- 首页
- 产品推荐个人精选服务科研辅助服务教育大数据服务行业精选服务学科系列服务产品服务
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
- 首页
- 产品服务
- 知识脉络
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
智能检索
二次检索
任意字段
在结果中检索
在结果中去除
暂无数据
共
44
条结果 ，以下是1
-
20条
1 / 3
已选:0 清除
批量下载
批量引用
相关度
摘要： 目的:癫痫是多种病因导致的慢性脑部病变,以大脑神经元过度、反复超同步化放电为特征,临床表现为短暂性中枢神经系统功能失常的综合征。氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、钙超载等多种因素都能诱导神经元异常放电触发癫痫。其中氧化应激产生的氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节。已有研究表明,癫痫发作时脑内自由基含量明显增加,ROS大量产生和释放,会引起细胞内氧化还原平衡状态被打破,导致一系列诸如DNA损伤、细胞膜结构被破坏、线粒体等细胞器被破坏等现象,最终导致细胞凋亡。因此,抑制氧化应激和清除氧自由基可能是癫痫治疗的重要策略。Keap1-Nrf2-ARE信号通路在细胞抗氧化过程中起着重要作用。Keap1为E3泛素连接酶CUL3提供支架,而后者能够通过泛素-蛋白酶体介导Nrf2降解,使Nrf2仅维持较低水平,以保证日常生命活动。氧化应激时,上游相关信号通路被激活,介导Nrf2降解终止并入核,促进下游HO-1等抗氧化相关基因的转录,参与细胞抗氧化防御机制。柚皮素为黄酮类化合物,具有较强的抗氧化活性。本研究以癫痫持续状态大鼠模型和人神经母细胞瘤细胞氧化损伤模型为研究对象,通过体内和体外实验,探讨柚皮素对癫痫大鼠脑损伤的神经保护作用以及通过Nrf2/HO-1通路抑制神经细胞氧化损伤的可能作用机制,为癫痫的抗氧化治疗提供研究基础。研究方法:1.建立氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫持续状态（status epilepticus,SE）模型,实验分为对照组、SE组和柚皮素组。应用脑电记录仪检测大鼠脑电图改变;水迷宫实验观察大鼠空间学习记忆能力;HE染色观察大鼠海马组织病理改变;尼氏染色观察存活神经元变化;TUNEL染色检测程序化死亡细胞;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。2.体外培养人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,MTT检测各组细胞增殖活性;DCFH-DA荧光染色检测活性氧（ROS）水平;JC-1荧光染色和罗丹明123染色检测线粒体膜电位;流式细胞分析检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyto C蛋白表达变化。3.Western blot检测Nrf2和HO-1蛋白表达水平;免疫荧光观察Nrf2核内移情况以及HO-1蛋白定位;免疫共沉淀检测Nrf2与Keap1蛋白相互作用;转染Nrf2shRNA质粒,Western blot验证质粒转染效果;Western blot检测Nrf2基因沉默后各组细胞Nrf2、HO-1蛋白表达水平;Western blot检测pERK、ERK、pAKT、AKT蛋白表达水平;流式细胞分析检测细胞凋亡率;MTT检测细胞增殖活性。结果:1.脑电记录仪结果显示,对照组大鼠脑电图节律规整,未见异常波形;癫痫组大鼠脑电图可见广泛性棘波节律发放。2.水迷宫实验结果显示,与对照组比较,癫痫模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长;柚皮素干预组逃避潜伏期明显缩短;与对照组相比,癫痫模型组大鼠穿越平台次数明显减少,柚皮素干预组大鼠穿越平台次数显著增加。3.HE染色结果显示,对照组大鼠海马组织结构和形态基本正常,细胞着色均匀,排列较规整,细胞核及核仁的大小正常,胞浆及胞核清亮,呈现浅红色及淡蓝色。癫痫后12h组,神经元细胞发生肿胀,胞浆透明,胞核及胞浆着色不均匀,细胞结构与形态紊乱;癫痫后ld组,可见锥体细胞明显丢失,神经元体积缩小,细胞核呈现固缩深染,核仁变小甚至消失,胞核及胞浆染色呈深蓝色和紫蓝色,且着色不均匀,大小不一,形态紊乱;癫痫后3d、7d和14d组,细胞形态与结构较癫痫后ld时逐渐恢复,神经元胞核及胞浆着色较前均匀,形态基本规整。4.尼氏染色结果显示,对照组大鼠海马区椎体神经元排列规则紧密,形态完整,核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,没有明显神经元丢失;与对照组相比,癫痫后ld组,大鼠海马神经元丢失明显,排列紊乱,可见细胞皱缩,染色质凝集成块、胞核固缩,胞浆内尼氏体明显减少;癫痫后3d、7d和14d组可见锥体细胞数目逐步回升,细胞间隙缩小,排列较规整,胞浆内尼氏体分布较丰富,核仁深染、固缩、碎裂等现象逐渐好转。5.Western blot结果显示,与对照组比较,癫痫后12h Nrf2表达水平升高,癫痫后1d达到高峰,3d、7d和14d逐渐下降。6.Western blot结果显示,与对照组比较,癫痫后12h HO-1表达水平升高,癫痫后1d达到高峰,3d、7d和14d逐渐下降。7.HE染色结果显示,与对照组相比,癫痫组细胞形态与结构明显紊乱,锥体细胞显著丢失,神经元体积缩小,细胞核固缩深染,核仁变小甚至消失。与癫痫组相比,柚皮素干预组细胞形态与结构较癫痫组明显恢复,锥体细胞丢失减少,胞核及胞浆着色较前均匀。8.尼氏染色观察柚皮素对癫痫大鼠海马组织病理损伤的影响。结果显示,与对照组相比,癫痫组大鼠海马神经元丢失明显,排列紊乱,可见细胞皱缩,染色质凝集成块,尼氏体数量显著减少。与癫痫组相比,柚皮素干预组海马神经元边缘较清晰,仅有少量染色质凝集,尼氏体数量显著增加。9.TUNEL染色结果显示,对照组海马神经元胞核呈蓝色,细胞排列规整,着色均匀,偶见凋亡神经元;与对照组相比,癫痫组大鼠海马神经元TUNEL阳性细胞数显著增多;与癫痫组相比,柚皮素干预组TUNEL阳性细胞数明显减少。10.Western Blot结果表明,柚皮素可上调癫痫大鼠海马Bcl-2/Bax比例,抑制Caspase-3的激活。11.Western blot实验结果显示,与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织Nrf2表达升高;与癫痫组比较,柚皮素干预组Nrf2表达显著升高。12.Western blot实验结果显示,与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织HO-1表达升高;与癫痫组比较,柚皮素干预组HO-1蛋白表达显著升高。13.MTT检测结果显示,柚皮素呈剂量依赖性抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞增殖活性的降低。14.H2DCF-DA荧光染色检测细胞内ROS,结果表明H2O2组ROS显著增多;柚皮素干预可显著抑制H2O2诱导引起的ROS释放增加。15.线粒体膜电位检测结果显示,H2O2组线粒体膜电位显著降低;柚皮素干预可抑制H2O2诱导引起的线粒体膜电位下降。16.流式细胞分析发现,H2O2组凋亡率显著增多,柚皮素干预可抑制H2O2诱导的凋亡增加。17.Western Blot结果显示,氧化应激条件下,柚皮素可上调Bcl-2/Bax比例;抑制细胞色素C的释放;抑制Caspase-3的激活。18.Western Blot结果显示,柚皮素上调HO-1的表达,免疫荧光结果显示上调的HO-1主要分布于细胞浆内。19.柚皮素激活Nrf2,Western Blot结果显示,柚皮素上调Nrf2的表达;柚皮素促进Nrf2进入细胞核,免疫荧光结果亦显示柚皮素促进Nrf2的进入细胞核。20.免疫共沉淀实验结果显示,对照组Nrf2与Keap1存在蛋白相互结合,柚皮素干预后,Nrf2与Keap1结合明显减少。21.Western Blot结果显示,转染shRNANrf2后,SH-SY5Y细胞Nrf2和HO-1蛋白表达水平均降低。22.Western Blot结果显示,沉默Nrf2后抑制柚皮素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞Nrf2和HO-1表达升高。23.流式细胞凋亡检测发现,Nrf2沉默部分逆转柚皮素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用。24.柚皮素激活ERK1/2和PI3K/Akt。Western Blot免疫印迹结果显示,柚皮素时间依赖性激活ERK1/2和PI3K/Akt。25.ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K/Akt抑制剂LY294002抑制柚皮素引起的HO-1表达上调,提示ERK1/2和PI3K/Akt参与柚皮素诱导的HO-1的表达上调。26.HO-1活性抑制剂ZnPP预处理可逆转柚皮素对H2O2诱导的氧化损伤的抑制作用,说明柚皮素上调HO-1的表达参与抑制H2O2诱导的氧化损伤。结论:1.柚皮素改善癫痫大鼠的空间学习记忆能力。2.柚皮素通过抗凋亡途径抑制癫痫大鼠脑损伤。3.柚皮素促进癫痫大鼠海马神经元Nrf2和HO-1的表达。4.柚皮素可能通过线粒体相关抗凋亡途径抑制SH-SY5Y细胞氧化损伤。5.柚皮素通过促进Keap1与Nrf2解离上调Nrf2表达。6.柚皮素通过激活ERK1/2和Akt通路上调Nrf2依赖的HO-1表达。总之,柚皮素对匹罗卡品诱导的幼年癫痫大鼠脑损伤具有神经保护作用。柚皮素通过激活ERK1/2和Akt通路,进而上调Nrf2/HO-1通路,从而抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤。
关键词: 柚皮素 ；氧化应激 ；Nrf2 ；HO-1 ；癫痫 ；神经保护
被引量
8
摘要： 背景(1)癫痫是一种常见的可致残的脑部疾病,由多种原因导致中枢神经系统神经元高度同步化异常放电所致,以反复发作的痫性发作为特点。目前全球癫痫患者数量达5000万之多,其中约20-30%患者发展为耐药性癫痫,需要终生药物治疗,且对药物疗效反应不佳,这给患者的身心健康、工作生活等一系列方面带来严重影响,因次,癫痫已成为全社会关注的公共卫生问题,迫切需要对其发作、发生、发展机制以及在此基础上挖掘出的干预靶点进行研究。(2)癫痫发作过程伴有组织酸化,酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是一种配体门控离子通道,当细胞外氢离子浓度升高时激活开放,所以该通道在癫痫发作中扮演了一定角色。但目前对酸敏感离子通道在癫痫发作中的作用尚不明确,有诸多争议,特别是关于该通道是促癫痫发作还是抗癫痫发作,多方证据各执一词。酸敏感离子通道3(acid sensing ion channel 3,ASIC3)是该通道的亚基之一,它对酸性刺激最为敏感,开放过程中表现为双相电流,亚基失活速度慢,保持开放时间长,因此最有可能对癫痫发作进行调控。目前,该亚基在癫痫发作方面的研究较少,值得深入挖掘。目的(1)本研究旨在探讨癫痫发作动物模型和癫痫发作细胞模型中ASIC3的表达变化。(2)通过研究ASIC3对癫痫发作动物行为学的影响及相关的分子机制,为抗癫痫发作药物研发提供新的思路和理论依据。方法(1)ASIC3在癫痫发作动物中的表达:采用氯化锂-匹罗卡品癫痫发作大鼠模型,用蛋白印迹检测不同时间点动物海马区ASIC3的蛋白表达变化;用RT-PCR技术检测不同时间点动物海马区ASIC3的mRNA转录水平变化;用免疫组织化学检测动物海马区ASIC3的免疫染色强度。(2)ASIC3在癫痫发作细胞模型中的表达:培养新生大鼠海马原代神经元,采用免疫荧光染色鉴定纯度;用无镁外液诱导神经元癫痫样放电,并用膜片钳技术予以证实;用蛋白印迹检测神经元癫痫样放电后ASIC3的表达变化。(3)ASIC3对癫痫发作动物行为学的影响:采用氯化锂-匹罗卡品癫痫发作大鼠模型,用ASIC3特异性阻断剂APETx2进行侧脑室注射,采用Racine评分评价动物癫痫发作潜伏期、最大发作强度、全身强直阵挛发作(Generalized tonic-clonic seizures,GTCS)比例以及发作强度随时间的变化曲线。(4)ASIC3对癫痫发作影响的机制研究:在癫痫发作大鼠模型中,采用蛋白印迹检测ASIC3 抑制后对 NMDA 受体(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs)、AMPA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors,AMPARs)各亚基表达的影响;用免疫共沉淀检测ASIC3和NMDA受体、AMPA受体的相互作用;用蛋白印迹检测NMDA受体下游信号通路钙调蛋白依赖的蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ,CaMKⅡ)和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的变化情况;用膜片钳检测在无镁外液诱导的癫痫发作细胞模型中ASIC3抑制后神经元自发和诱发动作电位发放的变化,用膜片钳检测ASIC3抑制后海马脑片中NMDA受体介导的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynapticcurrent,mEPSC)和诱发兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)的变化。结果(1)蛋白印迹检测显示,正常大鼠海马组织有ASIC3的本底表达,癫痫发作2小时后表达水平即开始增高,24小时显著升高,48小时到达平台期,72小时略有降低;RT-PCR显示,正常大鼠海马组织有ASIC3的mRNA本底表达,随着癫痫发作后时间推移,ASIC3的mRNA转录水平显著增加;免疫组织化学显示,正常大鼠海马区ASIC3的免疫反应强度较弱,癫痫发作24小时后,免疫反应强度显著升高。(2)原代培养海马神经元经过MAP-2免疫荧光染色鉴定纯度较高;培养12-14天后,在电流钳模式I = 0条件下进行全细胞模式记录显示,正常组海马神经元可见偶发的自发动作电位发放,而无镁外液诱导3小时组可见密集的动作电位发放;无镁外液诱导组神经元ASIC3蛋白表达水平较正常组显著升高。(3)侧脑室注射ASIC3的抑制剂APETx2后,大鼠癫痫发作潜伏期显著缩短,癫痫发作最大强度显著增加,全身强直阵挛发作发生率显著增加,在匹罗卡品注射后15分钟、30分钟、60分钟时间点癫痫发作强度显著高于假手术组,45分钟时间点癫痫发作强度无显著差异。(4)侧脑室注射ASIC3的抑制剂APETx2后,大鼠癫痫发作后NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基膜蛋白表达升高,而AMPA受体亚基GluR1膜蛋白表达未见明显改变;ASIC3和NR1、NR2A、NR2B亚基之间存在蛋白相互作用,但和AMPA受体的GluR1亚基没有相互作用;APETx2预处理显著增加了大鼠癫痫发作后磷酸化CaMKⅡα蛋白和磷酸化CREB蛋白表达水平;AP5抑制NMDA受体功能后反转了APETx2预处理引发的癫痫发作程度加剧。无镁外液诱导的海马神经元经过APETx2处理后自发动作电位和诱发动作电位发放数均增加;经过APETx2预处理的癫痫发作大鼠脑片中NMDA受体介导的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)频率和幅度增加,NMDA 受体介导的诱发兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)也增加。结论(1)ASIC3在大鼠氯化锂-匹罗卡品癫痫发作模型和无镁外液诱导原代海马神经元癫痫样放电模型中均表达升高。(2)抑制ASIC3加剧了氯化锂-匹罗卡品癫痫发作模型中大鼠癫痫发作严重度,增加了无镁外液中原代海马神经元兴奋性。(3)抑制ASIC3加剧动物癫痫发作严重度与NMDA受体上调、NMDA受体下游CaMKⅡ和CREB信号通路激活以及突触传递中NMDA受体介导的mEPSC和eEPSC增加相关。(4)ASIC3是机体自身抗癫痫发作的内源性保护机制,加强ASIC3的功能可能成为防治癫痫发作的新途径。
关键词: 酸敏感离子通道3 ；APETx2 ；NMDA受体 ；癫痫 ；痫性发作 ；CaMKⅡ ；CREB
