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【期刊论文】 • 李靓 ¹袁皓愉 ²唐振旺 ³于伟霞 ¹ +3位作者 • 《中国药理学通报》 • 2009年第12期 1563 - 1566，共4页

机构： [1] 南华大学药学与生命科学学院[2] 株洲市芦淞区疾病预防控制中心[3] 南华大学附属第一医院

摘要：目的观察肠道胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝(ezetimibe)对RAW264.7细胞源性荷脂细胞脂质蓄积的影响并对其机制进行初步探讨。方法采用油红O染色、高效液相色谱法检测细胞内脂滴数量和细胞内脂质含量,Western blot对NPC1L1(Niemann-Pick type C1Like-1)进行定性和半定量检测。结果RAW264.7细胞中有NPC1L1蛋白表达。不同浓度(0、0.003、0.01和0.03mol.L-1)依泽替米贝预先孵育RAW264.7细胞24h或最佳浓度(0.03mol.L-1)预先孵育不同时间(0、6、12和24h)后,换50mg.L-1oxLDL继续孵育24h,结果显示不同浓度ezetimibe预先孵育后,细胞内脂滴数量与面积随着浓度的增加而逐渐减少;Ezetimibe预先孵育可减少细胞内脂质蓄积,并呈浓度和时间依赖性。其中0.03mol.L-1ezetimibe预先孵育24h组作用最明显,CE百分比较oxLDL单独孵育组减少了约47%±0.1%。结论小鼠源性巨噬细胞RAW264.7中存在NPC1L1蛋白表达;依泽替米贝能够减少RAW264.7细胞中NPC1L1蛋白表达;依泽替米贝抑制RAW264.7细胞中脂质蓄积。

摘要译文

关键词: 药理学；依泽替米贝 ；巨噬细胞；脂质蓄积 ；尼曼-匹克C1型类似蛋白1 ；抑制作用

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【学位/硕士】 • 武晓静 • 天津医科大学 • 导师：章卫平 • 2021年

