胞活性越低;NIR-Ⅱ荧光显微镜和CLSM荧光图片表明Hep-2与MNPH2共孵育后会发生摄取;Calcein-AM/PI活死细胞双染从细胞层面再次证实MNPH2通过光热转化效应产生的热量足以杀死Hep-2细胞。3.2喉癌活体NIR-Ⅱ FI和PAI表明MNPH2经尾静脉注射后肿瘤被逐渐“点亮”,肿瘤组织的NIR-Ⅱ荧光和PA信号随时间延长而逐渐增强,于注射后8小时达到峰值,随后逐渐减弱。荷瘤小鼠主要脏器和肿瘤组织的NIR-Ⅱ FI图像表明MNPH2主要通过肝肠代谢排出体外。3.3在NIR-Ⅱ FI和PAI引导下对喉癌进行近红外激光照射,肿瘤局部温度升高至59.2℃,达到了杀伤肿瘤细胞的效果;对荷瘤小鼠的体重、肿瘤体积及肿瘤组织的HE染色分析表明MNPH2具有良好的光热治疗肿瘤的效果,且无副作用产生。结论:本研究以仿生型黑色素纳米颗粒为基础,通过一步法合成了集NIR-Ⅱ FI和PAI以及PTT治疗为一体的多功能纳米探针MNPH2。该探针具有以下优势:1)良好的水溶性和生理稳定性;2)优异的近红外光吸收特性;3)良好的生物安全性;4)NIR-Ⅱ荧光和PA成像性能;5)较高的光热转化效率和光热稳定性。该纳米探针实现了长期活体示踪皮下移植hUMSCs和治疗小鼠急性肝损伤的可视化,同时还能够实时无创动态监测活体肿瘤,在NIR-Ⅱ FI和PA双模态成像的引导下进行喉癌光热治疗。总之,MNPH2既可用于干细胞示踪和再生医学,又能用于肿瘤的诊疗一体化。本项研究进一步推动了以黑色素为核心的多功能纳米探针在生物医学领域应用的节奏,为其潜在的临床转化做准备。
关键词: NIR-Ⅱ荧光染料 ；黑色素 ；NIR-Ⅱ荧光/PA双模态成像 ；干细胞示踪 ；肿瘤诊疗一体化
被引量
5
摘要： 第一部分纳米粒制备、基本表征及靶向性考察目的制备一种叶酸靶向载黑色素/血卟啉单甲醚的PLGA纳米粒(folate targeted PLGA loaded melanin/hematoporphyrin monomethyl ether nanoparticles,FHMP NPs),考察其基本特性,并观察其对乳腺癌MDA-MB-231细胞的靶向性。方法1.纳米粒的制备及基本表征:采用双乳化法分别制备FHMP NPs、叶酸靶向载血卟啉单甲醚PLGA纳米粒(folate targeted PLGA loaded hematoporphyrin monomethyl ether nanoparticles,FHP NPs)、叶酸靶向载黑色素PLGA纳米粒(folate targeted PLGA loaded hematoporphyrin monomethyl ether nanoparticles,FMP NPs),在光镜、电镜下观察其形态,通过马尔文粒径仪检测其粒径、电位;采用紫外分光光度法检测纳米粒中黑色素(melanin,MNPs)及血卟啉单甲醚(Hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)含量,并计算包封率和载药量;将FHMP NPs分散放置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)一周,每天测量其粒径变化。2.细胞靶向性:将FHMP NPs分别和叶酸(folate,FA)受体阳性表达细胞MDA-MB-231及FA受体阴性表达细胞A-549共孵育1 h、2 h和3 h后,在激光共聚焦显微镜下观察其细胞靶向效果。同时,将靶向FHMP NPs及非靶向HMP NPs分别与MDA-MB-231细胞孵育3 h后,在激光共聚焦显微镜下观察两种纳米粒对细胞的靶向效果。结果1.基本表征:FHMP NPs在光学显微镜下观察呈点状小颗粒,扫描电镜和透射电镜下观察,呈球形,大小均一、形态规则。马尔文粒径仪测得FHMP NPs、FHP NPs及FMP NPs的粒径分别为310.3±10.6 nm,266.1±2.4 nm和270.1±4.9nm,Zeta电位分别为-23.03±1.33 mV,-21.2±0.8 mV和-21.4±1.7 mV。血卟啉单甲醚的包封率为80.13±4.81%,载药量为3.08±6.29%。黑色素包封率为47.72±4.26%,载药量为1.83±3.69%。FHMP NPs分散于PBS和FBS一周后粒径并无明显改变。2.细胞靶向效果:在MAD-MB-231细胞周围可见大量纳米颗粒,而A-549细胞周围没有明显纳米粒聚集。非靶向HMP NPs与MDA-MB-231细胞共孵育3h后仅有少数纳米颗粒聚集于细胞周围。结论本研究成功制备出叶酸靶向纳米粒(FHMP NPs),该纳米粒对MD-MB-231有特异性靶向功能。第二部分纳米粒生物安全性评价及体内分布目的评估FHMP NPs的体内外安全性,并观察FHMP NPs在乳腺癌移植瘤裸鼠的体内靶向分布情况。方法1.生物安全性评价:将不同浓度FHMP NPs(0.25,0.5,0.75,1mg/m L)分别与细胞孵育3 h、6 h、24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;将健康BALB/C小鼠随机分成空白对照组(静脉注射200μL生理盐水)和FHMP NPs组(静脉注射200μLFHMP NPs,10 mg/m L),分别在给药1 h、6 h,24 h,48 h后处死小鼠,收集其血液标本做血常规和血液生化检测。其血常规主要包括:白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、平均红细胞体积(MCV)、血小板(PLT);血生化包括:谷氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。2.体内分布:建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,通过尾静脉分别注射Di R标记的FHMP NPs、HMP NPs、游离叶酸+FHMP NPs(叶酸拮抗组),在不同时间点(注射前,0.5 h,2h,4 h,6 h,24 h)观察裸鼠活体荧光分布情况,并采集荧光图像,然后以成像系统软件测量肿瘤区域荧光信号值。24 h后,处死裸鼠,剥取肿瘤瘤块和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾),并进行离体组织荧光成像,比较不同脏器与瘤块的相对荧光信号值。此外,通过尾静脉分别注射Di I标记的FHMP NPs和HMP NPs,24 h后,剥离瘤块做冰冻切片,在显微镜下观察两种纳米粒在肿瘤区域的分布情况。结果1.生物安全性评价:FHMP NPs与MDA-MB-231细胞孵育后,各个浓度各个时间点细胞存活率没有明显降低,各组之间差异没有统计学差异。注射FHMP NPs后的BALB/C小鼠与正常对照组小鼠的血液学检测指标无显著性差异。2.体内分布:荷瘤小鼠活体荧光实验发现,FHMP NPs组纳米粒可靶向分布于肿瘤区域,该组肿瘤部位荧光信号显著高于HMP NPs组和叶酸拮抗组,且其荧光信号值在注射纳米粒2 h后达到峰值。离体荧光成像证实,FHMP NPs主要分布于裸鼠肝脏、脾脏和肿瘤区域。冰冻切片结果显示,FHMP NPs组在注射2h后可在肿瘤区域观测到大量红色荧光纳米粒富集,随着时间的延长,纳米粒富集量越少。而在注射非靶向纳米粒HMP NPs后,在2 h可观测到微量纳米粒分布于肿瘤部位,24 h后无纳米粒分布。结论FHMP NPs具有良好的体内外安全性,并可靶向富集于肿瘤部位。第三部分纳米粒增强光声成像及声动力治疗研究目的观察纳米粒增强光声成像及其声动力治疗效果,并研究其相关作用机制。方法1.体内外光声成像配置不同浓度FHMP NPs纳米粒,以光声成像采集该纳米粒在不同激发波长(680-930 nm)下的光声图像并测量其光声信号值,确定最佳的激发波长。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型并将荷瘤鼠随机分为三组:FHMP NPs、HMP NPs和游离叶酸+FHMP NPs组,经尾静脉注射上述三种纳米粒,采集肿瘤区域不同时间点的光声成像图,定量分析各组光声信号强度值。2.体外声动力治疗2.1超声辐照纳米粒生成ROS检测实验分组:生理盐水对照组(Control组),单独超声组(US),FMP NPs+US组,单独FHMP NPs组,FHMP NPs+US组。超声辐照上述纳米粒后通过DPBF法检测其ROS生成。通过单线态氧探针(singlet oxygen sensor green,SOSG)检测FHMP NPs在超声辐照后不同时间产生的ROS。