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摘要： 报道了利用大肠杆菌氨基酰化酶Ⅰ拆分消旋体生产L氨基酸的研究结果。大肠杆菌氨基酰化酶Ⅰ ,在培养 2 0～ 2 2小时 ,酶活力可达到 89.2 μmol/ml·h- 1。用它拆分DL Met ,其最适反应温度为 6 0℃ ,最适 pH值为 7.0 ,最适底物浓度为 0 .2 5～ 0 .2 75mol/L ,催化动力学过程不符合米式方程。 0 .0 4mol /L的Co2 + 对酶有较好的激活作用 ,活力提高
关键词: 大肠杆菌 ；氨基酰化酶 ；L-氨基酸 ；拆分 ；蛋氨酸消旋体 ；酶活力 ；米式方程 ；催化动力学 ；工业化生产
被引量
5
摘要： 用具有氨基酰化酶基因的大肠杆菌工程菌构建固定化细胞,并对DL-丙氨酸进行酶拆分进行了实验研究。考察了温度、pH、底物浓度、金属离子和时间对酶促反应的影响。确定了氨基酰化酶固定化细胞光学拆分DL-丙氨酸中酶促反应的最佳工艺条件:pH=7.5,温度50℃,反应时间6h,Co2+离子浓度5×10-4mol/L,在该条件下,D-丙氨酸产率为87.2%,光学纯度为98.0%。
关键词: 氨基酰化酶 ；固定化细胞 ；DL-丙氨酸 ；L-丙氨酸 ；D-丙氨酸 ；拆分 ；生物工程
被引量
7
摘要： 用亚硝基胍对产氨基酰化酶的米曲霉 ( Aspergillus oryzae) 30 42进行诱变 ,经过筛选获得诱变菌株30 42 - 5 ,再进行自然分离后得到了一株高产菌株 30 42 - 5 - 5 a,其自由酶活力提高了 2 15 .7% .采用此菌株进行了固定化细胞酶法拆分 DL -蛋氨酸 ( DL - Met)的研究 ,得到了最好的固定化条件为 8%明胶包埋 ,0 .1%戊二醛交联 12 h.制得的固定化细胞酶活力为 81.99u/ g.固定化细胞酶的最适作用温度为 6 5℃ ,最适作用 p H为 8.0 .用固定化细胞装柱 ,将连续拆分得到的产物用离子交换法进行分离精制 ,L -蛋氨酸盐酸盐的得率为理论产值的 6 9.4%
关键词: 米曲霉 ；氨基酰化酶 ；选育 ；固定化
被引量
18
摘要： D-缬氨酸，化学名为D-2-氨基-3-甲基丁酸，是合成抗生素、生理活性肽、农药等多种产品的重要原料，广泛应用于医学、生物和农业等研究领域，D-缬氨酸应用带动了其制备技术研究的发展。D-型氨基酸的制备方法主要有两类：一是利用酶或化学不对称合成，二是通过化学法外消旋后进行手性拆分。 N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(D-氨基酰化酶，3.5.1.81)催化的手性拆分是目前制备D-型氨基酸的主要途径。不同来源的D-ANase对不同底物的催化效率差别较大，其最适作用底物一般为D-Met、D-Leu及D-Phe的N-酰基衍生物，但是对于手性合成领域中作为重要有机手性源的D-缬氨酸的N-酰基衍生物，部分D-ANase转化效率较低。以D-缬氨酸作为衡量指标，Alcaligenes属来源的D-氨基酰化酶活力最高。
将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换，利用化学和基于PCR技术的酶促方法进行基因全合成，利用pET-32a构建重组表达载体pET-trx-dan，转化进E.coli BL21(DE3)中进行融合表达。经SDS-PAGE、Western-blot和活性测定，D-ANase可在大肠杆菌中进行高效表达，目的蛋白能够达到菌体总蛋白的64%，密码子优化菌株的发酵酶活为96U/mL；去掉融合标签，直接利用T7启动子表达的D-ANase，D-ANase表达量占菌体总蛋白的53%，密码子优化菌株的发酵酶活为52U/mL，密码子未优化菌株的发酵酶活为39U/mL。
利用CLC Main Workbench6预测非融合表达载体pET-dan转录mRNA的TIR区二级结构，统计起始密码子ATG下游连续四个氨基酸同义密码子替换后144种序列的ΔG值、ATG区域以及RBS区域形成的双键数量。挑选出ΔG值高、中、低三组序列，每组各6个，构建非融合表达载体并检测外源蛋白的表达和D-ANase活性。ΔG绝对值低组可明显的外源蛋白表达，也能检测到较高的菌体内酶活。