摘要：目的和内容: 心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)主要由动脉粥样硬化引起,是威胁人类健康的第一大杀手。血清过多的低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)积聚在易感动脉壁的内皮下可导致动脉粥样硬化。血清中的胆固醇主要来源于自身合成和小肠吸收途径。目前认为,哺乳动物细胞胞外游离胆固醇的吸收主要是由尼曼匹克C1型样蛋白1(Niemann–Pick type C1Like 1,NPC1L1)介导的囊泡内吞途径实现的。然而对NPC1L1介导胆固醇吸收的分子机制及其调节因素的认识还很有限。为可视化示踪肠道内源性NPC1L1介导的胆固醇吸收过程,本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将多肽标签FLAG和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)引入到内源性NPC1L1蛋白的C端,构建NPC1L1-FLAG-EGFP(NPC1L1-FG)小鼠,检测分析NPC1L1-FG蛋白在小鼠不同组织中的表达特征,以明确改造后的内源性NPC1L1蛋白的表达分布规律;分析NPC1L1-FG小鼠全身的脂代谢表型,以明确经改造后的NPC1L1-FG蛋白是否影响胆固醇吸收及其代谢稳态。在上述功能学验证的基础上,利用该小鼠模型示踪分析肠道胆固醇吸收过程中的NPC1L1内吞囊泡形成的时效和量效关系,以及胆固醇吸收抑制药物依泽替米贝对NPC1L1-胆固醇内吞囊泡形成的抑制作用。方法: 1.制备Cas9/单向导RNA(Single-guide RNA,sg RNA)质粒:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3’末端非编码区,设计不同sg RNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas 9/sg RNA核酸酶活性,筛选出高活性的sg RNA序列,经体外转录制备sg RNA和Cas9 m RNA。 2.构建打靶载体:PCR扩增小鼠NPC1L1基因靶点的两侧同源臂,长度均约为1.5 kb,与FLAG-EGFP编码的c DNA一起克隆至打靶载体。 3.经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sg RNA、Cas9 m RNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育,生成NPC1L1-FG敲入小鼠。 4.小鼠基因型鉴定:通过基因组DNA的PCR和Southern blot分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。 5.荧光显微镜可视化观察和Western blot检测NPC1L1-FG蛋白在敲入小鼠各组织中的表达谱。 6.基本代谢水平检测:在高胆固醇饮食(HCD)喂养条件下,检测野生型小鼠与NPC1L1-FG小鼠的体重、血糖、进食量、粪便量、血脂、肝脏以及小肠组织中的脂质水平有无差异。 7.探究NPC1L1-FG小鼠在胆固醇诱导下小肠上皮细胞中形成的内吞囊泡数量的时效和量效关系。 8.探究NPC1L1-FG小鼠在胆固醇诱导下小肠上皮细胞中形成的内吞囊泡数量能否被胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝所抑制。结果: 1.成功构建了Npc1l1基因敲入打靶载体,并且制备了Cas9 m RNA和高活性的sg RNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代NPC1L1-FG小鼠。 2.荧光显微镜下观察和Western blot实验显示NPC1L1-FG融合蛋白特异性地表达在模型小鼠的小肠组织的绒毛上皮细胞的刷状缘,并以空回肠表达较为丰富。 3.NPC1L1-FG的纯合子小鼠与野生型小鼠具有相似的基本代谢表型和全身脂质稳态。 4.NPC1L1-FG纯合子小鼠经40mg/ml的胆固醇灌胃后5～60分钟,其空肠中段上皮细胞在15分钟时形成的NPC1L1-胆固醇内吞囊泡数量最多。 5.NPC1L1-FG纯合子小鼠灌胃以0～40mg/ml的胆固醇15分钟后,其空肠中段上皮细胞内NPC1L1-胆固醇内吞囊泡的形成具有剂量依赖性,20mg/ml时囊泡数量最多,40mg/ml时大囊泡的比例最高。 6.依泽替米贝处理小鼠后,胆固醇诱导的小肠上皮细胞中内吞囊泡的数量有降低的趋势,但无统计学差异。结论: 我们成功构建了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行FLAG和EGFP双重标记的NPC1L1-FG敲入小鼠模型。该小鼠模型与野生型小鼠具有类似的NPC1L1表达谱和代谢表型,表明FLAG-EGFP不影响内源性NPC1L1的表达分布和对胆固醇的吸收。该模型可以示踪NPC1L1介导的肠道胆固醇吸收,以空肠中段上皮细胞为观察对象时,用含40mg/ml胆固醇的玉米油溶液灌胃15min为示踪内吞囊泡的最佳观察条件。用胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝处理小鼠后,胆固醇诱导的小肠上皮细胞中内吞囊泡的数量有降低的趋势,但无统计学差异。这说明依泽替米贝虽然能抑制NPC1L1摄取胆固醇,但不能完全抑制囊泡内吞过程。未来也可利用EGFP或FLAG抗体免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)富集NPC1L1蛋白及其潜在的共作用蛋白以深入探究NPC1L1摄取胆固醇的分子机制。总之,我们构建的FLAG-EGFP标记内源性NPC1L1蛋白的小鼠模型是可视化研究体内NPC1L1介导的囊泡转运和胆固醇吸收机制的有利工具,为进一步解析NPC1L1介导胆固醇吸收的具体机制及调控因素提供新的手段。

摘要译文

关键词: 胆固醇吸收；标签蛋白；示踪；内吞囊泡；CRISPR/Cas9 ；NPC1L1 ；转基因小鼠

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【学位/硕士】 • 孙雪妮 • 广州医科大学 • 导师：许小洋 • 2025年

