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摘要： 生物活性物质是一类对机体具有重要生理功能和保健治疗功效的成分，包括酶类、益生菌、挥发油类等。然而，生物活性物质普遍存在物化稳定性低、胃肠道易失活、活性较难保持等不足之处。当前，研究者多用微胶囊包埋技术以提高其稳定性，但仍存在包埋率低、工艺繁琐、控释能力弱作用等缺点。多肽自组装水凝胶由于生物相容性好、无毒性、构型多样、环境响应性良好等特点，在药物递送、组织工程、控制释放以及食品包埋等多个领域具有十分广阔的应用前景。 本研究在多肽及其杂化胶对食品生物活性物质的包埋方面开展了系列工作。主要为选择具有优异自组装和环境响应能力的多肽与明胶组成杂化水凝胶，以及使用单独的多肽水凝胶，对常见的不稳定性生物活性物质包埋并进一步研究胶体的性质及应用。主要结果如下: (1)利用具有肠溶性的Fmoc-Y分子、具有抵御胃酸能力的高机械性明胶制备Fmoc-Y/明胶自组装杂化水凝胶。。流变结果显示，在37℃时，Fmoc-Y/明胶在酸性条件下可以通过自组装作用逐渐形成水凝胶，且水凝胶的储能模量(G')与明胶的浓度呈正相关。圆二色谱(CD)分析证实杂化胶中Fmoc-Y减弱了明胶三螺旋二级结构的形成。红外光谱(FTIR)测试表明杂化胶的形成主要是由于氢键、疏水作用力的作用，而非形成共价键。扫描电子显微镜(SEM)结果可知，杂化胶表面具有多孔结构，内部形成网络空间构型。通过对不耐胃酸的乳糖酶进行包埋应用，结果显示，Fmoc-Y/明胶杂化胶的配比在明胶浓度55％、Fmoc-Y和明胶质量比为1/14时，通过模拟胃肠环境处理后，乳糖酶的酶活保留率达到85.2％，远远高于经过模拟胃肠道处理但未经包埋的乳糖酶的酶活。高效液相色谱(HPLC)结果证实经杂化胶包埋后，乳糖酶能够以较高的酶活性在pH为中性的模拟肠道环境中被释放出来并分解乳糖，且其对乳糖的分解能力比经过同样处理但未经包埋的乳糖酶的能力要强。 (2)利用Fmoc-Y/明胶自组装杂化水凝胶，进一步研究了其对肠道益生菌的保护作用。保加利亚乳杆菌对高温、强酸和胆盐不耐受影响了其进入肠道时的活菌数。经明胶浓度40％、Fmoc-Y和明胶质量比为1/14的杂化水凝胶包埋，保加利亚乳杆菌在通过模拟胃液环境后存活率高达81.9％，在经过模拟肠液处理后被释放出来后活菌数还能达到107 CFU/mL数量级，对人体具有良好的益生功效。 (3)对多肽自组装水凝胶的研究过程中，进一步发现了一种与Fmoc-Y具有截然相反的环境响应性短肽分子——Fmoc-F。利用具有中性pH成胶、酸性pH溶胶特性的Fmoc-F分子，对物化稳定性较低的抑菌物质大蒜精油进行包埋。结果显示，Fmoc-F自组装多肽水凝胶对大蒜精油包埋率可达97.07％;pH≤5.0时，Fmoc-F水凝胶能快速分解释放大蒜精油，抑制大肠杆菌的生长;对添加包埋了大蒜精油的Fmoc-F水凝胶的布丁食品进行的感官评价，结果表明Fmoc-F水凝胶几乎可以完全掩盖大蒜精油的不良气味。
关键词: 控制释放 ；水凝胶 ；多肽自组装 ；生物活性 ；杂化胶
摘要： 生物活性物质是一类对机体具有重要生理功能和保健治疗功效的成分,包括酶类、益生菌、挥发油类等。然而,生物活性物质普遍存在物化稳定性低、胃肠道易失活、活性较难保持等不足之处。当前,研究者多用微胶囊包埋技术以提高其稳定性,但仍存在包埋率低、工艺繁琐、控释能力弱作用等缺点。多肽自组装水凝胶由于生物相容性好、无毒性、构型多样、环境响应性良好等特点,在药物递送、组织工程、控制释放以及食品包埋等多个领域具有十分广阔的应用前景。本研究在多肽及其杂化胶对食品生物活性物质的包埋方面开展了系列工作。主要为选择具有优异自组装和环境响应能力的多肽与明胶组成杂化水凝胶,以及使用单独的多肽水凝胶,对常见的不稳定性生物活性物质包埋并进一步研究胶体的性质及应用。主要结果如下:(1)利用具有肠溶性的Fmoc-Y分子、具有抵御胃酸能力的高机械性明胶制备Fmoc-Y/明胶自组装杂化水凝胶。。流变结果显示,在37℃时,Fmoc-Y/明胶在酸性条件下可以通过自组装作用逐渐形成水凝胶,且水凝胶的储能模量(G')与明胶的浓度呈正相关。圆二色谱(CD)分析证实杂化胶中Fmoc-Y减弱了明胶三螺旋二级结构的形成。红外光谱(FTIR)测试表明杂化胶的形成主要是由于氢键、疏水作用力的作用,而非形成共价键。扫描电子显微镜(SEM)结果可知,杂化胶表面具有多孔结构,内部形成网络空间构型。通过对不耐胃酸的乳糖酶进行包埋应用,结果显示,Fmoc-Y/明胶杂化胶的配比在明胶浓度55%、Fmoc-Y和明胶质量比为1/14时,通过模拟胃肠环境处理后,乳糖酶的酶活保留率达到85.2%,远远高于经过模拟胃肠道处理但未经包埋的乳糖酶的酶活。高效液相色谱(HPLC)结果证实经杂化胶包埋后,乳糖酶能够以较高的酶活性在pH为中性的模拟肠道环境中被释放出来并分解乳糖,且其对乳糖的分解能力比经过同样处理但未经包埋的乳糖酶的能力要强。(2)利用Fmoc-Y/明胶自组装杂化水凝胶,进一步研究了其对肠道益生菌的保护作用。保加利亚乳杆菌对高温、强酸和胆盐不耐受影响了其进入肠道时的活菌数。经明胶浓度40%、Fmoc-Y和明胶质量比为1/14的杂化水凝胶包埋,保加利亚乳杆菌在通过模拟胃液环境后存活率高达81.9%,在经过模拟肠液处理后被释放出来后活菌数还能达到107 CFU/mL数量级,对人体具有良好的益生功效。(3)对多肽自组装水凝胶的研究过程中,进一步发现了一种与Fmoc-Y具有截然相反的环境响应性短肽分子——Fmoc-F。利用具有中性pH成胶、酸性pH溶胶特性的Fmoc-F分子,对物化稳定性较低的抑菌物质大蒜精油进行包埋。结果显示,Fmoc-F自组装多肽水凝胶对大蒜精油包埋率可达97.07%;pH ≤ 5.0时,Fmoc-F水凝胶能快速分解释放大蒜精油,抑制大肠杆菌的生长;对添加包埋了大蒜精油的Fmoc-F水凝胶的布丁食品进行的感官评价,结果表明Fmoc-F 水凝胶几乎可以完全掩盖大蒜精油的不良气味。
关键词: Fmoc-Y ；Fmoc-F ；明胶 ；自组装 ；杂化胶 ；控制释放
被引量
5
