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摘要： 目的:采用超高效液相色谱—四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)联用技术,对1、2、3年生防风样本进行分析,确定不同生长年限防风中香豆素类成分的含量变化。方法:使用超高效液相BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.7μm),以0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)为流动相梯度进行洗脱;使用高分辨飞行质谱仪,配置ESI离子源,在正、负离子模式下采集质谱数据,使用Markerview数据处理软件对高维质谱数据进行PCA处理,初步筛选目标化合物为香豆素类成分,根据高分辨质谱采集到的精准质量数及同位素等信息进一步确定质谱碎片的分子式,利用精确分子质量等信息与对照品及高分辨质谱自备数据库谱图进行比对从而得到鉴定结果,利用此结果进一步分析其含量变化规律。结果:鉴定或推断出不同生长年限防风中含量差异较大的13种香豆素类成分,其中补骨脂素等5个成分的含量逐年增加,而8-羟基补骨脂素等7个化合物含量以2年生最高,3年生略有下降,仅2-[(8-Methoxy-4-methyl-6-oxo-6H-benzo[c]chromen-3-yl)oxy]propanoic acid的含量以1年生最高。结论:该方法快速、准确,为不同生长年限防风中香豆素成分分析提供一种新的研究方法。
关键词: 液相色谱-四极杆飞行时间质谱 ；防风 ；生长年限 ；香豆素
被引量
18
摘要： 自毒作用是植物连作障碍形成的主要原因之一,严重影响植物生长和粮食生产。前期研究结果表明,土壤微生物多样性下降、土传病害加重是枸杞园连作障碍形成的重要原因,但枸杞残体的自毒作用及其物质基础目前仍不明确。为探讨自毒物质的主要来源,本研究对比分析了枸杞(Lycium barbarum L.)叶、茎、根等组织浸提液对枸杞幼苗生长的影响。浓度梯度试验结果表明,叶片浸提液的抑制效应高于根、老根皮及茎浸提液。向无枸杞种植历史的农田土壤中添加枸杞叶片干粉能够显著抑制枸杞幼苗生长及叶片光合作用,证实了枸杞叶片具有自毒作用。联合UPLC-QTOF-MS和GC-TOF-MS技术对生长季末期枸杞叶片进行代谢组分析,共鉴定出有机酸112种、醇类41种、氨基酸37种、醛酮类28种和糖类48种。对其中24种有机酸及衍生物的分析发现,20种有机物能够不同程度抑制枸杞幼苗初生根生长。其中水杨酸、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸和香豆素在浓度低至10μmol/L时仍具显著抑制效应。UPLC结果进一步显示,长期连作导致枸杞园土壤香豆素、水杨酸、苯甲酸、阿魏酸和香豆酸积累。此外,土壤总酚酸含量也随种植年限增加显著增加。这些结果表明土壤中枸杞叶片酚酸能够在长期连作下积累并诱发自毒作用,这为进一步探索枸杞连作障碍形成机制提供了研究基础。
关键词: 枸杞 ；连作障碍 ；自毒物质 ；叶片 ；酚酸
被引量
3
摘要： 肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)是列当科肉苁蓉属多年生全寄生草本植物,其寄主为苋科梭梭属梭梭(Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.)Bunge)。肉苁蓉是传统的名贵中药材,也是西北荒漠地区重要的药用经济作物,更是“一带一路”沿线传统植物药代表和关键物种。由于肉苁蓉野生采挖量大,且在梭梭植物上肉苁蓉相对较低的寄生率,导致其野生资源蕴藏量逐渐减少,因此探究肉苁蓉和梭梭的协同适应机理及寄生特性迫在眉睫。本研究从宏观到微观,依托微生物组学-转录组学-代谢组学技术,识别与鉴定水平转移基因、转移代谢物和核心微生物,解析肉苁蓉和梭梭协同进化特征。同时,通过单细胞转录组技术研究肉苁蓉细胞水平上的基因表达空间规律,探究与寄生生长、抗逆和活性成分苯乙醇苷类生物合成途径相关基因在不同细胞类型中的表达模式。主要结果如下:1.肉苁蓉寄生使梭梭根际微生物“寄生减少”。本研究通过对大田土(BULK)、未寄生肉苁蓉梭梭根际土(NCD)和寄生肉苁蓉梭梭根际土(RHA)进行16S和ITS测序分析,发现肉苁蓉的寄生降低了梭梭根际细菌和真菌的群落多样性,简化了共发生网络结构,增加了细菌群落组装机制中属于随机过程的扩散限制比例。溯源分析表明寄生使得BULK 土细菌占梭梭根际细菌群落来源比例从89.1%降低到1.2%;占梭梭根际真菌群落来源比例从3.1%降低到0.5%。2.梭梭微生物在跨域共发生网络中占主导地位。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉、梭梭(ECD&EHA)及其根际土(RCD&RHA)进行16S和ITS测序并分析,发现基于PCoA和PERMANOVA分析,肉苁蓉和梭梭微生物群落差异较小(细菌:R2=0.29971;真菌:R2=0.15631)。在肉苁蓉和梭梭的内生真菌群落中,共鉴定到4个属于梭梭的关键真菌属,1个属于肉苁蓉的关键真菌属。溯源分析发现梭梭微生物群落占肉苁蓉微生物群落的潜在来源比例(细菌:76.5%;真菌34.3%)高于肉苁蓉微生物群落占梭梭微生物群落的潜在来源比例(细菌:52.1%;真菌:16.7%)。3.寄生状态下肉苁蓉和梭梭的微生物群落协同适应。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉、梭梭和吸器部位(PR&HIR&HUR)以及对应根际土(PS&HIS&HUS)样品进行16S和ITS测序并分析,发现吸器部位(HIR&HIS)细菌和真菌群落多样性普遍低于梭梭,但高于肉苁蓉。寄生对于吸器的微生物群落存在影响,7个微生物类群在吸器组织中富集,包括微枝形杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、红色杆菌属、四折叠球菌属、毛壳菌属和青霉属等。共发生网络结构和普鲁克分析结果显示肉苁蓉和梭梭对应的微生物群落具高度一致性。4.肉苁蓉和梭梭间大规模mRNA转移。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉鳞叶和肉质茎、梭梭根进行Illumina高通量测序获得转录组数据,构建了肉苁蓉和梭梭foreignmRNA的生物信息学分析流程。在肉苁蓉鳞叶和肉质茎中分别鉴定到5,480和3,280个foreign mRNA,占整个转录本的11.8%和8.5%;在梭梭根中共鉴定到7,049个foreign mRNA,占整个转录本的23.2%。Foreign mRNA功能富集分析结果显示其可能参与细胞过程和代谢过程等。通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了 native mRNA 和 foreign mRNA的表达量,结果显示以foreign mRNA表达量显著低于native mRNA,与转录组得到的表达量结果基本一致。5.肉苁蓉和梭梭间特征代谢物转移。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉鳞叶和肉质茎、梭梭根进行基于UPLC-Q-TOF-MS技术的代谢组分析。分别在肉苁蓉鳞叶和肉质茎中鉴定出747和709种化合物;在梭梭根中鉴定出672种化合物。基于OPLS-DA模型的差异代谢物结果表明,肉苁蓉和梭梭的差异代谢物主要集中在次生代谢产物,包括毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、β-氧化毛蕊花糖苷、2'-乙酰毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷、沙苁蓉苷和管花苷等。值得注意的是,在梭梭根部检测到了肉苁蓉苷A、管花苷C和异毛蕊花糖苷等肉苁蓉属特征成分。Mantel分析结果表明,肉苁蓉中异毛蕊花糖苷、2'-乙酰毛蕊花糖苷和肉苁蓉苷A与转移来的mRNA存在相关性(r=0.2-0.4)。