进一步的酶学性质研究表明，Alcaligenes A-6的D-ANase对D-氨基酸的酰基衍生物具有较好的立体选择性，对D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-色氨酸、D-缬氨酸的底物有活性。以N-乙酰-DL-缬氨酸为底物，底物浓度10mmol/L，55℃、pH7.0～pH8.0时酶的催化效率最高；D-ANase固定化可更加高效的利用工程菌发酵得到的酶活力，经过十批次连续拆分N-乙酰-DL-缬氨酸，酶活还保留有原酶活的78%，为工业化应用奠定良好基础。
关键词: D-氨基酰化酶 ；产碱杆菌 ；基因合成 ；融合表达
被引量
1
摘要： D-缬氨酸,化学名为D-2-氨基-3-甲基丁酸,是合成抗生素、生理活性肽、农药等多种产品的重要原料,广泛应用于医学、生物和农业等研究领域,D-缬氨酸应用带动了其制备技术研究的发展。D-型氨基酸的制备方法主要有两类:一是利用酶或化学不对称合成,二是通过化学法外消旋后进行手性拆分。N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(D-氨基酰化酶,3.5.1.81)催化的手性拆分是目前制备D-型氨基酸的主要途径。不同来源的D-ANase对不同底物的催化效率差别较大,其最适作用底物一般为D-Met、D-Leu及D-Phe的N-酰基衍生物,但是对于手性合成领域中作为重要有机手性源的D-缬氨酸的N-酰基衍生物,部分D-ANase转化效率较低。以D-缬氨酸作为衡量指标,Alcaligenes属来源的D-氨基酰化酶活力最高。将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换,利用化学和基于PCR技术的酶促方法进行基因全合成,利用pET-32a构建重组表达载体pET-trx-dan,转化进E.coli BL21(DE3)中进行融合表达。经SDS-PAGE、Western-blot和活性测定,D-ANase可在大肠杆菌中进行高效表达。利用CLC Main Workbench 6预测非融合表达载体pET-dan转录mRNA的TIR区二级结构,统计起始密码子ATG下游连续四个氨基酸同义密码子替换后144种序列的ΔG值、ATG区域以及RBS区域形成的双键数量。挑选出ΔG值高、中、低三组序列,每组各6个,构建非融合表达载体并检测外源蛋白的表达和D-ANase活性。ΔG绝对值低组可明显的外源蛋白表达,也能检测到较高的菌体内酶活,为工业化应用奠定良好基础。
关键词: D-氨基酰化酶 ；密码子选择 ；核糖体结合区
摘要： 大肠杆菌中由argE基因编码的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶(N-acetylornithine deacetylase，简称NAOase;EC3.5.1.16)，可选择性地作用于L-型酰基化氨基酸，且具有较广泛的底物特异性，能立体拆分消旋化氨基酸生产L-氨基酸。此外，对该酶的研究还具有理论意义和潜在的医药应用价值。迄今为止尚无NAOase三维结构的相关报道。
本文首先运用生物信息学软件分析NAOase的一级结构，即NAOase主肽链由383个氨基酸组成，理论等电点为5.54，相对分子质量为42kD。由于NAOase与已知金属酶ACDase，CPG2、DEPE、ACY1、YSCS同源，预测分析得NAOase也是一种金属酶，而且酶活力的表现依赖于锌离子的存在。
其次预测分析NAOase的高级结构及其活性中心的组成，分析其结构特点。NAOase属于肽酶M2OA家族ArgE亚家族，12-383肽段是肽酶M20/M25/M40特征区域。每条亚基由19个β折叠和13个α螺旋构成两个结构域，结构域间以170-180肽段构成的柔性链接区相连。酶的活性中心位置由4个β折叠形成中空，外绕6个长度不等的α螺旋，呈环绕的α/β拓扑结构，与M2OA族的ACDase，CPG2，DAPE结构相似。β折叠与邻近的α螺旋中的氨基酸相互作用，形成一个细小狭长且深的口袋，为底物专一结合区。该处主要由Asp82，Asp112，Glu144-145，His355构成，即Asp，Glu，His三种氨基酸为酶活性中心的重要氨基酸。其中Glu144，Asp82是催化位点，Glu144为质子受体，Hissss，Asp112，Glu145可能是底物结合位点。