2.2细胞水平上的ROS检测将MDA-MB-231细胞分为以下组,(1)Control组(空白对照组),(2)US组,(3)FMP NPs+US组,(4)FHMP NPs组,(5)HMP NPs+US组,(6)FHMP NPs+NAC+US组,(7)FHMP NPs+US组。上述各组细胞与2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)孵育后进行超声辐照,通过激光共聚焦显微镜观察活性氧产生情况。2.3靶向纳米粒稳定性检测利用DPBF探针比较FHMP NPs在光声激光仪(PA laser)照射前后ROS产量的变化。实验分组为:Control组、FHMP NPs+PAlaser+US组、FHMP NPs+US。比较不同组之间ROS的产量。2.4 SDT产生细胞毒性检测用CCK-8法分别测定Control组,US组,FMP NPs+US组,FHMP NPs组,HMP NPs+US组,FHMP NPs+US组的细胞存活率。利用钙黄绿素(calcein-AM,CAM)和碘化吡啶(Pyridinium iodide,PI)共染色活死细胞,在激光共聚焦显微镜下观察以上各组的细胞存活状态。3.体内声动力治疗将MDA-MB-231移植瘤裸鼠随机分成以下6组:(1)Control组、(2)US组、(3)FMP NPs+US、(4)FHMP NPs组、(5)HMPNPs+US组、(6)FHMPNPs+US组。每隔3天重复上述治疗,治疗时间段为15天,每天记录裸鼠的体重和肿瘤体积,并拍取BALB/C小鼠数码照片。在治疗结束后,每组处死一只BALB/C小鼠,将肿瘤组织进行病理切片分析。结果1.体内外光声成像:FHMP NPs在700 nm处有最大光声信号值,因此700 nm被用作光声成像的最适激发波长。FHMP NPs的光声信号值强于同等浓度的FHP NPs和FMP NPs。在乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤区域可探测FHMP NPs的光声信号,其光声信号值在注射靶向纳米粒2小时后达到峰值,随后随时间逐渐降低。2.纳米粒体外ROS产生及细胞杀伤作用:FHMP NPs联合超声辐照后可产生ROS,而单独超声组或单独FHMP NPs组没有ROS产生,并且光声激光仪辐照后对其ROS的产生没有影响。FHMP NPs随着超声辐照时间的延长,ROS的产量逐渐增多。FHMP NPs与细胞孵育3h后,超声辐照下,细胞大量死亡,在共聚焦显微镜下观察到大量红色死细胞。3.体内声动力治疗:在第一次治疗结束后,各组裸鼠的肿瘤体积没有发生明显的变化,在后期治疗中,FHMP NPs+US组裸鼠肿瘤生长缓慢,而其余对照组肿瘤体积逐渐增加。治疗结束后,FHMP NPs+US组肿瘤部位HE染色结果显示仅残存一点正常细胞,大量细胞形态不可观察,出现核溶解,大量细胞坏死。TUNEL免疫检测显示了治疗组(FHMP NPs+US)的深棕色细胞核增多,说明细胞凋亡严重,而其余对照组却不能观察此现象。PCNA结果显示FHMP NPs+US出现的棕色颗粒最少,表示细胞增殖被明显抑制,而其余对照组没有明显增殖抑制情况。结论FHMP NPs不仅可增强光声成像,在低强度聚焦超声作用下,还可产生大量ROS,通过靶向性SDT作用显著抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长。
关键词: 纳米粒 ；表征 ；靶向性 ；纳米粒 ；生物安全性 ；体内分布 ；纳米粒 ；光声成像 ；ROS ；SDT
摘要： 目的:糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的严重微血管并发症,是慢性肾脏疾病最常见的形式,也是终末期肾功能衰竭的主要原因。传统的治疗方法有许多的局限性,目前没有一种有效的治疗方法可以完全治愈DN。本文旨在开发一种基于黑色素纳米粒负载达格列净(DA)并在表面包覆聚乙二醇壳聚糖(GCS)的黑色素基靶向纳米药物(CSMDNPs),在黑色素光声成像(PAI)引导下,通过降糖和抗氧化双重作用实现靶向联合治疗,为DN治疗提供一种新思路。方法:1.CSMDNPs的合成及表征根据团队前期报道的黑色素纳米粒制备方法,通过超声破碎法构建小尺寸水溶性黑色素纳米粒(MNP)。将MNP与DA过夜低温旋蒸,除去游离DA后,纳米复合物和GCS溶液搅拌过夜,水洗离心成功制备了黑色素基靶向纳米粒(CSMDNPs)。使用紫外可见分光光度计(UV-Vis)、透射电镜(TEM)和纳米粒度电位仪(Zetasizer)对CSMDNPs进行理化性质研究,采用高效液相(HPLC)法测量纳米药物中DA的负载量。2.体外实验通过CCK-8法测定不同浓度CSMDNPs的细胞毒性,使用共聚焦显微镜和流式细胞术检测CSMDNPs被大鼠肾小管上皮的细胞摄取情况,利用DCFH-DA试剂盒检测CSMDNPs纳米药物在细胞水平对活性氧(ROS)的清除能力。3.体内实验C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)联合高脂高糖饲料构建小鼠糖尿病肾病模型。以尾静脉注射方式给药,通过PAI监测纳米颗粒在小鼠体内的代谢。定期监测小鼠体重、血糖。通过血生化、尿常规、H&E、Masson和PAS染色等方法进行血液学和病理学分析,利用酶联免疫吸附实验表征氧化因子水平,综合对纳米药物疗效进行评估,最后通过Western Blot对纳米药物的治疗机理进行探索。结果:1.TEM和Zetasizer结果表明合成的纳米粒CSMDNPs具有合适的尺寸、良好的分散性和优良的稳定性,且表面为负电荷。紫外可见吸收光谱显示有明显的DA吸收峰,证实药物成功负载,根据高效液相计算的DA负载率为5.48±1.14%。2.CCK-8细胞毒性实验结果显示:浓度为12.5-500μg/mL的纳米药物与大鼠肾小管导管上皮细胞NRK-52E孵育24 h后,细胞存活率均未见明显下降,说明其具有良好的生物相容性。细胞共聚焦和流式结果显示:细胞在相同的时间内对壳聚糖包覆的纳米颗粒具有更高的摄取效率。DCFH-DA结果显示随着CSMDNPs浓度增加,细胞内ROS逐渐减少。3.PAI结果表明CSMDNPs在DN组小鼠肾脏部位滞留时间更长。与对照组相比,实验组小鼠体重减轻,血糖降低,血液学指标恢复明显,病理学检查可见肾脏病变程度明显好转,Western Blot结果说明纳米药物可以在蛋白水平抑制NAGL表达,抑制Nrf2/keap-1通路和调节HO-1发挥抗氧化作用,保护肾功能。综上表明该纳米药物能显著减缓糖尿病肾病。结论:本研究提供了一种生物相容性好,集降糖、抗氧化与光声成像于一体的黑色素基靶向纳米药物,可用于糖尿病肾病的联合治疗。本工作构建靶向、缓释及多功能纳米药物,为糖尿病肾病高效治疗提供了新思路。
关键词: 黑色素纳米颗粒 ；达格列净 ；靶向 ；抗氧化 ；联合治疗
摘要： 光学诊疗是利用光学手段来实现疾病诊断和治疗,具备高分辨、高灵敏、精确操控和易诊疗一体化等优点,正成为重大疾病早期诊断和精准治疗的重要手段。而开发高性能诊疗剂的关键在于如何权衡有效载荷、载体与表面修饰之间的利弊设计出个性化智能响应的纳米诊疗平台。例如,选择优秀的载体为有效载荷提供在运输过程中的保护、提高循环时间以及能够对肿瘤特异性响应。载体的表面修饰进一步为诊疗纳米材料提供额外的性能,例如,穿透障碍能力强,特异性结合靶点强等。所以纳米材料是发展光学诊疗技术在生物医学方面应用的关键环节。众所周知,无机材料具有优异的光物理性质,如高稳定性、高量子效率等,使其成为优秀的光学成像平台。高分子半导体通常为具有大共轭主链的共轭高分子或含有大共轭结构的高分子。因其优异的半导体光学性质,在光学诊疗方面潜力巨大。近年来,有机/无机杂化的纳米诊疗平台逐渐成为人们研究的热点。目前基于有机/无机杂化的纳米诊疗平台结合了有机与无机材料的优势,然而研究仍然存在一些问题和不足。在设计方面,如何巧妙的设计平台的结构来权衡纳米在运输、递送、靶向、渗透和毒性各方面的关系。本文旨在通过结构设计,开发基于共轭聚合物的具有近红外吸收的有机/无机杂化纳米诊疗平台。具体内容如下:1、基于共轭聚合物合成p H敏感的串联激活光动力治疗和化学疗法纳米诊疗平台的研究本章中我们使用基于半导体聚电解质的两性离子光敏剂（PFNS）来修饰上转换纳米颗粒的表面以制备近红外（NIR）光响应光动力治疗剂（UCNP@PFNS）。接下来将p H敏感的锰-磷酸钙（Mn Ca P）层进一步涂覆到UCNP@PFNS上,其中掺入缺氧激活的前药AQ4N。所获得的纳米复合材料在血液中具有73 nm的高稳定性直径,并且在肿瘤中具有显着增强的渗透性和保留（EPR）效应。重要的是,当这些纳米颗粒到达肿瘤部位时,酸性肿瘤微环境（p H6.5-6.8）会分解Mn Ca P层,并释放出UCNP@PFNS（30 nm）和AQ4N。相对粒径较小的UCNP@PFNS和AQ4N满足了纳米PS和药物在肿瘤中的不同分布要求,达到了很高的治疗效果,抑制率高达83%。