摘要： [目的]制备一种负载白藜芦醇的自组装多肽水凝胶并探讨其抗菌性能。[方法]通过自组装制备多肽(Fmoc-FFGGRGD)水凝胶和载有白藜芦醇的多肽水凝胶(Pep/RES);通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察水凝胶的形貌和内部结构;通过流变仪检测水凝胶的流变性质;通过高效液相色谱检测Pep/RES的释放速率;通过细胞毒性试验研究该水凝胶的生物相容性;通过抑菌圈实验和活死细菌染色研究Pep/RES对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。[结果]多肽溶液可在30 min内自组装形成稳定的水凝胶,水凝胶内部的三维结构密度随多肽浓度的增加而增加,2.0wt%浓度的多肽水凝胶稳定效果最好。白藜芦醇从Pep/RES水凝胶中缓慢释放7 d释放量达到50%,Pep/RES浸泡液对NIH/3T3细胞表现出良好的生物相容性。Pep/RES水凝胶中负载的白藜芦醇浓度为512μg/m L时,对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径即可达到5.41±0.18 mm,但即使白藜芦醇浓度达到1024μg/m L,对大肠杆菌的抑菌圈直径仅为4.27±0.22 nm。[结论]Pep/RES结构稳定,安全无毒,能缓释白藜芦醇,并对金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用。
关键词: 多肽水凝胶 ；白藜芦醇 ；自组装 ；抗菌
被引量
3
摘要： 以糖蛋白GPIbβ跨膜区C-末端一段序列为基础,采用Fmoc固相合成法合成多肽pal-RLRRLRARARA(简称p-RRL,pal是脂肪酸的简写,分子式C16H32O2);考察了此多肽自组装性质以及不同环境对此多肽自组装的影响;采用圆二色谱测试了不同条件下多肽分子间的微观排列情况,并利用透射电镜和扫描电镜对形成的凝胶的形貌进行表征。研究发现多肽p-RRL可以自组装成pH敏感型超分子水凝胶;pH、溶剂以及温度均会对多肽的二级结构产生影响,进而影响多肽自组装;虽然β-折叠结构有利于成胶,然而并不是所有能够形成水凝胶的多肽二级结构均是β-折叠。
关键词: 多肽自组装 ；水凝胶 ；环境影响
被引量
8
【专利/发明】 • CN202210718859.0 • •
申请日：2022-06-23,
公开日：2023-09-15
申请人： 南京凯玛生物科技有限公司
公开（公告）号： CN115040472B
摘要： 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种仿生可注射多肽水凝胶的制备及应用。本发明使用9‑芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的细胞外基质衍生的层粘连蛋白肽DDIKVAV(Fmoc‑DDIKVAV)和具有免疫刺激作用的多肽FTKPRF(Fmoc‑FTKPRF)作为水凝胶单体。该单元进一步利用氢键、疏水作用、π‑π堆积等非共价键力可在37℃条件下短时间内自组装形成水凝胶。该仿生杂合多肽水凝胶具有可注射性能且可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤残余肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。
【专利/发明】 • CN202210718859.0 • •
申请日：2022-06-23,
公开日：2022-09-13
申请人： 山东大学
公开（公告）号： CN115040472A
摘要： 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种仿生可注射多肽水凝胶的制备及应用。本发明使用9‑芴甲氧羰基(Fmoc)修饰的细胞外基质衍生的层粘连蛋白肽DDIKVAV(Fmoc‑DDIKVAV)和具有免疫刺激作用的多肽FTKPRF(Fmoc‑FTKPRF)作为水凝胶单体。该单元进一步利用氢键、疏水作用、π‑π堆积等非共价键力可在37℃条件下短时间内自组装形成水凝胶。该仿生杂合多肽水凝胶具有可注射性能且可作为药物储库植入肿瘤手术后形成的空腔中，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在手术后形成的空腔局部内缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤残余肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。
会议时间： 2017-04-14
摘要： 二苯丙氨酸二肽（FF）分子是构筑生物微纳结构材料最简单的基元,其自组装过程简单,容易修饰和改性,可以形成不同的自组装结构,形成的自组装结构材料具有良好的生物相容性和热化学稳定性,是最硬的生物材料,这些性质对于FF自组装材料的应用具有非常重要的意义。我们实验室近年来研究一系列二肽复合材料,包括二肽纳米线-石墨烯（PNWs-G）,二肽纳米管-壳聚糖（PNT-CS）,二肽–金纳米粒子杂化球（DP-AuNPs HS）等复合材料,来改善FF自组装材料存在的问题,并对其电化学性能进行了研究,将其应用于NADH、K562细胞及HO的高灵敏检测中。此外,我们也发展了基于FF的衍生分子N–芴甲氧羰基二苯丙氨酸（Fmoc-FF）的电化学传感器,利用其独特的三维网状水凝胶结构,包埋了GOD,HRP,SOD等生物酶分子,构建了葡萄糖、过氧化氢、超氧阴离子等生物传感器,并将其应用于2D及3D培养细胞的释放物的原位检测中。我们相信FF形成多种多样的纳米结构将提供无穷的生物纳米材料组合,对于电化学传感领域新材料的寻找和其生物分析应用具有重要的指导意义。
关键词: 二肽 ；电化学生物传感器
【会议论文】 • 宋爱新
会议时间： 2015-07-17
摘要： 多肽具有良好的生物相容性以及组成的单元氨基酸数目和排列的可设计性,因此在自组装聚集体材料研究方面具有重要价值[1]。并且当体系中引入金属离子时,多肽或者氨基酸能够通过配位等作用和金属离子发生自组装形成一定结构的金属复合物聚集体[2,3],所形成的这些复合物材料在生物传感器、抗菌等方面具有潜在的应用价值。本文研究了由芴甲氧羰基封端修饰的寡肽Fmoc-GCE在氢氧化钠溶液中通过和银离子的配位作用自组装形成的纳米纤维(Fig.1a)。在自组装过程中,可以同时形成尺寸均一的银纳米颗粒,并稳定负载于纳米纤维中(Fig.1b)。所形成的复合物表现出了抗菌能力以及对染料的催化降解能力(Fig.2)。适当条件下,纳米纤维聚集体可以进一步在三维空间交缠而形成水凝胶,该凝胶对吡啶和三聚氰胺具有可逆响应性,可发生凝胶-溶胶的可逆转化。另外,通过一系列表征手段如红外光谱、圆二色、紫外、X射线衍射、TEM等的测定,推测了聚集结构形成机理。多肽和银离子配位以及芴基的-堆积是使分子自组装发生的主要驱动力,此外,分子间其它的弱相互作用如氢键、疏水作用、范德华力等也发挥了协同作用,共同实现了多肽分子的自组装。
关键词: 多肽 ；配位 ；自组装 ；纳米纤维 ；纳米颗粒