6.肉苁蓉和梭梭间microRNA转移和跨界调控。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉鳞叶和肉质茎、梭梭根进行Illumina高通量测序获得转录组数据,构建了肉苁蓉和梭梭foreign microRNA的生物信息学分析流程。在肉苁蓉鳞叶和肉质茎中分别鉴定到13和22个foreign microRNA,占整个microRNA转录本的56.5%和64.7%;梭梭中鉴定到1个foreign microRNA,占整个microRNA转录本的4.5%。microRNA的靶基因预测结果发现,肉苁蓉的foreign microRNA靶基因个数为1,635个,梭梭的foreign microRNA靶基因个数为27个。靶基因功能富集分析结果显示其参与细胞过程和代谢过程等。通过茎环引物法qRT-PCR验证了 native和foreign microRNA的表达量,结果显示肉苁蓉中foreign microRNA表达量略高于native microRNA,而梭梭中foreign microRNA表达量低于 native microRNA。7.肉苁蓉单细胞转录组图谱构建。本研究利用10X Genomics技术对肉苁蓉肉质茎进行单细胞转录组Illumina测序。通过质控和过滤,共得到12,216个高质量细胞,平均每个细胞的UMI(Unique Molecular Identifier)数为2,207,表达的基因数目为1,753。降维聚类分析后,得到10个细胞类群,包括表皮细胞、薄壁细胞、韧皮部细胞、木质部细胞、中柱细胞、分生组织和异形毛状细胞,并开发了多个具有细胞类型特异性的新标记基因。8.单细胞转录组测序揭示肉苁蓉寄生生长、抗逆和次生代谢相关基因表达的空间分布特异性。通过对肉苁蓉单细胞数据进行拟时分析,绘制了维管束细胞和气孔细胞的发育轨迹。结果表明,维管束细胞分化轨迹以维管束类分生组织为起点,到分叉点沿两个方向分化成中柱细胞、木质部和韧皮部细胞。气孔细胞的分化轨迹依次为分生组织母细胞-分生组织细胞-气孔细胞和表皮细胞。植物激素、茎膨大、抗逆和次生代谢相关基因在不同细胞类群的表达谱存在差异。同时,鉴定到了一类寄生植物特有的新细胞类群,该类群中的水平转移mRNA表达量显著高于其他类群。研究结果支持寄生植物与寄主植物间通过吸器交流微生物、遗传物质和代谢物质等来维持两者的“寄生平衡”,所鉴定到的与寄生相关的核心微生物、重要代谢物和遗传物质是寄生形成的重要信号。该研究为特色中药栽培育种奠定基础;为西部关键区域及关键植物类群保护、防风固沙、维护可持续生态系统提供依据,对丰富荒漠植物寄生理论和中药品质生态学理论具有重要科学价值。
关键词: 肉苁蓉 ；梭梭 ；协同适应 ；微生物组 ；转录组 ；代谢组 ；单细胞 ；基因水平转移 ；跨界调控
被引量
2
摘要： 本文研究了刺葡萄表皮分离得到的一株香坊肠杆菌(保藏编号CCTCC NO:M2017152)的生理生化特性,并以酿酒酵母为对照,研究不同发酵条件下两者的生长繁殖及发酵豆芽汁、苹果、梨中香气成分之间的差异。最后利用超高效液相色谱—四级杆串联飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术对比研究了香坊肠杆菌M2017152和酿酒酵母的非挥发性代谢产物之间的差异。结果表明:香坊肠杆菌M2017152是革兰氏阴性无芽孢杆菌,需氧或兼性厌氧,无运动性,其适宜生长pH 2.0-8.0,温度≦404,能耐受12%的盐浓度和0.5 g/L以上的焦亚硫酸钠,对碳源氮源的利用范围广。香坊肠杆菌M2017152在初始糖浓度12%、氧气充足下生长繁殖最旺盛,香气成分种类最丰富;初始pH6.5时生长繁殖最旺盛,但香气成分种类最少;发酵前4 d生长繁殖最旺盛。通过对香坊肠杆菌M2017152香气成分的研究发现,香坊肠杆菌M2017152发酵产生的香气成分与酿酒酵母比较,在种类和含量上都有很大差异。香坊肠杆菌M2017152发酵果酒检测出的主要香气成分有3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸正丙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、癸酸乙酯、异丁酸等,呈现酒香、花香、果香、甜香、青草气等香气特征。经UPLC-Q-TOF-MS分析鉴定,香坊肠杆菌M2017152发酵豆芽汁代谢产物中未发现产生明显有毒有害组分。香坊肠杆菌M2017152发酵豆芽汁产生的特有代谢产物中N-乙酰-D-半乳糖胺、白雀木醇、四氢生物蝶呤、琥珀酸酐、次黄嘌呤、苯丙酮酸和赤星衣酸乙酯等具有一定的应用价值,可进行进一步研究。
关键词: 香坊肠杆菌 ；生理生化 ；代谢产物 ；香气成分
被引量
1
摘要： 目的:人参根据其生长环境和栽培方式的不同,主要分为三类,分别为园参、林下山参和野山参。在2008年国家颁布的《野山参鉴定及分等质量》(GB/T18765-2008)中把林下山参列入野山参的范畴。由于生长环境和生长年限不同,人参的质量和功效存在差异,市场认可程度也差异很大。林下山参价格昂贵且需求大,而目前对于林下山参的化学成分、质量控制研究尚不够深入,《中国药典》中将人参分为园参和林下山参,却使用相同的质量标准,林下山参与园参缺少各自专属的质量标准,导致鉴别与区分困难。因此对林下山参的化学成分研究,并对林下山参与园参进行有效区分,对建立林下山参科学的质量标准具有重要意义。方法:1、构建了基于HILIC×RP的离线二维液相分离系统,结合正负离子两种模式进行质谱数据采集,对林下山参中皂苷类成分的靶向表征。2、建立了一种基于UHPLC-Qtrap-MS动态多反应监测模式的定量/相对定量方法,实现了对14种皂苷成分定量以及199种成分相对定量的分析测定,并应用多元统计分析对林下山参以及园参的差异性代谢物进行分析。3、运用UPLC-Q-TOF/MS技术,采用正、负离子2种模式进行质谱扫描,通过数据库检索、对照品比对、MS DIAL辅助解析等方法对人参配方颗粒标准汤剂中的化学成分进行快速分析。运用超高效液相色谱建立人参配方颗粒指纹图谱,并进行方法学验证。结果:1、结合正负两种模式对林下山参进行质谱数据采集,最终从林下山参中共鉴定559个人参皂苷类化合物,包括148个PPT型,191个PPD型,40个OA型,17个OT型,124个C17-侧链变异型以及39个其他型。2、建立了一种基于UHPLC-Qtrap-MS动态多反应监测模式的定量/相对定量方法,经过方法学验证,结果均在可接受范围内,且方法灵敏度较好。并将该方法应用于15年生、20年生和25年生林下山参和园参的分析,利用PCA、OPLS-DA等方法对园参和林下山参以及不同年限的林下山参进行了区分。3、从人参配方颗粒标准汤剂中共鉴定57个化合物,包括皂苷25个、氨基酸及其衍生物12个、碱基及核苷5个、其他类成分15个。建立的人参配方颗粒指纹图谱有8个共有峰,指纹图谱方法精密度、稳定性、重复性良好,不同厂家不同批次人参配方颗粒的成分基本相同,仅含量上存在一定差异。结论:本论文建立离线二维方法系统分析了林下山参中的化学成分;建立了多成分定量分析方法,并应用于园参及林下山参测定中,运用多元统计分析对园参以及不同年限的林下山参进行对比分析,为林下山参的质量控制及质量标准研究奠定了基础;对人参配方颗粒进行了化学物质基础及指纹图谱研究,为人参配方颗粒的标准提升提供了科学数据。
关键词: 林下山参 ；指纹图谱 ；配方颗粒 ；质量控制