此外,在Ca P分解过程中可释放Mn2+离子,导致肿瘤部位的磁共振（MR）信号显着增加。总体而言,我们报道了由MRI和荧光成像引导的纳米颗粒具有PDT和化疗的串联活性激活模式,这有望用于未来的临床诊断和治疗。2、共轭聚电解质刷为模板合成金纳米粒子在光声成像引导光热疗法设计用于有效地将近红外光转换为热的金纳米颗粒（GNP）,为临床前的光声成像（PAI）指导光热诊疗学提供了广阔的前景;然而,低的光热转化效率（η）极大地限制了它们在与光热有关的光热学上的实际应用。因此,迫切需要设计新的方法和机理研究来提高转换效率。在本章中,报道了共轭聚电解质刷作为模板的方法可合成在体内为PAI和PTT的诊疗GNP材料,并且具有增强η的效果,同时解释了增强η的潜在机理。首先,通过使用单分散共轭聚电解质刷（PFNBr）作为模板,制备不同尺寸（30、45、60和75 nm）的聚合物模板GNP（PTG）。值得注意的是,30 nm PTG显示出最强的光热效应,相对于使用传统方法制备的相同大小的纯GNP,其显示的η增强了3.5倍。使用飞秒瞬态吸收（fs-TA）光谱进行的进一步机理研究表明,PTG加速了电子-声子相互作用,相对于纯GNP而言PTG的η增强了3.5倍。最后,使用最佳大小的PTG进行的体内研究表明,活体小鼠对肿瘤具有出色的抑制作用。这项研究不仅介绍了第一个共轭聚合物模板的PTG,而且还提供了对超快激发态动力学的更深刻的基本理解,这两者都将激发高性能PTG的未来制造。3、聚赖氨酸包裹的黑色素纳米颗粒靶向糖胺聚糖用于骨关节炎关节软骨退变的早期诊断本章中我们介绍聚赖氨酸（PLL）包裹的内源性黑色素纳米颗粒MNPs作为带正电荷的对比剂,通过其与软骨中阴离子糖胺聚糖（GAGs）的强静电相互作用,实现对软骨退变的准确光声成像（PA）。PLL-MNPs具有较高的PA强度、光稳定性和生物相容性。体外PAI研究显示,Zeta电位为+32.5±9.3 m V的PLL-MNPs比阴离子MNPs有更多的软骨吸收和更长的保留时间,并且与软骨中GAG含量呈正相关。在活小鼠模型中,经关节内注射给药后,PLL-MNPs在正常关节（高GAG含量）中表现出的PA信号约为OA（低GAG含量）的两倍。此外,所获得的PAI结果提供了OA膝关节中GAG含量分布的准确信息。因此,通过PAI检测分析OA软骨中GAG含量的变化,可以明确区分早期OA与晚期OA,监测药物治疗后OA的治疗效果,所有PAI结果均进行组织学检查。
关键词: 共轭聚合物 ；黑色素 ；上转换纳米粒子 ；近红外 ；有机/无机杂化 ；诊疗平台 ；光声成像 ；光热治疗
摘要： 肿瘤是威胁人类健康的一种恶性疾病。手术治疗、化学药物治疗和放射治疗等手段被广泛的应用于肿瘤的临床治疗。为了克服单一治疗手段引起的毒副作用大和治疗不彻底等缺点,因此两种甚至多种治疗手段的联合使用显得尤为重要。近年来,纳米技术应用于肿瘤的联合治疗有大量的研究报道,这些研究结果指出纳米技术具有很好的临床应用潜能,此外,也有了初步的临床产品问世。同时纳米颗粒在肿瘤放射治疗中有着特有的优势,而掌握这部分的优势有利于纳米技术更好的运用于放射治疗与其他手段的联合治疗中。具体体现为在电离辐射的作用下,纳米颗粒与生物界面的相互作用尤其是纳米颗粒与细胞的相互作用可能会发生变化。而在放射治疗与其他治疗手段联合使用时,这部分的变化将进一步的影响到后续的联合治疗疗效。本博士论文首先发现了细胞在电离辐射作用后,相对于未辐照状态下,与纳米颗粒的相互作用发生了一定的改变。然后,本论文对这种现象的发生机制进行了详细的解释。根据这些现象,本论文考察了电离辐射对白蛋白纳米载药系统在肿瘤组织和细胞中的运输的影响。最后,利用上述揭示的规律,本论文合成了一系列基于硫化铜的诊疗一体化纳米探针,用于以放射治疗为基础的肿瘤联合治疗中,以进一步体现出纳米颗粒的多功能性。主要的研究结果如下:第一章:简要概述纳米颗粒在肿瘤放射治疗中的研究进展。系统介绍了纳米颗粒用于肿瘤放射增敏的现状,并在肿瘤细胞和肿瘤微环境两个层面解释了其放射增敏机制。然后,本论文对纳米材料在以放射治疗为基础的联合治疗中的研究进行了归纳。同时纳米颗粒与生物界面的相互作用是一个重要的研究环节,而当纳米颗粒被应用于放射治疗时,电离辐射的引入势必会对这一相互作用的原有方式产生影响,本章节对这方面也进行了简介。最后具体阐明本博士论文的选题依据与研究内容。第二章:电离辐射对纳米颗粒与细胞相互作用的影响及其机制研究。本论文以白蛋白纳米粒、脂质体纳米粒、金纳米粒和硅纳米粒为模式纳米颗粒,并选择实验室多种肿瘤细胞,研究在有无电离辐射作用下,肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取和外排的区别。本论文发现电离辐射作用后,肿瘤细胞明显增加了对所选纳米颗粒的摄取,同时减少了对其的外排。之后,本论文从电离辐射改变细胞的细胞周期和改变细胞中与纳米颗粒摄取相关的蛋白Caveolin-1的表达量这两个方面对其中的机制进行了解释。这个现象的发现有利于支撑纳米颗粒运用于以放射治疗为基础的肿瘤联合治疗中,具有很大的基础医学和临床医学指导意义。第三章:电离辐射对白蛋白载药系统体内运输的影响及其在肿瘤治疗中的运用。首先,在细胞和组织水平,电离辐射作用后肿瘤细胞中Caveolin-1蛋白的表达量上调了,而Caveolin-1的表达量与细胞对纳米颗粒的摄取有着直接的关系。在细胞水平上表现为电离辐射处理后的肿瘤细胞增加了对白蛋白纳米载体的摄取。在动物水平上表现为辐射后肿瘤组织将更长时间的将白蛋白纳米载体滞留在肿瘤内部。然后,根据以上的研究,本论文使用白蛋白与治疗性放射性核素(131I),化疗药物（紫杉醇）和血管抑制剂（舒尼替尼）分别形成纳米药物,联合X射线用于肿瘤的联合治疗。证明先给予局部放疗再给予系统性药物的治疗疗效明显优于先给予系统性药物再给予局部放疗的治疗疗效。最后,本论文发现电离辐射可以破坏肿瘤血管,这使得用具有凝血靶向功能的A15多肽修饰的白蛋白纳米载体在辐照后肿瘤内的进一步富集,增强白蛋白药物在肿瘤联合治疗中的效果。第四章:黑色素包裹的硫化铜纳米粒在肿瘤联合放化疗中的运用。考虑到白蛋白纳米颗粒功能相对单一,本论文构建了一系列基于硫化铜的新型诊疗一体化纳米探针以进一步体现出纳米颗粒的多功能性。在该章节中,合成了以黑色素为模板的硫化铜纳米颗粒（CuS@Melanin）,并通过PEG修饰使其获得了很好的生物稳定性。借助其较大的疏水表面,CuS@Melanin-PEG可以装载大量的化疗药物-阿霉素。更为重要的是在电离辐射的作用下,肿瘤细胞不仅增加了对CuS@Melanin-PEG的摄取和减少对其外排,而且也增加了装载在CuS@Melanin-PEG的DOX的摄取和减少对其外排。此外,CuS@Melanin-PEG还可以用于肿瘤细胞的辐射增敏和肿瘤组织的近红外光光声成像以体现出其多功能性。这些都有利于该新型纳米颗粒在肿瘤联合放化疗中的运用。第五章:碘掺杂硫化铜纳米粒在肿瘤联合内放射-光热治疗中的运用。肿瘤治疗中,肿瘤细胞的转移是导致治疗失败的首要原因。对于转移瘤的治疗,外放射治疗由于缺乏对肿瘤靶区的清楚勾勒,使其运用受到了限制。而内放射治疗作为一种全身性治疗手段在转移瘤的放射治疗中有着重要体现。同时光热治疗是一种新型的肿瘤治疗手段,具有安全性高和肿瘤消融彻底等优点,从而使其得到了广泛的关注。本论文将治疗性的放射性核素131I成功掺杂到硫化铜纳米晶格中,并通过PEG修饰后使得其具有很好的生物相容性。利用具有较好光热转换效率的硫化铜和稳定掺杂的放射性碘,碘掺杂硫化铜纳米粒可用于淋巴转移瘤的CT/核素成像引导的联合内放射-光热治疗。更为重要的是本论文发现131I的掺杂增加了肿瘤细胞对硫化铜颗粒的摄取,而进入肿瘤细胞的硫化铜纳米粒的数量越多,其对肿瘤的光热治疗效果越好。这提示:电离辐射改变了肿瘤细胞与具有光热转换能力的纳米颗粒的相互作用,这将有利于肿瘤的放射治疗和光热治疗的联合。综上所述,本论文揭示了电离辐射对纳米颗粒与细胞相互作用的影响规律:电离辐射通过改变细胞的细胞周期和增加细胞中与纳米颗粒摄取相关的Caveolin-1蛋白的表达,使得细胞增加了对纳米颗粒的摄取并减少了对其外排。利用这一规律,纳米药物可以更好的被运用于肿瘤的联合治疗中。本论文的结果对辐射纳米医学的研究具有很好的参考价值,并且激励了纳米药物在临床上的进一步发展。
关键词: 电离辐射 ；纳米颗粒 ；细胞摄取 ；细胞外排 ；白蛋白 ；硫化铜