本文通过对酶活性中心的金属离子的结合的研究，验证了NAOase确实是金属酶。制备SDS-PAGE电泳纯的纯酶是研究前提。NAOase是胞内酶，对于100mL10％的菌悬液，200W超声5s，间歇5s，全程10min是菌的最佳破碎条件。以硫酸铵分级沉淀进行酶液的粗分离，NAOase主要集中在40％～50％的硫酸铵级分内，然后采用Ni-NTA亲和层析进一步纯化，经阶段洗脱后可得SDS-PAGE电泳纯的酶。纯化过程的总回收率为38.3％，纯化倍数为59.9。采用硫酸铵沉淀和一步亲和层析分离得到电泳纯的NAOase，简化了纯化步骤。
其次，酶反应体系中金属离子的存在确实对酶活力有较大的影响。Co2＋对酶活力有明显促进作用，最适用量为0.1mmol/L;反应体系中外加Zn2＋、Ni2＋、Cu2＋对酶反应有明显抑制作用，Zn2＋离子浓度越高，抑制作用越强;Mg2＋、Mn2＋、Fe3＋对酶活的影响不大;低浓度的Mn2＋对酶活有促进作用。
第三，自然酶、Zn2＋脱辅酶及Zn2＋重构全酶的活力比较证实了NAOase为依赖于Zn2＋的金属酶。Zn2＋在酶分子内的作用类似于氨基酰化酶中，既维护酶分子活性部位的特定空间结构又参与酶和底物的反应过程，起电子传递作用。自然酶、Co2＋脱辅酶及Co2＋重构全酶活力的对比实验证明了Co2＋不参与活性中心的组成，可能在活性中心外起到传递电子和稳定酶分子构象的作用。
第四，考察酶活性中心重要氨基酸的组成及它们在活性中心的位置确定。采用苯甲基磺酰氟(PMSF)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、5，5-二巯基-2，2-二硝基苯甲酸(DTNB)、焦碳酸乙二脂(DEPC)、N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3’-sulfonate(WRK)五种化学试剂，分别选择性修饰NAOase中Ser的羟基、Trp的吲哚基、Cys的巯基、His的咪唑基、Asp/Glu的羧基，结果显示His和Asp/Glu为酶活性中心内的重要氨基酸，而Ser、Trp和Cys不参与酶活性中心的形成。其中，His对底物和酶的结合起关键作用，Asp/Glu参与形成酶的催化中心。
综上所述，本文综合多种生物信息学软件预测得NAOase为金属酶，其活性中心Asp，Glu，His三种氨基酸组成，其次采用亲和层析分离方法得到SDS-PAGE电泳纯的NAOase，考察金属离子对NAOase的影响后发现NAOase依赖于Zn2＋，活性中心存在Zn2＋结合位点。最后纯酶经化学修饰剂修饰的结果确定了NAOase活性中心由Asp82，Glu144，His80组成。本文在序列和结构分析的基础上对保守氨基酸进行化学修饰，提高了化学修饰的针对性，同时从序列和结构的角度对化学修饰的结果进行合理的解释。
关键词: N-乙酰鸟氧酸脱酰基酶 ；结构预测 ；化学修饰 ；活性中心 ；底物保护
摘要： 氨基酸在人体及动物的生命活动中起着举足轻重的作用。从营养学的观点来看，只有L-氨基酸才能为机体直接利用；而在医药工业中，由于D-氨基酸难以被细菌降解而不致产生抗药性，使得其应用也日益广泛。目前，氨基酸的对映体主要通过化学合成的手段获得，但在D-氨基酸的合成上成功的例子并不多。由于对映选择性好、收率高、反应条件温和、步骤简便等，酶法合成已成为制备手性氨基酸的有效手段之一。本论文利用来源于Kluyveracitrophila的青霉素G酰化酶，选择性地水解氨基酸消旋体的苯乙酰衍生物，可以实现L-氨基酸和D-氨基酸的拆分分离。 在第2章中重点研究了碳源、氮源、诱导温度和诱导物IPTG的浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)[pET24a]的生长情况和青霉素G酰化酶的发酵表达的影响，确定了最适的发酵培养基和培养条件。通过在发酵罐中恒溶氧的批式发酵，菌体浓度达到15.5，酶活为15600U/L。 第3章中通过青霉素G酰化酶的硫酸铵分级沉淀，再经过DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析，优化了酶的纯化条件，提高了酶的比活。将纯化的青霉素G酰化酶固定化于环氧载体Amberzyme(R)上，并考察了该固定化酶和游离酶的最适pH、最适温度、温度稳定性和pH稳定性。结果表明游离酶的最适水解pH和最适温度分别为pH7.5和50℃，pH的使用范围为6.0-9.0。酶的固定化使其最适水解温度提高到55℃，同时酶的热稳定性和pH稳定性也相应提高。 