摘要： 背景:喹诺酮类抗生素(Quinolones antibiotics,QNs)是临床治疗中一类具有抗菌谱广、活性强、稳定性好、半衰期长、生物利用度高、口服吸收效果好、组织浓度高等多种优点的全合成抗菌药物。除了在呼吸系统、泌尿系统、消化系统、皮肤和软组织等各种外周感染中被广泛运用以外,对中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染的治疗也有很大的临床价值。大部分喹诺酮类抗生素对需氧革兰氏阴性菌最有效,包括肠杆菌科、嗜血杆菌、奈瑟菌和卡他莫拉菌。当患者对一线抗结核药物出现了耐药性或不耐受时,QNs是最有价值的二线抗结核药物。既往研究已经证明QNs在外周系统(肾脏、肠道、肺部等)中是多种膜转运蛋白(Transporter,也叫转运体)的底物,包括P-糖蛋白(Pglycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance Protein,BCRP)、多药耐药相关蛋白(Multidrug Resistance-Associated Proteins,MRPs)、和有机阴离子转运体(Organic Anion Transporters,OATs)。这些转运蛋白在血-脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)和血-脑脊液屏障(Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier,BCSFB)上也有表达。目前,这些转运蛋白对QNs在CNS分布的影响尚不清楚。QNs在脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)和脑细胞外液(Extracellular Fluid,ECF)中的分布可能不同。此外,在使用QNs治疗CNS感染时,药物的神经毒性是一个不可回避的问题。喹诺酮类抗生素致痫机制目前尚不明确,关于机制假说的验证多是体外实验研究或临床资料的总结,在动物体内验证以上机制的研究较少。 研究目的1、联合使用高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography,HPLC)和微透析技术同时测量大鼠血液、海马ECF和侧脑室CSF中QNs的游离浓度,以全面了解QNs在脑内的药代动力学情况。存在和不存在各种转运蛋白抑制剂的情况下,比较QNs在脑内的分布情况。明确各个转运蛋白在QNs脑内转运机制中所起的作用,为今后通过调节转运蛋白功能控制药物的脑分布奠定理论基础,为临床用药中可能出现的药物间相互作用提供理论依据。2、联合使用遥测信号采集系统及微透析技术测量大鼠脑内药物浓度、神经递质水平及脑电效应情况,同步视频监测大鼠行为学改变。在QNs致痫的大鼠模型上探究三者间的相关关系,探究QNs可能的致痫机制。 研究方法:1、制备大鼠海马、侧脑室双位点的微透析模型,之后在颈内静脉植入血管探针。将75只大鼠随机分为3大组,每组25只大鼠,按QNs类别分为环丙沙星(Ciprofloxacin,CFX)组、左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)组和莫西沙星(Moxifloxacin,MFX)组。每大组再根据转运蛋白抑制剂的不同分为5个亚组,每个亚组5只大鼠,详细分组如下:(1)对照组(n=5)QNs+空白溶质载体;(2)TAR组(n=5):QNs+Tariquidar(8mg/kg);(3)Ko143组(n=5):QNs+Ko143(15mg/kg);(4)MK571组(n=5):QNs+MK571(20mg/kg);(5)PRO组(n=5):QNs+丙磺舒(50mg/kg)。每组的干预药物经腹腔注射给药,30min后经尾静脉注射相应的QNs。从静脉注射QNs起进行微透析液采集,每15分钟收集1次。每个时间点同步得到的脑ECF、CSF及血液的透析液使用高效液相色谱仪进行测量分析得到相应的药物浓度。将药物-时间曲线代入Phoenix Win Nonlin version 8.2.0软件进行分析,计算QNs在大鼠脑内和血液中的各项药代动力学参数。2、将40只大鼠随机分为2组,每组20只,分别为脑微透析组和脑电模型组#。每大组根据不同的给药方案再平分为4小组,每组5只。详细分组如下所示:组1/组1#(n=5):0.5%CMC灌胃+0.1mol/L盐酸溶液腹腔注射;组2/组2#(n=5):0.5%CMC灌胃+CFX(50mg/kg i.p.);组3/组3#(n=5):0.5%CMC灌胃+CFX(200mg/kg i.p.);组4/组4#(n=5):100mg/kg联苯乙酸(Biphenyl Acetic Acide,BPAA)灌胃+CFX(50mg/kg i.p.)。两大组的实验流程一致,平衡2h后进行灌胃,灌胃1h后腹腔注射相应的剂量的CFX,注射药物后采集3.5h,总实验时长6.5h,连续进行不中断。将海马处采集的微透析液分为两份,分别使用紫外检测器测量透析液中CFX浓度,使用荧光检测器测量透析液中的谷氨酸(Glutamic acid,Glu)和γ-氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid,GABA)的水平。脑内药物浓度使用Phoenix Win Nonlin version 8.2.0软件进行计算各项药代动力学参数,脑电信号采集后使用Neuroscore软件进行相对功率谱分析。 研究结果:1、CFX在脑ECF和CSF中的非结合分配系数(Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF)分别为30.76±4.1%和35.14±4.6%。当丙磺舒与CFX合用时,大鼠血液和脑ECF中的药时曲线下面积(Area under curve,AUC)、半衰期(half-life period,T1/2)和平均驻留时间(Mean retention time,MRT)显著增加(p<0.05)。Ko143的干预也能提高CFX的脑内浓度。在BBB上,对CFX影响最大的转运蛋白是P-gp。Tariquidar(P-gp抑制剂)的预处理使得Kp.uu.ECF提高了1.45倍(p<0.05)。在BCSFB上,对CFX影响最大的转运蛋白是MRPs。MK571(MRPs抑制剂)的预处理使得Kp.uu.CSF提高了1.53倍(p<0.05)。2、LVFX在脑ECF和CSF中的Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别为33.90±1.7%和41.18±2.4%。当丙磺舒与LVFX合用时,大鼠血液和脑内的AUC、T1/2和MRT显著增加(p<0.05)。Ko143的干预增加了脑ECF中LVFX的水平。MRPs在介导LVFX从脑外排到血液起重要作用。MK571(MRPs抑制剂)干预后,Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别增加1.36倍和1.16倍(p<0.05)。3、MFX在脑ECF和CSF中的Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别为22.42±1.5%和28.13±0.7%。当丙磺舒与MFX合用时,大鼠脑内的AUC值显著增加(p<0.05)。Tariquidar的干预也能提高MFX脑ECF的分布。BCRP是介导MFX脑内转运的主要转运蛋白。Ko143(BCRP抑制剂)的干预后,Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别增加1.56倍和1.63倍(p<0.05)。4、药代动力学(Pharmacokinetics,PK)参数提示3种QNs在CSF和脑ECF中分布情况类似。脑脊液QNs浓度可以作为评估脑细胞外液中QNs浓度的替代物。5、所有经BPAA预先处置的大鼠均在QNs给药后出现明显的痫性发作,其余分组未观察到明显的行为学改变。6、本研究中海马处Glu的基线水平为0.976±0.270μg/ml,GABA的基线水平为0.049±0.006μg/ml。组3(0.5%CMC灌胃+CFX 200mg/kg i.p.)大鼠在给药后45-75min的区间内Glu相对于基线水平上升(p<0.05)。组4(100mg/kg BPAA灌胃+CFX 50mg/kg i.p.)大鼠观察到Glu和GABA相对于基线水平均有上升。Glu的上升趋势比GABA明显,峰值早于GABA出现约45min。GABA上升较为缓慢,峰值稍延后。7、组4#中可以观察到δ波和θ波段相对功率的轻度下降,α波和β波段相对功率的上升。其中α波段相对功率上升最明显(p<0.05),CFX给药后30min起持续至2.5h。α波段的相对功率与行为学评分成正相关。8、Glu的变化情况与α波段相对功率变化情况基本同步,GABA的变化稍迟滞。组4中的大鼠脑内CFX消除过程较未致痫组大鼠明显减慢。 结论:1、QNs从CNS外排涉及P-gp、MRPs、BCRP和OATs。P-gp是BBB上主要外排CFX的转运蛋白,MRPs是BCSFB上主要外排CFX的转运蛋白。MRPs是限制LVFX在CNS分布的主要转运蛋白,BCRP是限制MFX在CNS分布的主要转运蛋白。2、脑脊液QNs浓度可以作为评估脑细胞外液中QNs浓度的替代物。3、神经递质的水平异常是QNs导致癫痫发生的原因。NMDA受体的激活直接参与QNs的致痫机制。4、α波段的相对功率对QNs诱发的癫痫发作最敏感,行为学改变与EEG功率变化趋势一致。
关键词: 药物转运蛋白 ；血-脑屏障 ；血-脑脊液屏障 ；喹诺酮类抗生素 ；氨基酸神经递质 ；脑电图
摘要： 目的： 癫痫是一种常见的、以反复发作为特征的慢性神经系统疾病。癫痫发作极大的影响患者的生活质量，给人类健康带来严重威胁。迄今为止，癫痫依旧是一个全球性的社会问题和巨大的社会财政负担，全球有超过5000万人患有癫痫,其中大约30％的患者对现有药物治疗无效，因此寻找新的治疗方法和药物对于缓解癫痫患者的痛苦和提高生活质量具有重要意义。近年来，一些研究发现癫痫发作与线粒体功能障碍密切相关。癫痫发作引起细胞内钙离子浓度升高破坏线粒体膜，造成线粒体钙超载、ROS生成增加、同时ATP过度消耗加重线粒体功能障碍，线粒体内蛋白质稳态失调，严重时引起细胞凋亡，使细胞对痫性损伤更加敏感。 线粒体未折叠蛋白反应(Mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)是指在应激条件下，随着受损或错误折叠的蛋白质转运到线粒体并在线粒体内积累，激活的一种应激反应。mtUPR通过控制线粒体伴侣蛋白促进蛋白质折叠和防止聚集体形成，控制线粒体蛋白酶以减少受损或错误折叠蛋白质的积累，从而维持线粒体蛋白稳定。活化转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4),通过调节细胞内多种基因的表达来调节包括mtUPR在内的多种生物反应。近期研究表明，mtUPR在多种神经退行性疾病的发病过程中发挥重要作用，但目前为止，ATF4介导的mtUPR在癫痫神经损伤中的作用及机制仍然未知。 本研究使用氯化锂-匹罗卡品（pilocarpine,PILO）诱导的大鼠急性颞叶癫痫模型，通过双侧海马立体定位注射转染慢病毒，干预大鼠ATF4表达，通过检测海马组织mtUPR相关的线粒体分子伴侣和蛋白酶水平，检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和自噬、凋亡指标，探讨ATF4介导的mtUPR在急性期癫痫大鼠神经损伤中的作用及具体机制。 方法： 本研究将108只SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠分为时间点组和慢病毒干预组，其中时间点组共48只大鼠，慢病毒干预组共60只大鼠。 将时间点组中的48只8-9周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为6组:对照组（con组）、3h组、8h组、24h组、3d组和7d组（每组n=8）,PILO癫痫造模后根据时间点取海马组织，然后采用Western blot（WB）法检测各组大鼠对应时间点mtUPR相关蛋白的表达。 将慢病毒干预组中的60只6-7周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为5组:对照组（CON组）、致痫组（AE组，PILO诱导）、阴性对照组（NC组，海马定向导入lenti-pGV+PILO诱导）、ATF4低表达组（Sh-ATF4组，海马定向导入lenti-ATF4-shRNA+PILO诱导）以及ATF4高表达组（Lv-ATF4组，海马定向导入lenti-ATF4+PILO诱导），每组12只大鼠。在注射麻醉后，大鼠固定于立体定向仪上，双侧海马定向导入慢病毒干预ATF4表达。14天后，通过腹腔注射法建立PILO诱导的大鼠急性颞叶癫痫模型，对照组注射等量生理盐水。根据时间点组检测出的mtUPR最强的时间点（24h）,处死大鼠并取海马组织，采用HE染色和TUNEL染色观察海马组织细胞形态和组织损伤情况。此外，还采用WB法检测各组大鼠ATF4、线粒体分子伴侣（HSP60）、线粒体蛋白酶（Lonp1、ClpP）、自噬相关蛋白（LC3-B、Beclin-1）及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2）表达变化，采用免疫荧光染色观察各项指标的亚细胞定位，ROS染色检测氧化应激水平，探讨ATF4调控的mtUPR在癫痫神经损伤中的作用机制。 结果： 1.癫痫造模结果:本实验共用108只大鼠，其中88只进行氯化锂-PILO癫痫造模，其中造模成功的大鼠80只，造模失败8只，造模成功后死亡10只，死亡大鼠多在癫痫造模成功后第3-7天期间死亡（6只），大鼠多数在腹腔注射PILO后的0.5-1小时内达到四级或以上发作，平均潜伏期时长为30.89分钟，时间点组、AE组、NC组、Lv-ATF4组和Sh-ATF4组大鼠在造模过程中的行为学表现和发作时间无显著差异。 2.急性期癫痫大鼠海马组织中的mtUPR:WB结果显示癫痫急性期大鼠各时间点海马组织蛋白中的线粒体未折叠蛋白反应增强，其中以24h组线粒体伴侣蛋白和蛋白酶表达最高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 3.慢病毒转染结果检测:海马组织冰冻切片显示海马各细胞层均转染上慢病毒自带的亮绿色荧光;WB检测结果显示:与CON组相比，AE组大鼠ATF4表达明显升高;与NC组相比，Sh-ATF4组ATF4表达降低，Lv-ATF4组ATF4表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 4.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织损伤的影响:HE染色结果显示与CON组相比，AE组和NC组CA1区神经细胞数量明显减少，细胞排列紊乱，出现较多异形、深染的细胞;与NC组相比，Sh-ATF4组海马CA1区的神经细胞数量进一步减少，异形细胞比例明显增多;与NC组相比，Lv-ATF4组海马CA1区的异形和深染的细胞数量明显减少。采用TUNEL法检测海马石蜡切片CA1区细胞凋亡，结果显示:与CON组相比，AE组凋亡神经细胞数量明显增加，与NC组相比，Sh-ATF4组大鼠海马CA1区凋亡神经细胞比例明显增加（P＜0.05）,Lv-ATF4组大鼠海马CA1区凋亡神经细胞比例减少（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 5.ATF4对海马组织mtUPR相关蛋白的影响:WB检测结果显示与CON组相比，AE组大鼠线粒体分子伴侣HSP60、线粒体蛋白酶Lonp1、ClpP的蛋白表达明显升高;与NC组相比，Sh-ATF4组HSP60、Lonp1、ClpP的表达明显降低、Lv-ATF4组HSP60、Lonp1、ClpP的表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 6.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织自噬的影响:WB结果显示，与CON组相比，AE组大鼠海马中的LC3B、Beclin-1表达增加;与NC组相比，Sh-ATF4组Beclin-1、LC3B明显增加，Lv-ATF4组Beclin-1、LC3-B表达减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组相比，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 7.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织ROS染色的影响:海马组织冰冻切片ROS染色发现:与CON组相比，AE组海马CA1区ROS明显增加;与NC组相比，过表达ATF4组海马组织CA1区ROS明显降低，低表达ATF4组则增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间无统计学意义（P＞0.05）。 8.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织星形胶质细胞相关蛋白GFAP的影响:与CON组相比，AE组海马的CA1区GFAP荧光强度增加;与NC组相比，Sh-ATF4组CA1区的GFAP荧光强度明显增加，ATF4高表达GFAP荧光强度减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间无统计学意义（P＞0.05）。 9.ATF4对急性期癫痫大鼠海马神经组织中凋亡相关蛋白的影响:WB结构显示与CON组相比，AE组凋亡相关蛋白Bax明显增加、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少;与NC组相比，Sh-ATF4组凋亡相关蛋白Bax明显增加、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少;Lv-ATF4组凋亡相关蛋白Bax明显减少、而抗凋亡蛋白Bcl-2增加;差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。海马组织石蜡切片Caspase9免疫荧光染色结果显示:与CON组相比，AE组海马CA1区的Caspase9荧光强度明显增强;与NC组相比,Sh-ATF4组海马CA1区的Caspase9荧光强度明显增强,ATF4高表达组海马CA1区Caspase9的荧光强度明显减弱;差异均有统计学意义（P＜0.05）,AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论： 1.癫痫发作激活mtUPR,ATF4调控的mtUPR可能参与了癫痫的病理生理机制。 2.在癫痫发作急性期，ATF4可能通过激活mtUPR,抑制海马组织星形胶质细胞增生，减少海马组织ROS生成，最终抑制自噬和凋亡途径，减少癫痫引起的神经损伤，发挥神经保护作用。