摘要：研究背景随着全球经济的快速增长和西方饮食习惯的普及,动脉粥样硬化性心血管疾病（Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）的死亡率和发病率持续上升,该疾病在病理生理学上以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为基础。AS是一种慢性炎症性血管病变,主要特征是脂质在血管内膜中沉积,形成斑块。在其早期阶段,循环中的单核细胞进入血管壁并分化为巨噬细胞,后者吞噬氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein,oxLDL）并在溶酶体中降解。若溶酶体功能障碍,细胞内会沉积大量胆固醇和脂质,最终形成泡沫细胞。泡沫细胞在动脉粥样硬化的各个发展阶段均发挥重要作用。目前,抗动脉粥样硬化的药物主要包括他汀类、胆固醇吸收抑制剂和贝特类等降脂药物。尽管这些药物在降脂治疗中取得了显著效果,但临床观察表明,它们可能引发骨骼肌毒性、肝功能异常和胃肠道不适等不良反应。此外部分患者在接受标准剂量药物治疗后,疗效未能达到预期,这提示当前对AS斑块形成的分子机制仍存在一定程度的认知空白。因此进一步探讨泡沫细胞形成的调控机制,可能为AS的防治提供新的治疗靶点,并推动更加个性化的治疗策略的发展。细胞自噬通过溶酶体途径降解异常的生物大分子,近年来的研究表明,脂噬（即脂质特异性自噬）在清除脂滴和胆固醇方面发挥重要作用,抑制泡沫细胞的形成并且具有抗AS的潜力。需要指出的是,持续的自噬活动可能导致溶酶体的耗竭,进而引发胆固醇代谢紊乱,为应对这一问题,细胞通过溶酶体再生机制,维持胆固醇酯水解和胆固醇逆转运（Reverse cholesterol transport,RCT）能力,从而有效防止脂质的蓄积。转录因子EB（Transcription factor EB,TFEB）是溶酶体-自噬途径的主要调节因子,其活性状态直接影响溶酶体的生物合成及自噬通量。研究表明,经溶酶体受体电位粘脂蛋白1（Transient receptor potential mucolipin 1,TRPML1）钙通道释放的钙离子(Ca2+),能够激活钙调磷酸酶（Calcineurin,Cn）,后者促进TFEB的去磷酸化和核转位,激活溶酶体与自噬相关基因的转录活性,从而有利于溶酶体再生乃至脂噬的进行,进而产生抗泡沫细胞形成和AS发生的作用。因此寻找激活溶酶体TRPML1的上游信号分子及其有效的激活因子或药物,将为AS的预防与治疗提供潜在的治疗靶点。烟酸（Niacin,NA）作为烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,NAADP）的底物,通过CD38/NAADP途径激活巨噬细胞溶酶体TRPML1介导的钙离子(Ca2+)信号传导,进而通过肝X受体α（Liver X receptorα,LXRα）依赖性机制上调尼曼-匹克C1（Niemann-Pick type C1,NPC1）蛋白的表达,促进胆固醇的外排并发挥抗AS作用。然而,该信号通路是否同样能通过TRPML1通道释放的钙离子为介导,经Cn/TFEB促进溶酶体再生乃至脂噬的进行,进而产生抗泡沫细胞形成和AS发生的作用,目前尚未见报道。有鉴于此,我们推测CD38/NAADP与Cn/TFEB信号通路可能在NA调控巨噬细胞溶酶体再生与脂噬过程中起着关键作用,从而在对抗AS的过程中产生积极影响。研究目的本研究旨在探讨CD38/NAADP、Cn/TFEB信号通路在促进巨噬细胞溶酶体再生和抑制泡沫细胞形成中的作用,以期为阐明巨噬细胞溶酶体再生与胆固醇调节之间的关系提供实验依据,并为动脉粥样硬化的预防和治疗提供新的研究思路和治疗靶点。研究方法与结果 1.NA抑制动脉粥样斑块的形成且减少巨噬细胞溶酶体胆固醇的蓄积 1.1 NA通过CD38途径抑制主动脉根部及主动脉斑块形成采用低密度脂蛋白受体敲除(LDLr-/-)小鼠和LDLr与CD38双基因敲除小鼠(LDLr-/-/CD38-/-)作为实验模型,探讨NA和CD38对动脉粥样斑块形成的影响,发现NA通过CD38途径显著抑制了主动脉根部及主动脉的斑块形成。 