本文的第4章研究了青霉素G酰化酶催化DL-叔亮氨酸的拆分过程，考察了反应温度、pH、酶浓度等对酶促水解N-苯乙酰-D-叔亮氨酸的影响。酶在比较宽的pH范围和温度范围内具有很高的对映选择性，酶量的加大可以进一步提高产物的纯度。通过对酶法拆分过程的总体分析，获得了光学纯度很高的产物。对酶水解动力学的研究也证实了在低底物浓度时的水解反应符合米氏方程。在水解过程中，存在高底物浓度的抑制作用、苯乙酸的竞争性抑制作用和叔亮氨酸的非竞争性抑制作用。 第5章通过对多种α-氨基酸的苯乙酰衍生物的酶促水解反应进行了研究，结果表明青霉素G酰化酶优先选择L-型氨基酸的苯乙酰衍生物，并且水解速度的快慢与氨基酸的侧链R的结构有关。测定了酶对L-型氨基酸的苯乙酰衍生物的Km，并以kcat/Km来描述青霉素G酰化酶对底物选择性的差别。氨基酸的拆分效果采用ee和E值表示，E值大于100时可以用来拆分氨基酸并获得光学纯的氨基酸。这样，通过酶法对氨基酸消旋体的拆分，可以得到纯度较高的谷氨酸、叔亮氨酸、苯甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸的对映体。(kcat/Km)L/(kcat/Km)D被用来说明酶对L-型和D-型底物立体选择性的差别。 第6章以DL-叔亮氨酸的拆分为例，考察了有机共溶剂对氨基酸拆分的影响，结果发现有机共溶剂的浓度对酶反应的速度影响很大。重点研究了在2％(v/v)有机共溶剂浓度时不同溶剂对酶反应的作用，并由此建立了反应速度与有机共溶剂的疏水性参数logP和介电常数ε之间的关系。有机共溶剂对酶的稳定性和对映选择性的影响也是选择溶剂的一个重要衡量标准。高logP和低ε的有机共溶剂(如甘油和乙二醇)是酶反应首选的有机共溶剂。 在第7章中研究了水-乙酸丁酯双相体系中叔亮氨酸的拆分情况。在偏酸性条件下，底物N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸以及酶催化水解产生的产物苯乙酸主要分配在乙酸丁酯中，而另一种产物L-叔亮氨酸则保留在水相中。这样，在水解反应的同时底物逐渐地由有机相向水相转移，避免了高底物浓度对酶反应的抑制作用；产物苯乙酸被萃取到有机相中，从而减弱了苯乙酸的竞争性抑制作用；产物被萃取到有机相中改变了反应平衡，使得酶水解反应后L-叔亮氨酸的产率提高至近100％，回收的D-叔亮氨酸的纯度也相应提高至99.5％。
关键词: 氨基酸 ；青霉素G酰化酶 ；拆分分离 ；催化合成
摘要： L-色氨酸是人体内8种必需氨基酸之一，在人和动物的生长发育及新陈代谢中起着重要作用，广泛用于医药、食品、化妆品和饲料等领域。随着基因工程技术和酶工程技术的发展，生物酶法合成L-色氨酸将具有更加广阔的应用前景。本文立足于生物酶法催化丙酮酸发酵液或L-丝氨酸合成L-色氨酸，具有重要的理论意义和应用潜力。 将产气肠杆菌来源的色氨酸酶基因按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成，克隆至质粒pET-30a上，将重组质粒转化到宿主细胞内，成功构建基因工程菌[pET-30a-TEN/BL21(DE3)]。酶学性质研究确定最优转化条件为:氨水调pH9.0，温度35℃，氯化铵浓度400 mmol/L，PLP浓度2 mmol/L。分别以质量浓度为10 g/L的丙酮酸发酵液，质量浓度为11.93 g/L的L-丝氨酸为底物酶法合成L-色氨酸，结果表明丙酮酸工艺酶活大约是丝氨酸工艺的1.4倍。 建立了丝氨酸脱氨酶与色氨酸酶偶联反应体系酶法制备L-色氨酸，即采用丝氨酸脱氨酶催化L-丝氨酸生成丙酮酸，色氨酸酶催化丙酮酸和吲哚合成L-色氨酸。并对双酶偶联反应的酶学性质和工艺路线进行优化，双酶偶联体系最适反应条件为双酶质量配比0.7，氨水调pH9.0，温度40℃，氯化铵浓度350 mmol/L，2 mmol/L PLP。以3％L-丝氨酸为底物，双酶偶联催化制备L-色氨酸，反应24 h，L-色氨酸转化率达84.3％。 构建丝氨酸脱氨酶和色氨酸酶共表达基因工程菌，即将色氨酸酶基因TEN克隆在重组质粒pETDuet-1-SdaA中，然后将重组质粒转化到宿主细胞，成功构建了共表达基因工程菌[pETDuet-1-TEN-SdaA/BL21(DE3)]。在100 mL2％L-丝氨酸反应体系中，通过流加方式添加吲哚乙醇溶液，利用色氨酸酶基因工程菌单菌单酶法反应24 h，L-色氨酸产量为2.02 g，底物转化率为52％;利用共表达基因工程菌单菌双酶法反应24 h，L-色氨酸产量为2.36 g，底物转化率达60.8％。