关键词: 急性期癫痫 ；海马神经损伤 ；活化转录因子4 ；线粒体未折叠蛋白反应 ；病理机制
摘要： 颞叶癫痫（Temporal lobe epilepsy,TLE）是临床上最常见的癫痫发作类型之一,约有近一半左右的TLE患者存在认知功能障碍,严重影响患者的生活质量及身心健康,但临床上尚却缺乏有效治疗手段。因此,积极开展针对TLE认知功能障碍发病机制的研究并寻求新的治疗靶点具有重要的理论价值和现实意义。我们前期研究发现TLE共病认知功能障碍的发生机制与海马等脑区神经元铁死亡损伤有关。铁死亡（ferroptosis）是近年来发现的一种铁依赖的非凋亡的细胞程序性死亡方式,触发铁死亡程序的关键要素在于:铁(Fe2+)过度蓄积,谷胱甘肽（GSH）消耗或谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX-4）失活,脂质过氧化物蓄积,其中细胞内铁(Fe2+)过载是触发铁死亡的关键的诱发因素。研究表明,膜铁转运蛋白（ferroportin,FPN）是调控细胞内Fe2+水平维持细胞内铁稳态的关键蛋白,核因子红细胞-2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）的激活参与减轻海马神经元损伤进而改善认知功能的过程,同时可以调控FPN的表达。近年来研究发现,klotho具有神经保护作用及抗认知障碍效应,且海马内klotho表达下调可能与TLE共病认知障碍有关,但其具体作用及机制尚不清楚。本研究将首先明确klotho在氯化锂-匹鲁卡品（lithium-chloride pilocarpine,LiCl-Pilo）构建TLE大鼠海马组织中的表达及细胞定位情况;其次,探讨klotho通过减轻LiCl-Pilo诱导TLE大鼠海马神经元铁死亡损伤进而改善认知功能障碍;最后,从激活Nrf2通路可抑制铁死亡、上调FPN调控海马神经元Fe2+水平的角度来揭示klotho改善TLE认知功能障碍的作用机制,从而为TLE认知功能障碍寻求新的治疗靶点。第一部分Klotho在LiCl-Pilo诱导TLE大鼠海马中的表达及细胞定位目的:利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型,明确klotho在TLE大鼠海马组织中的表达及细胞定位情况,探讨klotho水平与TLE共病认知障碍之间是否存在相关性。方法:将雄性SD大鼠（8-10周,体重约为250-280g/只）随机分为Con组及LiCl-Pilo组。其中LiCl-Pilo组又分为4个亚组:3 d组、2w组、4w组、6w组,每组20只。大鼠通过腹腔注射LiCl-Pilo构建TLE模型,观察并记录建模后大鼠的癫痫发作情况。造模后根据不同的时间点深度麻醉各组部分大鼠后取材,分别利用免疫蛋白印迹技术（Western blot,WB）、双重免疫荧光技术检测TLE大鼠海马组织中klotho表达水平及细胞定位情况;Con组和6w组采用水迷宫实验评估大鼠认知功能;Nissl染色、HE染色评估各组大鼠海马神经元损伤情况。结果:（1）行为学结果:Con组没有癫痫发作。LiCl-Pilo组4个亚组大鼠在使用LiCl-Pilo诱导SE后均出现Racine分级4级以上发作,发作时间控制在30分钟作用,死亡率为13.75%（11/80）。（2）大鼠海马组织klotho表达水平:WB方法检测结果显示,与Con组相比,各时间点的模型组在给与LiCl-Pilo造模后第3天klotho表达水平开始下降,但统计学无显著意义,在2w至6w期间持续下降,并在4w达到最低,均具有统计学差异（p<0.05或p<0.01）。（3）klotho在海马组织不同类型细胞的共表达情况:采双重免疫荧光检测方法结果显示,在Con组及LiCl-Pilo组中,klotho均与神经元特异性标记物Neun共表达,与星形胶质细胞标记物GFAP不共表达。（4）大鼠认知行为学的研究:水迷宫实验结果显示,与Con组相比,LiCl-Pilo组大鼠每日找到潜伏平台的平均潜伏期长于Con组大鼠,差异具有统计学意义（P<0.05）;LiCl-Pilo组大鼠穿过平台次数及目标象限游泳时间的百分比均明显下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。两组大鼠在可视平台期中找到潜伏平台的时间和速度无明显差异（P>0.05）。（5）大鼠海马神经元损伤情况的研究:HE染色结果显示,与Con组相比,LiCl-Pilo组大鼠CA1区细胞计数明显减少,细胞染色变浅、模糊不清,差异具有统计学意义（P<0.001）。Nissl染色结果显示,与Con组相比,LiCl-Pilo组大鼠CA1区Nissl染色阳性的神经元细胞数明显减少且体积变小,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）Klotho在大鼠海马神经元表达,不在星形胶质细胞表达。（2）Klotho在LiCl-Pilo诱导TLE大鼠海马组织中表达下调,可能与TLE大鼠海马神经元损伤及认知功能障碍存在相关性。第二部分Klotho对LiCl-Pilo诱导LTE大鼠行为学及海马神经元损伤的影响目的:利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型,探讨klotho在LiCl-Pilo诱导TLE大鼠认知障碍中的作用。方法:本实验分为两部分:（1）大鼠海马注射过表达klotho腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV-KL）转染效率测定的研究:将雄性SD大鼠随机分为仅带有腺相关病毒空载体（AAV-NC）的对照组和AAV-KL组,每组20只。免疫荧光法和WB法检测分别在大鼠海马注射AAV-KL后时间点3w、9w各组大鼠海马klotho转染及蛋白表达情况。（2）Klotho对LiCl-Pilo诱导TLE大鼠癫痫发作的易感性、认知功能及海马神经元损伤的影响:通过海马立体定位注射AAV-KL上调海马内源性klotho的表达,将雄性SD大鼠随机分为分Con组、Saline组、AAV-NC组、AAV-KL组,每组20只,利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型。记录各组大鼠癫痫潜伏期时间和慢性期自发性发作次数（造模后第5周）;造模后第6周采用水迷宫实验评估各组大鼠认知功能;Nissl染色、HE染色评估各组大鼠海马神经元损伤情况;透射电镜观察各组大鼠海马神经元铁死亡病理学特征;WB法检测各组大鼠海马klotho、GPX-4表达水平;GSH试剂盒和ROS试剂盒检测各组大鼠海马GSH、ROS表达水平;Iron Assay试剂盒检测大鼠海马Fe2+水平。结果:（1）AAV病毒载体转染情况:免疫荧光染色检测结果显示,在注射AAV病毒载体后第3周和9周时,AAV病毒载体均成功转染到海马神经元。（2）klotho表达情况:在海马内注射AAV病毒载体后第3周和9周时,WB法检测结果显示:AAV-KL组较AAV-NC组海马组织中klotho蛋白表达水平均明显上调,且两组之间的统计学差异均具有意义（P<0.001,P<0.01）。（3）行为学结果:Saline组、AAV-NC组、AAV-KL组大鼠在使用LiCl-Pilo诱导SE后均出现Racine分级4级以上发作,发作时间控制在30分钟左右,死亡率为13.33%（8/60）。各组大鼠从注射LiCl-Pilo到首次进入4级或以上癫痫发作的潜伏期没有显著差异（P>0.05）。在注射LiCl-Pilo后的第5周,Saline组、AAV-KL组和AAV-NC组分别有90%、80%和90%的大鼠出现自发性癫痫发作,但各组之间大鼠的自发性癫痫发作次数没有显著差异（P>0.05）。（4）大鼠认知行为学研究:水迷宫检测结果显示,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠每日找到平台的平均潜伏期明显延长,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠每日找到平台的平均潜伏期明显缩短,差异具有统计学意义（P<0.05）。在空间搜索实验中,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠穿越平台次数明显减少以及在目标象限游泳时间的百分比明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠穿越平台次数以及在目标象限游泳时间的百分比明显增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。在可视化平台期中,各组大鼠找到平台的潜伏期和平均速度,差异均无统计学意义（P>0.05）。（5）大鼠海马神经元损伤情况的研究:HE染色结果显示,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠CA1区细胞计数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;而AAV-KL组较AAV-NC组相比,细胞染色变浅和模糊不清的特点明显改善,CA1区细胞计数也明显增加,两组统计学差异具有意义（P<0.05）。Nissl染色结果显示,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠CA1区Nissl染色阳性的神经元细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠CA1区Nissl染色阳性的神经元细胞数明显增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。（6）大鼠海马神经元铁死亡病理特征的研究:透射电镜结果显示:TLE组大鼠海马CA1区线粒体脊减少,外膜破裂,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠CA1区细胞线粒体面积减小,差异具有统计学意义（P<0.05）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠CA1区细胞线粒体面积增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）大鼠海马组织klotho、GPX-4表达水平:与Con组相比,Saline组大鼠海马klotho、GPX-4的表达水平明显下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠海马klotho、GPX-4表达水平明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。（8）大鼠海马组织GSH、ROS表达水平结果:与Con组大鼠比较,Saline组大鼠海马神经元GSH表达均明显下调、ROS表达均明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠海马神经元GSH表达均明显上调、ROS表达均明显下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。（9）大鼠海马组织Fe2+水平结果:与Con组大鼠比较,Saline组大鼠海马神经元中Fe2+水平升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠海马神经元中Fe2+水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）Klotho不影响TLE大鼠的癫痫易感性,也不能减轻自发性癫痫发作的次数。（2）Klotho通过减轻海马神经元铁死亡改善TLE大鼠的认知功能障碍。（3）Klotho通过上调海马内GSH、GPX-4水平下调ROS水平及减轻海马内铁沉积抑制TLE大鼠海马神经元铁死亡。第三部分Klotho改善LiCl-Pilo诱导TLE大鼠认知功能障的分子机制目的:利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型,探讨klotho改善LiCl-Pilo诱导TLE大鼠认知功能障的分子机制。方法:通过海马立体定位注射AAV-KL上调海马内源性klotho的表达,将雄性SD大鼠随机分为Con组、AAV-NC组、AAV-KL组、AAV-KL+ML385组,每组20只,AAV-KL+ML385组大鼠给予腹腔注射Nrf2特异性抑制剂（ML385,30mg/kg,连续7天）,利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型。造模后第6周开始采用水迷宫实验评估各组大鼠认知功能;Nissl染色、HE染色评估各组大鼠海马神经元损伤情况;透射电镜观察各组大鼠海马神经元铁死亡病理学特征;免疫蛋白印迹检测各组大鼠海马Nrf2、FPN、GPX-4表达水平;GSH试剂盒和ROS试剂盒检测各组大鼠海马GSH、ROS表达水平;Iron Assay试剂盒检测大鼠海马Fe2+水平。结果:（1）行为学结果:AAV-NC组、AAV-KL组、AAV-KL+ML385组大鼠在使用LiCl-Pilo诱导SE后均出现Racine分级4级以上发作,发作时间控制在30分钟作用,死亡率为15.00%（9/60）。（2）大鼠认知行为学研究:水迷宫检测结果显示,与Con组大鼠比较,AAV-NC组大鼠每日找到平台的潜伏期明显延长,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠每日找到平台的潜伏期明显缩短,
关键词: Klotho ；颞叶癫痫认知功能障碍 ；铁死亡 ；治疗靶点
摘要： 第一部分:P-gp单克隆抗体修饰含硒纳米粒子的鼻腔递送系统构建及表征目的:构建含硒纳米粒子(SeNPs)及P-gp单克隆抗体修饰含硒纳米粒子的靶向递送系统(P-gp@SeNPs),并对其性能进行初步表征,为下文的研究提供基础。材料与方法:取定量亚硒酸、PEG溶液混合构建SeNPs;之后将SeNPs与P-gp单克隆抗体进行混合,冻干获得样品,溶解后洗涤,得到P-gp@SeNPs;分别通过紫外系数光谱法、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射法(DLS)以及带毒平板法对SeNPs、P-gp@SeNPs两组物质的均匀度、结构及抗菌性能进行测定。结果:SeNPs在紫外光谱分析中210 nm到259 nm处存在两个特征吸收峰,当其在SeNPs在修饰了 P-gp单克隆抗体后期吸收峰发生了蓝移,其特征峰发生于6 nm处;TEM结果显示,SeNPs、P-gp@SeNPs样品颗粒性状表现均体现出球形的形状,粒径较为均一,平均粒径为61.7nm;P-gp单克隆抗体在其硒纳米表面所负载的浓度为2.55 mg/mL;P-gp@SeNPs样品对金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌具有较好的抑菌效果,整体上二者的抑菌率可以达到100%左右。结论:本部分成功制备了粒径较小、分散均匀的P-gp@SeNPs样本,样品稳定性及抑菌性均较高,有望成为一种新型的高效物质,为下文的研究提供基础。第二部分:含硒纳米粒子鼻腔递送对颞叶癫痫大鼠海马组织P-gp表达水平影响的研究目的:P-gp@SeNPs鼻腔递送系统的构建以及其对颞叶癫痫大鼠海马组织中P-gp表达趋势影响的研究。材料与方法:(1)构建大鼠海人酸杏仁核点燃模型(TLE大鼠),分别测定造模术后1d、7d、14d及30d大鼠海马组织P-gp表达水平(WB),选择最高点(30d)作为后续实验给药时间。经鼻腔给予iFlour594标记的P-gp@SeNPs 6小时后取脑切片,进行微血管内皮(GLUT1)特异染色;(2)设置Sham组(空白对照组)、Model组(颞叶癫痫大鼠组)、SeNPs(口服)组及P-gp@SeNPs(鼻腔递送)组;确定各组大鼠行为学发作;Western-blot、免疫组化检测各组大鼠脑组织内P-gp蛋白表达。结果:(1)随着术后时间的延长,大鼠脑组织内P-gp蛋白表达逐渐提升(P<0.05);微血管内皮(GLUT1)特异染色结果显示,P-gp@SeNPs在正常大鼠海马组织中与微血管内皮细胞存在共定位,提示P-gp修饰的SeNPs经鼻腔入脑后能有效富集在微血管内皮细胞,即P-gp的主要表达区域。(2)与Sham组相比,TLE大鼠模型构建可以提升海马组织内P-gp蛋白表达,干预可以下调TLE大鼠海马组织内P-gp蛋白表达(P<0.05);经P-gp单克隆抗体修饰后,SeNPs的鼻腔递送进一步抑制海马组织内P-gp表达(P<0.05)。结论:(1)大鼠进行杏仁核海人酸注射后30d内,术侧海马组织内P-gp表达水平呈现持续上升趋势。(2)SeNPs的口服给予以及P-gp@SeNPs的鼻腔递送显著抑制了癫痫发作后P-gp的过表达。第三部分:含硒纳米粒子靶向递送对颞叶癫痫大鼠的神经保护作用研究材料与方法:设置Sham组(空白对照组)、Model组(TLE大鼠组)、SeNPs组及P-gp@SeNPs组;确定各组大鼠行为学发作;通过尼氏染色、HE染色分析各组大鼠海马病理改变;ELISA检测各组大鼠海马组织内炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)浓度水平;TUNEL法检测各组大鼠海马组织细胞凋亡程度;Western-blot及RT-qPCR法分析各组大鼠组织内细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase3、Bax浓度表达。