摘要： 中药传统鉴别经验是我国几千年来大量临床实践基础上所总结出来的中药品质控制方法,其以临床疗效为指标,因此至今仍在中药质量控制与评价中具有不可替代的重要价值。然而传统鉴别经验较为倚重主观经验,存在量化、标准等客观化较难的问题。随着近现代理化技术的快速发展,对中药所含成分进行定性或定量分析成为当前中药质量控制的主要手段,如以《中华人民共和国药典》为代表的质量标准中多选择1个或几个主要成分作为指标性成分进行限量控制。理化分析方法具有相对客观化的优点,但受中药多成分复杂体系、物质基础不明确的特点影响,当前理化指标多存在与临床疗效相关性差,与药材生产过程关键质量影响因素关联性弱的问题。因此,利用现代科学技术手段对中药传统鉴别经验进行挖掘,将其转化成便于控制的理化指标,揭示传统鉴别经验的现代科学内涵,对提升中药质控标准,引导中药材高品质生产具有重要意义。本文以常用大宗药材白术和黄芩为例,因古今所用白术、黄芩的生产方式呈较大变化,而不同的生产方式使其性状发生了显著变化,其品质出现相应的变化,有必要在挖掘传统鉴别经验的基础上,以符合传统所总结的性状特征的优质白术、黄芩实物为基准,将不同生产方式或不同关键影响因素下相应的药材与其做对比研究,诠释传统性状对应的现代物质基础,为现代高品质白术及黄芩药材的生产提供依据,同时为其他药材的品质评价研究提供范式。主要研究内容如下。1 白术随着白术野生资源枯竭,栽培白术已成为药用绝对主流。但目前栽培过程中,种子直播、育苗后移栽、打顶与否与方式、生长年限等不同的生产方式使其性状发生了明显变化,古代本草总结的具“凤头鹤颈、甜味重、气清香”特点的优质白术几近消失。本研究立足传统,从性状、横切片显微特征、化学成分3个层次对不同生产方式(直播不打顶3年生、移栽后打顶3年生、亳州主流栽培2年生、浙江主流栽培2年生)、不同打顶处理(不打顶、人工打顶、化学打顶)、不同生长年限(直播不打顶1～4年,移栽后打顶2～5年,抛荒4～5年及抛荒7～8年)的白术进行系统的比较分析。性状方面,采用游标卡尺进行性状数据测量;显微方面,采用番红-固绿染色法制作石蜡切片并观察显微结构;化学成分方面,采用药典法测定水溶性浸出物及醇溶性浸出物含量,采用硫酸蒽酮法测定水溶性总多糖含量,采用纤维分析仪法测定纤维类成分含量,采用高效液相色谱法(UPLC)测定白术中单糖、低聚糖及部分次生代谢产物含量,综合比较化学成分差异。研究表明,栽培过程中不干预或少干预、生长年限长的白术样品最为接近历代本草中所总结的优质白术特征,即不同生产方式白术中的直播不打顶3年生白术,不同生长年限白术中的高年限白术,不同打顶方式白术中的不打顶白术。且接近历代本草中所总结优质白术特征的白术样品,普遍呈现甜味物质(单糖等)、清香型物质(倍半萜类成分)、纤维类物质含量高,而水溶性总多糖含量低的特点。结果说明,栽培过程中人工干预过多使得白术大量富集多糖,产量提高,但甜味物质、清香型物质、纤维类物质积累不足,影响了白术的品质。而现行白术质量标准在引导白术高品质生产方面存在明显不足,如2020年版《中国药典》中白术无指标性成分含量测定项,仅设立60%乙醇浸出物含量要求。根据本研究推测60%乙醇浸出物中主要包括单糖、低聚糖、次生代谢产物等成分,可用于粗略评价白术质量合格与否,但难以表征白术品质,如存在一年的白术种苗中该含量更高的现象,无法有效引导白术高品质生产。基于此,本研究建议修订白术质量标准,增补倍半萜类成分等次生代谢产物定量分析。2 黄芩黄芩自古以来区分子芩、枯芩2种规格入药,其性状、药效存在明显区别。现代研究也表明2者化学成分及药理活性存在明显差异。而目前,黄芩的药材生产受标准以及生产成本的影响,子芩已成为市场主流,枯芩几近消失。与此同时,黄芩的相关研究多围绕子芩展开,而高年限黄芩研究较少。“中枯而飘”是传统鉴别枯芩药材重要的性状指标,本文首次较为深入地表征了其性状特征的科学内涵,为引导枯芩药材的高品质生产提供了理论依据。本研究通过UPLC-Q-TOF/MS技术对黄芩的化学成分进行分析,共解析了黄芩中的125种化学成分,其中主要化合物类型为4'-脱氧黄酮及其苷类成分。随着年限的增长,子芩转变为枯芩的过程中黄酮苷与苷元的含量发生显著变化,其中黄酮苷类成分含量明显增加,黄酮苷元类成分含量明显降低。在生产实践中,“中枯而飘”是枯芩药材重要的性状鉴别特征,研究发现其科学内涵主要是近枯心木质部的黄酮苷元含量明显升高,以及黄酮苷水解、木间木栓合成、程序性凋亡等代谢通路基因表达显著上调。现行黄芩质量标准中多不再区分枯芩、子芩,同时受生产成本的影响,导致市场上枯芩饮片近乎消亡。目前,国家标准《中国药典》的含量测定项下仅检测黄芩苷含量,而研究发现黄芩苷在子芩中含量高,枯芩中含量大幅下降。基于此,本研究建议应根据子芩、枯芩各自的特点设定含量测定指标的标准,如子芩的含测指标设为黄芩苷,枯芩的含测指标设为黄芩素,进而引导市场恢复枯芩生产。
关键词: 白术 ；黄芩 ；传统鉴别经验 ；显微 ；代谢组 ；转录组 ；品质评价
被引量
3
摘要： 目的:
本实验通过构建H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠模型,探究健脾化瘀方对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用,同时结合16S rRNA高通量测序技术和粪便代谢组学技术,了解其对小鼠肠道菌群及粪便代谢物的影响。
方法:
1.健脾化瘀方药效学评价。通过体内实验,将H22肝癌荷瘤小鼠分为模型对照组(MOD)、健脾化瘀方水煎剂组(JPHA)、挥发油组(JPHB)及其两者混合给药组(JPHM)。同时设有生理状态下的空白对照组(CON)和空白给药组(JPH）。通过在药物提取过程中增设挥发油提取,进一步探讨优化复方的提取方式后复方作用的差异。连续给药14天,实验过程中观察小鼠的一般情况、体质量和突出体表肿瘤的大小。实验结束后计算各组小鼠的脏器指数和抑瘤率;通过HE染色观察小鼠各脏器的病理改变,TUNEL染色观察肿瘤组织的细胞凋亡情况;并进行生化指标的检测。
借助GC/MS和UPLC-Q-TOF/MS技术对健脾化瘀方进行成分鉴定,并根据TCMSP数据库中OB和DL值进行活性成分的筛选。通过OMIM、GeneCards等靶点数据库检索,利用String和Cytoscape分析可以形成复方活性成分-疾病靶点互作网络网络,并通过Metascape的通路富集分析,预测健脾化瘀方治疗肝癌的作用通路。
2.利用16S rRNA高通量测序技术检测健脾化瘀方混合给药后,H22肝癌荷瘤小鼠的肠道菌群变化。通过OTU聚类分析、Alpha菌群多样性和LEfSe分析,可以了解复方给药后小鼠肠道菌群的多样性和丰度的变化,同时利用Picrust软件预测给药后小鼠体内菌群的功能。通过粪便代谢组学技术,分析健脾化瘀方混合给药后小鼠粪便代谢物的变化。采用UPLC-MS技术和统计分析方法,结合前面肠道菌群的变化,从复方给药后粪便代谢角度进一步阐释健脾化瘀方治疗原发性肝癌的作用机制。取小鼠的结肠组织进行HE染色观察结肠组织的病理变化。用Elisa试剂盒检测小鼠外周血中肿瘤坏死因子TNF-α的含量。
结果:
1.H22肝癌荷瘤的病理状态下,健脾化瘀方三个给药组的小鼠活动能力明显强于模型对照组。JPH、JPHB和JPHM组给药后体重明显增加(P<0.05)。JPHM组给药后对比MOD组肿瘤生长得到明显的抑制(P<0.05)。脏器指数统计发现,健脾化瘀方三个给药组比MOD组的脾脏指数明显减少(P<0.05),而MOD组和CON组相比则显著增大(P<0.05)。生理状态下健脾化瘀方给药后小鼠活动能力明显强于空白对照组。各组的BUN、AST、ALT检测结果发现组间没有差异。肿瘤的HE染色和TUNEL染色结果可以看出,JPHB和JPHM组对诱导肿瘤组织中细胞的凋亡和破坏肿瘤组织结构的作用明显。组织切片HE染色中,MOD组小鼠的HE染色可见肝组织损伤,给药后,损伤出现不同程度的减轻;MOD组小鼠脾脏组织结构出现破坏,给药后组织结构破坏明显减少,但JPHA组与JPHB组的保护作用不明显;MOD组小鼠肾小管出现扩张,肾小球有萎缩的情况,三个中药给药组肾脏的结构正常。
健脾化瘀方成分鉴定得到2264个化合物,进行筛选后有232个潜在活性成分。经过分析可以推测健脾化瘀方可能通过53个靶点治疗原发性肝癌,其中6个核心靶点分别是TP53、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、MAPK3。通路富集分析结果表明,健脾化瘀方可以参与NF-κ B、JAK-STAT、Wnt等信号通路。