结果表明，以L-丝氨酸为底物单菌双酶法产L-色氨酸的底物转化率约为单菌单酶法产L-色氨酸的1.17倍。 本文在第五章部分，成功构建人来源的氨基酰化酶Ⅲ基因工程菌[pETDuet-1-hACY3/BL21(DE3)]，并且与本课题组已有的N-乙酰-鸟氨酸脱乙酰酶(NAO)进行酶学性质比较。酶学性质研究确定最优转化条件为:氨水调pH6.0，温度50℃，锌离子浓度为1mmol/L，PLP浓度2 mmol/L。hACY3对N-乙酰-L-芳香族氨基酸表现出较好的底物特异性。与NAO相比，hACY3对N-乙酰-L-苯丙氨酸和N-乙酰-L-色氨酸的酶活分别提至1.6倍和1.39倍。在0.2 mol/L的N-乙酰基-DL-苯丙氨酸100 mL反应体系中，加入hACY3全细胞2 g，终浓度为1 mmol/L锌离子，2 mmol/L PLP，反应5h后，底物中N-乙酰基-L-苯丙氨酸转化率可达到95％。
关键词: 生物酶法 ；催化合成 ；L-色氨酸 ；酶学性质 ；基因工程 ；发酵液
摘要： 生物催化因其具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、环境友好等优势而被广泛应用在医药、化工、农药、材料、能源等领域，其中手性药物中间体的合成是生物催化应用研究领域的热点。手性3-对氟苯基戊二酸单酯(3-FGAM)和L-叔亮氨酸(L-Tle)是医药化合物合成中重要的手性砌块，前者可用于合成抗抑郁药帕罗西汀和P2X7受体拮抗剂;后者是一种非蛋白质氨基酸，在手性配体、抗癌药及抗艾滋药等的合成中具有广泛应用。目前针对生物催化法合成手性3-FGAM的研究仍然较少，而L-Tle的生物催化合成则存在底物耐受性差、反应效率低等不足，因此研究二者的生物催化合成具有重要的理论意义和应用价值。 本论文一方面对脂肪酶分别催化3-对氟苯基戊二酸二甲酯(3-DFG)和3-对氟苯基戊二酸酐(3-FGA)去对称制备手性3-FGAM的反应进行了研究，另一方面研究了两条绿色高效的生物催化合成L-Tle反应工艺，包括固定化青霉素G酰化酶(PGA)催化的动力学拆分N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸(N-Phac-DL-Tle)反应工艺和亮氨酸脱氢酶(LeuDH)/甲酸脱氢酶(FDH)偶联催化三甲基丙酮酸(TMP)不对称还原氨化反应工艺。主要研究内容和结论如下: 1.研究了水/有机溶剂两相体系中脂肪酶催化前手性3-DFG去对称水解制备手性3-对氟苯基戊二酸单甲酯(3-MFG)的反应。确定了较佳的生物催化剂为固定化脂肪酶Novozym435，考察了助溶剂种类和浓度、缓冲液pH和离子强度、反应温度等因素对Novozym435催化该去对称水解反应的影响。在优化的反应条件下:0.2M，pH8.0磷酸盐缓冲液/MTBE(80/20，v/v)的两相反应体系，反应温度30℃，反应64 h产物(R)-3-MFG收率和ee值分别可达92.6％和95.6％。最后对固定化脂肪酶的操作稳定性进行了考察，结果发现Novozym435表现出良好的操作稳定性，重复利用10次后活性和选择性仍为其初始活性和选择性的95％以上。 2.研究了有机相中脂肪酶催化内消旋3-FGA的去对称醇解反应。确定了较佳的醇解反应体系，即固定化脂肪酶Novozym435为生物催化剂，MTBE为反应介质，甲醇为酰基受体。考察了反应温度、底物摩尔比、底物浓度等因素对该去对称醇解反应的影响，结果表明最适反应温度为25℃，3-FGA与甲醇摩尔比为1∶2，3-FGA浓度为100 mM。在优化后的反应条件下，反应放大至克级规模，底物可完全转化，产物(S)-MFG分离收率和ee值分别为97.3％和80.1％。进一步通过采用甲苯/正己烷(2/1，v/v)混合溶剂对粗产物进行处理以提高产物光学纯度，产物ee值可提高至95.8％。考察了固定化脂肪酶Novozym435在该有机相反应体系中的操作稳定性，发现重复利用3次后活性和选择性即出现明显下降。最后采用分子对接手段对该去对称醇解反应的分子机制进行了初步解析，对采用不同结构的醇作酰基受体时脂肪酶表现出的不同催化性能进行了合理解释。 3.研究了固定化PGA催化N-Phac-DL-Tle动力学拆分制备L-Tle的反应工艺。