摘要： 光热治疗（Photothermal therapy,PTT）是一种新型的肿瘤治疗技术,其主要原理是在近红外（Near infrared,NIR）激光的照射下,光热剂可将吸收的光能转化为热能产生局部高温,从而对肿瘤组织造成不可逆的损伤。然而,当PTT作为独立的治疗手段时,会面临组织内热量分布不均导致疗效不理想的问题,因而PTT通常可与光动力治疗、放射治疗、基因治疗、免疫治疗等手段联合应用,通过不同的作用机制产生协同抗癌作用,抑制单一疗法的耐受性,显著提高治疗效果。为了在治疗中实现精准定位和可视化监控,医学诊断成像利用特定的探针或造影剂可以检测早期疾病,能够对肿瘤组织进行全面的评估。因此,一种全新的疾病治疗模式即诊断治疗学（Theranostics）理论得到了迅速发展,即通过对纳米材料的合理设计,将成像造影剂载入或掺杂到治疗模块当中,可以实时、精确地诊断病情并同步进行个性化治疗,从而实现肿瘤的诊疗一体化。目前各种临床医学成像模式,如X射线计算机断层扫描（Computed tomography,CT）、磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）、超声（Ultrasonic imaging,US）、正电子发射断层扫描（Positron emission tomography,PET）等都显示出其独特的优势。具有多种成像模式的纳米探针,能够获取具有互补性的可视化数据以实现深入的临床分析。因而致力于探索新型纳米复合材料并构建个性化诊疗平台,在肿瘤诊疗方面具有重要的研究价值。在众多多功能生物材料中,聚多巴胺（Polydopamine,PDA）作为天然生物色素——黑色素的主要成分,具有良好的生物相容性和较强的近红外吸收能力。基于聚多巴胺的纳米粒和纳米涂层,其表面的活性基团容易被巯基和氨基端分子修饰,在药物输送和多功能组件的偶联上显示出特有的优势。因此,赋予聚多巴胺纳米材料协同治疗和多模态成像的功能将会为纳米诊疗领域的发展带来突破。基于此,我们首先设计了聚多巴胺修饰的磁性普鲁士蓝纳米粒,用于多模态成像引导的光热和光动力治疗。对于光热治疗,普鲁士蓝（Prussian blue,PB）纳米粒子在近红外区域具有强烈的光吸收和较高的光热转换效率。与此同时,PB NPs被证明在光声（Photoacoustic,PA）成像方面具有很大的应用潜力。为了实现基于普鲁士蓝纳米材料的靶向诊疗一体化,本课题先以超顺磁性Fe3O4纳米粒子为核,在酸性条件下[Fe（CN）6]4-和Fe3+生成普鲁士蓝壳层沉积于Fe3O4纳米粒表面,从而得到磁性普鲁士蓝纳米粒（Magnetic Prussian blue nanoparticles,Fe3O4@PB NPs）以实现T2核磁成像和磁靶向引导的光热治疗。由于单一光热疗法难以根治肿瘤,我们引入光敏剂以实现光动力疗法（Photodynamic therapy,PDT）和光热治疗联合应用。铝酞菁（Aluminum phthalocyanine,Al Pc）作为第二代光敏剂,具有较高的单线态氧产率,较高的吸收波长,且可以作为荧光成像追踪剂。然而普鲁士蓝纳米涂层在药物传递方面存在局限性,以至于Al Pc难以直接封装或连接到PB表面。因而我们利用多巴胺的氧化自聚反应生成具有粘附性的聚多巴胺涂布于Fe3O4@PB NPs表面,可以有效地吸附光敏剂Al Pc,增加了光敏剂的稳定性。之后,在纳米粒表面包覆牛血清蛋白（Bovine serum albumin,BSA）能有效地延长其在生物体内的循环时间。本课题将紧紧围绕多模态成像介导的光热/光动力协同治疗,设计和制备聚多巴胺修饰的磁性普鲁士蓝纳米粒子（Fe3O4@PB@PDA）,并实现了光敏剂Al Pc的运载和牛血清白蛋白BSA的表面包覆,最终合成目标复合纳米材料Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA。首先对所制备的纳米材料进行结构表征,Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA的透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）结果显示其形貌为球形,具有明显的核壳结构。X射线衍射测试出现的普鲁士蓝的特征衍射峰和紫外可见吸收光谱中的740 nm处的吸收峰均证实了Fe3O4@PB NPs的成功制备。红外光谱分析图中出现的PDA的特征吸收带可以证实PDA的成功包覆。从磁滞回线结果可以看出Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米材料均具有较好的超顺磁性。利用紫外可见分光光谱和荧光发射光谱验证了光敏剂的装载,且光敏剂呈现出近红外光触发的加速释药行为。体外升温实验中Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA表现出良好的光热升温效果和光热稳定性,光热转换效率达到22.3%。借助1,3-二苯基异苯并呋喃（1,3-diphenyl isobenzofuran,DPBF）验证了Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA可在短时间内产生大量单线态氧。在细胞水平,细胞毒性MTT检测和双染实验结果共同表明,基于Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA的光热与光动力联合治疗的对癌细胞的杀伤作用最强。利用单线态氧敏感探针DCFH-DA检测细胞内的单线态氧产生情况,结果表明,Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA处理的细胞内产生了最强的荧光信号,说明其能在细胞内产生大量ROS,预示着该处方具有潜在的增强光动力学治疗的作用。活体成像研究中,尾静脉注射12 h后荧光信号主要集中在肿瘤部位,说明Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA能够较好地靶向至肿瘤。该纳米复合物也在体内的核磁成像和光声成像中表现出显著的造影效果。小鼠的体内热成像实验数据表明,通过尾静脉注射Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA,在近红外光源的激发下,小鼠肿瘤部位在短时间内显著升温,温度可高达54℃。体内抑瘤实验结果证实了该处方能够通过光热治疗和光动力治疗的联合作用抑制肿瘤生长,且未对其他组织器官产生明显损伤。Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米复合材料主要优势如下所述:（1）多功能的Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米复合材料具有良好的生物相容性和超顺磁性,有利于在生理环境下实现磁靶向引导的光热治疗。（2）光敏剂通过π–π堆积和疏水作用被装载到纳米载体上,能显著增加Al Pc的稳定性和在肿瘤部位的积累,从而提高光动力治疗的疗效。（3）Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA可以作为一种多模态成像的纳米探针,能够实现肿瘤区域的近红外荧光成像,磁共振成像和光声成像。（4）Fe3O4@PB@PDA/Al Pc/BSA纳米复合材料在单一近红外660 nm激光触发下的光热和光动力联合疗法能够明显的抑制肿瘤生长。考虑到近红外光对组织的穿透深度有限,而放射治疗（Radiotherapy,RT）可利用高穿透性的电离辐射（X-ray,γ-ray）作用于深部肿瘤,诱导DNA损伤,因此放疗结合光热治疗是一种极具吸引力的治疗手段。基于此,我们围绕聚多巴胺进行了更深入的研究,构建了嵌入硫化钨量子点（Tungsten sulfide quantum dots,WS2 QDs）的介孔聚多巴胺（Mesoporous polydopamine,MPDA）纳米材料。目前介孔聚多巴胺纳米粒是一种有效框架结构,其具有较大的表面积和较高的孔体积,有利于将多功能组件集成于一体,从而实现高效的诊疗一体化。钨元素由于其高原子序数,WS2 QDs可以作为放疗增敏剂,能在更安全的辐射剂量下增强放疗效果。同时,硫化钨对X-ray具有较高的光衰减能力,可被发展成为CT成像的造影剂。受到量子点嵌入介孔二氧化硅的组装形式的启发,我们尝试将WS2QDs装载到MPDA中,从而实现CT/PA成像指导的放疗和光热治疗一体化。由于肿瘤组织缺氧诱导的耐受性会严重阻碍放射治疗的疗效,我们进一步引入二氧化锰（Mn O2）纳米材料,使其与肿瘤部位的H+和H2O2反应生成大量的氧气以克服组织缺氧,同时该过程释放的Mn2+可以用于T1磁共振成像。本研究首先采用乳液诱导界面各向异性组装策略制备了聚多巴纳米海绵MPDA NSs,并将WS2 QDs嵌入MPDA NSs的孔道结构中,然后通过原位还原法包覆二氧化锰纳米壳,设计了一种新型自产氧的纳米诊疗剂（MPDA-WS2@Mn O2 NPs）,用于光声、核磁、计算机断层扫描三模态成像介导的光热和放射治疗。