摘要： 自组装在自然界中扮演着重要的角色,为功能材料的设计和构造提供了一种先进的技术。在自组装的引发因素中,酶控自组装由于其具备较高的可控性和生物相容性而被应用到各种生命进程中。以碱性磷酸酶调控的多肽自组装为例,它通常包括两个步骤,首先底物分子在碱性磷酸酶的催化作用下脱去磷酸根,随后去磷酸根产物通过分子间相互作用进行自组装从而用于生物材料制备,生物成像,癌症治疗,药物递送等。本课题基于碱性磷酸酶调控的多肽自组装反应,设计了几种新型的磷酸化自组装前体分子用于生物学过程,如肿瘤成像分析和细胞毒性研究,以实现对早期癌症的高灵敏诊断,或者为开发用于癌症治疗的纳米药物提供新思路。本论文第二章中,采用酶控自组装策略,我们合理设计了近红外光声探针1P,用于体外和肿瘤的光声成像。在碱性磷酸酶的催化下,1P被有效地转化为1,并自组装形成纳米粒子1-NPs。纳米粒子的形成猝灭近红外荧光,同时增强光声信号。利用这一性质,我们开发了一种体外测定碱性磷酸酶活性的方法。体内光声成像结果表明,可激活光声探针1P可用于增强肿瘤的光声成像信号,注射了 1P的过表达碱性磷酸酶的HeLa肿瘤的光声信号相比于用碱性磷酸酶抑制剂预处理的对照组肿瘤的光声信号明显增强。该策略可以应用于浅表过表达碱性磷酸酶的肿瘤的高灵敏诊断。此外我们还可以将1P中的Phe-Phe-Tyr(H2PO3)-OH序列替换为其他酶切序列,并应用于相应癌症的诊断。本论文第三章中,我们设计了三种超分子水性凝胶因子及其磷酸化前体分子,并系统地研究了氟取代对其自组装能力和细胞毒性的影响。结果表明苯丙氨酸芳香侧链的氟取代而不是三氟取代可以增强超分子水性凝胶因子的自组装能力。在所有研究的物理和酶促水凝胶之中,凝胶2和凝胶2P具有更强的力学性能。细胞毒性研究表明,单氟原子取代的水性凝胶因子2具备最高的自组装能力,同时也表现出最高的细胞毒性。我们设想对氟取代水凝胶的初步研究将为开发具有更广泛生物医学应用的超分子水凝胶提供新的策略。本论文第四章中,我们合理设计了芘-多肽共轭偶联物Py-Phe-Phe-Glu-Tyr(H2PO3)-Gly-lyso(Py-Yp-Lyso),并对肿瘤细胞进行了溶酶体靶向的细胞毒性实验,其芘(Py)激基缔合物荧光在480 nm处“开启”。体外实验结果表明,Py-Yp-Lyso被碱性磷酸酶催化去磷酸根,生成Py-Phe-Phe-Glu-Tyr-Gly-lyso(Py-Y-Lyso),并自组装形成纳米纤维。细胞实验证实了被HeLa细胞摄取后,Py-Yp-Lyso组装体的激基缔合物荧光“开启”,并且组装体特异性靶向溶酶体,使得溶酶体膜通透性增强,最终杀死癌细胞。体内实验表明在研究的四种化合物中,Py-Yp-Lyso对HeLa肿瘤的抑制作用最强。我们期望在未来的临床试验中使用Py-Yp-Lyso来达到治疗癌症的效果。本论文以碱性磷酸酶调控的多肽自组装为基础,研究了其在肿瘤成像分析和细胞毒性研究中的应用。我们期望这种“智能”策略能为早期癌症的高灵敏诊断和开发新型抗癌纳米药物提供指导意义。
关键词: 碱性磷酸酶 ；多肽 ；自组装 ；光声成像 ；细胞毒性
摘要： 选择不同的构筑单元,调控多种非共价相互作用（π-π堆积,氢键等）,可以得到结构有序的超分子自组装体,并表现出单体所不具备的优异新特性。手性是不同尺度物质体系的本质属性之一,而超分子手性则是超分子组装中的重要一环。通过调节现超分子组装体系的纳米结构转变以及手性的传递和放大,对于探索超分子组装体结构和手性调控的方法和原理,进一步加深对自然界复杂体系的变化以及分子间相互作用的理解,具有十分重要的意义。具有大共轭平面结构的酞菁分子,改变周边取代基以及中心配位金属可以表现出多种理化性质;二肽分子则可以通过氢键和静电作用构筑具有良好的稳定性和生物相容性的超分子水凝胶体系。目前,酞菁和二肽分子因其高度可调性和广阔的应用范围,在超分子自组装和超分子手性研究领域都备受关注。本文选择以不同取代基单、双层酞菁和N-芴甲氧羰基保护的苯丙氨酸二肽分子（Fmoc-FF）为研究对象。通过多种组装和调控方法,对双层酞菁在二维气-液界面Langmuir-Boldgett（LB）膜以及酞菁和二肽分子在三维水凝胶体系的纳米结构和手性的调控,以及新性质的出现进行研究,来探究超分子自组装过程中产生的神奇现象和性质的原因。酞菁与其它超分子组装体系结合,尤其是具有生物活性和三维纳米结构的超分子水凝胶体系共组装还有待发展。将微量的八羧基酞菁锌配合物{Zn[Pc（COOH）8]}（Pc）分子与大量Fmoc-FF混合组装,探索酞菁平面共轭分子对Fmoc-FF组装体的影响。研究发现,加入微量Pc后Fmoc-FF分子组装体的二级结构发生了很大的改变,产生了大量Helix二级结构。而基于二级结构的多层次组装,使得体系从纤维状结构转变为了长程有序的螺旋纳米管状结构,并且表现出很强的圆偏振发光（CPL）性质,具有较大的不对称因子（glum=0.04）。这个结果说明微量Pc分子就可以调控Fmoc-FF组装体的结构转变,手性重组和激发态手性的出现与放大。这些结果为利用微量的辅助因子调控螺旋结构和具有CPL特性的超分子纳米管的生成,提供了新的思路。尽管Pc与Fmoc-FF之间一般意义上的非共价相互作用很弱,微量Pc却能对Fmoc-FF组装体产生了巨大的影响。另一方面,从Fmoc-FF组装体到Pc的手性传递并未发生。同时,Fmoc-FF作为一个优秀的超分子水凝胶构筑单元,在柔性材料和生物工程等领域有很强的应用前景。基于此,将Fmoc-FF自组装体作为手性主体,加入少量作为客体的非手性分子罗丹明B（RhB）分子,通过手性传递,得到具有可见光区域CPL特性的超分子水凝胶。同时,通过改变Fmoc-FF组装体系的缓冲溶液,成功实现了 Fmoc-FF组装体的形貌结构的改变,以及RhB超分子手性和激发态手性方向的调控。这些结果拓展了柔性光学材料调控的方法和途径。在二维气-液界面,利用LB技术对非手性双层酞菁的对称性破缺的研究依然是一个空白。本文将非手性的十六丁烷氧链取代铈双层酞菁分子(Ce（Pc1）2)作为自组装的构筑单元,通过LB技术,研究Ce（Pc1）2在气-液界面自组装形成的LB和Langmuir-Schaefer（LS）薄膜的结构及超分子手性。研究发现,Ce（Pc1）2的薄膜能在高表面压力下实现对称性破缺,产生超分子手性。然而最出乎意料的是,在室温和标准大气压下,Ce（Pc1）2的固态超分子自组装体能够自发的进行重组,伴随着螺旋纳米结构的形成和科顿（Cotton）效应的放大。实验结果说明,基于烷氧链取代的双层酞菁的二维自组装体系,可以实现对结构和超分子手性的优良调控。这些结果为超分子组装体系的调控研究提供了新的视角。尽管超分子自组装体的研究已经非常全面,但针对含有复杂芳香取代基的π共轭分子的超分子组装体的研究依然较少。利用LB技术对十六苯酚取代的双层铈、钇酞菁(Ce（Pc2）2和Y（Pc2）2)分子的超分子组装体进行了研究。研究发现双层酞菁在气-液界面以一种特殊的堆积方式进行多层次组装,形成了排列整齐的纳米颗粒。通过调节表面压力,可以进一步全面调控自组装体的纳米结构。这个研究结果为复杂π共轭体系的超分子组装开辟了新的途径。综上所述,利用多种酞菁和Fmoc-FF的共组装或自组装,成功在二维薄膜和三维水凝胶组装体系中实现纳米结构转变以及手性放大。为超分子组装体系结构和手性调控提供了新的思路与见解。