考察了pH、反应温度、底物浓度、反应时间等因素对反应的影响以及固定化PGA的热稳定性和操作稳定性。实验结果表明该反应可以去离子水为反应介质，底物浓度0.4 M，pH8.0，30℃反应4h转化率和产物ee值分别可达45.8％和＞99％。固定化PGA具有良好的操作稳定性，在底物浓度为0.4 M和0.8 M时重复利用50批次（每批次反应时间4h）和20批次(每批次反应时间8h)，剩余活力都可维持在初始活力的85％以上。在填充床反应器(PBR)中成功进行了多批次L-Tle的半连续制备，固定化PGA在PBR中表现出良好的稳定性，连续使用51 d后酶活性和选择性未出现明显下降。最后研究了D构型底物对映体的消旋再利用，160℃加热15 min可以使N-Phac-D-Tle消旋，并进一步用作动力学拆分制备L-Tle的底物。 4.构建了共表达LeuDH和FDH的重组大肠杆菌并对其发酵产酶条件进行了优化。首先设计了双质粒共表达系统，构建了共表达LeuDH和FDH的重组菌E.coli BL21-1eudh-fdh，实现了来源于Lysinibacillus sphaericus CGMCC1.1677的LeuDH和来源于Candida boidinii的FDH在重组E.coli中的共表达。在摇瓶中对重组菌发酵培养基的碳氮源种类和浓度、初始pH以及诱导条件进行了优化，确定了优化的培养条件为:甘油和酵母膏为较佳的碳氮源，用量均为10g/L，初始pH为8.0，菌体密度(OD600)为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM开始诱导表达，诱导温度和诱导时间分别为25℃和20 h，发酵最终菌体密度(OD600)可达8.6，LeuDH和FDH酶活分别可达1543.3 U/L和2572.4 U/L，是优化前的2.0和3.1倍。 5.研究了重组菌表达获得的LeuDH和FDH的酶学性质并将重组菌用于催化TMP不对称还原氨化合成L-Tle中。酶学性质实验结果表明LeuDH的最适pH和最适温度分别为8.5和40℃，FDH的最适pH和最适温度分别为7.5和50℃。考察了LeuDH催化还原氨化反应的底物特异性，发现其对脂肪族α-酮酸表现出催化活性，但不能催化芳香族α-酮酸还原氨化为相应的L-氨基酸。采用粗酶液催化TMP的不对称还原氨化反应合成L-Tle，考察了pH、反应温度、辅底物浓度、底物浓度、酶量和辅酶用量等因素对L-Tle合成反应的影响，在优化后的反应条件下:pH8.5、0.75 M TMP、1.5 M甲酸铵、30g/L湿细胞和0.25 g/L NAD+，30℃反应6h转化率和ee值均＞99％。为了消除底物抑制效应，提高底物浓度，考察了不同底物补加策略对反应效果的影响，发现底物连续流加策略可有效消除底物抑制，最终底物浓度和时空收率可提高至1.50 M和32.8 g/L/h，反应效果优于已报道文献。以去离子水为反应介质，反应体系放大至1L规模时，该工艺仍可稳定运行，显示出良好的工业化应用前景。
关键词: 手性药物中间体 ；3-对氟苯基戊二酸单酯 ；L-叔亮氨酸 ；生物催化工艺
摘要： 甲硫氨酸是一个含硫的必需氨基酸,在饲料、医药、保健和食品工业领域都有着广泛的用途。甲硫氨酸是一个高附加值产品,也是我国为数不多需从国外大量进口的氨基酸之一。寻找成本低,产量高的甲硫氨酸生产工艺和方法成了近年来国内氨基酸生产领域的一个研究热点。
本研究以嗜热脂肪芽孢杆菌为原始菌,从中克隆出氨基酰化酶基因,并转化到大肠杆菌中进行诱导表达,同时对菌体细胞进行了直接固定化研究,以N-乙酰-DL-甲硫氨酸为底物,探讨适合工业化拆分DL-甲硫氨酸的应用可能性。
方法是以嗜热脂肪芽孢杆菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增出编码氨基酰化酶amaA基因,与pMD-18T vector重组,对阳性克隆菌的序列分析显示,与Genebank中amaA（Y08753）序列完全一致。用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切pET-28a（+）和pMD-18T vector阳性克隆,T4 DNA连接酶连接,构建了amaA-pET28a（+）的重组表达载体,转化到E.coli BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE分析和氨基酰化酶活性测定都表明,amaA基因在大肠杆菌中获得了高效表达。研究了IPTG的浓度,IPTG加入的时间和诱导表达的时间等。结果显示的最佳条件为:37℃,200rpm培养,菌浓度OD600在0.8～1.0之间时加入IPTG诱导,IPTG终浓度0.4mmol/L,诱导表达6h后,获得了氨基酰化酶活性为1,043U/g湿菌体。