结果:对照组大鼠海马组织结构以及形态基本正常,海马细胞的染色形态均匀,排列整齐,细胞核以及细胞核仁的大小均基本正常,尼氏小体数量较多;TLE模型构建后,大鼠海马组织神经元细胞发生不同程度肿胀,细胞出现透明空泡化,核以及细胞浆的着色欠均匀,细胞结构与形态紊乱,同时神经元细胞的体积逐渐缩小,固缩深染,尼氏小体数量减少;硒纳米粒子(SeNPs)干预可以改善大鼠海马组织病理形态,细胞形态及结构均较模型组有所恢复,尼氏小体数量增加;经P-gp单克隆抗体修饰后,海马组织的病理形态得到进一步的提升,神经元的着色更加均匀,形态更加规整,尼氏小体数量进一步提升。与Sham组相比,TLE大鼠模型构建可以提升海马组织内炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)及 Caspase3、Bax 表达,降低 GR、CAT、GPx、SOD、Bcl-2 水平(P<0.05);与Model组相比,硒纳米粒子(SeNPs)干预可以下调TLE大鼠海马组织内炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)水平及 Caspase3、Bax 表达,上调 GR、CAT、GPx、SOD、Bcl-2水平(P<0.05);经P-gp单克隆抗体修饰后,硒纳米粒子(SeNPs)干预进一步抑制海马组织炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)、Caspase3、Bax 表达,提升 GR、CAT、GPx、SOD 及 Bcl-2水平(P<0.05)。结论:(1)对杏仁核KA注射癫痫大鼠进行SeNPs的递送通过减轻癫痫发作导致的氧化应激抑制神经炎症的发展,减轻大鼠海马组织神经元凋亡,发挥神经保护作用。(2)P-gp@SeNPs的鼻腔递送绕过血脑屏障直接入脑并向P-gp高表达区域的靶向富集进一步增强神经保护作用。第四部分:含硒纳米粒子鼻腔递送对颞叶癫痫大鼠的神经保护作用机制研究目的:探究SeNPs、P-gp@SeNPs递送系统对颞叶癫痫大鼠的神经保护作用的分子机制。材料与方法:(1)构建大鼠海人酸杏仁核点燃模型(TLE大鼠),设置Sham组(空白对照组)、Model组(TLE大鼠组)、SeNPs组及P-gp@SeNPs组;Western-blot检测各组大鼠海马组织内MAPK信号通路关键蛋白p-p38、p-JNK、p-ERK1/2表达水平。(2)采用MAPK信号通路抑制剂VX-702干预模型组大鼠,设置Model组、VX-702 组、SeNPs 组、P-gp@SeNPs 组、P-gp@SeNPs+VX-702 组;Western-blot检测各组大鼠海马组织内MAPK信号通路关键蛋白p-p38、p-JNK、p-ERK1/2表达水平;确定P-gp@SeNPs靶向递送系统对大鼠海马组织内MAPK信号通路的抑制作用。结果:(1)与Sham组相比,TLE大鼠模型建立后,海马组织内p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达提升(P<0.05);SeNPs的干预可以降低p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05);P-gp单克隆抗体修饰后,SeNPs抑制MAPK信号通路活性与之接近(P>0.05)。(2)与Model组相比,MAPK信号通路抑制剂的干预可以明显降低海马组织内p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05);SeNPs的干预可以降低p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05);将P-gp单克隆抗体修饰后,SeNPs抑制MAPK信号通路活性与之接近(P>0.05);P-gp-SeNPs与VX-702联合可以进一步降低 p-p38、p-JNK、p-ERK1/2 的水平(P<0.05)。结论:SeNPs可抑制MAPK信号通路的活性,进而缓解TLE病理进展,为临床的研究提供基础。
关键词: 癫痫 ；纳米硒 ；P-gp ；鼻腔递送 ；神经保护
摘要： 癫痫是一种以脑神经元异常同步放电导致的反复发作为特征的慢性脑部疾病，是神经科常见病、多发病之一。全球约有6500万癫痫患者，在我国癫痫患病率约为7‰，据此估计我国癫痫患者不少于900万。其中约30%为难治性癫痫。癫痫患者常常伴随有焦虑、精神病、抑郁和认知缺陷等合并症，据报道约有半数以上癫痫患者伴有认知功能障碍。近几年发现抗癫痫药本身也可导致认知功能障碍。因此，临床上亟待需要开发既能抑制癫痫发作同时能改善癫痫相关的认知障碍的新型药物。 颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy，TLE)是最常见的难治性癫痫类型。TLE常常由脑损伤诱导，脑损伤后触发了细胞和分子水平的改变，增加了癫痫发作的几率。颞叶癫痫以反复性自发性癫痫发作(SRS)和海马硬化为主要特点，伴有明显的药物抵抗。临床研究表明，TLE患者的认知功能明显降低。TLE对手术及抗癫痫药物治疗效果均不明显，因此TLE仍是当前癫痫领域研究的热点及难点，深入研究TLE的病因、病理、发病机制及预防措施，具有重要理论价值及临床意义。氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠行为学和海马神经元损伤的病理学改变均与人类颞叶癫痫相似，因此是目前研究TLE的常用模型。 以往的研究中，离子通道异常、神经递质异常、神经网络重组、信号转导、线粒体功能异常、自身抗体等是癫痫机制研究的重点。近年来大量的研究已经表明炎症是癫痫产生及癫痫发作的关键因素之一。抗炎治疗在临床和实验研究中都获得了良好的治疗效果。Toll样受体4Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的受体，能识别损伤或应激所致的“内源性危险信号”，激活核转录因子kappaB(Nuclearfactor-k-genebinding,NF-κB)发生磷酸化，磷酸化的NF-κB(PhosphorylatedNuclearfactor-k-genebinding,p-NF-κB)进入细胞核，诱导促炎因子基因表达，脑内炎症导致癫痫反复发作。已有研究证明TLR4/NF-κB通路在缺血性脑损伤、脑外伤、中枢神经系统感染、神经退行性疾病和脑自身免疫性炎症中发挥作用。在耐药性TLE，局灶性皮质发育不良和TSC患者的手术切除标本中发现TLR4蛋白的表达增高。动物实验发现，给予HMGB-1/TLR4蛋白抑制剂可以抑制癫痫的形成，提高癫痫发作的易感性。此外，TLR4敲除动物癫痫易感性性明显升高。在颞叶癫痫的动物模型中，抑制IL-1R1/TLR4途径可抑制癫痫发作。总之，TLR4信号通路为癫痫的的治疗提供了新的靶点。 (-)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶中最主要的多酚组分，它具有抗氧化，抗炎和抗凋亡的生物学特性。EGCG可以透过血脑屏障，在阿尔茨海默病，帕金森病，缺血性中风和脊髓损伤中起到了神经保护作用。EGCG可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，对大鼠模型肾脏缺血再灌注损伤起到保护作用。在砷诱导的小鼠炎症和免疫毒性的影响研究中指出，EGCG可以抑制IL-1β、IL-6及TNF-α炎症因子分泌，减轻炎症反应。同时，EGCG可以改善酒精、脑缺血、糖尿病、铅中毒及应激反应等因素所导致的认知功能损伤，同样正常大鼠给予EGCG可以有效提高大鼠的认知功能。在唐氏综合Ⅱ期临床试验中发现长期应用EGCG可以改善唐氏综合征患者的认知功能。EGCG能否通过抑制TLR4通路以抑制颞叶癫痫发作，改善TLE认知障碍尚未有报道。 本实验采用氯化锂-匹鲁卡品建立颞叶癫痫模型，观察EGCG对TLE发作及癫痫继发认知障碍中的神经保护作用，并对其中可能的机制进行了探讨，以期寻找到新的既能抑制癫痫形成，又能改善癫痫后认知功能障碍的新型药物。 第一部分EGCG对氯化锂-匹鲁卡品诱导癫痫发作的影响 目的：应用氯化锂-匹鲁卡品诱导颞叶癫痫模型，于癫痫持续状态(SE)后分别给予低、中、高剂量EGCG干预，通过评价大鼠SRS发作潜伏期，SRS发作比率，SRS发作频率及发作持续时间、脑电图(electroencephalogram, EEG)等指标，以探讨不同剂量EGCG对颞叶癫痫的保护作用。 方法： 成年健康雄性SD大鼠62只，随机选取52只制备大鼠SE模型。将成功制备的大鼠SE模型随机分成4组，模型组(EP)，依据SE后给予EGCG干预剂量不同分为EGCG低、中、高三组，即EP+EGCG12.5mg/kg组、EP+EGCG25mg/kg组及EP+EGCG50mg/kg组，每组10只，另设有正常对照组(Control)10只，总共5组。EGCG给药分别于SE后24h给予相应剂量腹腔注射，每日一次，连续给药28天。EP组给予相应的生理盐水腹腔注射。于SE后1周应用高清视频系统监测大鼠行为变化，记录大鼠SRS发作潜伏期，SRS发作频率及发作持续时间。于给药完毕后，监测各组大鼠脑电图变化。 结果： 1.52只用以诱发SE的大鼠，48只被诱发成SE，成功率为92.30％，8只在SE诱发成功后死亡，最终可纳入实验的大鼠共40只，将40只大鼠随机分为EP(n=10)及EP+EGCG12.5mg/kg(n=10)组、EP+EGCG25mg/kg(n=10)组及EP+EGCG50mg/kg(n=10)组。 2.大鼠SRS发作潜伏期及发作率比较:EP组在SE后18.00±2.00天出现SRS发作，EP+EGCG12.5mg/kg在SE后(19.00±2.34)天出现SRS，EP+EGCG25mg/kg组出现SRS发作平均时间为(20.15±3.41),而EP+EGCG50mg/kg组出现SRS发作平均时间为(19.48±2.87)，四组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。EP组大鼠10只均出现SRS发作，SRS发生率达100%。EP+EGCG12.5mg/kg组有1只未出现SRS发作，SRS发作率达90%，EP+EGCG25mg/kg组有2只未出现SRS发作，SRS发作率达80%,EP+EGCG50mg/kg组有2只未出现SRS发作，SRS发作率达80%,四组间出现SRS发作比率差异无统计学意义(P＞0.05)。 3.大鼠SRS发作频率及发作持续时间比较：与EP组SRS发作频率(2.11±0.09)相比，EP+EGCG12.5mg/kg组(1.62±0.10)、EP+EGCG25mg/kg组(1.00±0.08)、EP+EGCG50mg/kg组(1.02±0.05)SRS明显减少(P＜0.001)。并且EGCG中、高剂量组发作频率明显低于低剂量组(P＜0.001)，而EGCG中、高剂量两组无明显差异(P＞0.05)。EP组的平均癫痫发作持续时间较长(37.57±0.89s)，EP+EGCG(低、中、高)三组平均癫痫发作持续时间分别为(27.07±1.30、16.08±0.60s、15.24±0.85)，较EP组明显缩短(P＜0.001)。并且EGCG中、高剂量组发作时间明显低于低剂量组(P＜0.001)，而EGCG中、高剂量两组癫痫发作时间无明显统计学差异(P＞0.05)。SE后给与EGCG治疗可降低SRS发作频率和癫痫发作持续时间，EGCG中、高剂量效果明显优于低剂量组。 4.慢性期大鼠脑电图变化： Control组大鼠脑电图以α或β节律为主，频率5-10Hz，波幅小于100uV。节律规则，脑电图记录过程中脑电波形基本一致而无过多变化，未出现棘波、棘慢波等异常波。EP组大鼠脑电图出现丛集样癫痫波，伴随间断棘波尖波慢波等癫痫波，大鼠IV/V自发作脑电图特点：发作时出现明显规律的丛集样癫痫波，首先变现为出现规律的频率约2Hz尖波，波幅约110uV，大鼠进入静止状态，随后尖波频率逐渐增快，波幅逐渐增大1mV，大鼠开始出现Ⅲ级发作，随着脑电放电频率增快，以θ或α节律放电，波幅增加达1mV，大鼠出现级V发作，同时脑电图极性发生改变，大鼠发作停止，脑电图出现发作后抑制状态。给予EGCG干预后，大鼠SRS发作次数减少，每次发作时间缩短，与脑电图显示癫痫放电相一致，给予EGCG后，丛集样放电较少，大鼠行为学发作多为IV级发作，出现V级次数明显减少，发作程度减轻。中剂量及高剂量EGCG干预组，脑电图表现发作时不易出现持续高尖波，很少出现发作后抑制。 5.间期放电次数比较：随机选取非癫痫发作的10min的片段，每只大鼠选取5段，与EP组癫痫间期放电次数(37.27±2.00)相比，EP+EGCG12.5mg/kg组(30.53±2.18)、EP+EGCG25mg/kg组(18.27±1.87)及EP+EGCG50mg/kg组(17.00±6.12)间期放电次数明显减少(P＜0.001)。并且EGCG中、高剂量组发作频率明显低于低剂量组(P＜0.001)，而EGCG中、高剂量两组无明显差异(P＞0.05)。 第二部分EGCG对氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠认知功能障碍的影响 目的：研究EGCG对癫痫大鼠认知功能、突触超微结构及相关突触蛋白的影响，进一步探讨相关的作用机制。 方法： 将健康成年雄性SD大鼠(n=35)，制备大鼠SE模型。依据第一部分实验结果，EGCG给药选择效果最好而用药最少的25mg/kg。将成功制备的大鼠SE模型随机分成2组，模型组(EP)，EGCG给药干预组(EP+EGCG)，每组10只，另设有正常对照组(Control)10只，总共3组。EGCG给药剂量及给药方式：25mg/kg，腹腔注射，于SE后24小时给予，每日一次，连续给药28天。EP组给予相应的生理盐水腹腔注射。根据文献报道及前期预实验，SE发作后多于14-42d出现SRS行为，由此我们选取SE发作后49d时，进行Morris水迷宫检测，检测完毕后行在体场电位记录(L-LTP)。电生理记录结束后行westernblot检测海马突触相关蛋白的表达，及透射电镜观察海马CA1区突触超微结构。 结果： 1.水迷宫检测：定位航行实验结果显示，每组大鼠的逃避潜伏期随着训练而缩短。三组的逃避潜伏期在前两天无统计学差异(P＞0.05)。在第3-5天，每组的逃避潜伏期短于前两天。与Control组相比，EP组大鼠的逃避潜伏期延长(P＜0.05)。EP+EGCG组大鼠的逃避潜伏期较EP组逃避潜伏期缩短(P＜0.05)。空间探索试验表明，EP组大鼠120s内穿越平台次数显著少于Control组(P＜0.01)。EP+EGCG组120s内平台穿越次数高于EP组(P＜0.01)，但仍与Control组有显着差异(P＜0.01)。EP组目标象限停留时间明显短于Control组(P＜0.01)。然而，EP+EGCG组大鼠目标象限的停留时间明显长于EP组大鼠(P＜0.01)。可视平台实验：各组大鼠逃避潜伏期无统计学差异(P＞0.05)。 2.电生理记录结果:在体L-LTP,EP组其各个时间点fEPSP幅度显着低于Control组中的值(P＜0.001)。与EP组相比，EP+EGCG组的平均fEPSP幅度明显增加(P＜0.05)。 3.海马CA1区超微结构：与Control组海马CAl区突触密度相比，EP组及EP+EGCG组突触密度明显减少(P＜0.001)。而EP+EGCG组突触密度较EP组明显增加(P＜0.001)。与Control组海马CA1区突触后致密物厚度比较，EP组及EP+EGCG组突触后致密物厚度明显变薄(P＜0.001)。而EP+EGCG组突触后致密物厚度较EP组明显增加(P＜0.001)。 4.突触相关蛋白表达：与Control组大鼠相比，EP组大鼠海马中PSD95、SNAP25、Synaptophysin及Synaptotagmin1表达均显著降低(P＜0.01)。而EP+EGCG组PSD95、SNAP25、Synaptophysin及Synaptotagmin1表达较EP组明显升高(P＜0.01)。 第三部分EGCG对氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠神经保护作用及机制研究 目的：研究EGCG与SE后给予干预，
关键词: 颞叶癫痫 ；激活核转录因子 ；4Toll样受体 ；表没食子儿茶素没食子酸酯 ；神经保护