关键词: 超分子自组装 ；超分子手性 ；调控 ；酞菁 ；二肽
摘要： 多肽和DNA均具有独特的自组装性能和优越的生物相容性,在纳米生物材料领域越来越受到人们的关注。特定的短肽序列能够通过自组装快速形成纤维结构,在环境响应性生物材料、纳米药物等领域都有着广泛的应用。DNA通过碱基互补配对原则形成组装体,具有更强的可设计性,因而能够获得更加丰富多样的纳米形貌。多肽自组装材料与DNA自组装材料的杂交融合或许能够带来更多新的性质和组装策略,具有重要的研究意义。而由于DNA与多肽的合成方式不同,DNA-多肽复合物的构建也具有许多挑战,因此目前在这方面的研究还十分有限。肽核酸(PNA)作为一类人工合成的DNA类似物,具有与核酸相同的碱基侧链和与多肽相同的肽键骨架,能够方便地通过固相合成获得PNA-多肽的杂交序列,因而为研究多肽-核酸复合的自组装材料提供了便利。本论文初步探索了多肽与PNA杂交的自组装材料的设计,探究了PNA的碱基序列对于多肽纤维化自组装的影响规律,期望以此探索新颖的生物自组装材料的调控方式。在此基础上,进而构建了一种能够通过核酸序列杂交调控溶液-凝胶转换的多肽自组装水凝胶。本论文主要包括以下三个部分:(1)PNA-多肽体系的构建。本部分讨论了Fmoc/Boc正交保护的PNA单体的合成线路,PNA、多肽的合成原理及合成过程。同时探究了含有鸟嘌呤(G)的多肽-PNA复合序列的合成。其中的多肽序列能够形成稳定的纤维结构,而富含鸟嘌呤的核酸序列则倾向于以纳米颗粒形式组装。将这种具有较强自组装能力的碱基引入到多肽序列中,为研究PNA碱基对于多肽纤维化组装行为的影响奠定了基础。(2)G对多肽纤维化结构调控的研究。该部分探究了pH对原始多肽序列自组装形貌的影响,探究了不同数量G对多肽组装结构的影响,证实了多肽末端两个G的修饰可以完全抑制多肽的纤维化,使其形成纳米球形的组装体。而在溶液中加入与GG互补杂交的CC核酸序列,则能够抑制GG之间的相互作用,使得多肽的纤维化组装结构重现。该研究第一次揭示了G碱基的修饰对于多肽纤维化组装的影响作用,为多肽自组装结构的设计和调控提供了新的策略。(3)肽核酸多肽自组装水凝胶。我们探索了上述多肽-PNA复合序列通过多肽纤维化组装形成的交联网络制备多肽水凝胶的方法。加入CC互补序列能够迅速诱导PNA-多肽杂交序列形成自组装纤维,从而引发溶液向凝胶状态转化。该凝胶可以通过CC修饰进一步功能化。通过引入RGD多肽修饰的CC序列,能够获得RGD修饰的水凝胶,其具有良好的生物相容性,且成胶过程温和,不影响细胞活性,因而能够用于三维细胞培养。
关键词: 肽核酸 ；DNA ；多肽 ；水凝胶 ；三维细胞培养
摘要： 背景:植入体感染和骨整合不良常导致植入手术失败,给患者造成经济负担和身心伤害。因此,同时赋予植入体以抗感染和优良骨整合的特性十分必要。目前多种植入体表面改性材料,包括多肽锚定、金属元素沉积、生物活性药物负载和水凝胶涂层已被广为研究。但是复杂的改性过程或者生物安全性方面的潜在问题阻碍了这类材料的进一步转化及应用。利用层层自组装（LbL）来构建植入体多功能涂层简便易于实现,但却需要材料具备特殊的化学性质,如带相反电荷的聚电解质、氢键等,限制了LbL在植入体表面改性中的应用。 目的:基于现有植入体的表面功能化涂层制备工艺复杂、设备要求高、生物安全性低等缺点,构建具有普适黏附能力的单宁酸（TA）介导的LbL,实现通过简便、高效、生物安全性高的方法在植入体表面引入抗感染和促成骨成分,为植入体表面改性策略的开发提供新思路。 方法:1.选择钛（Ti）片作为基底,具有典型抗污作用的单端氨基聚乙二醇（PEG-NH2）和具有促成骨作用的生物矿化诱导剂（8DSS）作为功能组分。通过紫外照射促进TA在Ti表面均匀、快速的沉积,构建Ti/TA;在Ti/TA表面滴加8DSS溶液,静置20分钟,构建Ti/8DSS;进一步在Ti/8DSS表面形成新的TA涂层后滴加PEG-NH2溶液,静置24小时,沉积PEG,构建Ti/8DSS/PEG。通过数码照片记录各个样本的大体外观;通过傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、X射线光电子能谱分析（XPS）表征各个样本的化学组成和分子结构;通过荧光显微镜观察功能涂层的均匀性和稳定性;通过表面静态水接触角表征Ti/8DSS/PEG的表面湿润性;提取大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,通过CCK-8实验和活细胞/死细胞染色评价Ti/8DSS/PEG的细胞毒性。2.选择异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白（FITC-BAS）作为模式蛋白,通过荧光显微镜观察并对荧光染色图片进行半定量计算评价Ti/8DSS/PEG的抗蛋白黏附能力。选择金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）作为模式细菌,通过Syto 9染色与半定量分析、扫描电子显微镜（SEM）评价Ti/8DSS/PEG的抗细菌黏附能力。在模拟体液（SBF）中进行矿化实验,通过扫描电镜（SEM）观察新生矿物的微观形貌;通过X射线衍射技术（XRD）分析新生矿物的晶体结构及矿物类型。将矿化后的Ti/8DSS/PEG与BMSCs共培养,通过碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色（ARS）评价生物矿化后Ti/8DSS/PEG的促进BMSCs成骨向分化能力。3.构建大鼠股骨植入体模型,4周后收集含有植入体的股骨利用Micro-CT分析成骨能力;收集主要内脏器官（心、肝、脾、肺和肾）进行苏木精-伊红染色（HE染色）分析Ti/8DSS/PEG的体内生物相容性。 结果:1.成功构建了TA介导的LbL,并利用该方法在Ti基底上成功引入抗污和促成骨的功能成分（PEG和8DSS）。TA通过螯合作用与Ti基底紧密结合,通过氢键相互作用负载8DSS,通过TA的酚羟基氧化后形成的羰基与PEG-NH2的端胺基的席夫碱反应以及TA与PEG间的氢键相互作用负载PEG。红外、XPS从化学组成和分子结构角度显示Ti/8DSS/PEG的成功制备。荧光显微镜观察显示制备的涂层均匀且稳定,能在PBS环境中稳定存在7天不崩解。PEG的引入使Ti/8DSS/PEG的亲水性显著提高。Ti/8DSS/PEG不影响细胞活力,对细胞没有毒性。2.超亲水PEG的存在使Ti/8DSS/PEG具有良好的抗污能力,荧光观察及SEM显示Ti/8DSS/PEG能显著抑制蛋白和细菌的黏附;生物矿化诱导剂8DSS的存在使Ti/8DSS/PEG的存在使Ti/8DSS/PEG能在模拟体液（SBF）中形成均匀的羟基磷灰石晶体,并进一步促进黏附在表面的BMSCs的成骨分化,增加细胞内ALP的活性和细胞外基质的矿化水平。3.动物实验显示Ti/8DSS/PEG在体内也可发挥稳定的成骨作用,Micro-CT结果显示Ti/8DSS/PEG能显著促进植入体周围的新骨形成。主要内脏器官的HE染色结果没有异常说明其对机体没有潜在毒性,生物相容性良好。 结论:本课题应用单宁酸调控的层层自组装实现了通过简便的方法制备多功能植入体涂层（Ti/8DSS/PEG）。利用简便、快捷、环境友好的手段将矿化诱导剂8DSS和超亲水PEG成功沉积在植入体表面,赋予了植入体优异的抗生物污染和成骨能力。本课题为开发多功能植入体涂层提供了新的更简便、通用的策略。