2.小鼠粪便菌群的16s rRNA测序结果提示,健脾化瘀方给药后小鼠肠道菌群结构发生变化,优势菌属丰度发生明显改变,给药后厚壁菌门丰度下降、双歧杆菌丰度显著上升。粪便非靶向代谢组学分析中表明,中药复方给药后小鼠粪便中显著增多的代谢物大多数为与中药成分相关的的物质:有萜类化合物、类黄酮化合物、生物碱类化合物和香豆素类化合物;脂质:有类聚酮类化合物、脂肪酰基和固醇脂质;有生物作用的代谢物:苯和衍生物、有机酸和酚类、吲哚、嘌呤。经过分组,具有强大抗炎作用的Resolvin d1在健脾化瘀方给药后明显增加。通过KEGG富集分析对甄别出来的代谢物进行功能注释,确定代谢物主要参与生化代谢途径和信号转导途径。结合肠道菌群的变化和结肠病理染色,可以得知健脾化瘀方可能通过增加双歧杆菌的丰度、增加Resolvin d1的分泌、减轻肠道的损伤和减少促炎因子的产生。
结论:
健脾化瘀方治疗原发性肝癌的作用体现在抑制肿瘤的生长,保护脏器,改变肠道菌群的结构。这个过程增加了抗炎作用物质的产生,减少促炎因子的水平,从改善机体炎症情况治疗原发性肝癌,结合代谢组学和通路富集的结果推测其可能通过参与调控NF-κ B通路发挥作用。
关键词: 健脾化瘀方 ；原发性肝癌 ；肠道菌群 ；代谢组学
被引量
2
摘要： 党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花党参Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen或川党参Codonopsis tangshen Oliv·的干燥根,因具有显著的补益作用而受到普遍的关注。然而对党参的研究多聚焦于多糖,以及弱极性部分的分离,鲜有对弱极性部分含量测定及活性研究的报道。为了深入了解党参弱极性部分化合物的结构类型、含量以及相关活性,本论文首先采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术结合对照品比对开展了党参中弱极性部分的化学成分鉴定,构建了党参弱极性部分的UPLC-MS指纹图谱,并开展了抗炎活性的谱效关系研究,进一步构建了14种可能具有抗炎活性成分的UPLC-Q-TOF-MS含量测定方法,对23批党参样品中14种成分进行含量测定,基于14种成分的含量结合化学计量学分析实现了3种基原党参的鉴别。具体研究内容如下:1.党参弱极性部分化学成分分析采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,对流动相、电离源以及质谱参数进行优选,通过化合物的保留时间、相对分子质量、一级和二级质谱信息对比,并结合参考文献,在党参弱极性部分中共鉴定出36个化合物（11个三萜类化合物,5个甾醇类化合物,8个生物碱及含氮类化合物,1个己醇苷类化合物,2个炔类及烯类化合物,5个酚酸及有机酸类化合物,3个倍半萜类化合物和1个其他类化合物）。三萜及甾醇类成分是具有独特骨架和良好生理活性的一类天然产物,但对于党参中三萜及甾醇类成分的质谱分析却鲜有报道。因此,针对党参中三萜及甾醇类成分的质谱规律展开研究,对比分析电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）对三萜和甾醇类化合物电离的影响,发现APCI源较ESI源更适合党参内三萜和甾醇类成分的电离,归纳党参中三萜和甾醇类化合物的一级和二级质谱信息,对三萜和甾醇类化合物可能的裂解途径进行推测,并总结了党参中两类五环三萜同分异构体的鉴别规律,为类似物质的分析和鉴别提供参考。2.党参弱极性部分抗炎谱效关系研究通过UPLC-MS构建了18批党参弱极性部分的指纹图谱,标记了20个共有峰。18批党参样品指纹图谱的相似度在0.850-0.973之间,说明不同产地、基原和生长年限党参的弱极性部分存在差异。通过小鼠单核巨噬细胞RAW264.7构建体外炎症模型,测定18批党参药材弱极性提取物对NO的抑制率。运用灰色关联度法对指纹图谱中共有峰峰面积及NO抑制率进行分析,发现对抗炎作用贡献最大的5个峰为峰7、10、12、17和20,其中,共有峰12推测为甾醇类化合物,共有峰17为β-sitosterol,共有峰20为friedelin。三萜和甾醇类化合物glut-5-en-3β-ol、stigmasta-4,22-dien-3-one、stigmasterol、taraxerol、codopitirol A、24-methylenecycloartanol、codonopliate C与抗炎活性的关联度均大于0.8。表明党参弱极性部分中三萜及甾醇类化合物在抗炎药效的发挥中起到重要作用。3.党参中14种萜类及甾醇类化合物的UPLC-Q-TOF-MS含量测定方法研究党参中三萜和甾醇类化合物含量低、成分类型多、结构相似、无紫外吸收、电离困难、对照品难获得,至今尚无相关成分含量测定的研究报道。因此,基于实验室前期从党参中分离得到的1个倍半萜内酯类化合物,10个三萜类化合物和3个甾醇类化合物,构建党参中14种成分的UPLC-Q-TOF-MS含量测定方法,14种化合物在各自范围内都具有良好的线性关系,R2≥0.9925,平均加样回收率在81.25%～118.05%（RSD<4.00%）,日内精密度RSD<4.54%,日间精密度RSD<6.82%,方法学考察证实该方法简便、可行。进一步采用该方法测定了3个基原23批党参样品中14个成分的含量,发现各批次党参样品中friedelin、taraxerol、β-sitosterol和stigmasterol的含量均大于万分之二,达到药典中指标性成分含量的最低要求。研究发现3个基原党参样品中14种化学成分的含量存在差异,结合化学计量学分析发现线性判别分析可成功实现3个基原的党参样品的区分。
关键词: 党参 ；萜类 ；甾醇类 ；液质联用 ；谱效关系 ；含量测定
被引量
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摘要： 柴胡作为我国常用大宗中药材之一,由于其药用及经济价值不断被挖掘,市场需求骤增,野生柴胡资源被过度挖掘,难以满足市场需求。供需关系的失衡极大地刺激了北柴胡栽培产业的发展,近30年来栽培北柴胡产业发展迅猛,目前栽培北柴胡已逐渐取代野生资源成为商品柴胡的主要来源。野生与栽培北柴胡受生境、年限、栽培措施及经济效益的影响,两者的药材品质也存在明显差异。因此,有必要在辩状论质的基础上,联合现代分析技术从外观性状-化学成分-解表退热三个层面系统比较野生与栽培北柴胡的质量差异,为增补修订栽培北柴胡质量评价标准,引导生产高品质北柴胡药材提供理论参考。主要研究内容如下:
通过文献、市场、基地等多种调研方式,收集北柴胡主产区的野生与栽培样品,观察并测量药材的体长直、侧根数目、根皮颜色、断面质地、气味等外观性状特征;化学成分方面,通过比较两者的浸出物类(水溶性浸出物、醇溶性浸出物)、糖类(蔗糖、淀粉、总多糖)、细胞壁组分(半纤维素、纤维素、木质素)、代表性次生代谢物(5种柴胡皂苷、4种黄酮)含量进行对比分析,以及通过非靶向代谢组学技术顶空进样联合气相色谱-质谱法(HS-GC-MS)、超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS),表征两者由野生向栽培的转化中挥发性成分、柴胡皂苷类等相关代谢物的差异变化。解表退热方面,参考临床煎药方式制备野生与栽培北柴胡的水煎液,探究两者在干酵母诱导大鼠发热模型上的解表退热功效对比。
结果表明,在外观性状上,野生北柴胡生长年限长、生长环境复杂,药材根头部膨大,主根粗大,常有多个茎残基,根形不规则,弯曲粗短,长度在91～125 mm之间,变化范围宽;表皮粗糙、颜色深,具纵皱纹、皮孔及支根痕,呈棕褐色或灰棕色;质硬且韧,不易折断,断面呈纤维性;气微香,味微苦辛。而栽培北柴胡生长环境土壤较松软,逆境胁迫少,药材根头部较野生来说膨大不明显,主根顺直,少茎基,长度在96～161 mm之间,均匀规则,变化范围更小,药材更为匀称;表皮皮孔较少,颜色浅,呈棕黄色或淡棕色,断面纤维性弱,气味淡。