摘要： 研究背景癫痫（epilepsy）是一组由于脑部神经元异常过度放电所引起的突然、短暂、反复发作的中枢神经系统功能失常的临床综合征。全世界约1%的人口受其影响,其中超过三分之一的患者表现为难治性癫痫。反复的癫痫发作可引起认知、行为和心理健康问题,给家庭和社会带来沉重负担[1]。因此,明确癫痫的发病机制及寻求新的治疗靶点具有重要现实意义。近年来大量研究表明细胞内钙离子浓度的变化和钙稳态调节机制的失调在癫痫发生过程中扮演重要角色[2,3]。线粒体是细胞内重要的钙离子贮存库,其调节的钙离子内稳态对细胞和线粒体均具有重要意义。研究表明线粒体钙超载参与了癫痫神经损伤过程,而抑制线粒体钙离子转运可缓解线粒体钙超载,从而发挥神经保护作用[4-6]。近年鉴定的线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter,MCU）在线粒体钙离子摄取中发挥重要作用[7]。近年来,研究发现MCU在心肌和大脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用[8-11],但其在癫痫神经损伤中的作用尚缺乏相关研究。研究目的本研究采用氯化锂-匹鲁卡品（pilocarpine,PILO）致痫大鼠模型,应用MCU激动剂精胺（Spermine）与抑制剂Ru360干预,观察其对癫痫大鼠行为学及癫痫持续状态（status epilepticus,SE）后海马组织神经元凋亡的影响,并进一步检测大鼠海马线粒体钙离子浓度和Bcl-2、Bax、Cyt C及caspase-3等线粒体介导的凋亡相关蛋白,以明确MCU在PILO癫痫大鼠海马神经损伤中的作用及相关机制。研究方法1.大鼠分组及癫痫模型建立将84只雄性SD大鼠随机分为CON（0.9%Nacl）组、PILO（PILO）组、Ru360（Ru360+PILO）组、Spermine（Spermine+PILO）组4组,其中PILO组又分为SE 2h、8h、24h及72h 4个亚组。2.行为学观察采用Racine分级法[12]评估各组SD大鼠的行为学表现,观察记录各组大鼠行为学变化,记录致痫发作潜伏期。3.细胞凋亡检测TUNEL染色检测CON组、PILO组、Ru360组及Spermine组的海马组织CA3区神经元凋亡。4.线粒体Ca2+浓度检测荧光染色法检测CON组、PILO各亚组、Ru360组、Spermine组的海马组织线粒体Ca2+浓度。5.细胞凋亡相关蛋白检测Western Blotting法检测CON组、PILO组、Ru360组及Spermine组凋亡相关蛋白Cyt C、caspase-3、Bax和Bcl-2表达变化。研究结果1.行为学观察CON组大鼠行为无异常,PILO组、Ru360组及Spermine组大鼠均出现不同形式癫痫发作,3组大鼠发作潜伏期无统计学差异（P>0.05）。2.细胞凋亡检测与CON组相比,PILO组凋亡神经元明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）。与PILO组相比,Ru360组凋亡神经元明显减少,而Spermine组明显增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.线粒体Ca2+浓度检测与CON组相比,PILO组海马线粒体Ca2+浓度明显升高,2h达峰值,差异具有统计学意义（P<0.05）。与PILO组相比,Ru360组海马线粒体Ca2+浓度明显减少,而Spermine组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.凋亡相关蛋白的检测与CON组相比,PILO组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少（P<0.05）。与PILO组比较,Ru360组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显减少,而Bcl-2表达水平明显增多（P<0.05）;Spermine组海马Bax表达水平、线粒体Cyt C释放及caspase-3激活明显增多,而Bcl-2表达水平明显减少（P<0.05）。结论1.MCU在PILO致痫大鼠海马神经损伤中发挥重要作用。2.抑制MCU可发挥对海马神经元凋亡的保护作用,其机制可能是通过抑制线粒体钙离子超载,避免线粒体膜通透性增加,从而抑制Cyt C等促凋亡蛋白从线粒体释放,阻断线粒体介导的细胞凋亡途径。
关键词: 癫痫 ；线粒体钙单向转运体 ；线粒体钙离子 ；凋亡
被引量
2
摘要： 背景:颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）是最常见的成人局灶性癫痫,约1/3的TLE系药物难治性癫痫,挖掘新的药物治疗靶标是难治性颞叶癫痫治疗突破的关键。癫痫与免疫的关系近年来备受关注。免疫炎症的激活常加速并促进癫痫发生,而反复的痫性发作又常会导致致痫灶及远隔脑区的系列炎症,并对癫痫的预后产生影响。最新研究提示外周免疫炎症激活大脑中的常驻小胶质细胞可能是TLE发作的驱动因素,但其具体作用机制尚不清楚。因此,进一步深入挖掘癫痫疾病的外周-中枢免疫炎症互作机制,有助于阐明癫痫发生的异常免疫基础,从而为颞叶癫痫免疫炎症治疗提供特异的干预靶点。 目的:从颞叶癫痫患者及颞叶癫痫动物模型两个层面揭示外周免疫细胞CD4+T细胞迁移入脑与中枢小胶质细胞存在相互作用,进而介导癫痫中枢免疫炎症的机制。深入挖掘外周CD4+T细胞趋化迁移和Th1/Th2分型极化的关键基因和可能的调控途径,探索其作为癫痫免疫炎症关键干预靶点的可行性,为耐药性癫痫的精准防治提供新思路。 方法: 1.TLE外周血CD4+T细胞的Th1偏移和颞叶癫痫严重程度的相关性 1.1纳入27名难治性颞叶癫痫患者,收集癫痫患者临床资料,包括临床表现、脑电图及磁共振等。同时招募27名年龄、性别匹配的志愿者作为健康对照组,静脉收集外周血。 1.2构建氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型,慢性自发痫性发作期收集外周血。 1.3免疫指标和血清神经丝蛋白（s NFL）测定:ELISA检测颞叶癫痫患者和动物模型血清细胞因子IL-1β,IL-6和IL-4,流式细胞仪检测CD4+T细胞的Th1（IFN-γ）和Th2（IL-4）亚型。提取PBMC通过q PCR检测血液的PBMC转录因子T-bet、GATA3。检测神经系统疾病的预后生物标志物s NFL,并将T-bet/GATA-3比值和s NFL进行相关性分析。 2.外周血CD4+T细胞迁移入脑调控中枢小胶质细胞炎症 2.1伊文思蓝评估慢性期颞叶癫痫动物模型血脑屏障的完整性,同时检测CD4+T细胞的迁移能力;免疫荧光观察大脑致痫灶海马和远隔皮层脑区CD4+T细胞和小胶质细胞的相对空间位置。 2.2构建慢性期氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型,尾静脉注射CD4+T细胞耗竭抗体,以及回输癫痫大鼠外周血CD4+T细胞后,检测对癫痫大鼠中枢小胶质细胞分型极化和炎症细胞因子分泌的影响。 3.探究介导外周CD4+T细胞迁移入脑激活中枢小胶质细胞炎症反应的信号通路 3.1对TLE患者的海马组织进行m RNA高通量测序,寻找颞叶癫痫患者致痫灶海马和健康对照的差异表达基因,并通过富集分析获得同时调控外周CD4+T极化和免疫细胞趋化入脑的关键基因。 3.2颞叶癫痫动物模型上验证调控该基因和相关信号通路将对颞叶癫痫大鼠外周CD4+T极化、CD4+T细胞趋化入脑和中枢小胶质细胞炎症产生的影响,同时完善癫痫大鼠视频脑电和行为学相关检测。 结果: 1.与健康对照组相比,TLE患者和动物模型血清CD4+T细胞中Th1相关的促炎因子如干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达明显升高;而Th2相关抑炎细胞因子如白细胞介素（IL-4）和（IL-10）则显著降低。 2.与健康对照相比,TLE患者和动物模型血清神经丝轻链（s NFL）显著升高;外周血Th1/Th2 CD4+T细胞比例及T-bet/GATA3比值与s NFL水平显著相关。 3.在TLE大鼠致痫灶（海马）与远隔皮层,外周CD4+T细胞表达明显增加,且伴随有促炎因子INF-γ的表达上调和抑炎因子IL-4的表达下降。 4.与正常对照相比,TLE血脑屏障体外细胞模型中CD4+T细胞迁移率明显增加。在慢性期氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型的脑组织中,致痫灶海马和远隔皮层M1型小胶质细胞表达升高,而M2型小胶质细胞表达下降。 5.当外周CD4+T细胞被阻断耗竭,TLE大鼠海马和远隔皮层M1型小胶质细胞表达下降,而M2型小胶质细胞表达增高,同时伴随促炎因子INF-γ的分泌减少和抑炎因子IL-4的释放增加。 6.静脉回输自TLE大鼠提取的外周血CD4+T细胞后,实验大鼠致痫灶海马和远隔皮层M1型小胶质细胞表达增加,而M2型小胶质细胞表达减少,同时伴随促炎因子INF-γ的分泌增加和抑炎因子IL-4的释放减少。 7.对难治性TLE患者的手术切除海马组织行m RNA高通量测序,生物信息学分析筛选出可能同时参与CD4+T细胞Th1/Th2分化和趋化过程的关键基因通路——Notch 1信号通路。 8.在TLE大鼠模型中,腹腔注射DAPT抑制Notch 1降低了CD4+T细胞的中枢浸润,同时促进了外周和中枢神经系统CD4+T细胞向Th2亚型转化。此外,DAPT干预后中枢M1型小胶质细胞标志物（CD32、CD86）的表达显著下调,而M2型小胶质细胞标志物（CD163、CD200R）的表达则明显增加。 9.DAPT干预Notch 1信号通路显著降低TLE大鼠模型慢性期自发痫性发作次数,且显著提高了大鼠识别新物体和熟悉物体的能力。 结论: 1.颞叶癫痫患者和慢性颞叶癫痫大鼠模型外周血均存在CD4+T细胞的激活,并显著向促炎Th1型转变,且与神经元损害程度相关,提示外周血Th1 CD4+T细胞可能参与并影响颞叶癫痫的病理生理过程和疾病进展。 2.颞叶癫痫大鼠模型致痫灶海马和远隔皮层脑区CD4+T细胞浸润明显增加,且向Th1极化;CD4+T细胞与中枢小胶质细胞在空间位置上毗邻;致痫灶海马和远隔皮层脑区的小胶质细胞活化并向M1极化,推测颞叶癫痫外周CD4+T细胞可趋化入脑,通过调节中枢M1型小胶质细胞促炎反应介导癫痫炎症反应。 3.Notch 1可能是调节外周血CD4+T细胞趋化入脑、介导中枢小胶质细胞炎症的关键基因。γ分泌酶抑制剂DAPT选择性抑制Notch1,可降低外周血CD4+T细胞趋化入脑、减轻小胶质细胞炎症反应和神经元损伤,减少癫痫发作频率并改善记忆等认知功能。 图14幅,表5个,参考文献154篇
关键词: 颞叶癫痫 ；CD4+T细胞 ；小胶质细胞 ；互作 ；免疫炎症
摘要： 目的:我们团队的前期研究发现癫痫患者及大鼠模型中ZAG表达降低,ZAG具有抑制癫痫的作用。胰岛素和过表达ZAG均可抑制癫痫发作和异常放电,既往研究发现ZAG可影响多种组织的胰岛素敏感性,但胰岛素是否调节ZAG的表达目前尚不清楚。癫痫中,氧化应激发挥了重要作用,而胰岛素和ZAG在多种疾病中均与氧化应激损害有关,但癫痫中ZAG是否具有抗氧化应激作用尚不清楚。本研究拟探讨胰岛素对原代培养皮层神经元中ZAG表达的影响及其机制,并探索胰岛素和ZAG在癫痫诱导的氧化应激中的作用。方法:1.提取并培养大鼠原代皮层神经元,用免疫荧光双标技术检测神经元中ZAG的表达;2.用不同浓度（0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM）的胰岛素干预皮层神经元,用MTS法测定不同浓度胰岛素对神经元活性影响,用RT-qPCR、Western blot测定不同浓度胰岛素干预条件下神经元中AZGP1 mRNA和ZAG表达量的变化,并通过AXL1717（IGF-1R拮抗剂）和BMS-754807（IR和IGF-1R拮抗剂）干预进一步探讨其作用机制;3.建立无镁细胞外液培养神经元癫痫模型,运用RT-qPCR、Western blot方法测定癫痫模型中AZGP1 mRNA和ZAG蛋白表达量的变化;4.验证LV的转染效果:将原代皮层神经元分为四个组分别转染慢病毒:过表达空载体组（Vector）、过表达组（LV-AZGP1）、低表达空载体组（LV-RNAi-Vector）、低表达组（LV-RNAi）。运用激光共聚焦显微镜观察、RT-qPCR及Western blot方法检测慢病毒转染效果;5.探索胰岛素及ZAG在癫痫诱导的氧化应激中的作用机制:将培养的神经元随机分为八个组,分别给予不同的处理:空白对照组（Control）、癫痫组（Seizure）、过表达空载体组（Vector）、过表达组（LV-AZGP1）、低表达空载体组（LV-RNAi-Vector）、低表达组（LV-RNAi）、胰岛素组（Insulin）、胰岛素+低表达组（Insulin+LV-RNAi）。激光共聚焦下观察超氧阴离子(O2-)的水平并统计。结果:1.免疫荧光结果显示ZAG在原代皮层神经元中有表达;2.MTS结果显示低于200nM的胰岛素处理对神经元的活性无影响,但500nM的胰岛素降低了神经元的活性（P<0.05）。RT-qPCR和Western blot结果分别显示当浓度≤200nM时,胰岛素会增加神经元中AZGP1mRNA及ZAG水平,在200nM作用最明显。AXL1717或BMS-754807处理均可抑制胰岛素诱导的ZAG升高;3.RT-qPCR和Western blot结果分别显示在无镁癫痫模型中AZGP1mRNA及ZAG水平较对照组明显降低（P<0.01）;4.原代皮层神经元转染慢病毒后,绿色荧光结果显示神经元慢病毒转染成功,RT-qPCR及Western blot结果显示,与相应对照组相比,过表达组AZGP1 mRNA和ZAG在病毒转染72小时后显著增加（P<0.01）,低表达组AZGP1 mRNA和ZAG在病毒转染72小时后显著降低（P<0.01）;5.Seizure组超氧阴离子(O2-)产生增加,过表达AZGP1和胰岛素可减轻O2-的产生,低表达AZGP1可增加O2-的产生。与胰岛素组相比,Insulin+LV-RNAi组O2-的产生明显增加。结论:在原代皮层神经元中,胰岛素主要通过作用于IGF-1R诱导ZAG表达增加。在神经元癫痫模型中,胰岛素发挥抗氧化应激作用可能是通过增高ZAG水平实现的。
关键词: 胰岛素 ；神经元 ；氧化应激 ；癫痫 ；锌-α2-糖蛋白
被引量
2
摘要： 目的:癫痫和偏头痛在临床特征、先兆症状、发病机制、治疗方式等方面均具有相似之处,而且二者容易共病。但是由于缺乏动物模型,目前癫痫和偏头痛的共病研究主要集中在临床方面,本研究拟采用我们此前建立的癫痫易化偏头痛大鼠模型,探讨癫痫/偏头痛共病的病理生理机制。基因机制为癫痫/偏头痛共病的公认机制,而对于数量更多的散发性癫痫/偏头痛共病患者,炎性机制的可能性最大。有研究发现Toll-like receptor 4(TLR4)诱导固有免疫,刺激炎性细胞因子产生,参与偏头痛和癫痫的病理过程。我们前期关于癫痫和偏头痛的单病研究发现,大鼠痫性发作和偏头痛样发作后,均可见GABAARα1表达降低。因此,本研究采用此前建立的癫痫易化偏头痛大鼠模型,以炎性机制作为癫痫/偏头痛共病的切入点,选取颞叶皮层、海马为癫痫感兴趣区,三叉神经节、延髓背角神经元为头痛感兴趣区,探讨GABAARα1-TLR4通路在疾病中的可能作用机制及上下游关系。方法:1.动物模型建立:手术暴露大鼠上矢状窦旁硬脑膜,放置导管,腹腔注射(Intraperitoneal,I.P)氯化锂-匹鲁卡品(Lithium chloride-pilocarpine),建立大鼠癫痫模型;随后,每日从导管给予炎性汤(Inflammatory soup,IS)刺激硬脑膜,建立大鼠偏头痛模型。2.分组:将大鼠随机分为对照组、偏头痛组、癫痫组、癫痫-偏头痛共病组(简称共病组)。3.行为学方法:腹腔注射匹鲁卡品,诱发痫性发作后,观察大鼠痫性发作的潜伏期和最大发作级别;给予炎性汤刺激硬脑膜,诱导偏头痛样发作后,观察大鼠挠头次数,用von-Frey纤维丝测量面部机械痛阈值。4.蛋白免疫印迹法:将各组大鼠的组织匀浆裂解,离心后提取蛋白液,通过BCA法测定浓度,算出上样量,SDS-PAGE电泳后转膜,脱脂牛奶封闭,按目的蛋白分子量大小分别孵育一、二抗,最后扫膜计算灰度值,比较组间差异。5.组织免疫荧光法:将各组大鼠脑组织切片进行抗原修复,免疫组化笔小心沿组织块画圈后,滴入组织自发光淬灭剂,湿盒中封闭后,分别孵育一、二抗,最后封片,荧光显微镜下阅片拍照,计算荧光强度值,比较组间差异。6.免疫共沉淀法:将共病大鼠的延髓背角组织匀浆裂解,提取蛋白液,目的蛋白抗体与相应种属IgG(阴性对照组)与蛋白液按1:50比例加好,孵育后加入protein A/G琼脂糖磁珠,再次孵育后用PBS充分洗涤,离心去除上清液,进行SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,最后扫膜显影,检测GABAARα1和TLR4是否可形成受体异聚复合物。7.药物干预:观察GABAAR激动剂Muscimol和TLR4拮抗剂TAK-242干预后,共病组、共病+Muscimol组和共病+TAK-242组的行为学差异,包括偏头痛行为学(挠头次数和面部机械痛阈值),癫痫行为学(癫痫发作的潜伏期和Racine分级评分)。WB检测颞叶皮层、海马、延髓背角及三叉神经节GABAARα1和TLR4蛋白表达水平,比较组间差异。结果:1.与对照组比较,偏头痛组大鼠挠头次数增加,面部机械痛阈值下降,差异有统计学意义(P<0.01),提示炎性汤模型可致大鼠头面部痛觉敏化。与对照组比较,癫痫组大鼠挠头次数和面部机械痛阈值差异无统计学意义(P>0.05),提示单独痫性发作对大鼠头痛行为无影响。与偏头痛组比较,共病组大鼠挠头次数增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示癫痫-偏头痛共病模型比偏头痛模型痛觉超敏更明显。2.与对照组比较,偏头痛组大鼠头痛感兴趣区三叉神经节小胶质细胞阳性表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示炎性机制参与大鼠偏头痛样发作。与对照组比较,癫痫组大鼠三叉神经节小胶质细胞阳性表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示痫性发作同时也激活了头痛感兴趣区的炎性过程。与偏头痛组和癫痫组比较,共病组大鼠三叉神经节小胶质细胞阳性表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示共病组的炎性反应比单病组更明显。3.采用蛋白免疫印迹法检测TLR4和GABAARα1表达。与对照组比较,在癫痫感兴趣区颞叶皮层和海马,以及头痛感兴趣区延髓背角和三叉神经节中,偏头痛、癫痫组大鼠TLR4表达水平均升高,偏头痛、癫痫组GABAARα1表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与偏头痛和癫痫组比较,共病组大鼠以上区域TLR4表达水平升高,GABAARα1表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示TLR4表达升高,GABAARα1表达降低,在偏头痛/癫痫的单病和共病时均可出现,共病比单病更明显。