关键词: 表面改性 ；抗黏附 ；骨整合 ；层层自组装 ；多酚
摘要： 手性是描述一个物体不能与其镜像完全重叠的性质,普遍存在于自然界中,不论从微观尺度还是宏观世界都可以观察到手性现象。近年来,手性无机纳米材料（例如贵金属纳米颗粒和半导体量子点）由于具有独特的手性光学性质,受到了广泛的关注。因此,设计和构筑手性无机纳米材料,研究其独特的手性光学性质及应用具有很重要的意义。本论文制备了具有等离激元圆二色性（PCD）的手性金纳米颗粒和具有圆偏振发光（CPL）性质的手性半导体量子点,并对其手性光学信号的产生和调控进行深入分析和理解。研究工作主要包括以下两个方面:首先,利用硒代胱氨酸（SeCys2）作为手性诱导剂,构筑具有手性形貌的金纳米结构——带有螺旋沟槽的金纳米箭头（HeliGNAs）,产生等离激元圆二色性（PCD）信号,并研究了光照对手性结构和PCD信号的影响。结合其它一些手性小分子（含巯基和硒基的氨基酸衍生物）作为手性诱导剂对金纳米结构的手性形貌的影响,阐明了金纳米结构手性螺旋形貌的产生机制。基于贵金属纳米颗粒的表面增强拉曼散射（SERS）效应,利用制备所得的手性金纳米结构实现了对氨基酸衍生物的对映选择性识别。本研究提供了一种可控构筑手性金纳米材料的策略,并深入探究了金纳米颗粒的手性形貌的产生机制。再者,利用手性传递策略诱导非手性发光量子点产生圆偏振发光（CPL）信号。通过L/D-芴甲氧羰基-谷氨酸（L/D-Fmoc-Glu）和D-脱氧鸟苷（d G）的共组装形成的超分子水凝胶中掺杂非手性量子点,实现水凝胶体系中赋予非手性量子点CPL性质,并进一步引入钾离子（K+）研究了多元超分子体系中的手性竞争。在没有K+的情况下,量子点的诱导CPL信号受Fmoc-Glu的手性控制。随着K+引入,脱氧鸟苷在K+的稳定下形成G-四联体（G-quadruplex,G4）,量子点的CPL信号则与脱氧鸟苷的手性信号一致。本研究成功制备了具有CPL性质的量子点水凝胶,探讨了多组分体系中的手性竞争现象,进一步调控了量子点的圆偏振发光性质。
关键词: 手性 ；金纳米颗粒 ；量子点 ；光学活性 ；圆偏振光
摘要： 研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种系统性自身免疫性疾病,主要累及全身周围关节,最终可能导致患者关节的功能丧失,给患者生活带来极大影响。目前,RA的早期治疗主要以药物治疗为主,其对于延缓疾病发展、抗炎具有一定效果,但其长期有效性及药物的副作用等问题依旧存在,对于RA的治疗有不利影响。近年来,许多新型生物材料如脂质体、水凝胶、碳纳米管等被发明,因其具有良好的生物相容性、生物响应性、可调节性等,成为载药系统的研究热点。其中,超分子自组装多肽水凝胶材料作为药物递送系统可通过纳米结构和小聚集体的混合物的形式缓慢释放,从而使药物缓释;天然氨基酸为L构型,D构型氨基酸为非天然氨基酸,由其构成的多肽具有不同的生物相容性,利用这个特点可以提高药物的选择性,从而达到降低药物副作用、提高药物治疗效果的目的。因此,超分子自组装多肽水凝胶材料药物递送系统具有良好的应用前景。研究目的:1.构建一种超分子自组装多肽水凝胶材料(Nap-GFFY)及其D构型多肽载药系统搭载改善病情抗风湿药物甲氨蝶呤(MTX);2.验证该载药系统体外毒性,及其对于RA成纤维滑膜细胞的增殖、迁移的抑制作用;3.验证该载药系统的抗炎作用效果,探讨其抗炎作用的机制;4.验证该载药系统在动物类风湿关节炎模型中的体内毒性及治疗作用。研究方法:本实验将分为材料表征、细胞实验、动物实验三个方面进行。首先通过标准9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成(SPPS)法进行制备超分子自组装多肽水凝胶(Nap-GFFY),同时其D构型多肽由相同的D构型氨基酸合成;制备搭载MTX的超分子自组装多肽水凝胶(MTX-GFFY)的方法也是采用SPPS法,将MTX与甘氨酸充分反应后连接便可制得;通过透射电镜、质谱分析等方法研究其材料表征、药物缓释等理化性质及生物功能。通过MTT法、划痕法、Transwell法研究该载药系统的体外毒性、对于RA成纤维滑膜细胞的增殖、迁移、侵袭的作用。通过实时荧光定量PCR(QPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)法探究其对于巨噬细胞表型分化的作用。最后使用该载药系统对抗原诱导膝关节炎(AIA)模型小鼠进行治疗后,通过H&E染色、Safarin-O染色、症状评分、肝肾组织切片等完成体内治疗效果及安全性评价。数据结果采用SPSS 20.0、Image J、GraphPad Prism 8.0、PS 2018等软件进行分析及图表制作。研究结果:实验中,D构型超分子自组装多肽水凝胶相较于L构型具有显著的缓释效果。搭载MTX的超分子自组装多肽水凝胶及其D构型载药系统可有效抑制RA成纤维滑膜细胞的增殖及迁移,同时无明显体外毒性。该载药系统可有效抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化,达到抗炎目的;同时也不会抑制M2型巨噬细胞极化,不会影响炎症修复作用。最后,在体内实验中,我们证实了该载药系统可有效改善关节炎模型小鼠的临床及病理评分,也无明显体内毒性。值得注意的是,D构型序列多肽载药系统各作用效果均优于天然L构型多肽。研究结论:该实验证实了 Nap-GFFY超分子自组装多肽水凝胶特别是其D构型药物递送系统搭载MTX在治疗RA时可有效减少目的药物的副作用,并达到缓释、增加药物作用效果的目的。
关键词: 类风湿关节炎 ；药物疗法 ；超分子自组装 ；多肽
被引量
2