化学成分上,野生北柴胡醇溶性浸出物、木质素含量明显高于栽培北柴胡(p<0.05);水溶性浸出物、槲皮素含量略高于栽培北柴胡,但两者差异无统计学意义。栽培北柴胡中纤维素含量明显高于野生北柴胡(p<0.05);蔗糖、淀粉、总多糖及半纤维素含量略高于野生北柴胡,差异无统计学意义。超高液相色谱法(UPLC)测定野生与栽培北柴胡中5种柴胡皂苷类成分(柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D、柴胡皂苷E、柴胡皂苷F)、4种黄酮类成分(芦丁、槲皮苷、水仙苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷)含量,结果显示栽培北柴胡中五种柴胡皂苷、芦丁、水仙苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷均明显高于野生北柴胡(p<0.05);槲皮苷含量略低于野生北柴胡,两者差异无统计学意义。将这些指标测定结果进行主成分分析(PCA)与偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)多元统计分析,发现蔗糖、木质素、纤维素是导致两者聚类明显分离的重要指标。
基于HS-GC-MS技术,在野生与栽培北柴胡中共鉴定得到67种挥发性成分,野生北柴胡59种,栽培北柴胡51种,两者共有化合物43种;67种挥发性成分可归为脂肪酸、芳香族、烯烃、醛、酮、烷烃、醇、酯、醚九类化合物,它们在野生与栽培北柴胡中占比不同,占比最高的为脂肪酸与芳香族化合物,野生北柴胡中两者占比为49.33%,栽培北柴胡中为50.78%;醇、酯、醚占比较低,野生北柴胡中三者占比总和为9.68%,栽培北柴胡中为6.69%。基于UPLC-Q-TOF-MS技术,在北柴胡样品中解析得到72种化合物,其中主要为柴胡皂苷类成分,联合多元统计分析筛选得到的差异性化合物在栽培北柴胡中的响应值更高。
解表退热方面,在干酵母诱导的大鼠发热模型上,通过监测模型组大鼠各时间点的体温变化,结果显示颈背部皮下注射干酵母能够成功诱导大鼠发热。北柴胡实验组发热大鼠经过两次灌胃给药,在造模3h后与模型组大鼠体温具有明显差异,在二次灌胃给药时,观察到给药组大鼠体温下降,展现出了较好的解表退热疗效。通过独立样本t检验、单因素方差分析等多种统计学分析方法,综合对比两者在监测过程中的体温变化曲线、最大体温上升高度、平均体温变化差值及体温反应指数,发现野生与栽培北柴胡的退热效果存在明显差异,其中野生北柴胡高剂量组>栽培北柴胡高剂量组>野生北柴胡低剂量组>栽培北柴胡低剂量组。
综上所述,本研究从外观性状-化学成分-解表退热三个层面对野生与栽培北柴胡进行系统比较分析,发现野生与栽培北柴胡的外观性状差异较大,其醇溶性浸出物、木质素、纤维素、柴胡皂苷类、挥发性物质含量明显不同,对于干酵母致热大鼠模型的解表退热疗效也存在差异。目前栽培北柴胡质量评价体系并不完善,本研究摆脱了凭借少数指标成分含量测定来进行柴胡质量评价的束缚,通过综合分析多方面的指标,制定出具有全面性、代表性和普适性较强的柴胡质量评价方法,为维护北柴胡质量、保护其资源提供理论支撑。
关键词: 北柴胡 ；野生与栽培 ；质量评价 ；代谢产物 ；解表退热
摘要： 目的：初步确定苍术药材的质量标志物，并建立基于质量标志物的苍术饮片等级评价标准。 方法：（1）基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的苍术药材化学成分分析：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，对北苍术、茅苍术和关苍术的药材化学成分进行定性分析。并以此为基础，采用PCA和OPLS-DA对不同品种苍术化学轮廓图谱进行差异研究。 （2）苍术HPLC指纹图谱研究：采用HPLC技术建立三个品种苍术药材的HPLC指纹图谱，同时运用UPLC-Q-TOF-MS/MS法对指纹图谱上主要特征峰进行辨识。 （3）基于网络药理学技术筛选苍术质量标志物（Q-Marker）：选取北苍术与茅苍术差异性成分、指纹图谱共有特征性成分一共9个化合物作为候选成分，利用Swiss Target Prediction服务器、Pubchem服务器对苍术9个候选成分进行靶点预测，采用Genecards、OMIM数据库寻找慢性胃炎疾病靶点，再通过在线Venn2.1分析工具获得成分和慢性胃炎疾病靶点交集，使用Uniprot数据库将预测出的靶点蛋白名转换为对应的基因名、利用DAVID数据库筛选出重要通路，利用Cytoscape3.6.1软件得到“药材-成分-靶点-通路”网络关系，筛选苍术药材潜在的质量标志物（Q-Marker）。 （4）苍术三种Q-Marker的含量测定：建立3种Q-Marker的HPLC含量测定方法，分析苍术不同品种、不同产地、不同加工方式、不同生长年限、主根与须根中Q-Marker的含量差异，探究Q-Marker的动态变化规律，考察Q-Marker的可测性。 （5）基于Q-Marker的苍术饮片等级评价研究：对50批苍术饮片进行质量评价研究，以外观性状、水分、总灰分、酸不溶性灰分、β-桉叶醇、苍术素、苍术酮/苍术素作为等级划分指标，确定苍术饮片等级划分标准。 结果：（1）一共鉴定出苍术药材中32个化合物，分别属于有机酸类、糖苷类、聚乙烯炔类和倍半萜类等不同类型。识别出苍术正品（北苍术和茅苍术）与关苍术差异成分12个，北苍术与茅苍术差异成分9个，其中TDDA在苍术正品中相对含量较高，在关苍术中相对含量低。而TDEYA、芹烷二烯酮在苍术正品中相对含量低，在关苍术中相对含量较高。 （2）建立了三个品种苍术药材的指纹图谱，共标定9个主要特征峰，并指认北苍术与茅苍术中5个共有成分：(4E,6E,12E)-tetradecatriene-8,10-diyne-1,3-diol-diacetate（TDDA），(6E,12E)-tetradecad ecatriene-8,10-diyne-1,3-diol-diacetate（TDEYA），β-桉叶醇，苍术素，苍术酮;关苍术中5个共有成分：白术内酯Ⅲ、TDDA、TDEYA、芹烷二烯酮、苍术酮。 （3）结合网络药理学活性以及Q-Marker理念，得到14个核心靶点和20条通路，初步预测Diacetyl-atractylodiol、TDDA、芹烷二烯酮、β-桉叶醇、苍术酮、TDEYA、3β-acetoxy atractylon、苍术素共8个化合物可作为苍术的候选Q-marker。 （4）建立了3个Q-Markers的HPLC含量测定方法，三种有效成分在不同品种、不同产地、不同生长年限、不同生长部位以及炮制前后的药材中均可以检测到，且含量较高，不同批次样品中Q-Marker的含量存在着量的差异，符合Q-Marker的可测性和特有性的要求。 （5）根据外观性状、水分、总灰分、酸不溶性灰分、β-桉叶醇、苍术素、苍术酮/苍术素7项指标测定值的范围将苍术饮片划分为一等、二等品和不合格品，结果表明总共50批苍术饮片，一等品有15批，占比30%，二等品有8批，占比16%，不合格饮片有27批，占比54%。 结论：本研究基于中药质量标志物理论，整合化学成分-品种差异-指纹图谱-药效成分-含量测定-等级评价，对苍术药材进行了基础性的研究，初步拟定了苍术饮片等级标准，为中药质量评价研究提供了一种思路，为苍术药材的质量评价及临床应用提供了一定的科学依据。
关键词: 苍术 ；等级评价 ；质量标志物 ；指纹图谱
摘要： 金不换为蓼科酸模属网果酸模Rumex chalepensis Mill.的根及根茎,味苦、性寒,具有清热解毒、破瘀生新、消肿痛、止血、通便、杀虫等功效,民间用于止血和治疗痢疾。现代临床应用认为其具有理气活血、破瘀生新、消肿生肌之功效。其单味药或复方治疗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)相关性胃炎、消化性溃疡、十二指肠球部溃疡等均取得了较好的疗效。上世纪80年代,湖北省荆州市中医医院已制成金不换(网果酸模)冲剂,该制剂临床治感染Hp相关性胃炎等,疗效确切。但金不换(网果酸模)基础研究比较薄弱,没有建立地方和国家标准,质量难以控制,制剂未经过严格的工艺筛选,难以发挥最大药效,毒性及药效学研究几乎为空白。因此,有必要对已有30余年临床应用的金不换(网果酸模)开展全面的基础研究。本课题对金不换(网果酸模)的基原、化学成分、质量标准、制剂工艺、急性毒性、抑制胃酸、胃蛋白酶药理作用进行研究,主要内容及结果如下:1金不换基原鉴定金不换鉴定用样品采自湖北省荆州市公安县章庄铺镇,共2批,第一批具有根、茎、叶和花;第二批具有根、茎、叶和果实。