4.采用组织免疫荧光法检测TLR4和GABAARα1表达与分布。与对照组比较,偏头痛组和癫痫组大鼠颞叶皮层、三叉神经节、延髓背角处TLR4阳性表达升高,GABAARα1阳性表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与偏头痛组和癫痫组比较,大鼠颞叶皮层、三叉神经节、延髓背角处TLR4阳性表达升高,GABAARα1阳性表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示TLR4表达升高,GABAARα1表达降低,在偏头痛/癫痫的单病和共病时均可出现,共病比单病更明显。5.采用免疫共沉淀法,发现GABAARα1和TLR4之间有直接相互作用。6.GABAAR受体激动剂Muscimol预处理后,在癫痫-偏头痛共病的癫痫期,大鼠痫性发作潜伏期延长,发作级别下降,差异有统计学意义(P<0.05),提示激活GABAAR可抑制痫性发作。TLR4受体拮抗剂TAK-242预处理后,在癫痫-偏头痛共病的癫痫期,大鼠痫性发作潜伏期和发作级别没有明显改变,差异无统计学意义(P>0.05),提示抑制TLR4对痫性发作无影响。GABAAR受体激动剂Muscimol和TLR4受体拮抗剂TAK-242分别预处理后,在癫痫-偏头痛共病的共病期,大鼠挠头次数均减少,面部机械痛阈值均升高,差异有统计学意义(P<0.01),提示激活GABAAR/抑制TLR4均可抑制偏头痛样发作。7.采用蛋白免疫印迹法,检测颞叶皮层、海马、延髓背角和三叉神经节处GABAARα1和TLR4表达。GABAAR受体激动剂Muscimol预处理后,共病+Muscimol组大鼠较共病组TLR4的表达水平降低,GABAARα1表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。TLR4受体拮抗剂TAK-242预处理后,共病+TAK-242组大鼠较共病组TLR4的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),但GABAARα1表达水平没有显著改变(P>0.05),提示激活GABAAR可逆转共病所致的GABAARα1减少/TLR4增加,抑制TLR4只能逆转共病所致的TLR4增加,对GABAARα1表达无影响。结论:1.癫痫-偏头痛共病模型并不是两个单独疾病的简单叠加,此模型可模拟癫痫易化头痛发作的病理生理过程。2.炎性机制参与癫痫对头痛的易化作用,癫痫-偏头痛共病可导致GABAARα1表达降低,TLR4表达增加。3.GABAARα1和TLR4之间存在直接相互作用。4.GABAARα1减少引起痫性发作,为癫痫-偏头痛共病的始动因素,可导致TLR4表达增加,易化偏头痛样发作。
关键词: 癫痫 ；偏头痛 ；共病 ；TLR4 ；GABAARα1
摘要： 目的: 癫痫患者常常伴有认知功能减退。频繁的痫性发作和神经发生损害是导致癫痫患者认知功能障碍的重要原因,但具体发病机制仍不清楚。由于成体海马神经发生在学习和记忆中起着至关重要的作用,异常神经发生可能成为治疗癫痫相关认知功能障碍靶点。通过清除癫痫发作诱导的异常新生颗粒细胞或者移植神经干细胞（neural stem cells,NSCs）和间充质干细胞源性外囊泡,修复或者重建癫痫动物模型大脑中的神经回路并促进正常的神经发生为治疗癫痫相关认知功能障碍带来了曙光。然而,既往的研究尚未阐明癫痫患者大脑中的病理改变如何导致成体神经发生失调和认知功能减退。探究癫痫发生过程中影响神经发生的分子机制,对于有效地从内源性或者外源性NSCs的角度调控神经发生是至关重要。研究显示,脂肪细胞衍生的瘦素（leptin,Lep）参与突触可塑性和神经发生过程的调控过程。大脑内leptin的相对缺乏会导致神经内分泌功能障碍和肥胖。抑制leptin的活性或减少leptin的表达均可导致阿尔茨海默病和抑郁症模型动物海马中神经发生减少。癫痫相关的大脑内病理改变与leptin信号也存在内在联系。研究者发现,匹罗卡品（pilocarpine,Pilo）诱导的癫痫大鼠在慢性期体重明显增加并出现肥胖,海马组织中代谢相关基因的表达水平也发生改变。Leptin干预能够降低未成熟脑癫痫发作易感性。我们课题组及其他研究小组的前期研究结果均显示颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）患者血清中的leptin水平较健康人增加,部分存在leptin抵抗。此外,在临床工作中,我们也观察到难治性癫痫（drug-resistant epilepsy,DRE）患者肥胖比例相对较高。但是,leptin及leptin信号分子在癫痫患者脑内表达水平的改变以及对神经发生的具体影响尚不明确。基于leptin在癫痫和神经发生过程具有重要作用的研究证据,我们推测癫痫发作可能导致leptin信号转导损害,扰乱海马中NSCs的微环境,进而导致神经发生异常和认知功能障碍。因此,在本研究中,我们首先通过临床研究探讨肥胖与癫痫的相关性,然后通过构建癫痫动物模型探讨leptin在神经发生和认知功能中的作用及分子机制,旨在寻找潜在的干预靶点。 材料和方法: 本研究收集2015年1月至2020年3月在四川大学华西医院神经内科就诊的癫痫患者。通过卡方检验和方差分析方法分析超重和肥胖的癫痫患者在人口学特征,临床特征和病理学改变等之间的差异。通过多因素Logistic回归调整混杂因素分析癫痫患者肥胖的相关因素。 研究选取6-7周健康雄性SD大鼠137只,随机分为Sham组和Pilo组。采用氯化锂-匹罗卡品诱导构建大鼠癫痫模型。在大鼠诱导癫痫持续状态（status epilepticus,SE）后的第一天,将造模成功的大鼠随机分为安慰剂组（Pilo+Veh）和腹腔注射leptin（1 mg/kg/d）干预组（Pilo+Lep）至SE后第7天。在SE后第三天,随机对三组中其中一半的动物按照每日2次进行Brd U（50 mg/kg）腹腔注射至SE后第7天,用于标记NSCs。 监测大鼠体重并分别收集SE后3天,7天,14天,35天及50天大鼠海马组织和血清样本。实验过程中:（1）采用ELISA方法检测大鼠血清中的leptin浓度;（2）采用Western blot和免疫组织化学染色分析癫痫发生过程中海马中的leptin信号分子的表达水平及分布的差异;（3）采用水迷宫实验和Western blot评估大鼠的空间记忆能力;（4）采用q PCR检测海马神经发生相关标志物的转录水平;（5）采用Brd U免疫荧光染色分析NSCs的增殖和迁移情况;（6）通过检测大鼠海马中成熟神经元标记物（Neu N）,神经胶质细胞标记物（GFAP/S100β）,未成熟神经元标记物（DCX）和Brd U免疫共标记的细胞数目分析大鼠海马中NSCs分化的细胞谱系的改变;（7）采用尼氏染色评估神经元细胞存活情况;（8）采用免疫组织化学染色检测Reelin+中间神经元数目评估颗粒细胞的异位迁移。 此外,我们在SE后35天提取了Sham组,Pilo+Veh组和Pilo+Lep组的大鼠海马组织中的RNA进行RNA-Seq分析,探究leptin干预对癫痫大鼠神经发生和认知功能调控在转录水平的影响。最后,通过q PCR,Western blot方法及脂质氧化物水平的测定对相关机制进行验证。 结果: 癫痫患者超重和肥胖的特点:研究中共纳入1617名癫痫患者。我们发现未经治疗新诊断癫痫,接受丙戊酸治疗,多药联合治疗和难治性癫痫（drug-resistant epilepsy,DRE）患者超重和肥胖的综合比例相对较高。多因素Logistic回归分析提示DRE与癫痫患者肥胖具有相关性。 癫痫发作诱导海马神经发生异常和认知功能障碍:（1）Brd U荧光染色结果显示:与Sham组比较,在SE后7天和14天海马DG区中的Brd U阳性细胞数增加,但在SE后35天Brd U阳性细胞数较前期明显下降。SE后14天,Pilo组的大鼠海马中较多的新生颗粒细胞迁移至DH区,CA1区和CA3区。（2）Brd U/Neu N和Brd U/GFAP荧光染色双标的结果显示:在Pilo组内,Brd U+Neu N+细胞数以及Brd U+Neu N+占Brd U+细胞百分比从SE后7天开始出现持续性下降（P<0.0001）。然而,相对于Sham组,Brd U+GFAP+的数量占Brd U+细胞数比例在SE后14天短暂减少后（P=0.0783）,在SE后35天Brd U+GFAP+细胞所占比例显著增加（P=0.0004）。（3）水迷宫实验结果提示Pilo组大鼠的空间记忆能力减退,但无明显的运动功能差异。 癫痫发作导致海马中leptin信号转导受损:（1）大鼠海马组织的Western blot结果分析结果显示:Leptin仅在SE后7天表达水平较Sham组增加（P=0.0030）,我们也未发现Lep R在各组大鼠海马中的表达水平具有差异性。然而,Pilo组大鼠海马中的p-Lep R（活化的Lep R）表达水平随着时间增加而降低,在SE后14天（P=0.0028）,35天（P=0.0004）和50天（P<0.0001）均显著低于Sham组。进一步检测leptin信号通路下游p-Stat3,p-Akt的表达水平（作为Lep R活性附加指标）:相对于Sham组,p-Stat3在SE后3天（P=0.0233）和SE后7天（P<0.0001）表达水平增加,在SE后14天和35天表达减少。p-Akt的表达水平在SE后14天,35天和50天均减少。Pilo组内比较分析发现,海马中的p-Stat3和p-Akt的相对表达水平在SE后14天开始随着时间增加而逐渐降低。（2）p-Lep R免疫组织化学染色结果显示:在SE后35天,Pilo组和Sham组中的大鼠海马CA1,CA3和DG区的神经细胞中均有p-Lep R免疫反应阳性,提示海马区存在Lep R的表达。与Sham组比较,Pilo组大鼠海马DG区和CA1区中的p-Lep R免疫阳性的神经细胞数量较少。 Leptin影响癫痫大鼠海马神经发生和认知功能:（1）大鼠体重监测和血清leptin浓度检测结果显示:与Sham组相比,Pilo+Veh组大鼠在SE后1天至9天内体重下降明显。Pilo+Lep组与Pilo+Veh组的大鼠体重相比,在SE后19天至27天体重偏低。尽管在SE后28天至35天,Pilo+Veh组大鼠的体重有增加趋势,但三组之间无统计学差异。在ELISA实验中,我们发现在SE后35天,Pilo+Veh组和Pilo+Lep组大鼠血清中的leptin浓度较Sham组增加,但未发现Pilo+Veh组和Pilo+Lep组间具有差异性。（2）Brd U荧光染色结果显示:在SE后7天,Pilo+Lep组与Pilo+Veh组比较,大鼠海马DG区的Brd U阳性细胞数量无差异。在SE后35天,与Pilo+Veh组比较,发现Pilo+Lep组大鼠海马中的Brd U标记的细胞数明显增加（P=0.0051）。（3）q PCR实验分析海马神经发生相关基因的表达水平,结果显示:相对于Pilo+Veh组,leptin能够增加癫痫大鼠海马组织中Neu N基因的表达水平,降低GFAP基因的表达水平,但未发现Nestin基因在组间的表达水平的差异性。（4）在SE后35天,Brd U/Neu N,Brd U/DCX,Brd U/GFAP和Brd U/GFAP/S100β荧光染色共标的结果显示:Pilo+Veh组中的Brd U+Neu N+细胞数（P=0.0055）,Brd U+DCX+细胞数（P=0.0008）和Brd U+Neu N+细胞数占Brd U+细胞数的比例（P=0.0131）均低于Pilo+Lep组。然而,Pilo+Veh组中的Brd U+GFAP+细胞数目和Brd U+GFAP+细胞数占Brd U+细胞数的比例却显著增加,与Brd U+GFAP+S100β+细胞数及所占Brd U+细胞数比例的分析结果一致。（5）尼氏染色结果显示:相对于Sham组,Pilo+Veh组大鼠海马区的部分椎体神经元核溶解,其中CA1和CA3区神经元显著丢失。Leptin干预后在一定程度上修复了癫痫大鼠的海马结构,CA3区的神经椎体细胞变性丢失数量减少（P=0.0471）。（6）Reelin免疫组织化学染色结果显示:与Pilo+Veh组比较,Sham组（P=0.0287）和Pilo+Lep组（P=0.0101）的大鼠海马DH区中Reelin+中间神经元数目增加,提示leptin减少了新生颗粒细胞的异常迁移。（7）水迷宫实验和Western blot结果显示:Leptin能够改善癫痫模型大鼠的空间记忆能力并降低p-Tau的表达水平。 Leptin调控能量代谢和减轻氧化应激:（1）海马组织的RNA-Seq分析结果显示:Sham和Pilo+Veh组比较发现有735个表达具有差异的基因。差异基因中表达上调的有601个,表达下调的基因有134个。GO功能富集分析结果显示,癫痫发作诱导神经细胞凋亡,神经胶质细胞激活,活性氧的代谢和Akt信号转导相关通路的基因表达上调。Pilo+Veh和Pilo+Lep组比较,有1348个表达具有差异的基因。差异表达基因中表达上调的有494个,表达下调的有854个。KEGG信号通路分析和GSEA富集分析均显示leptin干预后能量代谢过程,突触可塑性相关蛋白质合成和神经发生通路相关基因的表达发生改变。（2）基因功能富集分析揭示了代谢相关基因的显著改变,基于前期结果,我们分析了RNA-Seq数据中能量代谢过程包括糖异生,糖酵解,TCA循环和脂肪酸代谢相关基因的具体表达变化。癫痫发作导致大鼠海马中脂肪酸代谢,TCA循环和糖异生代谢过程失调。然而,参与糖酵解过程关键酶的编码基因的表达上调包括:HK2,Aldh2,Aldh3,Pfkfb3,Hif1α,Eno1,Pgk1和Pgm1。Leptin干预后参与糖酵解过程相关基因表达相对下调,脂肪酸代谢过程尤其是脂肪酸β氧化过程相关基因表达上调包括:Acaca,Acacb,pparα,Fasn,Acsl1,Hadhα,SLC27a,SLC22a,Cpt1α和Cpt1b。TCA循环过程的相关分子:Ogdh1,Gls2,Aco2,Aco1,Mdh1和Pdha1在Pilo+Lep组的表达也相对上调。但我们未发现leptin影响糖异生代谢过程。（3）我们进一步分析了与能量代谢密切的线粒体功能相关指标。q PCR分析结果显示,线粒体生物发生的标志物PGC-1α和Tfam在转录水平无明显改变。检测调控线粒体融合Mfn1和Mfn2以及线粒体分裂的分子Fis1和Drp2在转录水平的表达水平,发现Mfn1的表达水平在leptin干预后显著增加（P=0.0048）。在蛋白水平上,Mfn1分子在Pilo+Lep组的表达也上调（P=0.0450）。（4）我们测定了反映氧化应激程度的脂质氧化物水平。
关键词: 癫痫 ；共患病 ；认知功能 ；神经发生 ；瘦素
摘要： 癫痫是以脑神经元反复异常放电导致的发作性脑功能障碍为特征的神经系统疾病。癫痫发作可导致脑神经元的坏死或凋亡,继发中枢神经胶质细胞增生,导致异常兴奋性神经网络建立,造成反复痫性发作或癫痫持续状态。约有30%癫痫患者可伴有认知功能损伤。近年来癫痫中的认知功能障碍已成为研究的热点。癫痫的病因学及发病机制复杂,目前仍未阐明,可能的发病机制包括:氧化应激反应、中枢胶质细胞增生、离子通道异常等多种机制。在众多发病机制中,氧化应激反应诱导的瀑布式自由基产生及损伤作用被认为是癫痫发病中损伤脑神经元的重要病理基础。通过自由基连锁式反应使细胞膜脂质及细胞核蛋白过度氧化,并损伤线粒体结构和功能,导致细胞能量产生不足从而导致细胞死亡或凋亡。因此,抗氧化应激反应和清除过量自由基可能是抗癫痫治疗的重要策略。依达拉奉(Edaravone,EDA),作为自由基清除剂,具有抗氧化应激,抑制脂质过氧化反应等作用。研究证实,依达拉奉可以通过抑制环氧化酶(Cyclooxygenase,Cyclooxygenase-1,COX-1 and Cyclooxygenase-2,COX-2)的活性而发挥对机体组织的保护作用。COX-2主要在海马组织和皮质神经元中表达并可以介导神经元的损伤。COX-2是前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)代谢产生的关键酶和限速酶,同时又能促进一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生,而前列腺素E2、一氧化氮能够参与炎症、氧化应激、凋亡等多种病理过程。因此,具有抗氧化作用的依达拉奉可能成为治疗癫痫的新型药物。本研究通过腹腔注射戊四氮(pentylenetetrazoloe,PTZ)建立慢性点燃大鼠癫痫模型,给予不同剂量依达拉奉进行干预,观察不同剂量依达拉奉对癫痫大鼠的痫性发作等级、全面性强直-阵挛发作潜伏期和极小阵挛性发作潜伏期、认知功能及海马组织中氧化应激参数和神经元的影响,并检测海马组织中COX-2的m RNA及蛋白表达水平,探讨依达拉奉对戊四氮致痫大鼠是否具有脑保护作用及其可能的机制,为抗癫痫药物的选择提供新的思路和实验依据。本研究共分为三部分,各部分内容分述如下。第一部分依达拉奉对戊四氮致痫大鼠痫性发作和认知功能的作用目的:建立戊四氮慢性点燃雄性白化型大鼠癫痫模型,观察癫痫大鼠的痫性发作等级、全面性强直-阵挛发作潜伏期(Generalized tonic clonic seizure latency,GTCS)、极小阵挛性发作潜伏期(Minimal latency of clonic seizures,MCS)和大鼠认知功能变化,以及依达拉奉对癫痫大鼠的干预作用。方法:取8-12周清洁级健康雄性白化型Wistar大鼠(200-220 g)60只,随机分为四组:Sham组、Control组、PTZ+Edaravone 5 mg/kg组和PTZ+Edaravone 10 mg/kg组,每组15只。