摘要： 自组装形式存在自然界中的方方面面,从简单蛋白质的形成,到复杂的生命演变过程。生物分子的自组装为构建功能材料提供了一种新策略。而研究分子间作用机制为构建目前急需的功能组装体提供了一种新的思路和方法。我们以Fmoc-氨基酸,Fmoc-寡肽等生物分子通过简单的调控来构建功能材料,为生物分子组装体在生物成像、治疗等方面提供一个更加安全有效的可能性。通过超声辐射的方法,研究了生物启发型二肽组装体结构的转变。超声作用下,组装体结构由三斜结构聚集体向纳米纤维进行固-固相转变,最终转变为具有强偏振发光性能的单斜纳米带。这种超声波诱导的固-固相转变演化,取决于组装体在不同阶段所受到的分子间相互作用力的不同。采用上述方法得到的结晶纳米带,首次被应用于细胞的偏振成像,在无荧光标记的情况下,实现了对纳米材料的细胞摄取乃至于细胞内的代谢路径等的实时监测。通过协调自组装和局部矿化形成广谱抗菌金属水凝胶,用于局部药物递送和抗菌氨基酸和银纳米颗粒(AgNPs)的持续释放,使得药物剂量和毒性的降低,改善生物利用度和延长的药物效应。这种配位水凝胶对细胞和小鼠中的革兰氏阴性(大肠杆菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)细菌均表现出显着的抗菌效力,这是由Fmoc修饰的氨基酸的两亲性质和AgNPs的广谱抗菌活性,而且仅通过伤口敷料的氨基酸配位水凝胶,对于主要器官没有病理损伤。本研究工作主要利用分子的自组装行为构建的功能体系,用于组装过程研究及成像治疗方面的应用。通过生物分子的选择和弱相互作用的协同,构建组装引起的功能增强的生物材料。
关键词: 寡肽 ；自组装 ；固固相转变 ；偏光成像 ；水凝胶 ；抗菌
被引量
1
摘要： 目的:龋病的发生机制与变异链球菌(S.mutans)主导的菌斑生物膜介导的酸性微环境密切相关,其核心病理过程表现为牙体硬组织脱矿。本研究针对当前防龋策略的局限性,基于抗菌肽(AMPs)独特的抗菌特性——兼具高效抗微生物活性、生物可降解性及低耐药诱导特性,旨在开发一种可自组装成胶的抗菌肽。通过体外-体内实验体系,系统评估该抗菌肽对于致龋菌生长、菌斑生物膜形成及龋损进展的干预效果,为解决龋病管理中传统剂型应用受限问题提供新型治疗策略。 方法: (1)采用Fmoc固相多肽合成法合成抗菌肽,利用高效液相色谱仪进行多肽纯化并进行质谱鉴定;通过最小抑菌浓度(MIC)测定、最小杀菌浓度(MBC)测定、杀菌动力学曲线拟合、抗菌后效应(PAE)检测和细菌生物膜形成抑制等实验对抗菌肽的体外抗菌活性进行研究;借助扫描电镜(SEM)、碘化丙啶(PI)流式细胞术等研究抗菌肽对于细菌细胞膜的破坏作用;通过CCK-8细胞活力检测、LDH释放实验、溶血毒性及唾液稳定性实验评价抗菌肽的体外生物安全性。 (2)采用控制变量法探究抗菌肽形成水凝胶的最适条件,利用核磁滴定法阐明其成胶机制;采用SEM表征微观形貌,流变仪测定机械性能;并通过可注射性、体外降解动力学来评估其临床适用性;采用高效液相色谱(HPLC)定量分析凝胶缓释性能;采用流式细胞术检测细菌活性氧(ROS)水平揭示抗菌机制;采用CCK-8、LDH检测、溶血毒性和细胞活/死染色评价其体外生物安全性。 (3)构建大鼠龋齿模型,分别考察抗菌肽水溶液或水凝胶对大鼠龋病的预防作用或早期龋病的抑制作用,利用荧光素钠表征抗菌肽水溶液或水凝胶在口内的持久性;利用体视显微镜记录龋损进展,结合16S-r RNA基因测序分析口腔菌群结构变化;并通过Micro-CT三维重建技术评估抗菌肽水凝胶对大鼠早期龋损的抑制效果;系统监测脏器结构及血液生化指标等以验证体内生物安全性。 结果: (1)依据目标序列(RRRWRWRIGIRIY)成功合成并纯化抗菌肽A3,质谱检测其分子量与理论分子量(1887.24 Da)高度吻合;A3对S.mutans表现出特异性抑制作用(MIC=16μM,MBC=4×MIC),杀菌动力学曲线和PAE结果显示A3对于S.mutans的抑制作用具有高效性和持久性,且显著抑制细菌生物膜的形成;A3作用8 h后S.mutans形态显著皱缩,流式检测PI峰值右移;CCK-8结果显示A3对于L929细胞无明显细胞毒性,溶血率与阴性对照组相当,HPLC结果显示抗菌肽在唾液环境中稳定性较好。 (2)形成A3抗菌肽自组装水凝胶(A3-SAG)的抗菌肽最适浓度为5 m M,PBS的浓度为8 m M,其机制主要为抗菌肽与PBS中的磷酸根离子交联成胶;A3-SAG在扫描电镜下呈现多孔三维网络结构,且具有良好的可注射性能和体外降解性能,在酸性条件下降解速度更慢;A3-SAG在唾液中具有缓释现象,其浸出液可通过促进细菌内ROS生成发挥其抗菌活性,且具有较好的生物安全性。 (3)动物实验结果显示A3溶液和A3-SAG在大鼠口腔内滞留时间均超过1h,A3溶液局部涂布后,大鼠龋病发病率明显低于模型对照组,其浓度为4MIC时对龋病的预防效果最佳;通过致龋饲料及蔗糖水喂养,成功构建大鼠早期龋病模型,随后给予A3-SAG局部涂布,Micro-CT结果显示实验组大鼠龋损程度再无明显进展,釉质脱矿程度较对照组更低;大鼠脏器指数、器官组织切片及血液生化指标均无统计学差异。 结论: 本研究设计了一种可自组装成胶型抗菌肽A3,其溶液及凝胶态均具有优良的抗菌性能和生物相容性,在致龋环境中能够显著抑制龋病的发生及发展,为临床上龋病的预防及早期抑制提供了安全且有前途的解决方案。
关键词: 龋病 ；抗菌肽 ；抗菌肽自组装水凝胶 ；变异链球菌 ；菌斑生物膜
摘要： 近几十年来,随着纳米技术的快速发展,功能纳米材料受到广泛的关注和研究,科学家们致力于开发性能优越、安全稳定的纳米材料,以满足不同领域的应用需求。目前,基于多孔硅、金属纳米颗粒、氧化石墨烯、水凝胶、多肽自组装体以及金属有机框架材料（Metal Organic Frameworks,MOFs）等热点纳米材料已经有大量的研究报道。其中,MOFs作为多孔固体材料的一个新品种,是近几十年来发展较为迅速的一类纳米材料,这种多孔材料具有比表面积极大、孔径易调控以及表面易修饰等优异特性,因此受到研究人员深入的研究,是一类十分具有应用前景的纳米材料,被广泛应用于气体储存和分离、催化、传感器以及药物载体等相关领域。本论文中,选择类沸石咪唑框架材料（ZIF-8）为研究对象,利用其优势特点,进行药物载体系统的构建,合成一种能够有效治疗癌症的诊疗一体化纳米制剂,主要研究内容如下:1、作为一种孔径可调的多孔纳米材料,有效的调控可以使其MOFs材料获得更高的比表面积和孔容,从而提高材料的吸附和容纳性能。本文中,以ZIF-8为研究对象,以多肽作为调节剂,系统的对ZIF-8进行了形状和粒径的调控,并深入研究了ZIF-8调控后的各种性能以及调控的机理。研究发现,两亲性多肽分子作为一种高效调节剂,通过疏水片段长度的改变可以有效调控ZIF-8的形状和粒径,并且多肽的生物相容性高、功能丰富,更适合用于药物输送研究。因此,将多肽引入ZIF-8合成体系,通过一锅合成的方法在水溶液中合成尺寸均匀、形状不同的纳米晶体颗粒。当多肽浓度为1.0 m M时,I2R4、I4R4、I6R4三种多肽可以分别调控ZIF-8晶体生长成立方体、截头菱形十二面体和菱形十二面体,并且,通过将多肽浓度从0 m M增加到2.0 m M,晶体颗粒尺寸由1.7μm调控到<100 nm。2、诊疗一体化是近年来治疗癌症的研究热潮,为人类攻克癌症带来新的希望。在诊疗一体化中,功能纳米载体材料是整合诊断和治疗为一体的关键,本论文中研究并利用ZIF-8作为构建诊疗纳米平台的载体,对其进行功能化:通过在ZIF-8表面合成二氧化锰,使其具有改善细胞微环境、并通过核磁成像进行诊断的多重功能,然后通过功能纳米材料负载盐酸阿霉素（DOX）以及二氢卟吩e6（Ce6）用于癌症的化疗和光动力治疗（Photodynamic Therapy,PDT）。通过TEM、SEM、XRD、DLS、FTIR以及XPS等技术手段对材料的形貌、粒径以及性质进行表征,并对诊疗一体化制剂的药物释放性能及细胞毒性进行了初步探究。结果表明,功能化纳米颗粒具有尺寸和形状的可控性,尺寸可以由1μm减小至100 nm以下,此外,纳米颗粒呈现出实心、核壳和空心三种不同的结构状态。在药物负载应用中,药物负载率较高,合成的诊疗制剂能够有效杀死癌细胞。本论文成功合成了ZIF-8/MnO2核壳纳米材料,可作为药物载体制备诊疗一体化制剂,在生物医药领域具有极大的发展潜力。