黑龙江中医药大学王振月教授以植物形态和解剖上相似性为基础,依据《中国植物志》第25(1)卷,鉴定其为蓼科酸模属网果酸模Rumex chalepensis Mill.的干燥根及根茎。2金不换(网果酸模)化学成分分析采用UPLC-Q-TOF-MS技术,对金不换(网果酸模)可能含有的化学成分进行分析。结果共鉴定化合物18个,其中结合蒽醌化合物3个,游离蒽醌化合物3个,萘醌类化合物4个,黄酮类化合物7个,木脂素类1个。该研究结果为其质量控制及药效的阐明奠定了基础。3金不换(网果酸模)质量标准的制定3.1建立金不换(网果酸模)的薄层鉴别方法对金不换(网果酸模)中5个成分进行薄层鉴别。以硅胶G板为固定相,以乙酸乙酯-三氯甲烷-丙酮-甲醇-水(1:5:2.5:1.5:0.4)为展开剂,在紫外光365 nm下,检识大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷;以硅胶G板为固定相,以石油醚(60～90℃C)-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6:1:1:0.5)为展开剂,在紫外光365 nm下检识大黄素、酸模素、大黄酚、大黄素甲醚。薄层图谱显示,在与对照品相同位置处,供试品显示相同颜色的斑点,样品各成分分离较好,Rf大黄酚-8-O-β-D葡萄糠苷=0.59,Rt大黄素=0.26,Rf酸模素=0.46,Rf大黄酚=0.54,Rf大黄素甲醚=0.62,Rf值均在0.2～0.8之间。该方法可作为金不换(网果酸模)薄层鉴别方法。3.2建立金不换(网果酸模)液相含量测定方法,明确其生长年限、采收时间采用高效液相色谱法建立了金不换(网果酸模)含量测定方法。通过对色谱柱、流动相、检测波长进行考察,确定含量测定条件为:色谱柱Agent Extend-C18(250×4.6mm,5μm),254nm波长处二极管阵列检测器检测,流动相为:A 甲醇,B 0.1%甲酸,梯度洗脱,0～14 min,45%～60%A,14～25 min,60%～86%A,25～30 min,86%～100%A,30～35 min,100%A。流速11 mL/min,柱温25℃,进样量5μL。通过筛选供试品溶液提取方法、溶剂、溶剂体积、提取时间,确定供试品溶液制备方法为:金不换药材粉末(过50目筛)1.0g,加甲醇40 mL,超声提取1h;并进行方法学考察,标准曲线、精密度、稳定性、重复性、加样回收均符合含量测定要求。对采集的16批金不换(网果酸模)中大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量进行测定,含量范围分别为0.06%～0.71%、0～0.27%、0.10%～0.65%、0.01%～0.06%、0.07～0.43%、0.01%～0.04%。上述 6 个成分可作为金不换(网果酸模)含量控制指标。同时,对不同生长年限、不同采收期、不同地块样品含量对比分析,认为金不换(网果酸模)最佳采收年限为2年,适宜在初春或夏末初秋采集。3.3建立金不换(网果酸模)指纹图谱采用液相色谱法,对16批金不换(网果酸模)开展指纹图谱研究。结果显示,16批次金不换(网果酸模)在254nm波长下,共获得10个共有峰,各色谱峰分离度较好,平均相似度为0.91。对比分析不同地块、不同生长年限、不同采收季节样品含量发现,金不换(网果酸模)HPLC指纹图谱相似度虽有变化,但均大于90%。本文所建立金不换(网果酸模)的指纹图谱特征性及专属性强,可用于全面控制金不换的质量。4金不换(网果酸模)制剂的研究4.1优化金不换(网果酸模)提取方法,确定最佳工艺参数采用L9(34)正交设计和单因素考察,以金不换(网果酸模)主要成分总提取率和抑菌环为考察指标,对金不换(网果酸模)水提醇沉工艺和醇提取工艺进行对比筛选,同时按荆州医院金不换冲剂的生产工艺制备金不换样品。实验结果显示,金不换(网果酸模)最佳醇提取工艺为药材加6倍量75%乙醇回流提取90 min,提取3次,酸模素及蒽醌类总提取率为0.73%,明显高于水提工艺的0.24%、水提醇沉工艺的0.28%和荆州原冲剂工艺的0.24%,6个成分转移率为84.11%,高于水提工艺的27.68%、水提醇沉工艺的33.08%和荆州冲剂工艺的27.68%,因此,确定金不换的提取工艺为75%乙醇回流提取,最佳工艺条件为饮片加6倍量75%乙醇回流提取90 min,提取3次。4.2制备金不换胶囊剂按2015版《中国药典》(通则0103),制成金不换乙醇提取物胶囊剂。水分含量、装量差异、崩解时限、稳定性均符合《中国药典》的要求。胶囊剂规格:0.49 g/粒,服用方法:3次/日,3粒/次。4.3建立金不换胶囊剂HPLC含量测定方法采用高效液相色谱法建立了金不换胶囊含量测定方法。金不换胶囊内容物主要含有大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、酸模素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等成分,3批金不换胶囊6个成分平均含量分别为3.20%、0.40%、0.23%、0.10%、1.03%、0.25%,总含量5.21%。该研究结果为金不换胶囊剂质量控制提供了科学依据。4.4建立金不换胶囊剂的薄层鉴别方法对金不换(网果酸模)胶囊中5个成分进行薄层鉴别。参照金不换(网果酸模)饮片薄层鉴别方法进行检识。薄层图谱显示,供试品色谱在与对照品色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,同时,各荧光斑点分离度较好,Rf大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷=0.59,Rf大黄素=0.26,Rf酸模素=0.46,Rf大黄酚=0.54,Rf大黄素甲醚=0.62,Rf值均在 0.2～0.8之间。上述5个成分可作为金不换(网果酸模)胶囊剂薄层鉴别成分。5开展金不换(网果酸模)急性毒性研究在无法得到金不换(网果酸模)的半数致死量(LD50)情况下,进行最大耐受量实验,结果显示:小鼠灌胃量等同人服用生药量的250倍,远大于100倍,表明金不换(网果酸模)75%乙醇提取物毒性很小。6金不换(网果酸模)对胃幽门结扎大鼠胃酸、胃蛋白酶的影响采用幽门结扎法考察金不换(网果酸模)75%乙醇提取物对大鼠胃酸、胃蛋白酶的影响。实验结果表明,各给药组均具有降低胃溃疡大鼠胃液总酸度、每小时总酸排出量和胃组织蛋白酶活力的作用,金不换(网果酸模)高剂量组联合奥美拉唑(西药)抑制胃酸、胃蛋白酶分泌能力在各给药组中最强,其对胃酸、胃蛋白酶的抑制作用优于阳性药奥美拉唑和单味中药金不换(网果酸模),说明金不换(网果酸模)高剂量组联合奥美拉唑具有增效作用。
关键词: 金不换(网果酸模) ；基原鉴定 ；成分分析 ；质量控制 ；制剂工艺 ；急性毒性 ；胃酸 ；胃蛋白酶
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摘要： 目的:林下山参为我国传统名贵药材,近年来随着其在食品、医疗领域的广泛应用,其质量愈加成为人们关注的焦点。由于林下山参资源稀缺,价格昂贵且市场需求大,假冒林下山参及掺伪现象不断增多,制定林下山参科学准确的质控方法,完善林下山参质量标准,显得尤为重要。林下山参作为多年生草本植物,采收年限对其质量有重要影响,对生长年限的正确判断与质量控制息息相关。本课题对辽宁省桓仁地区林下山参展开研究,通过建立林下山参HPLC指纹图谱结合多成分含量测定方法,利用LC-MS技术解析林下山参化学物质成分,基于代谢组学技术深度研究林下山参代谢物组分,结合多元统计方法对结果进行分析,对林下山参质量评价、生长年限研究以及林下山参与园参的鉴别具有一定意义。方法:（1）对林下山参的提取方法进行单因素考察,完成林下山参供试品制备方法初步确定,再通过均匀设计优化确定最优提取条件。通过HPLC-PDA对样品进行色谱条件考察,建立林下山参HPLC指纹图谱结合多成分含量测定方法。（2）采用HPLC-PAD对林下山参指纹图谱进行分析,运用国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》（2012版）软件进行分析,生成10、15年和20年林下山参指纹图谱共有模式。