PTZ于每次给药前溶于生理盐水新鲜配制,Edaravone、PTZ均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。Sham组隔日腹腔注射0.9%Na Cl(10 ml/kg),共15次。Control组隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg),共15次,每日腹腔注射0.9%Na Cl(10 ml/kg),生理盐水注射30 min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone5 mg/kg组:隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg),共15次,每日腹腔注射5 mg/kg Edaravone,Edaravone注射30 min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone 10 mg/kg组:隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg),共15次,每日腹腔注射10 mg/kg Edaravone,Edaravone注射30 min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。每次PTZ给药后,观察大鼠的行为变化。参照Racine(1972)行为学分级法对大鼠癫痫发作进行分级。最后一次PTZ给药24 h后,行Morris水迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力。结果:1连续腹腔注射PTZ后,大鼠出现痫性发作,从最初的凝视、点头、洗脸样动作起,痫性发作等级逐渐升高,并最终出现全身强直-阵挛样大发作。与Control组比较,PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预均能够有效降低戊四氮点燃癫痫大鼠的痫性发作等级(P<0.05),依达拉奉(5 mg/kg、10 mg/kg)组间在降低大鼠痫性发作方面对比无明显差异(P>0.05)。Sham组大鼠未出现痫性发作。并且与Control组大鼠比较,依达拉奉(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后均能够显著延长癫痫大鼠的全面性强直-阵挛发作潜伏期(GTCS)和极小阵挛性发作潜伏期(MCS)(P<0.05),且高剂量依达拉奉药物干预组较低剂量组在延长潜伏期方面效果更为明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 Morris水迷宫检测结果2.1定位航行实验结果:对每日逃避潜伏期的平均值进行比较,结果显示,(1)Sham组、Control组、PTZ+Edaravone 5 mg/kg组、PTZ+Edaravone10 mg/kg组大鼠的逃避潜伏期在第1、2天无统计学意义(P>0.05)。(2)实验第3、4、5天,与Sham组大鼠比较,Control组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05);PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后大鼠的逃避潜伏期较Control组大鼠均明显缩短(P<0.05);PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)大鼠的逃避潜伏期和Sham组大鼠对比没有明显差异性变化(P>0.05)。PTZ+Edaravone(5 mg/kg、10 mg/kg)组之间潜伏期对比,差异无明显统计学意义(P>0.05)。2.2空间探索实验结果:Control组大鼠120 s内穿越平台区域的次数明显低于Sham组(P<0.05);PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)大鼠120 s内穿越平台区域的次数与Control组比较均明显增多(P<0.05)。PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)大鼠穿越平台区域的次数和Sham组比较均没有明显差异性变化(P>0.05)。PTZ+Edaravone(5 mg/kg、10mg/kg)组之间比较,差异无明显统计学意义(P>0.05)。结论:连续给予戊四氮腹腔注射能够成功建立慢性点燃大鼠癫痫模型,依达拉奉干预能明显降低癫痫大鼠痫性发作等级、延长全面性强直-阵挛发作潜伏期和极小阵挛性发作潜伏期,延缓了戊四氮点燃大鼠癫痫进程,表明依达拉奉具有抗癫痫的作用。依达拉奉干预后癫痫大鼠在Morris水迷宫实验中的空间学习记忆能力与癫痫组大鼠对比有明显增强,表明依达拉奉对戊四氮点燃大鼠模型的认知功能损伤有显著的改善作用。第二部分依达拉奉对戊四氮致痫大鼠脑组织氧化应激状态的作用目的:观察戊四氮点燃癫痫大鼠的脑组织氧化应激反应及依达拉奉对癫痫大鼠海马组织抗氧化防御能力的保护作用。方法:取8-12周清洁级健康雄性白化型Wistar大鼠(200-220 g)60只,随机分为四组:Sham组、Control组、PTZ+Edaravone 5 mg/kg组和PTZ+Edaravone 10 mg/kg组,每组15只。PTZ于每次给药前分别溶于生理盐水新鲜配制,Edaravone、PTZ均在08:00-10:00之间给予腹腔注射。Sham组隔日腹腔注射0.9%Na Cl(10 ml/kg),共15次。Control组隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg),共15次,每日腹腔注射0.9%Na Cl(10 ml/kg),生理盐水注射30 min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone 5 mg/kg组:隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg),共15次,每日腹腔注射5 mg/kg Edaravone,Edaravone注射30 min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。PTZ+Edaravone 10 mg/kg组:隔日腹腔注射PTZ(90 mg/kg),共15次,每日腹腔注射10 mg/kg Edaravone,Edaravone注射30 min后再给予PTZ(90 mg/kg)腹腔注射。最后一次PTZ给药24 h后,各组大鼠尾静脉抽血检测NO水平;取大鼠海马组织根据试剂盒说明书检测:丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,Gpx)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、硫醇(Thiol content)含量的改变;应用流式细胞仪检测大鼠海马组织细胞内检测海马组织细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、和线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)的水平。结果:1.氧化应激参数与Sham组相比,Control组、PTZ+Edaravone 5 mg/kg组大鼠海马组织中抗氧化应激参数GSH、SOD、CAT、Gpx、Thiol content含量降低(P<0.05),氧化应激参数MDA含量升高(P<0.05)。与Control组对比,PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后大鼠海马组织中抗氧化参数GSH、SOD、CAT、Gpx、Thiol content含量均明显升高(P<0.05),氧化应激参数MDA水平均明显降低(P<0.05)。PTZ+Edaravone 10 mg/kg组与PTZ+Edaravone 5 mg/kg组对比,各项氧化应激参数含量存在差异(P<0.05),而与Sham组在各项氧化应激参数含量方面对比差异无明显统计学意义(P>0.05)。2.海马组织细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△Ψm)水平与Sham组相比,Control组、PTZ+Edaravone 5 mg/kg组、PTZ+Edaravone 10 mg/kg组海马组织细胞中ROS的水平升高(P<0.05),△Ψm水平显著下降(P<0.05);与Control组相比,PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)治疗后癫痫大鼠海马组织细胞中ROS水平均显著下降(P<0.05),△Ψm水平均明显升高(P<0.05)。PTZ+Edaravone 10mg/kg组与PTZ+Edaravone 5 mg/kg组相比大鼠海马组织细胞中ROS水平和△Ψm水平,差异均无统计学意义(P>0.05)3.NO含量检测与Sham组相比,Control组、PTZ+Edaravone 5 mg/kg组、PTZ+Edaravone 10 mg/kg组大鼠血清NO水平升高(P<0.05)。与Control组对比,PTZ+Edaravone组(5 mg/kg、10 mg/kg)药物干预后癫痫大鼠血清NO水平均明显下降(P<0.05)。PTZ+Edaravone组(5mg/kg、10mg/kg)之间NO含量对比,差异无明显统计学意义(P>0.05)。结论:戊四氮点燃大鼠海马组织内发生明显氧化应激反应,抗氧化能力受损,依达拉奉能够有效减轻癫痫大鼠脑内氧化应激损伤,保护癫痫大鼠海马组织细胞的抗氧化防御能力及海马神经元线粒体的功能。第三部分依达拉奉对戊四氮致痫大鼠海马组织神经元的保护作用目的:观察不同剂量依达拉奉对癫痫大鼠海马组织Nissl染色结果及海马组织细胞的凋亡率、前列腺素E2水平、COX-2的m RNA及蛋白表达水平的影响,探讨依达拉奉对戊四氮致痫大鼠海马神经元的保护作用及可能的机制。方法:取8-12周清洁级健康雄性白化型Wistar大鼠(200-220 g)60只,
关键词: 癫痫 ；戊四氮 ；认知障碍 ；依达拉奉 ；环氧化酶Ⅱ ；前列腺素E2
摘要： 背景: 癫痫是全球最常见的中枢神经系统疾病之一,影响超过7000万患者,造成显著的疾病负担。细胞焦亡是一种新型炎性程序性细胞死亡,近年研究表明,其在癫痫的病理生理机制中发挥重要作用,但具体机制尚未完全阐明。二甲双胍(Metformin,Met)是一种经典抗糖尿病药物,已被证实可通过多靶点机制发挥抗癫痫及神经保护作用。然而,尚不清楚其在癫痫模型中是否通过调控细胞焦亡来实现神经保护作用。本研究基于海人酸(Kainic acid,KA)杏仁核点燃癫痫大鼠模型,聚焦大鼠海马组织中焦亡相关蛋白的表达水平及细胞分布,并探讨二甲双胍通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制焦亡的神经保护作用及机制,旨在为靶向细胞焦亡的癫痫治疗策略以及二甲双胍在癫痫领域的潜在应用提供新理论依据。 目的: 验证GSDMD介导的神经细胞焦亡参与颞叶癫痫大鼠的病理生理过程,明确焦亡执行分子GSDMD及其活性片段GSDMD-N在癫痫大鼠海马组织中的表达水平及细胞分布,并探究二甲双胍通过抑制神经细胞焦亡所发挥的神经保护作用及机制。 方法: 选用210±30g的雄性Wistar大鼠,采用KA杏仁核点燃模型进行实验。第一部分实验分为健康组、假手术组、癫痫发作后1d、3d、7d、14d、21d组。应用Western blot检测焦亡执行分子GSDMD、GSDMD-N的表达水平及变化趋势。选取焦亡水平最高的时间点,应用免疫荧光染色检测GSDMD的表达与分布,并通过透射电镜观察大鼠海马组织的超微结构。第二部分实验分为Sham组、KA组、KA+Met组和KA+Met+CC(AMPK特异性抑制剂Compound C)组。在Met给药期间监测大鼠的血糖及体重。使用Nissl染色评估各组大鼠海马神经元的损失情况,评价Met的神经保护作用。通过Western blot检测各组大鼠海马组织内AMPK、p-AMPK及焦亡相关蛋白的表达水平差异,并利用免疫荧光及免疫组化染色检测GSDMD的表达,以验证Met通过激活AMPK通路抑制GSDMD介导的细胞焦亡,从而发挥神经保护作用。 结果: (1)Western blot结果显示,与Sham组相比,癫痫发作后1天,GSDMD及GSDMD-N的表达水平显著增高,且在第7天达到峰值,随后开始下降; (2)免疫荧光染色结果显示,在癫痫发作后7天,GSDMD与神经元标志物Neu N及小胶质细胞标志物Iba-1共定位,而未观察到其与星形胶质细胞标志物GFAP的共定位; (3)透射电镜图像显示,在癫痫发作后7天,Sham组大鼠海马神经元及小胶质细胞表现出完整的细胞膜结构,而癫痫组则表现出不连续的膜结构,伴有细胞和线粒体肿胀,及其他细胞器和核糖体的丧失; (4)给药期间对大鼠体重及血糖监测结果显示,与Saline组相比,Met组的体重及空腹血糖水平无统计学差异,且空腹血糖水平均在正常范围内; (5)Nissl染色结果显示,在癫痫发作后7天,与Sham组相比,KA组大鼠海马CA3区和CA1区的神经元数量明显减少且排列紊乱。KA+Met组的神经元损伤程度轻于KA组,而在Met给药基础上给予AMPK特异性抑制剂Compound C干预则部分逆转了Met的神经保护作用。各组DG区的神经元形态结构正常、排列规整,尼氏小体完整且数量无明显差异; (6)Western blot结果显示,在癫痫发作后7天,与Sham组相比,KA组大鼠海马组织p-AMPK/AMPK比值显著降低,NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD、GSDMD-N及IL-1β的表达水平均显著增加;KA+Met组与KA组相比显著提高了海马组织内p-AMPK/AMPK比值,同时显著下调了焦亡相关蛋白的异常高表达,且Met的作用可被Compound C部分逆转; (7)免疫荧光染色结果显示,在癫痫发作后7天,与Sham组相比,KA组大鼠海马组织CA3及CA1区GSDMD的表达量显著升高;与KA组相比,Met的干预下调了GSDMD的表达量,且Met的作用可被Compound C部分逆转; (8)免疫组织化学染色结果显示,在癫痫发作后7天,与Sham组相比,KA组大鼠海马组织内GSDMD蛋白的表达量显著升高;与KA组相比,Met的干预下调了癫痫大鼠海马组织中GSDMD的表达量,且Met的作用可被Compound C部分逆转。 结论: (1)海马组织中焦亡执行蛋白GSDMD及其活性片段GSDMD-N的表达水平在癫痫发作后第7天达到峰值,且主要在神经元及小胶质细胞中表达,证明GSDMD介导的经典细胞焦亡途径参与颞叶癫痫大鼠的病理生理过程。 (2)二甲双胍可能通过激活AMPK抑制GSDMD介导的神经细胞焦亡,从而发挥保护癫痫大鼠海马神经元的作用。
关键词: 癫痫 ；细胞焦亡 ；二甲双胍 ；AMPK ；神经保护