1.2 NA剂量依赖性地抑制LDLr-/-骨髓源性巨噬细胞溶酶体游离胆固醇的蓄积使用不同浓度的NA处理LDLr-/-骨髓源性巨噬细胞,通过激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞溶酶体内游离胆固醇的蓄积情况,发现NA剂量依赖性地抑制LDLr-/-骨髓源性巨噬细胞溶酶体游离胆固醇的蓄积。 2.NA通过CD38/NAADP/TFEB通路促进溶酶体再生调节巨噬细胞胆固醇外流 2.1 NAADP促进LDLr-/-巨噬细胞中溶酶体数量的增加使用Dil-oxLDL染色法标记溶酶体,并通过活细胞共聚焦成像系统对溶酶体数量进行定量评估,发现巨噬细胞溶酶体的再生过程与NAADP/Ca2+/Cn信号通路有密切关联。 2.2 NA上调CD38促进NAADP的合成以低密度脂蛋白受体敲除(LDLr-/-)小鼠的骨髓源性巨噬细胞为实验模型,研究NA与CD38之间的相互作用,发现NA通过上调CD38的表达,促进了NAADP的合成。 2.3 NA通过CD38/NAADP信号通路抑制TFEB的磷酸化水平采用免疫印迹法检测了TFEB的磷酸化水平,发现NA通过CD38/NAADP途径显著抑制了TFEB的磷酸化。 2.4抑制CD38/NAADP信号通路可抑制NA介导的溶酶体数量增多及胆固醇外流利用激光共聚焦显微镜检测了巨噬细胞中溶酶体数量以及游离胆固醇和脂质的蓄积情况,发现CD38/NAADP信号通路在NA介导的溶酶体再生及胆固醇外流过程中起到了关键作用。 2.5 CD38回补在LDLr/CD38双基因敲除巨噬细胞中的溶酶体数量与胆固醇外流中的作用通过转染CD38 cDNA,发现NA显著增加了LDLr/CD38双基因敲除巨噬细胞中溶酶体的数量,并有效减少了胆固醇的蓄积。 3.NA通过Cn/TFEB途径调控THP-1源性巨噬细胞自噬蛋白的表达促进胆固醇流出 3.1 NA对自噬蛋白ATG5、P62和LC3的影响采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白ATG5、P62、LC3II的表达。结果显示,与oxLDL处理组相比较,NA+oxLDL处理组ATG5、LC3II的表达增加,P62的表达降低。 3.2 NA减少THP-1源性巨噬细胞脂质的蓄积使用油红O染色和Nile red荧光染色观察各组细胞中脂质蓄积。结果发现,与oxLDL处理组相比较,NA+oxLDL处理组减少了巨噬细胞脂质的蓄积。 3.3 3-MA减弱了NA对THP-1源性巨噬细胞脂质蓄积的抑制作用 使用自噬抑制剂3-MA对细胞进行预处理。结果显示,与NA+oxLDL处理组相比较,3-MA+NA+oxLDL处理组ATG5、LC3II的表达降低,P62的表达增高,减弱了NA对THP-1源性巨噬细胞脂质蓄积的抑制作用。 3.4 NA通过TFEB调控THP-1源性巨噬细胞自噬蛋白的表达通过Western blot检测NA对oxLDL处理组TFEB的去磷酸化影响。结果表明TFEB是NA调控THP-1源性巨噬细胞自噬蛋白表达的关键介导分子。 3.5 NA通过Cn/TFEB途径调控THP-1源性巨噬细胞自噬蛋白的表达通过Western blot检测NA是否依赖于Cn/TFEB调控巨噬细胞自噬蛋白的表达。结果显示,NA促进了Cn的表达。使用Cn抑制剂后,抑制了NA促进TFEB去磷酸化的作用,且抑制ATG5和LC3II的表达,促进了P62的表达。3.6 NA通过Cn/TFEB途径减少THP-1源性巨噬细胞脂质的蓄积用Nile red荧光检测观察各组细胞中脂质蓄积。结果显示,敲减TFEB和使用Cn抑制剂减弱了NA减少巨噬细胞中的脂质蓄积的作用。 3.7 NA通过Cn/TFEB途径促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇外流通过Western blot检测,相比于oxLDL处理组,NA促进了ABCA1的表达,而使用3-MA、敲低TFEB、使用Cn抑制剂抑制了ABCA1的表达。通过激光共聚焦检测巨噬细胞游离胆固醇及脂质的蓄积,结果显示NA可减少巨噬细胞溶酶体中游离胆固醇和脂质的蓄积,而使用3-MA、Cn抑制剂及敲低TFEB均可减弱NA的上述效应。结论我们发现,NA能够显著抑制动脉粥样斑块的形成,其机制为:（1）NA通过CD38/NAADP及Cn/TFEB信号通路,促进巨噬细胞中溶酶体的再生,进而促进胆固醇的外流;（2）NA通过上调Cn的水平,促进TFEB的去磷酸化,激活巨噬细胞中的脂噬作用,从而促进胆固醇外流,并抑制细胞内脂质与胆固醇的蓄积。