以N-乙酰-DL-甲硫氨酸为底物的拆分研究显示:底物浓度＜0.08mol/L时,反应速度随底物浓度增加呈线性关系;55℃酶反应,游离菌的Km为4.5mmol/L,固定化后的Km为14.7mmol/L。酶学性质研究同时表明,65℃酶的催化效率最高,最适pH为7.0;固定化后酶pH稳定范围更广,热稳定性也更高;连续10批次拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸,活性仅损失20%左右;4℃条件下保存23天仍保留有固定化时73.6%的酶活性。
菌体直接固定化研究显示,最佳条件为:3%卡拉胶包埋30%菌体细胞,以1.25%多乙烯多胺渗透交联固定化菌体细胞10min和0.1%戊二醛硬化处理20min,与未固定菌体比较,菌体固定化后仍保留有83%的酶活性。
本研究显示,重组大肠杆菌表达的氨基酰化酶有着很好的应用前景。
关键词: 嗜热脂肪芽孢杆菌 ；克隆 ；氨基酰化酶 ；卡拉胶 ；渗透交联 ；固定化
被引量
1
摘要： 本文报道了以L—谷氨酸为手性源，通过化学合成、生物转化及化学生物耦合法，制备了一系列用途广泛的化合物。如，L—茶氨酸、谷氨酰胺及其衍生物;L—丙氨酰—L—谷氨酰胺(力肽)和谷胱甘肽等。
在文中第二章，首先以中试规模制备了L—茶氨酸和L—谷氨酰胺。即用廉价的L—谷氨酸为原料，采用邻苯二甲酰基(pht)作为保护基，保护L—谷氨酸的α-氨基，醋酐回流10 min使其分子内脱水生成N—邻苯二甲酰—L—谷氨酸酐，在常温、常压条件下，分别与2 mol/L氨水和2 mol/L 乙胺水溶液反应生成中间产物N—邻苯二甲酰—L—谷氨酰胺、N—邻苯二甲酰—L—茶氨酸，中间产物在室温条件下与0.5mol/L水合肼反应48 h脱除保护基，分别以57％、61％的收率得到L—谷氨酰胺和L—茶氨酸。
为了解决化学合成的L—茶氨酸旋光偏低的问题，文中采用化学法合成DL—茶氨酸，将其进行乙酰化反应，生成N—乙酰—DL—茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分N—乙酰—DL—茶氨酸获得L—茶氨酸。对氨基酰化酶酶促反应研究表明，在转化温度40℃、转化时间30 h、pH 7.0和底物浓度0.2 mol/L时，目的产物L—茶氨酸的产率最高。
为了更好地了解L—茶氨酸的性质，文中报道用X射线单晶衍射法确定了L—茶氨酸的单晶结构。晶体属单斜晶系，P2(1)/c空间群，分子量M=173.19，a=1.954(4)nm，b=0.4761(10)nm，c=0.9781(2)nm，β=90.55(3)°，Z=4，Dc=1.264g/cm3，V=0.9099 nm3，μ=0.10 mm-1，F(000)=372.0。该化合物通过分子间氢键形成了一种三维结构。
作为L—谷氨酰胺的替代物，N—乙酰—L—谷氨酰胺在临床上有着重要用途。文中报道了分别以L—谷氨酸和L—谷氨酰胺为原料，制备N—乙酰—L—谷氨酰胺;前者经过酯化、乙酰化和氨解反应得到产物，后者在碳酸钠水溶液中直接与醋酸酐进行酰化反应生成N—乙酰—L—谷氨酰胺。
D型氨基酸的在医药领域有着重要用途，它的研究与开发引起了广泛关注。本文报道了以化学生物耦合法制备光学纯D—谷氨酰胺。首先用化学法合成DL—谷氨酰胺;再利用大肠杆菌(E． coliAS 1.505)谷氨酰胺脱羧酶，将底物．DL—谷氨酰胺中L型对映体完全转化为4-氨基丁酰胺，分离得到D—谷氨酰胺。
本文第三章报道以L—谷氨酸为原料，采用化学生物耦合法，制备了D—谷氨酸和γ-氨基丁酸。即利用大肠杆菌L—谷氨酸脱羧酶对L—谷氨酸的专一性脱羧作用，高效制备D—谷氨酸和γ-氨基丁酸。考察了最佳酶法转化条件为：转化温度37℃，pH 4.8，菌体浓度6g/100 mL，吐温—80浓度0.015％，菌龄14 h。
此外，还报道了以L—谷氨酸为原料，直接加热脱水同时制备L—焦谷氨酸与DL—焦谷氨酸;以L—酪氨酸正丁酯为拆分剂，化学拆分DL—焦谷氨酸制备D—焦谷氨酸。