利用UPLC-Q-TOF/MS对指纹图谱共有峰进行鉴定;利用SIMCA-P软件以峰面积为变量进行聚类分析、正交偏最小二乘法分析。（3）基于UPLC-Q-TOF/MS的植物代谢组学技术分析林下山参与园参,对30批林下山参与10批园参差异性代谢物进行研究。结果:（1）确定了林下山参最佳提取工艺:提取方法为超声提取后,旋转蒸发至干后复溶;提取溶剂为70%甲醇;提取时间为100 min;提取温度为50°C。建立了林下山参指纹图谱结合多成分含量测定方法:色谱柱采用Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm,2.7μm）,检测波长203 nm,柱温30°C,进样量5μL,流速1.0 m L/min,流动相以0.1%甲酸-乙腈为A相,0.1%甲酸-水溶液为B相进行梯度洗脱。测定了人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的含量。（2）生成林下山参指纹图谱共有模式,以人参皂苷Re为参照峰,标定33个共有峰,并利用UPLC-MS技术对16个色谱峰进行了解析。以指纹图谱共有峰面积为依据建立的OPLS-DA判别模型可区分林下山参与园参、不同参龄（10年、15年和20年）林下山参。（3）基于UPLC-Q-TOF/MS的植物代谢组学技术分析林下山参与园参,利用PCA、PLS-DA、OPLS-DA等分析方法鉴定林下山参生长年限范围、鉴别林下山参与园参,并对影响分组贡献率较大的差异代谢物在不同样本的丰度进行分析。结论:本课题首次建立辽宁桓仁产区林下山参的指纹图谱结合多成分含量测定方法,从整体对林下山参质量进行评价。利用指纹图谱结合数理统计方法,建立OPLS-DA判别模型,可用于区分林下山参和园参、不同生长年限的林下山参。基于UPLC-Q-TOF/MS的植物代谢组学从代谢物层面技术区分林下山参和园参及不同参龄林下山参。本实验建立的检测方法合理、稳定、可靠且重现性好,可用于不同参龄林下山参质量评价分析、生长年限相关研究及林下山参与园参的鉴别研究。
关键词: 林下山参 ；指纹图谱 ；LC-Q-Tof-MS ；OPLS-DA
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摘要： 前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根。《中国药典》记载前胡有降气化痰、散风清热的功效,用于痰热喘满,咳痰黄稠,风热咳嗽痰多等症。香豆素类化合物是前胡中的主要化学成分,包括角型吡喃香豆素、呋喃香豆素和其他香豆素,是前胡质量评价的重要指标。目前对前胡的质量研究集中在化学成分的定性分析,或对少数香豆素成分进行定量分析,尚缺乏对前胡药材中香豆素类化合物进行全面鉴定和定量分析的方法。本研究针对前胡质量评价中存在的问题进行了以下两方面研究:1采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）,建立了前胡中香豆素类成分同时鉴定和定量的分析方法,并对不同前胡样品和混淆品进行比较。2依据《欧洲药典》起草了前胡的质量标准。包括性状,粉末显微鉴别,薄层色谱法鉴别,水分、总灰分和酸不溶性灰分的检查,白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色谱法含量测定。呋喃香豆素类化合物广泛分布于高等植物中,其基本骨架由苯并a吡喃酮和呋喃环构成,分为线型和角型两种,并常以C-5位和C-8位不同取代的同分异构体形式共存。由于同分异构体具有分子量相同、结构相近和理化性质相似等特点,通常具有相似的色谱行为和质谱裂解特征而不易区分。本文采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,通过研究4对呋喃香豆素同分异构体,总结了特征碎片离子的相对丰度比法（RRA）用以区分C-5位和C-8位不同取代的同分异构体,并将此方法用于白芷中呋喃香豆素同分异构体的区分,为中药复杂体系中异构体的研究提供了新思路。第一部分前胡中香豆素类化合物同时鉴定和定量分析方法的建立及其在前胡与混淆品分析中的应用目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,建立同时鉴定和定量分析前胡中香豆素类成分的方法,并评价不同前胡样品和混淆品的质量。方法:1检测条件:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对样品进行检测。色谱柱为Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm,3μm）,流动相为1mmol/L乙酸铵水溶液（A）和乙腈（B）,梯度洗脱,流速为0.5 m L/min;进样量5μL。高分辨质谱采用ESI源,正离子模式,一级全扫描采集,采用动态背景扣除和信息依赖采集触发二级碎片的采集,每一循环采集12个最强峰的二级质谱图。2样品制备:甲醇作为提取溶剂,采用超声处理的方式制备样品。3化合物鉴定和定量分析:将已知的化学式输入数据处理软件Master View中,对误差范围在±5 ppm内的色谱峰基于精确分子质量和一级、二级质谱图,结合香豆素的裂解规律和文献中已报道的化合物的裂解途径进行鉴定;在进行鉴定的同一分析周期内,对有对照品的9个成分白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E、欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒素、佛手柑内酯、补骨脂素和异茴芹内酯进行绝对定量,对所有色谱峰得到专属分离的化合物采用峰面积进行相对量测定。4样品分析:以对照药材中各定量化合物的峰面积为标准,其他样品中各化合物峰面积与之比较,产生峰面积比值,基于峰面积比值的和及主成分分析法对23批前胡样品进行分析。依据已鉴定的化合物对13批前胡混淆品进行分析。结果:应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析鉴定了前胡中54个香豆素类化合物,包括36个角型吡喃香豆素、13个呋喃香豆素和5个其他香豆素。其中色谱峰得到专属分离的化合物共29个。9种成分在测定浓度范围内线性关系良好,仪器重复性、检测限、定量限、精密度、准确度和稳定性均符合要求。9种化学成分在所有批次样品中的总含量范围为694.57～26532.10μg/g,RSD值为51%。29个化合物中有8个角型吡喃香豆素和2个呋喃香豆素的峰面积在样品中较大。PCA分析结果表明前胡香豆素E、白花前胡甲素和3'-（异戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）-4'-（异戊酰氧基/2-甲基丁酰氧基）凯尔消旋内酯的含量是评价前胡药材质量的关键因素。对13批前胡混淆品的分析结果表明紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防风具有与白花前胡一定相同的物质基础,且可以分别利用15、13、14和31个香豆素成分区分白花前胡与紫花前胡、少毛北前胡、毛前胡和石防风。前胡混淆品隔山香不具有与白花前胡相似的物质基础。前胡已鉴定的54个化合物中有8个化合物（6个角型吡喃香豆素、1个呋喃香豆素和1个其他香豆素）均不存在于13批混淆品中。结论:本研究首次建立了同一分析周期内同时鉴定和定量分析前胡中香豆素成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS法。该法简便、灵敏度高、专属性强。对前胡样品和前胡混淆品的分析可知角型吡喃香豆素是评价前胡质量的关键,且能用于区分前胡及其混淆品。第二部分前胡质量标准研究目的:建立前胡质量评价方法,为《欧洲药典》前胡质量标准的制订提供参考。方法:以9批样品为分析对象,探索前胡质量评价方法。1鉴别:采用性状鉴别、显微鉴别和薄层色谱鉴别法。观察前胡的外观性状及其粉末在显微镜下的特征;薄层色谱鉴别法以甲醇作为提取溶剂,超声处理的方法制备样品,使用硅胶G薄层板,以环己烷-乙酸乙酯（2:1）为展开剂,紫外光灯（365 nm）下检视。