首先对所制备的纳米材料进行结构表征,TEM图像显示MPDA NSs为单分散的介孔球,平均直径为170nm,孔径约为9 nm。所制备的硫辛酸修饰的的WS2 QDs平均粒径为4～5nm;当WS2 QD掺入MPDA NSs时,其形态和分散性没有明显的变化,而孔道结构较为模糊。此外,MPDA-WS2-PEG通过PEG和KMn O4之间的氧化还原反应充当Mn O2纳米壳生长的位点,从而形成MPDA-WS2@Mn O2 NPs,可以看出MPDA的介孔结构被粗糙的Mn O2层完全覆盖。元素Mapping有不同元素（C,S,W和Mn）的分布,进一步验证了MPDA-WS2-Mn O2纳米粒子的成功制备。N2吸附-解吸等温线结果表明WS2 QDs嵌入MPDA NSs后,其孔径和比表面积明显减小。在Mn 2p的XPS谱图中,特征的Mn 2p3/2和Mn 2p1/2信号说明Mn（IV）O2纳米壳的形成。紫外可见吸收光谱表明该纳米材料在近红外区有明显的吸收。评价光热性能,在近红外激光照射下,MPDA-WS2@Mn O2 NPs表现出了优异的近红外光诱导的热效应和光热稳定性。通过定量测定在MPDA-WS2@Mn O2 NPs催化下H2O2溶液中的O2浓度,证明该处方具有很好的产氧能力。细胞MTT实验结果表明,随着MPDA-WS2@Mn O2 NPs浓度的增加,大多数细胞被NIR诱导的过高热杀死,而MPDA-WS2@Mn O2 NPs没有表现出明显的暗毒性。细胞双染实验进一步验证了MPDA-WS2@Mn O2 NPs诱导的过高热对细胞的杀伤作用。利用荧光探针ROS-ID来评估细胞内缺氧水平,用MPDA-WS2@Mn O2 NPs处理后细胞仅显示了极微弱的红色缺氧信号,表明该处方可以显著提升细胞内氧气浓度。采用克隆形成实验评估放射疗法的效果,表明MPDA-WS2 NP具有出色的放射增敏作用。进而使用γ-H2AX免疫荧光染色标记评价DNA损伤的程度,MPDA-WS2@Mn O2 NPs+X射线照射组产生了最强的荧光光斑,表明对细胞造成了高强度的DNA损伤。对MPDA-WS2@Mn O2的体外体内成像能力进行评价,MSOT成像、CT、核磁成像的信号强度均表现出较好的线性关系,并在体内产生了优良的造影效果。MSOT成像表明MPDA-WS2@Mn O2 NPs可以在静脉注射12 h后富集至肿瘤部位。近红外热成像表明,在激光照射下,注射MPDA-WS2@Mn O2 NPs后的小鼠肿瘤区域快速升温,说明该纳米材料可以在体内发挥有效的光热治疗作用。连续监测小鼠的肿瘤体积和体重,可以看出联合治疗能够显著抑制肿瘤生长,明显优于单一治疗的效果。H&E组织学分析表明治疗组的主要器官未见明显的组织损伤。MPDA-WS2@Mn O2 NPs的主要优势如下:（1）制备了具有大孔结构的MPDA NSs,并进一步探索其作为新型载体封装WS2 QDs的能力,在近红外光和X射线的触发下,能够实现光热效应与放疗增敏效应相结合的抗肿瘤治疗。（2）巧妙地利用PEG的还原性,以PEG修饰的MPDA-WS2 NPs为模板实现KMn O4的原位还原,获得了均匀的Mn O2纳米壳。Mn O2纳米壳能够与肿瘤微环境发生响应,缓解肿瘤组织缺氧,提高RT疗效,并释放Mn2+用于T1 MR成像。（3）制备的MPDA-WS2@Mn O2纳米剂将计算机断层扫描、多光谱光声断层扫描、肿瘤微环境响应的T1磁共振成像能力很好地整合与一体,能够在癌症治疗过程中进行实时的治疗指导和监测。放射治疗和光热治疗的协同作用能显著抑制肿瘤生长,表现出出色的治疗效果。
关键词: 磁性普鲁士蓝纳米粒 ；介孔聚多巴胺 ；光热治疗 ；光动力治疗 ；放射治疗 ；多模态成像
摘要： 光学成像与治疗,具有无创性、非侵入性、实时原位等优势,在生物医学领域占据重要地位。随着激光器与检测器技术的飞速发展,新兴的光学成像与诊疗技术取得了重大进展,例如NIR-Ⅱ荧光成像,光声成像以及光热治疗等。针对以上技术开发生物安全性与生物相容性好的新型光学功能材料,显得尤为重要。本文旨在开发具有临床转化潜力的光学成像与诊疗功能材料,并对它们的应用进行研究,为目前临床中亟待解决的问题提供新的探索,以及思考与发展方向。
我们发现ZC-1001分子,在固体的状态下可以发出强的NIR-Ⅱ(1000-1700nm)荧光,而溶于有机溶剂中时发NIR-Ⅰ(700-900nm)荧光信号,推测它具有AIE效应,并对其可能产生聚集发光的机制进行研究。分别对ZC-1001溶液在体内和体外的应用进行探索。结果显示将其注射到动物体内可依次清晰观察到腘淋巴结。在体外实验中进一步发现,HSA的疏水口袋能够以1:1的摩尔比装载ZC-1001分子,限制它构象的扭曲以及在水中分子间的静电相互作用,使荧光增强120倍以上。并且与BSA、IgG、胰酶、不同的氨基酸等组分相比,ZC-1001对HSA的识别具有很强的特异性,LOD只有15.64nM。更重要的是,在人血清这样的复杂体系中,ZC-1001能够准确检测出HSA浓度。因此,开发了一种新型荧光功能材料,在体内能够对动物淋巴结进行NIR-Ⅰ荧光成像,在体外则是价格低廉、速度快、灵敏度高、检测限低以及特异性强的HSA检测体系。
目前在没有辐射的情况下,很难以无创的方式可视化医疗器械在体内的状态。我们基于ZC-1001固体可以产生强NIR-Ⅱ荧光信号的特点,分别在动物体内通过NIR-Ⅱ成像模拟了监测手术缝线的降解过程、内置导管的磨损情况以及AVM栓塞成像并在NIR-Ⅱ荧光成像引导下进行手术切除的过程。并不会对周围软组织以及主要脏器造成组织毒性。以上的研究结果表明,ZC-1001是一种非常有潜力用于医疗器械制造的新型光学成像功能材料,能够非侵入性地可视化其生物降解过程、完整性和混合荧光引导栓塞手术等。
癌症是全球关注的公共卫生问题,因此十分有必要研发能够直接区分肿瘤组织与正常组织的新型光学诊疗功能材料。NIR-Ⅱ分子影像作为医学成像领域研究的重点,其对于推动癌症的早期诊断、术中导航以及个体化医疗的发展都是至关重要的。在本研究中,通过ICG标记人源化抗GPC3单克隆抗体,开发了一种HCC靶向的NIR-Ⅱ荧光探针GPC3-ICG。与非靶向的IgG-ICG探针相比,GPC3-ICG在体外表现出HCC细胞系的特异性识别能力。对于高表达GPC3的Huh-7肿瘤,GPC3-ICG能够富集在肿瘤部位,TBR可以达到3.0。小鼠器官的NIR-Ⅱ离体成像也表明GPC3-ICG可以靶向成像Huh-7肿瘤组织。总的来说,GPC3-ICG是一种能够用于HCC靶向成像的NIR-Ⅱ探针,并且有希望用于荧光引导HCC肿瘤切除手术的光学诊断功能材料。
除诊断外,随着诊疗一体化概念的提出,越来越多同时具有成像和治疗功能的光学功能材料被开发出来,然而大多数的材料在体内的应用都面临着潜在毒性的威胁。因此在本研究中,基于内源性物质黑色素,通过装载化疗药物,构建了具有光声成像以及化学/光热联合治疗的诊疗一体化纳米粒(M-Dots-CuET)。其中,化疗药物选择的是二乙基二硫代氨基甲酸铜(Ⅱ)复合物(CuET),它是双硫仑在体内与铜络合的代谢物,也是双硫仑治疗癌症的有效成分。但是CuET的疏水性限制了其在体内的应用,将CuET装载到黑色素纳米粒上,可以显著提高它的水溶性。分别在体内和体外对该纳米粒的成像与治疗能力进行了检测。结果表明M-Dots-CuET纳米粒在PBS溶液中具有较强的光声信号,并且具有较好的光热转化能力,光热转换效率达到了34.78%。动物水平实验中,光声成像的结果显示,该纳米粒具有肿瘤富集能力,在给药后1h能够达到最大的肿瘤富集量。同时M-Dots-CuET也表现出优异的肿瘤抑制能力,肿瘤生长抑制值(TGI)为45.1%,结合光热疗法后,TGI可以达到78.6%。综上所述,基于内源性物质构建的M-Dots-CuET诊疗一体化纳米粒为进一步研发癌症的诊疗功能材料提供了一种新的研究策略。
总的来说,本研究通过不同的途径,开发了三种具有不同功能的光学成像与诊疗功能材料,它们分别在相应的应用中表现出了优异光学成像与诊疗效果以及巨大的临床转化潜力。
关键词: 光学功能材料 ；NIR-Ⅱ成像 ；聚集诱导发光 ；分子影像 ；光声成像 ；化学/光热治疗 ；诊疗一体化 ；黑色素纳米粒