摘要译文

关键词: 烟酸；Cn ；TFEB ；溶酶体再生；脂噬；胆固醇外流

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4. 认领

【学位/硕士】 • 袁皓瑜 • 南华大学 • 导师：庹勤慧 • 2008年

摘要：目的:研究肠道胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝抑制巨噬细胞摄取脂质的作用及可能机制。方法:采用油红O染色、DiI-oxLDL荧光示踪法检测细胞内脂滴数量和细胞摄取脂质含量。采用Western blotting对尼曼-匹克C1型类似蛋白1 (Niemann-Pick type C1 Like-1, NPC1L1)和清道夫受体B族I型(Scavenger receptor class B type I, SR-BI)进行定性和半定量检测;采用Reverse-transcription PCR法检测SR-BI及SREBP-1的mRNA表达。结果: RAW264.7细胞中存在NPC1L1蛋白表达。不同浓度(3, 10和30μM)依泽替米贝(ezetimibe)预先孵育RAW264.7细胞24小时或最佳浓度(30μM)预先孵育不同时间(0, 6, 12和24h)后,换50mg/L oxLDL或DiI-oxLDL继续孵育24小时,结果显示ezetimibe预先孵育组呈浓度依赖性减少脂质蓄积,其中30μM ezetimibe预先孵育24小时组作用最明显,CE百分比相比oxLDL孵育组约减少了47%+0.1%;ezetimibe呈时间依赖性抑制细胞摄取脂质:30μM ezetimibe预先孵育24小时组摄取DiI-oxLDL量较DiI-oxLDL单独孵育组减少约59%+4.5%。ezetimibe预先孵育组能够呈浓度依赖性和时间依赖性减少RAW264.7荷脂细胞中SR-BI蛋白和mRNA表达,较未孵育组分别减少12%+1.5%和80%+6.3%,较oxLDL孵育组分别增加约10%+4.8%和42%+5.3%;同时,ezetimibe预先孵育组能够浓度依赖性和时间依赖性减少RAW264.7荷脂细胞中SREBP-1 mRNA表达,较未孵育组分别减少约18%+0.8%,较oxLDL孵育组分别减少约22%+2.7%。Ezetimibe单独孵育细胞24小时,30μM ezetimibe组相比未孵育组的NPC1L1和SR-BI蛋白表达分别减少约23%+6.2%和15%+2.8%。SR-BI抑制剂非诺贝特预先孵育细胞24小时后换30μM ezetimibe继续孵育24小时,虽然两者联用也能减少SR-BI表达,但无叠加性作用(additive effects),与非诺贝特单独孵育组比较无明显差异(P>0.05),但两种药物联用孵育组的DiI-oxLDL摄取量较ezetimibe单独孵育组和fenofibrate单独孵育组分别减少约6.6%+0.3%和8.6%+3.8%。SREBP-1抑制剂油酸预先孵育细胞24小时后换30μM ezetimibe继续孵育24小时,发现对SREBP-1的mRNA表达也有减少作用,相比油酸单独孵育组无显著性差异,但仍然多于ezetimibe处理组。结论:1.小鼠源性巨噬细胞RAW264.7中存在NPC1L1蛋白表达; 2.依泽替米贝能够减少RAW264.7细胞中脂质蓄积; 3.依泽替米贝通过降低SREBP-1表达进而减少SR-BI表达并最终抑制RAW264.7细胞摄取oxLDL。

摘要译文

关键词: 依泽替米贝 ；清道夫受体B族I型；固醇调节元件结合蛋白1 ；巨噬细胞；胆固醇

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