关键词: 多肽 ；调控 ；ZIF-8晶体 ；诊疗一体化
摘要： 酶是经过数十亿年自然选择和优化而成的高效生物催化剂,通过催化多种多样的化学反应在生物体中发挥着重要作用。酶的折叠结构对环境的变化极其敏感,导致酶的催化性能容易受到外界条件变化的影响。因此天然酶实现高效的催化往往需要温和的反应条件,这通常不能满足工业转化的需求。同时,天然酶还有难以分离纯化、修饰工艺复杂等不足。研究者们为了扩大酶的应用范围发展了多样的酶工程技术,比如定向进化是调控酶功能的有效手段,但该方法仅限于酶蛋白中天然氨基酸种类的更换,无法利用种类丰富的氨基酸变体或衍生物,且需要反复迭代而费时费力。基于酶本身固有的超分子属性,分子自组装作为一种自下而上构建特定结构材料的方法,具有操作方法简单、制备条件温和以及可设计性强等特点,为从头设计和制备具有酶催化功能的人工催化剂提供了一条新的途径。酶的活性位点是酶催化功能发挥的关键区域,如何在人工体系中模拟天然酶活性位点的几何结构和化学环境,获得催化性能能够匹敌甚至超越天然酶的催化体系,是一项有挑战性的研究课题。本论文受天然酶的活性中心结构和催化原理启发,通过生物分子自组装的方法设计并构建了三种仿氧化酶催化体系:（1）天然水解酶活性中心通常含有组氨酸残基,同时组氨酸也是多铜氧化酶（如漆酶）活性位点的关键残基,能够与辅因子铜配位并实现底物的高效转化。受到水解酶和多铜氧化酶活性中心结构的启发,本论文通过芴甲氧羰基（Fmoc）组氨酸衍生物与Cu2+自组装制备了能够催化水解和氧化反应的双功能模拟酶。通过Fmoc基团的聚集,实现组氨酸咪唑基团的富集,获得了较高的催化水解活性;Cu2+与Fmoc-组氨酸组装构建了具有类似漆酶多铜活性中心的氧化模拟酶,鸟嘌呤核苷酸（GMP）的加入进一步提升了催化氧化活性。模拟酶展现了催化水解-氧化（或氧化-水解）级联反应的能力,且具有良好的热稳定性,在分解芳香酯类污染物方面具有一定的应用潜力。进一步地,通过对组装基元中咪唑不同位置N的甲基修饰实现了对仿酶活性的调控;当Nδ位的H被甲基取代后,咪唑侧基的亲核能力增强以及与铜的配位-解离速度变快,使得模拟酶表现出较高的催化水解和氧化活性,而Nε位的H被甲基取代后水解和氧化活性均明显下降,咪唑不同位置的N在催化过程中展现出异质性。该工作证实了分子自组装方法可以方便的利用两亲性氨基酸构筑级联的人工催化体系,并通过氨基酸的修饰实现对催化性质的调控。（2）基于酶-底物复合物的启发,本论文通过鸟嘌呤核苷自组装制备了负载核黄素的可光产H2O2的超分子凝胶状材料。鸟嘌呤核苷在K+的辅助下通过氢键形成G四分体,进而π-π堆积成纤维,随后在交联剂的作用下形成超分子凝胶,并通过共价连接和堆积作用负载核黄素。核黄素作为光催化活性中心,鸟嘌呤核苷作为还原性底物,两者相互靠近,形成待激活的活性中心-底物复合物功能材料。在蓝光（460 nm）照射下,材料无需添加其他组分便可实现完整的催化氧化循环并释放H2O2,且具有优异的储存稳定性和耐热性能。光产H2O2的特点使得光照后的材料表现出良好的抗菌性能,同时材料具备生物安全性,有潜力成为一种无需实时光照的具有抗菌效果的伤口敷料。（3）基于辣根过氧化物酶（HRP）活性中心远端组氨酸残基在催化循环中的作用,本论文设计了富含组氨酸的多肽并与HRP共组装形成具有高催化活性的超分子复合物。组氨酸多肽能够自组装形成β-折叠结构并与HRP发生非共价相互作用改变HRP的构象,使得多肽提供的外源组氨酸可能接近血红素活性中心并加快血红素静息态和中间态的转换,从而加快酶的催化循环,使得HRP的催化速率最大提升接近3倍。同时,HRP/多肽复合物具有更好的稳定性,且组氨酸多肽表现出对其他血红素依赖酶的活性增强作用。高催化活性的HRP/多肽复合物应用于生物分子检测,能够有效提高检测灵敏度。本论文中基于天然酶启发的生物分子自组装的方法为调控酶功能、扩大酶的应用范围提供了一条简而有效的途径,为超分子化学和酶工程等领域建立了桥梁。以天然酶为灵感进行模拟酶催化体系的人工仿生设计,有助于人们理解酶的催化过程和生命的进化演变。
关键词: 生物分子 ；自组装 ；模拟酶 ；生物催化 ；活性中心
被引量
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摘要： 三阴性乳腺癌（TNBC）是具有雌激素、孕激素、HER2受体表达阴性（ER-、PR-、HER2-）表型的一类乳腺癌,具有高度的侵袭性,易复发,易转移,严重危害女性的健康。TNBC占所有乳腺癌病例的～15%,其死亡率占所有乳腺癌相关死亡病例的25%。目前,化疗仍然是临床上三阴性乳腺癌治疗的主要方法,但其易导致肿瘤耐药、转移且毒副作用大,使患者的临床获益显著下降。因此,迫切需要开发安全高效的治疗方法以提高TNBC治疗的疗效。免疫治疗是继手术治疗,放疗,化疗后又一重要的临床肿瘤治疗手段,旨在增强机体免疫应答以消除恶性肿瘤细胞,在晚期TNBC治疗中取得了明显进展。2019年,化疗药物（Abraxane,白蛋白紫杉醇）与免疫治疗药物（Tecentriq）联用治疗无法进行手术切除、PD-L1阳性的局部晚期或转移性TNBC的临床治疗方案得到FDA的加速批准,有望显著提高TNBC治疗的疗效。常用于免疫治疗的核酸类药物,例如聚肌胞苷酸(Poly（I:C）),Cp G-寡脱氧核苷酸（Cp G ODN）,信使RNA（m RNA）疫苗以及作用于免疫相关通路的小干扰RNA（si RNA）在抗肿瘤免疫治疗中被广泛应用,以提高肿瘤细胞免疫原性。但核酸类药物容易被肾小球过滤或被血浆中的核酸酶快速分解,导致了其在目标部位蓄积差;同时因其具有负电性、分子量大等物理化学性质,不易被肿瘤细胞摄取。非病毒基因递送系统具有免疫原性低、生产成本低、重现性好及安全性高等优点,广泛应用于递送核酸类药物。阳离子纳米载体作为非病毒基因递送系统的一种,能通过静电相互作用荷载核酸类药物,提高其稳定性,改善其体内分布及在靶细胞的摄取。