2检查:依据《欧洲药典》中的检查方法对前胡进行水分、总灰分和酸不溶性灰分的检查。3含量测定:采用高效液相色谱法测定白花前胡甲素和白花前胡乙素两成分。以甲醇作为提取溶剂,超声处理时间为30分钟,提取液直接测定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,以甲醇-水（68:32）为流动相,流速0.8 m L/min,进样体积10μL,检测波长322 nm。结果:1鉴别:前胡外观性状突出,具有特征性的纵沟、纵皱纹及横向皮孔样突起;前胡粉末显微特征突出,具有特征性的木栓细胞、导管和木纤维;薄层色谱法可见7个荧光斑点。2检查:9批样品的含水量均小于8.9%,总灰分均小于7.8%,酸不溶性灰分均小于3.4%。3含量测定:白花前胡甲素和白花前胡乙素分别在5.00～400.00μg/m L和0.50～40.00μg/m L范围内线性关系良好,回归方程分别为Y=28.4782224X+6.484094（r=0.99999）和Y=25.5893187X-0.3288223（r=0.99999）,精密度（RSD）均在0.6%2.0%之间,加样回收率均在90.7%104.8%之间。白花前胡甲素的含量范围为0.73%2.24%,白花前胡乙素的含量范围为0.12%0.33%。结论:本文建立的鉴别、检查和含量测定方法稳定,更简便,可用于前胡的质量控制。第三部分UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术区分呋喃香豆素类同分异构体及其在白芷中的应用目的:建立一种快速、稳定的区分C-5位和C-8位不同取代的呋喃香豆素类同分异构体的质谱方法,并将其应用于白芷中呋喃香豆素类同分异构体的鉴定。方法:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术中的MS-IDA-12MS/MS模式和子离子扫描模式对4对同分异构体,花椒毒素和佛手柑内酯、欧前胡素和异欧前胡素、补骨脂素和异补骨脂素、茴芹内酯和异茴芹内酯进行采集,使用Master View软件对其碎裂规律和碎片信息进行总结和分析,建立呋喃香豆素类同分异构体的质谱区分方法,并对白芷中的呋喃香豆素类同分异构体进行鉴定区分。采用Epic C18色谱柱（15 cm×2.1 mm,3μm）,流动相为1 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和甲醇（B）,梯度洗脱。结果:建立特征碎片离子的相对丰度比法（RRA）用于C-5位和C-8位不同取代的呋喃香豆素类同分异构体的区分。即呋喃香豆素类化合物易连续丢失CO产生碎片离子,根据同分异构体间主要碎片离子的相对丰度比值的大小区分取代基的位置。采用建立的方法共鉴定出白芷中5对呋喃香豆素类同分异构体。结论:本方法基于呋喃香豆素的质谱裂解规律建立了稳定、快速的区分呋喃香豆素类同分异构体的质谱方法,并成功应用于中药复杂体系中此类同分异构体的区分。
关键词: 前胡 ；UHPLC-Q-TOF-MS/MS ；香豆素 ；质量标准 ；同分异构体 ；相对丰度比法 ；白芷
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摘要： 目的:采用现代质谱技术，对来源于不同产地人参中的化学成分进行系统的定性与定量分析，考察生长环境、生长年限等因素对人参成分的影响，进一步探究道地产区以及非道地产区人参质量的差异。旨在通过的化学成分的研究，为人参药材综合质量评价体系的建立提供参考。 方法:采用UPLC-TOF-MS/MS及UPLC-MRM-MS/MS技术对来自全国5个地区(辽宁，吉林，黑龙江，湖北，云南)的多种人参进行成分分析，并结合多元统计方法评价不同产区药材优劣。 (1)采用63种现存的人参皂苷作为对照品，人参皂苷Re3(1),人参皂苷20-glu-Rf(2),人参皂苷Re4(3),人参皂苷Re2(4),三七皂苷R1(5),人参皂苷Re1(6)，人参皂苷Rg1(7)，人参皂苷Re(8),人参皂苷Ro(9),CS-Ⅳ(10),CS-Iva(11),三七皂苷R4(12),20(S)-人参皂苷Rf-1a(13),20(S)-人参皂苷Rf(14),20(R)-人参皂苷Rf(15),20(S)-三七皂苷R2(16),人参皂苷F3(17),人参皂苷Ra2(18),人参皂苷Ra3(19),20(R)-三七皂苷R2(20),人参皂苷Rb1(21),20(S)-人参皂苷Rg2(22),20(R)-人参皂苷Rg2(23),人参皂苷Ra1(24),人参皂苷Rc(25),20(S)-人参皂苷Rh1(26),20(R)-人参皂苷Rh1(27),人参皂苷Rb2(28),人参皂苷Rb3(29),Q-R1(30),人参皂苷Rd(31),人参皂苷Rk1(32),人参皂苷Rs2(33),人参皂苷Rs1(34),人参皂苷Ro甲酯(35),人参皂苷Rh19(36),DHDGG(37),人参皂苷Rg6(38),人参皂苷F4(39),DHDXG(40),CS-Iva甲酯(41),人参皂苷Rk3(42),人参皂苷Rh4(43),人参皂苷Rg9(44),人参皂苷F2(45),20(S)-人参皂苷Rg3(46),20(R)-人参皂苷Rg3(47),DEDT(48),20(S)-PPT(49),20(R)-PPT(50),20(S)-人参皂苷Rs3(51),20(R)-人参皂苷Rs3(52),人参皂苷Rs4(53),ZB-RI-6''甲酯(54),人参皂苷Rg5(55),人参皂苷K(56),20(S)-人参皂苷Rh2(57),20(R)-人参皂苷Rh2(58),DDT(59),20(S)-PPD(62)以及20(R)-PPD(63),对来源于集安的15年生的林下参，5年生的林下参，5年的生园参，5年生的农田参进行定性分析。采用Peakview1.2软件分析解析化合物，同时，运用网站Sci-Finder查询推测的化合物是否为潜在的新型人参皂苷化合物。采用代谢组学的方法处理质谱数据，利用多元统计分析技术如聚类分析、OPLS-DA分析、热图分析、韦恩图分析等，比较不同生长环境下人参中人参皂苷种类差异。 采用上述方法，对我国道地产区（吉林省抚松县）以及非道地产区（黑龙江省铁力县）两个主产区的5年生的农田参进行定性分析处理，研究两个不同生长环境下，两个主要产区的人参在皂苷成分方面的差异。 （2）采用（1）中方法对道地产区与非道地产区的5年生的园参和农田参进行定性分析。 （3）采用41种人参皂苷作为对照品，利用岛津LCMS-8050超高效液相色谱-质谱仪对5个主要产区198批次的生晒参样品进行定量分析，样品粉碎，比较不同生长环境，生长年限的人参中人参皂苷含量差异，并运用多元统计分析的方法进行成分比较。 结果:首先，在不同人参样品中共鉴定出包括63种人参皂苷标准品在内的571种人参皂苷，其中新型人参皂苷191种。统计分析结果表明，来自于相同地域但生长环境和生长年限不同的人参，人参皂苷种类具有明显的差异。就人参皂苷数量而言，15年生的林下参大于5年生的林下参，这表明生长年限可影响人参药材的质量;而5年生的园参多于5年生的农田参，这表明生长环境同样影响人参药材质量;道地产区的5年生的园参和农田参分别多于非道地产区的5年生的园参，农田参，这表明在化学成分方面，道地产区人参较非道地产区人参更加优异，印证了大力发展道地产区药材的重要性与必要性。 定量结果表明，不同产区、不同生长年限的人参中皂苷类成分差异较大。以样品中定量的41种人参皂苷对照品含量之和为总皂苷进行多元统计分析，道地产区中15年生的林下参中皂苷成分较5年生的林下参更高，园参较农田参更高。与非道地产区对比，道地产区同类型人参更为优质。以上结果再一次印证了环境对人参中化学成分的影响以及道地产区较非道地产区的优势。 结论:本课题针对来源于全国不同产区的人参药材建立了一种新的定性与定量相结合的，同时分离测定多种皂苷类化合物的液质联用技术，为快速鉴定与检测人参中皂苷类化合物提供了新的分析技术。本课题采用色谱分析与代谢组学方法相结合的模式，为开展中药材质量分析提供了新的研究思路与方法。
关键词: 人参 ；人参皂苷 ；液质联用 ；成分分析 ；道地药材 ；多元统计分析