摘要： 过渡金属配合物通常具有低毒性、极好的生物相容性和光稳定性等优秀特质，因此在生物成像、疾病监测以及生物治疗等领域均具有广泛的应用前景。本论文从研究目标出发，分别设计合成了以铁和铱为中心原子的两大类金属配合物。实验结合配合物的光物理特征以及在共聚焦成像、超分辨成像、荧光寿命成像、活体荧光成像以及光声成像等成像系统上的优异的成像效果，系统研究了过渡金属配合物在生物医学等领域的应用。主要研究内容如下： 1.三联吡啶基铁配合物的设计合成以及光热性质和光声成像的应用探索 光声成像（PAI）是一种利用生物组织不同的光学吸收特性，通过对光激发所产生的不同的超声信号进行重建从而达到极高分辨率的成像效果。光声成像由于其在深层组织穿透中的超高分辨率以及无创性，近十年来受到广泛关注。其巨大的应用前景催生了一系列可用于光声成像的造影剂，目前已经报道的造影剂无机材料类有金纳米晶体、过度金属硫化物和MXene基纳米材料等;有机材料类有氰基染料、二亚胺和黑色素等，而在低成本水平上具有可调控分子结构的功能性PA探针仍然是一个重大挑战。在此，我们以三联吡啶为母体，分别引入具有良好抗炎效果的磺酸盐、极佳水溶性的季铵盐和极好脂溶性的醚氧链基团，合理设计了三种具有不同水溶性的三吡啶铁复合物：S-Fe，J-Fe和O-Fe。这些配合物均具有较大的摩尔消光系数、低荧光量子产率以及可忽略不计的细胞毒性，同时由于其快速的激发态失活而具有较高的光热转换效率，使其适合作为PA探针。值得注意的是,其中一种名为S-Fe的配合物的光热转换效率可高达29.6%。此外，S-Fe具有良好的溶解性和生物相容性，这为体内光声成像提供了潜在可能。令人惊喜的是，进一步的药代动力学评价表明，这种配合物对活体动物几乎具有无创性，并且具有相对较快的代谢速度，避免了药物堆积造成的肝肾损伤。该研究利用价格低廉的铁配合物作为PA剂，填补了光声成像材料的空白，同时为研究者对于配合物的应用前景开辟了新的思路。 2.一种具有黏度响应的荧光探针通过荧光寿命成像鉴别正常细胞与肿瘤细胞 肿瘤以其高发病率及致死率成为人类棘手但又亟待攻克的难题，能够早期诊断病变可以大大提高患者生存率。然而，目前临床上主要以HE染色以及免疫组化等手段来进行鉴别和诊断，步骤繁琐且耗费大量人力物力。因此，研发简单高效的方法能够早期对于癌变部位进行确诊以及是否发生转移进行鉴定仍然是一种挑战。荧光寿命成像作为新型的成像方式，因其只受荧光分子所受环境影响而得到广泛关注。基于此，我们设计合成了一种黏度响应型荧光探针MIr用于鉴别正常细胞和肿瘤细胞。MIr的荧光寿命与黏度之间呈现出极好的线性关系（R2=0.99），同时，MIr受细胞内其他微环境如ph以及极性等影响几乎可忽略不计，对于黏度具有高度的专一性。细胞层面上，MIr通过嵌入膜磷脂双分子层的方式特异性靶向线粒体，不受膜电位影响的同时也避免了与细胞器组分发生反应对细胞器造成伤害，因而具备了长期动态监测的能力，其低的细胞毒性以及良好的生物相容性为进一步的组织层面上鉴定提供了可能。另外，铱的引入使得探针具有生成活性氧的能力，在进行肿瘤细胞鉴别的同时能够进一步进行光动力治疗而达到抗肿瘤的效果。基于正常细胞和肿瘤细胞黏度的差异性，该研究利用一种黏度响应性荧光探针通过荧光寿命成像这种简单高效的手段对正常细胞和肿瘤细胞进行鉴别，同时，其具有的单线态氧产生能力能够在早期发现并确诊肿瘤发生的同时进一步进行抗肿瘤治疗，以期能够大大提高患者的生存率。
关键词: 过渡金属配合物 ；光声成像 ；荧光成像 ；荧光寿命成像 ；细胞器靶向 ；肿瘤细胞鉴别 ；光动力治疗 ；荧光探针
摘要： 目的：骨关节炎(OA)是临床最常见的退行性关节疾病，给患者和社会造成巨大的经济负担。目前缺乏早期有效的诊断和追踪OA疾病动态进展的方法。关节软骨的损伤、退变是其早期和主要的病理改变。关节软骨基质中带有阴离子的糖胺聚糖(GAGs)含量的减少是OA发生发展的标志性分子事件。本研究旨在基于黑色素纳米颗粒，构建富含阳离子的光声纳米探针，通过静电吸引特异性靶向关节软骨中的GAGs，结合光声成像探究阳离子探针监测OA疾病进展及分期的可行性，为构建OA纳米诊疗一体化载体提供实验基础。 方法：(1)黑色素纳米粒(MNPs)的制备：依次使用0.1NNaOH溶液和0.1NHC1溶液通过调节pH以溶解20mg酪氨酸衍生的合成黑色素，经超声、过滤、去离子水冲洗后冻干，获得带有阴离子、水溶性黑色素纳米粒(MNPs)。 (2)阳离子聚赖氨酸一黑色素纳米粒(PLL-MNPs)的制备与表征：5mgMNPs溶于10ml去离子水中，0.1NNaOH调节pH至9，并超声10分钟。加入10ml，0.25mM的聚赖氨酸(PLL)溶液(pH=9)，30℃下磁力搅拌24h，通过PLL和MNPs之间的静电相互作用形成PLL-MNPs，去离子水多次冲洗，去除多余聚合物，得到最终的PLL-MNPs。红外光谱法确认目标产物PLL-MNPs的结构。透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)仪器测量PLL-MNPs的粒径大小与形态;Zeta电位分析仪测定PLL-MNPs的电位;在PLL-MNPs水溶液中测量其光声光谱及光声特性;680nm激光连续照射检测PLL-MNPs的光稳定性。 (3)体外软骨实验：取大鼠新鲜膝关节软骨，用硫酸软骨素酶ABC溶液（0，0.1，0.3，和0.5U/ml的50mmolTris，0.02%牛血清白蛋白和60mmol醋酸钠缓冲液，pH8）在37℃下处理24小时，得到含有不同GAGs浓度的关节软骨。经PLL-MNPs(0.5mg/ml)孵育24小时，进行光声检测，记录光声信号值并绘制相关曲线，验证和分析阳离子光声探针对GAGs的靶向性及监测关节软骨中GAGs含量变化的能力。 (4)细胞毒性实验：MTT法考察一系列浓度梯度的PLL-MNPs对大鼠软骨细胞的细胞毒性。 (5)PLL-MNPs追踪体内OA疾病进展的考察：选用切断板胫韧带手术致内侧半月板不稳(DMM)诱导的方法建立小鼠OA模型。利用同一只小鼠左右两侧后肢膝关节作为对照研究以减少潜在的个体差异，右侧膝关节行DMM造模，左侧关节行假手术作为正常对照组。首先取DMM术后第四周小鼠，关节腔内注射10μL的PLL-MNPs(0.5mg/mL)，通过观察各时间点光声图像及量化光声信号强度考察PLL-MNPs诊断骨关节炎小鼠软骨退变的可行性。在DMM术后，小鼠关节腔内注射10μL的PLL-MNPs(0.5mg/mL)进行光声成像，并进行X线检查，连续观察10周，评估PLL-MNPs追踪体内骨关节炎进展的有效性。每一阶段实验结束后取小鼠膝关节进行组织病理检查，验证软骨退变、GAGs含量的变化，检测软骨细胞死亡与骨赘形成。 (6)考察PLL-MNPs光声纳米探针在体内的生物分布：向健康小鼠膝关节内注射10μLPLL-MNPs(0.5mg/mL)或PBS，分别在24h、96h处死小鼠。收集包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌肉和骨骼等的主要器官组织。将各器官分别包埋在琼脂糖凝胶中进行光声成像，计算光声信号强度值。将10μL浓度为0.5mg/mL的PLL-MNPs注射到正常小鼠膝关节内，不同时间点进行光声成像，监测PLL-MNPs在关节内的代谢。 结果：(1)通过控制反应pH、温度(30℃)、氮气保护，本实验最终合成PLL-MNPs光声纳米探针。PLL-MNPs纳米颗粒呈深棕色，水合粒径稳定约为42.5nm。PLL-MNPs光声探针水溶液吸收波长范围较宽，峰值在680nm，因此选用680nm作为后续实验光声激发波长。Zeta电位分析仪测定合成的PLL-MNPs的电位为+32.5±9.3mV。PLL-MNPs探针溶液在680nm波长的激光照射下1小时，PLL-MNPs的吸收几乎没有减弱，说明PLL-MNPs具有良好的光稳定性。(2)体外软骨实验结果显示，经过PLL-MNPs孵育的正常关节软骨，光声信号强度明显增强（孵育前：148±23a.u.，9呼育后：2798±98a.u.，p＜0.01），并且PLL-MNPs光声信号强度与软骨中GAGs含量成正相关(R2=0.87)，表明PLL-MNPs增强的光声成像具有灵敏检测关节软骨中GAGs含量变化的能力，在光声图像中可以清楚区别正常软骨与退变软骨。(3)0-200μg/ml的PLL-MNPs与大鼠软骨细胞孵育24h后，细胞存活率均超过90%，表明PLL-MNPs生物相容性良好。(4)体内实验结果表明，造模后第4周，注射PLL-MNPs后，3小时探针在关节腔内显著聚集，表现为局部亮度增加、光声信号明显增强，而OA关节内光声信号(1698±86a.u.)明显低于正常关节（2245±72a.u.，p＜0.05），这一结果表明通过PLL-MNPs靶向GAGs含量变化，早期即可分辨软骨退变，从而实现疾病的早期诊断;对比临床常用的X线检查，在DMM术后第2、4周小鼠膝关节未见特征性的OA表现。在监测骨关节炎疾病进展中，通过连续观察注射探针后小鼠光声成像发现，OA关节内光声信号强度随造模时间的延长呈连续下降趋势，各周之间差异具有明显的统计学意义(p＜0.05)。组织病理结果提示，软骨退变、GAGs含量的变化、软骨细胞死亡及骨赘形成的量化结果与光声信号强度具有良好的相关性;除软骨厚度外，OA关节的平均光声信号强度与OA损伤的组织学参数呈负相关(p＜0.05)。(5)PLL-MNPs在正常小鼠膝关节中的半衰期约为48小时。 结论：本课题成功制备了光声特性及生物相容性良好的阳离子光声纳米探针PLL-MNPs。通过体外软骨及体内实验研究证实，PLL-MNPs能够特异靶向软骨中的GAGs，并敏感的监测到软骨基质中GAGs含量变化，从而实现可视化追踪骨关节炎疾病进展及分期。