本文第四章报道了用邻苯二甲酰基为L—丙氨酸的保护基，分别以L—谷氨酸(方案1)和L—谷氨酰胺(方案2)为原料，采用混合酸酐法合成L—丙氨酰—L—谷氨酰胺(力肽);比较两种方案，发现方案2较好，根据方案2，在中试规模制备了力肽。通过考察发现，制备L—丙氨酰—L—谷氨酰胺的最佳条件为：溶剂是乙酸乙酯，温度为0℃，N—Pht—L—丙氨酸与L—谷氨酰胺的摩尔比为1：1。以L—丙氨酸计，总摩尔收率为34.4％。
为了解L—丙氨酰—L—谷氨酰胺的分子结构及空间构型，还报道用X射线单晶衍射法确定了L—丙氨酰—L—谷氨酰胺的单晶结构．晶体属正交晶系，P212121空间群，分子量M=252.25，a=0.5028(1)nm，b=1.5261(1)nm，c=1.6336(5)nm，Z=4，Dc=1.337g/cm3，V=1.254 nm3，μ=0.11 mm-1，F(000)=540.0。该化合物通过分子间氢键形成了一种孔状三维结构。
本文第五章报道了苄氧甲酰基(Cbz)保护胱氨酸与甘氨酸乙酯缩合制备保护的胱氨酰二甘氨酸乙酯，其脱保护后与pht保护的谷氨酸酐作用合成pht保护的氧化型谷胱甘肽，后经水合肼去保护、电解还原制备了谷胱甘肽。此外，还研究了化学生物耦合法制备谷胱甘肽。首先在中试规模上，以化学法合成的γ-L—谷氨酰—L—半胱氨酸(γ-GS)，代替L—谷氨酸和L—半胱氨酸为原料，利用具有高活性的谷胱甘肽合成酶(GSH Ⅱ)的基因工程菌，将其与甘氨酸生物合成为谷胱甘肽(GSH)。文中还考察了Mg2+与ATP浓度、反应时间、pH值和底物浓度等因素对酶促反应的影响。实验表明，转化时间8 h、pH 7.0、Mg2+与ATP以及底物浓度均为20 mmol/L时，目的产物GSH的产率最高(4.5 g/L)。
关键词: 谷氨酸 ；手性源 ；化学合成 ；生物转化 ；化学生物耦合法 ；乙酰化反应
摘要： D-氨基酸作为医药及食品领域的重要原材料，被广泛用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂、甜味剂等生产。非天然D-氨基酸常用生物法或生物-化学法生产。化学合成法结合手性拆分的方法，具有低成本、适于大规模生产等优点。而高效、绿色、安全的氨基酰化酶法拆分，是拆分氨基酸的最佳方法之一。
本文对具有氨基酰化酶基因的大肠杆菌工程菌DM202[pET32a-argE/BL21(DE3)]进行固定化，研究了固定化前后菌体的酶学性质，并成功利用该固定化细胞由L-氨基酸转化合成了相应的D-氨基酸。
1、海藻酸钙法固定氨基酰化酶基因工程菌的最佳工艺条件为：海藻酸钠溶液浓度3％，菌体细胞包埋浓度为6％，二者在pH为7.0的缓冲溶液下混合注入3％CaCl2溶液成型，然后用1％的戊二醛溶液交联。
2、固定化细胞与固定之前的游离菌体相比，对温度和pH的稳定性有所加强，最佳拆分温度由45℃变为50℃;最佳拆分pH由7.0变为7.5。该固定化细胞酶活半衰期达到50天，操作稳定性优异，满足工业生产要求。
3、固定化细胞在拆分N-乙酰-DL-丙氨酸过程中，当底物浓度[S0]<300mol/L时，固定化细胞的酶促拆分反应符合米氏方程;在底物浓度[S0]>300mol/L，存在着底物抑制现象。进一步研究证明，拆分反应同时还受到反应体系中共存的其他两种产物的抑制作用，其中，产物乙酸是非竞争性抑制物，产物L-丙氨酸是竞争性抑制物。二者在50℃、pH7.5条件下抑制常数Ki，Ac、Ki，Ala分别为8.40mmol/L、5.51mmol/L。
4、氨基酰化酶固定化细胞催化N-乙酰-DL-氨基酸乙酰基水解的最佳温度是50～55℃，最佳pH为7.5～8.0。金属离子对拆分反应具有促进或抑制作用。低浓度的钴离子对固定化细胞有明显的激活作用，而高浓度则抑制酶活，5×10-4的钴离子对固定化细胞酶活活性提高约20％。该固定化细胞对N-乙酰-DL-丙氨酸、N-乙酰-DL-缬氨酸的催化活性较高，酶活分别达到1756U和1255U，而对N-乙酰-DL-亮氨酸的催化活性稍低，酶活为702U，催化水解需要的时间较长。由三种L-氨基酸经过消旋、乙酰化、酶水解、产物分离、脱乙酰基五步操作后制得D-氨基酸的总摩尔收率分别为：D-丙氨酸75.4％，D-亮氨酸70.1％，D-缬氨酸73.2％。;比旋光分别为：D-丙氨酸[α]D25=-14.3°(10％，6MHCl)，D-亮氨酸[α]D25=-14.1°(4％，6MHCl)，D-缬氨酸[α]D25=-28.3°(8％，6MHCl)，光学纯度符合要求。
关键词: 氨基酰化酶 ；基因工程菌 ；D-氨基酸 ；固定化细胞