但是,纳米载药系统经细胞摄取后,其具有的正电性仍会阻碍核酸药物的胞内释放,从而导致药物失活、降解和疗效下降。针对肿瘤特异性环境,如弱酸环境、酶环境及乏氧环境,并利用近红外光、温度、磁场等外部刺激,设计刺激响应性纳米载体来促进核酸药物的释放,有望提高核酸药物用于肿瘤免疫治疗的疗效,从而实现对三阴性乳腺癌的有效治疗。本文首先利用对巯基苯硼酸的巯基与多肽Fmoc-KCRGDK结构中半胱氨酸的巯基反应构建FK-PBA;利用聚乙烯亚胺（PEI）的氨基与Ce6的羧基酰胺缩合构建PEI-Ce6;利用硼酸与聚乙烯醇（PVA）的间二醇结构形成六元环硼酸酯将PVA修饰至FK-PBA,并与PEI-Ce6通过纳米共沉淀自组装形成光控电荷反转纳米粒LCCN。PEI的氨基质子化后使纳米粒具有正电性,以荷载Poly（I:C）形成LCCN-Poly（I:C）纳米复合物。该纳米载药系统具有活性氧（ROS）及还原环境双重刺激响应性:六元环硼酸酯具有ROS敏感性,负载的Ce6在近红外照射下产生大量的ROS诱导其发生化学键断裂。断键产生的酚氧负离子,可屏蔽PEI氨基,使纳米粒的表面电位由正电反转为负电,促进Poly（I:C）的释放;而FK-PBA的二硫键在还原环境中发生断裂,使得纳米粒进一步被破坏。我们首先对LCCN进行了处方筛选并考察了其理化特性,结果表明当FK-PBA/PVA质量比为15:1,PVA分子量为67 k Da时,能自组装形成～113.4 nm的均一球形纳米粒,其中Ce6的载药量为17.6±0.3%。在近红外光照射后,LCCN水化粒径减小～20 nm且表面电荷发生反转;进一步与1 m M谷胱甘肽（GSH）孵育后,纳米粒被完全破坏。我们进一步考察了LCCN对Poly（I:C）的荷载能力及光控释药特性,结果表明LCCN能有效荷载Poly（I:C）;琼脂糖凝胶电泳结果显示,近红外光照射能有效促进Poly（I:C）释放。同时,我们探究了LCCN的细胞摄取、光毒性及体外诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD）的能力。4T1细胞对LCCN的摄取呈时间依赖性。LCCN具有显著的光毒性,4T1细胞给与0.5μg/m L Ce6+200 m W/cm2近红外光照射后,其相对存活率下降87%。LCCN介导的光动力效应显著诱导ICD,钙网蛋白（CRT）的细胞膜外翻增加,高迁移率族蛋白（HMGB1）核外排增多及细胞外泌三磷酸腺苷（ATP）增多。在4T1荷瘤小鼠中分布实验结果表明,LCCN有效提高了核酸类药物在肿瘤部位的蓄积。我们进而考察了LCCN-Poly（I:C）对肿瘤相关淋巴结树突状细胞（DC）及肿瘤免疫微环境的影响。纳米复合物能促进DC熟化,激活抗肿瘤免疫应答,同时促进细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的肿瘤浸润,下调调节性T细胞（Fox P3+CD4+T）的比例。4T1荷瘤小鼠抗肿瘤药效评价结果显示,基于LCCN-Poly（I:C）的光动力-免疫联合治疗有效抑制了4T1原位瘤和远端移植瘤的生长,延长了小鼠的生存期。研究结果表明:我们构建的光控电荷反转纳米粒LCCN能有效提高Poly（I:C）的肿瘤递送并实现光控释药,同时LCCN-Poly（I:C）介导的光动力-免疫联合治疗显著增强了机体抗肿瘤免疫应答,提高对TNBC原位瘤与远端移植瘤的治疗效果,具有一定的临床转化潜力。
关键词: 纳米粒 ；三阴性乳腺癌 ；光动力治疗 ；免疫治疗 ；聚肌胞苷酸
摘要： 骨骼肌作为人体重要的动态可塑性组织,在运动、姿势维持和体温调节中发挥关键作用。然而,由创伤、肿瘤切除等因素导致的大体积肌肉缺损(VML)往往超出机体的自修复能力,造成不可逆的功能障碍。虽然自体移植是当前临床主要治疗手段,但其应用受到供体来源有限、移植存活率低等问题的制约。针对这一挑战,基于载体辅助的细胞移植技术作为一种创新性治疗策略,为上述问题提供了新的解决方案。理想的细胞载体需具备良好的生物相容性、可降解性和支持细胞增殖的能力,同时应具有与肌肉组织相匹配的机械强度以维持收缩功能。水凝胶因其与细胞外基质(ECM)相类似的结构特性,以及三维多孔网络结构有利于物质交换和细胞生长的优势,在肌肉组织工程领域展现出广阔的应用前景。 基于上述研究背景,本文针对肌肉损伤修复的实际需求,构建了新型丝素蛋白/肽可注射水凝胶,以模拟天然肌肉组织微环境特征,进而探索其在肌肉组织修复中的应用。该体系具有制备过程简便、可实现对不规则缺损区域的完全填充、有效促进细胞的三维增殖以及保护移植细胞等优势,为细胞疗法在肌肉组织工程的应用提供了新的思路。本论文主要包括以下研究内容: (1)通过多肽(Fmoc-YL)在生理条件下诱导丝素蛋白(SF)溶液凝胶化,成功制备了具有细胞适应性的丝素蛋白/多肽可注射水凝胶(SF/YL),并将其作为三维细胞载体用于大体积肌肉损伤修复。通过优化SF与Fmoc-YL的配比(5:1),该水凝胶可在5 min内实现凝胶化。Fmoc-YL和SF之间的超分子相互作用加速了SF二级结构向β-折叠的转变进程。SF/YL水凝胶表现出与肌肉组织相似的机械性能(储能模量11 k Pa)和细胞适应性,既能提供细胞生长所需的力学支撑,又能适应细胞增殖迁移过程中的形态变化。此外,该水凝胶可保护细胞免受注射过程中的剪切力损伤,作为缓释细胞库持续释放细胞,并显著提高移植细胞的体内存活率和滞留时间,可支持细胞在体内保持活性7天以上。在肌肉损伤大鼠模型治疗中,负载细胞的水凝胶治疗组表现出显著的修复效果。与损伤组相比较,治疗组的运动协调性明显改善,运动能力可恢复至正常大鼠的97%,新生肌纤维数量增加5.23倍,胶原沉积面积减少66%,乙酰胆碱受体(Ach R)表达量提高5.21倍,肌球蛋白重链(MHC)阳性肌纤维密度较损伤组提高4.32倍,新生血管密度提升6.63倍。这种新型SF/YL水凝胶为体积性肌肉损伤修复的临床应用研究提供了新的治疗思路。 (2)将SF引入多肽(Fmoc-YYK)自组装水凝胶体系,成功构建机械强度增强的YYK/SF可注射水凝胶,并探索其作为载体促进细胞三维扩增的性能。YYK/SF水凝胶不仅维持了肽自组装水凝胶所特有的仿生纳米纤维微观结构,而且借助SF长链分子骨架的模板效应,增强了多肽分子间的相互作用,进而显著提升了水凝胶的机械性能,使得多肽水凝胶的储能模量从52 Pa提升至36 k Pa。此外,YYK/SF水凝胶表现出优异的生物相容性。这种水凝胶不仅能够实现细胞的三维包封与增殖,而且可通过细胞注射移植手段实现微创治疗,从而为细胞治疗提供充足的细胞。这种新型YYK/SF水凝胶对于仿生细胞三维扩增载体的设计制备与应用表现出至关重要的理论价值与实践指导意义。
关键词: 多肽 ；丝素蛋白 ；可注射水凝胶 ；细胞疗法 ；肌肉损伤修复
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