关键词: 骨关节炎 ；关节软骨 ；糖胺聚糖 ；黑色素 ；光声分子成像
摘要： 光声分子影像技术因其结合了光声成像高对比和大穿透深度以及分子影像的高特异等优点,而被广泛作为一种新型医学成像模态用于疾病的诊断和治疗。近年来,基于生物体内源性分子探针如血红蛋白、黑色素等的光声分子成像可以显示出小动物皮下血管高清脉络和黑色素瘤的精准定位。但是对于如肿瘤、炎症病灶等特殊疾病的光声分子成像,血红蛋白、黑色素等内源性分子的光吸收和散射会显著增加成像的背景噪声以及影响成像的穿透深度。因此,设计和合成具有高特异性、强近红外吸收的外源分子探针成为迫切需要。本论文围绕光声分子探针的设计与合成,目标是对皮下移植瘤、深度原位脑胶质瘤以及类风湿性关节炎进行高灵敏、高特异和大深度的成像诊断。第一部分工作,针对皮下移植瘤的诊疗一体化研究,我们基于高生物相容性的过渡金属硫化物家族成员硒化钼和FDA批准的吲哚菁绿,设计并合成了一种新的光声成像/光热治疗纳米试剂（sMoSe2-ICG NSs）。sMoSe2-ICG NSs在近红外区830 nm处具有强吸收且具有很好的光稳定性和生物相容性。体内外实验表明了sMoSe2-ICG NSs具有优异的光声性能和光热转化能力,可以对乳腺癌4T1皮下移植瘤高灵敏成像,并对肿瘤内纳米材料的聚集浓度实时追踪,从而引导肿瘤的高效光热治疗。本工作的创新点在于巧妙的将ICG连接到硒化钼表面,既增加了硒化钼的近红外吸收,又增加了ICG的体内循环时间,使sMoSe2-ICG NSs成为高效的光声成像/光热治疗试剂。第二部分工作,第一部分结果显示我们成功的实现了皮下移植瘤的高特异、高灵敏光声成像。但是对于位于颅骨下的原位脑胶质瘤的高灵敏光声成像仍然是一个挑战。我们选择了过渡金属硫化物家族另一个成员硫化钼作为载体,装载上ICG后形成了一种新的纳米探针（MoS2-ICG）。表征实验结果表明,MoS2-ICG的最强吸收峰位于800 nm,在近红外生物窗口内。仿体实验结果显示,相比可见光区675 nm波长,800 nm脉冲激光照射下可以很好的穿透颅骨。在体实验结果进一步证实了MoS2-ICG通过尾静脉进入小鼠体内后5小时,800nm脉冲激光可以显著激发原位脑胶质瘤内富集的MoS2-ICG探针的光声信号,光声图像显示肿瘤位于颅骨下3.5mm深度。本工作很好的说明了基于近红外分子探针的光声分子影像可以对大深度病灶进行高灵敏的成像。第三部分工作,类风湿关节炎（RA）是一种常见的免疫性骨关节炎症性疾病,其发病隐匿、病因不详,早期出现红肿热痛,随着病情的发展,骨关节出现骨侵蚀最终导致残疾。RA的早期识别和治疗对于达到有效的治疗效果至关重要。相比肿瘤病灶,RA病灶血液丰富、炎症分子分布在软骨和骨头周围,对光声分子成像的穿透能力要求更高。近年来,由于其具有大组织穿透深度、高信噪比等特性,近红外二区（NIR-II）光声分子成像（PMI）技术为我们了一种可选择的策略。但是目前仍然缺乏RA特异性的近红外二区分子探针。在此,我们设计和合成了一种托珠单抗（TCZ）修饰的共轭聚合物纳米颗粒（TCZ-PNPs）。TCZ-PNPs具有很强的NIR-II消光系数,高光稳定性和生物相容性。体内研究显示,TCZ-PNPs具有出色的靶向能力,可在3D PA断层扫描图像中以35.8 dB的高信噪比（SNR）对RA关节组织进行有效的非侵入性诊断。值得注意的是,使用TCZ-PNPs进行的为期一个月的治疗和PA监测显示,RA被显著抑制。光声的诊疗结果与临床Micro-CT和组织学分析结果一致。本工作很好的证明了NIR-II光声分子成像技术可以对复杂组织环境的RA病灶进行高特异、高信噪比的成像,研发的TCZ-PNPs辅助的NIR-II光声分子成像为RA治疗学,治疗监测等领域提供了一种新的策略。综合以上三个研究工作,我们成功实现了从被动靶向探针合成到高靶向探针合成以及从近红外一区探针设计到近红外二区探针设计的技术提升;从低深度病灶到大深度病灶高灵敏高信噪比成像的空间跨越。系统地阐明了光声分子成像技术相比其他光学成像技术对不同组织深度和背景病灶精准诊断的优越性。
关键词: 光声成像技术 ；分子影像 ；成像探针 ；肿瘤诊疗一体化 ；类风湿性关节炎
被引量
1
摘要： 目的: 纳米材料作为新型造影剂凭借其小尺寸、高比表面积和易修饰等特性在生物成像等领域发挥着重要作用。其中,纳米对比剂的功能化修饰是实现高靶向性生物成像的关键。本研究旨在探究功能化纳米对比剂的不同构建策略及其在分子影像领域的应用,以深入了解其在疾病诊断和监测中的潜在作用。通过对比剂的表面功能化修饰,提高其靶向性和生物相容性,从而改善成像效果,为生物医学成像提供更为精准和灵敏的工具。传统纳米对比剂由于较低的靶向效率和高毒性水平,限制了其的进一步发展。在没有任何靶向分子附着的情况下,这些纳米颗粒通常表现出全身的非特异性分布,很难根据特定病变或组织的生物学差异进行优化,可能对生物体产生不必要的影响,严重限制了其应用场景。功能化对比剂的开发旨在增强探针的成像性能并显著提升纳米颗粒的靶向性,以进一步提高图像对比度。在第一部分内容中,首先讨论了基于生物膜修饰的仿生纳米技术,与传统的功能化策略相比,细胞膜修饰提供了一种创建多功能纳米探针的简易手段,是十分有潜力的纳米颗粒功能化修饰方式。肿瘤源性细胞外囊泡是一类来源于肿瘤细胞的天然囊泡,其膜结构与肿瘤细胞相似,具有良好的同源肿瘤细胞归巢能力,可被开发作为优良的纳米递送载体。黑色素作为一种内源性生物聚合物,具有天然的生物相容性和可降解性,通过对其进行修饰可实现多种成像功能。因此,本部分中拟用肿瘤源性细胞外囊泡对黑色素纳米颗粒进行修饰,赋予该纳米对比剂良好的肿瘤靶向能力,以实现高生物安全性的肿瘤靶向多模态成像。在第二部分中将着重聚焦于小分子有机对比剂的靶向性修饰合成和脑胶质瘤成像应用。脑胶质瘤因其所处位置较深且有颅骨和头皮的覆盖,对传统光学成像提出了挑战。与常规可见光相比,生物组织在NIR-Ⅱ窗口中的消光系数显著降低,表现出较弱的光子散射、吸收和自发荧光。因此,NIR-Ⅱ生物成像具有更深的组织穿透深度、更高的对比度和分辨率。在本部分中拟设计一种具有脑胶质瘤靶向能力的NIR-Ⅱ光学成像探针,来实现原位脑胶质瘤的NIR-Ⅱ荧光和光声的双模态分子成像。 方法: 第一部分:基于黑色素纳米囊泡的多模态分子成像 1.1 TDMVs+MNP-Gd的制备和表征:制备螯合了钆离子的黑色素纳米颗粒（MNP-Gd）,并在最优条件下分离提纯得到肿瘤细胞外囊泡（TDMVs）后,将两者共孵育得到TDMVs+MNP-Gd。分别完成对MNP-Gd、TDMVs和TDMVs+MNP-Gd的物理特性、稳定性和光学成像能力的表征。 1.2 TDMVs+MNP-Gd的体外实验:通过细胞毒性实验来评价纳米对比剂的体外生物安全性,并在体外对其光声成像能力和MR成像能力进行验证。 1.3 TDMVs+MNP-Gd的体内成像实验:建立小鼠肝癌皮下瘤模型,尾静脉注射TDMVs+MNP-Gd纳米探针后在不同时间点进行MR和光声扫描,分析该探针的肿瘤成像情况。 1.4 TDMVs+MNP-Gd的体内生物分布评价:分别在不同时间点收集尾静脉注射TDMVs+MNP-Gd纳米探针后的小鼠脏器,采集各主要脏器的光声信号,并使用ICP-MS对各脏器的消解溶液进行检测,分析TDMVs+MNP-Gd在体内的生物分布情况。 1.5 TDMVs+MNP-Gd的体内毒性评估:TDMVs+MNP-Gd尾静脉注射24小时后,收集其主要器官进行H&E染色,评估该探针对各组织的病理损伤情况。 第二部分:靶向探针用于原位脑胶质瘤的光学成像 2.1靶向性探针IR-32p的合成和表征:用靶向基团c RGDfk对光学探针IR-32p进行修饰,得到具有靶向整合素αvβ3能力的对比剂,并对其基本理化特性进行表征。 2.2 IR-32p的稳定性测试:分别对该探针的光稳定性和介质稳定性等特性进行评价。 2.3 IR-32p的体外穿透深度测试:使用鸡胸肉组织测试不同波长下光声信号与组织穿透深度的关系。 2.4 IR-32p的体外细胞实验:通过细胞毒性实验来评价其体外生物安全性和对细胞的光毒性,并且在体外对其光声和荧光成像性能进行验证。此外,在细胞层面对其靶向肿瘤细胞的能力进行测试。 2.5 IR-32p的体内毒性评估:IR-32p经尾静脉注射24小时后,采集血样进行血常规和血液生化分析,并收集其主要器官进行H&E染色,以评估该探针对各组织的病理损伤情况。 2.6 IR-32p的体内光声和荧光成像:首先使用U87MG皮下瘤小鼠模型分别通过NIR-Ⅱ荧光成像、NIR-Ⅰ光声和NIR-Ⅱ光声成像对该探针的肿瘤靶向能力进行评价。之后在原位脑胶质瘤小鼠模型中进行光声成像,并对不同波长下该探针的靶向成像能力进行对比和评价。 结果: 第一部分:基于黑色素纳米囊泡的多模态分子成像 1.1成功制备得到了具有良好光学吸收和MR成像能力的TDMVs+MNP-Gd,并验证了其在不同介质中的杰出稳定性。 1.2 TDMVs+MNP-Gd的体外实验证实其有良好的生物安全性,并且对其成像性能进行测试后发现,该纳米颗粒具有良好的光声及MR成像的能力。 1.3小鼠肝癌皮下瘤模型中进行的MR和光声双模态成像结果发现,通过尾静脉注射TDMVs+MNP-Gd后,肿瘤部位的光声信号强度在注射6小时后表现出峰值。随后,肿瘤组织的光声信号在第8小时出现略微的减弱,并且随着时间的推移持续衰减,在24小时后基本回到注射前水平。 1.4通过尾静脉注射后不同时间点各器官组织的光声成像研究TDMVs的生物学分布行为发现,随着时间的推移,TDMVs+MNP-Gd注射6小时后,肝脏的信号强度达到最高水平,之后逐渐下降。然而,注射8小时后,肾脏部位的信号逐渐达到峰值。此外,通过ICP-MS对小鼠肝脏和肾脏中的Gd3+含量进行测定后发现了同样的分布趋势。 1.5体内安全性测试中,通过H&E染色发现各组脏器均没有发生明显的器质性病变,表明该探针具有良好的生物安全性。 第二部分:靶向探针用于原位脑胶质瘤的光学成像 2.1成功合成了一种基于小分子的αvβ3靶向NIR-Ⅱ光声/荧光双模态探针IR-32p。该探针在水中的最大吸收波长为1094 nm,在900 nm下IR-32p的发射峰在1120 nm。 2.2 IR-32p表现出良好的NIR-Ⅱ光稳定性和介质稳定性,表明该探针在长期NIR-Ⅱ荧光和光声成像中具有极好的稳定性和活力。 2.3体外穿透深度实验发现IR-32p在NIR-Ⅱ窗口中的最大穿透深度超过2厘米。且在相同条件下,该探针在1020 nm处的NIR-Ⅱ光声成像始终显示出比800 nm处更高的背景信号比,表明NIR-Ⅱ光声成像在深度穿透方面相对于NIR-Ⅰ光声成像表现更优越。 2.4 IR-32p的细胞毒性实验证实其有良好的生物安全性和可忽略的光毒性。并且与阻断组相比,在高表达αvβ3整合素的实验组中,U87MG细胞表现出强的荧光信号。而同样在与该探针孵育后,低表达αvβ3整合素的293T细胞中表现出弱的荧光信号。 2.5体内安全性测试中,H&E染色结果发现各组脏器没有发生明显的器质性病变,且各组小鼠的血常规和血清生化指标均维持在正常水平,表明该探针具有良好的生物安全性。 2.6在皮下荷瘤小鼠模型中进行靶向性验证实验发现,肿瘤部位的NIR-Ⅱ荧光信号在注射6小时后达到最高值,并且在注射后24小时显著减弱。荧光成像中,阻断组小鼠肿瘤部位的荧光信号强度在整个观察期间内与单纯IR-32p注射组小鼠相比均有所下降。单纯IR-32p注射组肿瘤部位的光声信号强度在注射后5小时达到最强,并且在1020 nm波长下观察到了更高的对比度。 2.7在原位脑胶质瘤小鼠模型中进行NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ光声成像发现,在探针注射6小时后可以清楚观察到直径约为1毫米的微小脑胶质瘤,并且在NIR-Ⅱ光声成像中具有更好的对比度和定位深度的准确性。 结论: 功能化纳米对比剂相较于传统对比剂在分子影像中表现出更高的选择性和灵敏度。对纳米探针进行靶向性修饰能使其更精准地定位病灶,并在成像过程中提供更为清晰的信号。此外,通过对纳米对比剂的功能性修饰可以显著改善其生物相容性,降低不良反应风险。其中,利用肿瘤源性细胞外囊泡对黑色素纳米颗粒进行修饰,可以赋予其优良的同源肿瘤细胞归巢的靶向能力。并且借助黑色素纳米颗粒的多模态成像功能可以同时完成对细胞外囊泡的生物分布可视化。对于有机小分子探针的靶向性修饰,为实现能穿过颅骨和头皮的深层脑胶质瘤的光学成像带来了新的可能性。靶向性探针IR-32p的NIR-Ⅱ光学成像能够为原位脑胶质瘤提供精确的定位信息,并勾勒出清晰的肿瘤轮廓。此外,通过与NIR-Ⅰ光声成像结果对比,进一步凸显了NIR-Ⅱ成像在深层次组织光学成像上的巨大优势。总之,本研究从细胞膜修饰仿生技术和小分子有机对比剂的靶向性修饰两个方面入手,验证了功能化纳米对比剂在分子影像领域的潜在价值。功能化纳米对比剂的不断发展将为医学影像学提供更多创新性工具,有望为疾病的早期诊断和监测提供更为精确的手段。
关键词: 功能化纳米对比剂 ；分子影像 ；生物膜修饰 ；靶向探针 ；有机小分子
摘要： 无损光声成像技术结合了纯光学成像高选择特性和纯超声成像中深穿透特性的优点，克服了光散射限制，实现了对活体深层组织的高分辨、高对比度成像。该成像技术对内源物质例如脱氧血红蛋白、含氧血红蛋白、黑色素、脂质等进行成像，提供了活体生物组织结构和功能信息，已经在生物医学领域表现出巨大的应用前景。然而，很多与病理过程相关的特征分子的光吸收能力较弱，在活体环境中难以被光声成像系统所识别，从而限制了光声成像技术的应用范围。基于功能纳米探针的光声成像一光声分子成像极大拓展光声成像的应用范围，可以在活体层面对病理过程进行分子水平的定性和定量研究，将为实现目标疾病的早期诊断提供强大的技术支持。 多种成像模式的结合可实现不同成像模式的优势互补，从而弥补单一成像技术的不足，是未来分子影像学的发展方向之一。多模探针是联合各个成像模式的桥梁。对现有光声探针进行修饰，从而增加特定的物理特性，使其同时具备增强某种或者多种医学成像对比度的能力，这样的多模探针将有助于光声成像与其它成像模式的结合，实现多尺度、跨层次、高分辨率结构和功能成像。 本论文在课题组已有研究工作的基础上，主要开展了以下工作: 1.为了容易地识别与病理相关的特征分子，光声分子成像急需高光-声转化效率的探针。本论文从光声信号产生的机理出发，发现了通过焠灭探针的荧光可以实现光—声转化效率的最大化。据此，我们构建了基于荧光能量共振转移效应的高效光声探针。该探针由氧化石墨烯和染料构成。氧化石墨烯作为基底材料既可用于负载染料（通过π-π键的相互作用），又可以通过荧光能量共振转移效应焠灭负载在其表面的染料的荧光。实验结果显示，在相同条件下，新构建的荧光能量共振转移型探针产生的光声信号高于单独氧化石墨烯和单独染料产生的光声信号之和。我们将此荧光能量共振转移型探针应用于提高深层组织和活体肿瘤的光声成像对比度，展现了其在光声肿瘤成像领域的应用前景。进一步地，在离体和活体研究中，我们发现荧光能量共振转移型探针的光声治疗效率高于常用的光声治疗剂。通过荧光能量共振转移效应提高无辐射跃迁几率将为发展高效的光声探针提供一种有效的方法。荧光能量共振转移型探针有望用于深层肿瘤的光声分子成像和光声治疗中。 2.巨噬细胞的聚集是高风险动脉粥样硬化斑块的特性之一。如何识别易损斑块已经成为动脉粥样硬化领域中的重要研究内容。定量检测动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞对血管壁的浸润程度将有助于医生判断斑块的易损性。本文成功构建了适用于核磁共振成像和光声成像的双模探针—钆离子修饰的纳米金棒（GdⅢ-GNRs），并将该探针应用于定量检测动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞。实验证实了GdⅢ-GNRs可以同时提高核磁共振成像和光声成像的对比度。实验验证了GdⅢ-GNRs可被巨噬细胞吞噬。进一步地，基于GdⅢ-GNRs，我们提出并且实现了一个多尺度互补成像的方案:巨噬细胞被GdⅢ-GNRs标记后，核磁成像系统体外扫描确定巨噬细胞聚集的位置（斑块炎症可疑区域）;根据核磁成像提供的空间位置信息，内窥光声成像系统对可疑区域进行成像，获取细微结构和定量化信息即血管壁结构，巨噬细胞浸润的深度、浸润的面积。这些信息将有助于医生判断斑块的易损性。核磁共振成像和光声成像的双模探针将有希望用于定量检测动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞。 3.为了准确监测探针在活体中的靶向行为和监测肿瘤的微环境，基于辐射和非辐射跃迁竞争机制的光声-荧光互补成像系统被开发和应用。结果表明光声-荧光互补成像方法通过同时探测辐射（荧光）和非辐射能量（光声波），可以从多视角监测探针的靶向行为。当探针的荧光（或者光声）信号消失时（例如荧光被淬灭），光声-荧光互补成像方法通过监测其互补信号:光声（或者荧光）信号，依然可以执行监测功能。这将为准确监测探针在活体中的靶向行为提供新的方法。有趣的是，我们在研究中发现肿瘤的生理环境对探针有很大的影响，它可以改变荧光/光声信号的平衡。这将有可能为活体肿瘤的生物事件提供新的标识，例如肿瘤氧化还原状态的改变。此新方法的应用将为实时监测探针的靶向行为和肿瘤对个性化治疗的反应提供新的工具。
关键词: 光声成像 ；功能纳米探针 ；荧光共振转移 ；核磁共振成像 ；双模成像探针 ；生物医学