摘要： 癫痫是一种由脑神经元异常同步化放电所致的慢性脑部疾病,以慢性反复自发性发作为特征,是最常见的神经系统疾病之一,全球发病率约为6.38‰-7.60‰,其中约30%的患者尽管应用了合理的药物治疗,其发作仍得不到有效缓解,被称为难治性癫痫。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是最常见的难治性癫痫类型,以反复性自发性癫痫发作(spontaneous recurrent seizures,SRSs)为特征,并多伴有学习记忆能力下降、注意力缺陷、多动、焦虑、执行障碍等认知、精神共患病,严重影响患者的生活质量。因此深入研究癫痫的病理机制,探索既能抑制癫痫发作同时又能改善癫痫相关的认知障碍的新型治疗策略具有重要的临床意义。TLE合并认知障碍的机制尚不明确,但海马神经元丢失与突触可塑性受损是两个已经证实的因素。TLE一方面通过损伤突触可塑性,影响海马神经环路中突触间的传递效率而损害认知功能;另一方面通过海马神经元丢失、苔藓纤维出芽等病理损害引发突触重组,导致异常的海马神经环路形成,进而影响认知功能。此外,海马神经元丢失还可提高神经网络的兴奋性,促进癫痫发生。细胞凋亡是生物体内最常见的一种程序性细胞死亡方式,也是癫痫导致神经元死亡的重要机制,可分别通过线粒体通路、内质网通路以及死亡受体通路被激活,其中线粒体通路与内质网通路均属于内源性凋亡途径,两者存在明显的交联关系,共同参与TLE的癫痫发生及神经元凋亡。因此,改善海马突触可塑性,抑制线粒体及内质网通路介导的海马神经元凋亡对于癫痫及其认知共患病的治疗具有十分重要的意义。生酮饮食(ketogenic diet,KD)是一种高脂肪、低碳水化合物、适量蛋白质的特殊饮食,常被用于难治性癫痫的治疗中。研究显示KD可有效控制癫痫发作次数,降低癫痫的致死率;此外,还具有一定的改善认知与情绪的作用。目前已知KD的作用机制可能涉及调节神经递质、抑制氧化应激、调节炎症介质、维持能量代谢等,但KD对突触可塑性及细胞凋亡的影响尚不明确。氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫模型具备人类TLE的癫痫发生及海马损伤等主要特点,是目前公认的研究TLE的动物模型。本实验在该模型上评价了KD对癫痫发生及癫痫相关认知损害的治疗作用,并对其可能的作用机制进行深入的探讨,以期寻找到TLE及其认知共患病的新的治疗靶点。第一部分氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型的建立及生酮饮食对癫痫发生的影响目的:建立氯化锂-匹罗卡品(pilocarpine,Pilo)诱导的TLE大鼠模型,通过观察行为学及脑电监测分析KD对SRSs及发作间期癫痫样放电(interictal epileptiform discharges,IEDs)的影响,以明确KD对癫痫发生的作用。方法:将40只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成4组:正常对照组(Control组,n=8),匹罗卡品组(Pilo组,n=12),匹罗卡品+生酮饮食组(Pilo+KD组,n=12),生酮饮食组(KD组,n=8)。对Pilo组及Pilo+KD组大鼠先后腹腔注射氯化锂及匹罗卡品,以诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE),Control组及KD组腹腔注射生理盐水。SE后3天,给予Pilo+KD组及KD组大鼠KD治疗,给予Control组及Pilo组大鼠正常饮食。各组大鼠连续喂养28天后均恢复正常饮食。使用血酮仪分别在饮食干预前及干预后第7天、14天、21天、28天检测尾静脉血中的β-羟丁酸的浓度,以观察生酮饮食是否生效。在SE后第8天,使用高清摄像头连续监测大鼠行为学改变,并记录各组大鼠SRSs发生率、潜伏期、发作频率。在SE后第38天,监测各组大鼠皮层及海马脑电图的变化,并统计各组大鼠每次SRSs持续的时间及棘波放电的频率。结果:1.Pilo组1只大鼠未达到SE标准,11只大鼠成功诱发SE,但其中有3只大鼠在SE后死亡;Pilo+KD组全部成功诱发SE,4只大鼠在SE后死亡,模型成功率为67%。Control组及KD组大鼠均无抽搐发作,最终每组有8只大鼠可纳入实验。在进行饮食干预后,正常饮食组大鼠(Control组及Pilo组)的血β-羟丁酸浓度保持在较低的水平;而接受生酮饮食的大鼠(Pilo+KD组及KD组)在饮食干预后的前2周血β-羟丁酸浓度迅速升高,并稳定在一个较高的水平,证明生酮有效。2.视频系统监测大鼠行为学改变:Pilo组及Pilo+KD组中每只大鼠都出现了SRSs发作,发生率均达100%;Control组及KD组均无SRSs发作。Pilo+KD组SRSs潜伏期明显长于Pilo组(20.63±2.18天vs14.38±1.10天,P<0.05)。此外,Pilo+KD组大鼠SRSs的发作频率也显著低于Pilo组(1.13±0.21次/天vs1.91±0.28次/天,P<0.05)。3.脑电图观察IEDs:Control组及KD组大鼠脑电图基本正常,以α或β节律为主,频率为6-18Hz,波幅在10～60u V,节律规则,未出现慢波、尖波、棘波、棘慢波等异常波。而Pilo组及Pilo+KD组大鼠则可监测到分散的尖波、棘波、棘慢波等癫痫波,并且Pilo+KD组大鼠皮层及海马棘波放电的频率明显低于Pilo组。4.脑电图观察SRSs:Pilo+KD组SRSs癫痫波的频率及波幅均明显低于Pilo组,发作后抑制期也短于Pilo组。然而,Pilo+KD组SRSs的平均持续时间虽也短于Pilo组(41.54±1.32s vs 46.38±1.65s),但差异并不明显(P>0.05)。结论:KD并不能抑制癫痫大鼠SRSs的出现,但可明显延长SRSs的潜伏期,降低SRSs的发作频率,并通过降低癫痫波的波幅及频率减弱SRSs发作时的电活动强度,而对SRSs放电持续时间的影响并不明显。此外,KD干预还可明显降低癫痫大鼠发作间期皮层及海马IEDs的频率。由此说明,KD可在一定程度上抑制TLE大鼠的癫痫发生。第二部分生酮饮食对颞叶癫痫大鼠认知功能的保护作用目的:观察KD对TLE大鼠认知功能及突触可塑性的影响。方法:在成功建立SE模型后,癫痫组(Pilo组)及癫痫+生酮饮食组(Pilo+KD组)每组有13只大鼠可纳入实验中,另设有正常对照组(Control组,n=14)及生酮饮食组(KD组,n=14),总共4组。饮食干预方法同第一部分。在SE后第52天,每组随机选取8只大鼠进行水迷宫测试。完成行为学实验后通过在体长时程增强(long-term protentiation,LTP)记录海马场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,f EPSP),以评价突触的功能可塑性。其后将大鼠处死,通过透射电镜观察海马CA1区突触超微结构;高尔基染色分析海马树突棘的密度,以评价突触的结构可塑性。最后通过Western blot检测海马突触相关蛋白的表达。结果:1.水迷宫检测:在定位航行实验的第2-5天,Pilo组大鼠的逃避潜伏均明显长于Control组;在第4-5天,Pilo+KD组的逃避潜伏期较Pilo组明显缩短;Control组与KD组的逃避潜伏期始终没有明显差异。在空间探索实验中,与Control组相比,Pilo组大鼠在目标象限的停留时间明显缩短,穿越平台的次数也显著减少。而与Pilo组相比,Pilo+KD组大鼠在目标象限的停留时间明显延长,穿越平台的次数也显著增加。Control组与KD组,在目标象限停留的时间及穿越平台的次数上均无明显差异。在可视平台实验中,各组大鼠的逃避潜伏期及平均游泳速度无明显差异。2.LTP结果:四组基础波幅无明显差异,在给予高频刺激后的1min、30min和60min,Pilo组在各时间点的f EPSP幅度均显著低于Control组;而Pilo+KD组在各时间点的f EPSP幅度均显著高于Pilo组;KD组与Control组间f EPSP的幅度在各时间点均无明显差异。3.海马CA1区突触超微结构:Pilo组大鼠突触PSD厚度显著低于Control组,而Pilo+KD组PSD厚度较Pilo组则明显增加。此外,与Control组相比,Pilo组突触间隙宽度显著增加,而Pilo+KD组突触间隙宽度较Pilo组则明显变窄;KD组与Control组突触间隙宽度及PSD厚度均无明显差异。4.树突棘密度:与Control组相比,Pilo组海马CA1及CA3区树突棘密度均显著降低;而与Pilo组相比,Pilo+KD组CA1区树突棘的密度明显增加,但CA3区树突棘密度增加并不明显;KD组与Control组CA1及CA3区树突棘密度均无显著差异。5.突触相关蛋白表达:与Control组相比,Pilo组大鼠海马组织中Syp、Syt 1、SNAP-25及PSD-95的表达均显著降低;而Pilo+KD组上述突触相关蛋白的表达量则明显高于Pilo组;KD组与Control组间,突触相关蛋白的表达量无明显差异。结论:TLE大鼠出现了明显的空间学习、记忆能力的损害及突触可塑性的改变。而KD上调了突触相关蛋白的表达,改善了突触的结构及功能可塑性,包括:改善海马CA1区突触的超微结构、提高树突棘的密度、增强LTP效应等,这可能是KD改善癫痫相关认知功能损害的原因之一。第三部分生酮饮食可能通过抑制ASIC1a及线粒体凋亡通路发挥神经保护作用目的:研究KD对TLE大鼠海马神经元的保护作用,并进一步探索KD对ASIC1a及线粒体凋亡途径的影响,以期发现KD在TLE中发挥神经保护作用的潜在机制。方法:成功建立SE模型后,癫痫组(Pilo组)及癫痫+生酮饮食组(Pilo+KD组)每组有18只大鼠可纳入实验中,另设有正常对照组(Control组)及生酮饮食组(KD组),各18只,总共4组。饮食干预方法同第一部分。在SE后第9周将大鼠处死,通过Nissl染色观察各组大鼠海马CA1及CA3区海马神经元形态及丢失情况;通过流式细胞术检测海马神经细胞内钙离子浓度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)以及细胞凋亡情况;通过透射电镜观察海马CA1区线粒体的超微结构;通过Western blot检测大鼠海马组织总蛋白中酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)、Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3的表达,以及线粒体及胞浆蛋白中的细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)的表达。结果:1.Nissl染色结果:Control组及KD组大鼠海马CA1及CA3区锥体神经元密集且排列整齐,结构完整,尼氏小体丰富,核仁清晰;Pilo组锥体神经元排列稀疏、杂乱,结构不完整,尼氏小体减少,细胞核固缩;而Pilo+KD组锥体神经元排列及结构相对正常。此外,Pilo组海马CA1及CA3区锥体神经元的数量均明显少于Control组;而Pilo+KD组CA1及CA3区神经元的数量较Pilo组则显著增加;KD组海马神经元的数量较Control组无明显差异。2.ASIC1a的表达:与Control组相比,Pilo组大鼠海马组织中ASIC1a蛋白的表达在癫痫慢性期显著上调;而Pilo+KD组ASIC1a的表达则明显低于Pilo组,但仍高于Control组;KD组与Control组ASIC1a的表达无明显差异。3.流式细胞术结果:与Control组相比,Pilo组大鼠海马组织中[Ca2+]i升高,MMP下降,ROS产生增多,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义;而与Pilo组相比,而Pilo+KD组大鼠海马组织中[Ca2+]i明显降低,MMP显著升高,ROS产生明显减少,细胞凋亡率也显著降低。Control组与KD组间上述各项指标无明显差异。4.线粒体超微结构:Control组及KD组线粒体结构正常、无肿胀、基质密度高,
关键词: 颞叶癫痫 ；生酮饮食 ；认知功能 ；线粒体凋亡 ；内质网应激
摘要： 耐药性癫痫(Pharmacoresistant Epilepsy,PRE)以反复癫痫发作和进行性认知功能损害为核心特征,神经炎症被证实是介导其病理进程的关键机制,然而,导致神经炎症持续高反应的“根源”仍不明确,且它是PRE形成的驱动因素还是作为疾病进展的继发性结果促进癫痫恶化尚存争议。既往研究表明,致痫区大量神经元凋亡并释放损伤相关分子模式(Damage-Associated Molecular Patterns,DAMPs),进而激活炎症反应并加剧神经损伤,形成“神经元死亡-炎症”恶性循环,死亡细胞清除机制可能是打破这一循环的核心环节。胞葬(Efferocytosis)是特异性清除凋亡细胞的关键过程,其功能缺陷可导致凋亡细胞堆积、继发性坏死及DAMPs持续释放,推动神经炎症慢性化。Mer受体酪氨酸激酶(Mer Receptor Tyrosine Kinase,MerTK)是胞葬的核心受体,在炎症性疾病中发挥关键作用,但PRE中持续神经炎症是否由胞葬缺陷介导、上调MerTK增强胞葬能否减轻炎症并改善认知功能仍不明确。为此,本研究从临床出发,采用多种动物模型,结合蛋白质组学技术和基因调控方案,探讨神经炎症在PRE病程中的角色及胞葬作用与PRE神经炎症反应及认知功能的关联。 目的: 1.通过回顾性队列研究、炎症大鼠模型、癫痫大鼠模型及PRE大鼠模型,了解系炎症反应对痫性发作的影响,并一进步探析炎症与癫痫耐药形成间的因果关系,为阐释PRE神经炎症机制提供实验依据。 2.通过蛋白质组学组学技术探析参与PRE神经炎症反应、细胞死亡及认知障碍相关的分子及通路,为探寻细胞死亡后的清除机制与神经炎症反应间的关联提供实验依据。 3.采用腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)对PRE大鼠胞葬受体MerTK进行上调及干扰,探析胞葬作用对PRE大鼠神经炎症反应及认知功能的影响,为阐释PRE神经炎症驱动机制及认知功能障碍机制提供新的视角,同时也为PRE癫痫发作治疗策略的制定提供新的思路。 方法: 1.临床部分:采用单中心、回顾性研究方法,根据纳入/排除标准,最终纳入病例414例,根据入院主诉是符合痫性发作分为2组,分析2组病例一般资料、重要病史资料及血常规炎症指标,包括中性粒细胞(Neutrophil,NUE)、淋巴细胞(Lymphocyte,LYM)、中性粒细胞与淋巴细胞比率(Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio,NLR)及白细胞。在亚组分析中根据NLR值段进行分组,本研究将具有相近的癫痫发作率NLR值段分为一个组,最终将414例病例分为6组,即NLR值小于1组、NLR值1-2组、NLR值2-3组、NLR值3-5组、NLR值5-10组和NLR值大于10组。 2.炎症模型构建、分组及鼠尾静脉血采集:根据炎症模型构建方式,分为4个组,分别是对照(Control,CON)组、假手术组(Sham)组、颅内炎症模型组(Intracranial Inflammation,ICI)组、系统炎症模型(Systemic Inflammation,SI)组。ICI模型构建方法为在麻醉状态下通过颅内立体定向注射5μL脂多糖溶液(4μg/μL)。SI模型构建方法为腹腔注射LPS溶液,剂量为750μg/kg,每日1次,连续5天。Sham组:颅内注射无菌生理盐水5μL,注射及护理方法同ICI组。CON组不做任何干预。于第6日,构建癫痫模型前采集4组尾静脉血行血常规检查并分析组间NUE、LYM、白细胞及NLR差异。 3.耐药性癫痫模型构建及分组:炎症模型构建成功后于次日采用匹罗卡品-氯化锂诱导癫痫模型,采用苯妥英钠及苯巴比妥对癫痫模型进行耐药性筛选。分为3组,即CON组、药物敏感性癫痫(Pharmacosensitive Epilepsy,PSE)组、PRE组。 4.行为学分析:本研究采用Y迷宫及Morris水迷宫检测各组大鼠认知水平。 5.蛋白质组学:采集CON组、PSE组及PRE组脑组织行蛋白质组学分析。 6.MerTK AAV构建及分组:为了实现对PRE大鼠脑内MerTK基因表达的调控,本研究构建MerTK AAV载体,并采用颅内定向注射的方法,将MerTK AAV定向注射至大鼠海马区。在病毒注射3周后,随机选取部分大鼠,通过免疫荧光染色检测海马及颞叶区域MerTK表达水平。进一步通过Q-PCR及Western blot检测各组MerTK m RNA及蛋白水平,以验证MerTK AAV转染效率。MerTK AAV调控分组如下: 1)CON组:正常对照,不施加干预; 2)PSE组:癫痫药物敏感大鼠,无额外处理;3)PRE组:癫痫耐药大鼠,不进行任何干预; 4)UPRE组:对PRE大鼠实施颅内定向注射过表达MerTK的腺相关病毒; 5)UPRC组:向PRE大鼠颅内定向注射过表达AAV空载体,作为对照; 6)DPRE组:对PRE大鼠颅内定向注射携带MerTK干扰元件的AAV,以干预下调MerTK; 7)DPRC组:向PRE大鼠颅内定向注射干扰AAV空载体,作为对照。 7.其他分子生物学实验方法: 1)透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、H&E染色、NISSL染色:脑组织细胞减少/凋亡及损伤; 2)ELISA及Q-PCR:检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达; 3)Western blot及Q-PCR:检测HMGB1、NLRP3、IL-6、TNF-α、IL-1β及MerTK的表达; 4)免疫组化及免疫荧光:检测MerTK、PSD95的表达。 结果: 1.系统感染显著增加痫性发作风险。入院主诉为痫性发作组癫痫病例感染暴露率显著高于对照组(52.0%vs 37.8%P=0.007),其中主要为肺部感染,占总并发感染病例的64.9%。二元logistic回归结果显示,暴露于感染的癫痫患者痫性发作的风险是未暴露于感染的癫痫患者的1.788倍(OR=1.788,95%CI:1.182-2.703,P=0.006),提示系统感染是癫痫患者癫痫发作的独立危险因素。 2.外周血炎症指标NLR是痫性发作早期的炎症预警信号。伴有痫性发作组癫痫病例与对照组间炎症指标NEU、LYM及NLR差异无统计学意义(P>0.05)。亚组分析结果显示,NLR与痫性发作率并非线性相关性,而呈“V”型关联。NLR值为2-3组病例痫性发作率最低(49.2%),与其他组别间差异具有统计学意义(P<0.05)。NLR值小于2时,NLR值与痫性发作呈负相关关系,NLR值大于3时,NLR值与痫性发作呈正相关关系。NLR值小于2的病例具有显著增高的脑血管病病史及更低的年龄(P<0.05),揭示结构性病因对癫痫发作的影响;NLR值大于3的病例更多的暴露于感染,体温显著高于NLR值小于3的病例(P<0.05),血液炎症指标方面,表现为NEU异常增大及LYM异常降低(P<0.05),表明NLR值升高与更严重的感染和炎症反应相关,揭示炎症反应与癫痫发作的密切关联,炎症指标NLR升高作为癫痫病人痫性发作预警信号的价值。 3.LPS诱导的ICI炎症模型组及SI炎症模型组尾静脉血NEU及NLR显著高于Sham组及CON组,LYM百分百显著低于Sham组及CON组(P<0.05),ICI组及SI组间,Sham组及CON组间无显著差异(P>0.05),组间白细胞数及NEU绝对值组间差异无统计学意义(P>0.05)。此外,LPS诱导的ICI炎症模型组及SI炎症模型组脑组织IL-6及TNF-α显著高于Sham组及CON组(P<0.05),ICI组及SI组间,Sham组及CON组间差异无统计学意义(P>0.05)。此结果提示LPS诱导的系统炎症及颅内炎症均介导外周血炎症指标升高及颅内炎症因子上调。 4.在癫痫模型构建阶段,LPS诱导的ICI炎症模型组(90.5%)及SI炎症模型组(83.3%)持续性痫性发作诱导率显著高于Sham组(65.6%)及CON组(60.8%)(P<0.05),ICI组及SI组间,Sham组及CON组间无显著差异(P>0.05),提示颅内炎症及系统炎症皆可提高痫性易感性,是癫痫发作的重要影响因素。对癫痫大鼠进行耐药性筛选后本研对大鼠模型的有效性进行了验证,脑电图结果显示,PRE大鼠较PSE及CON组大鼠表现出显著异常的放电模式。TEM兴奋性突触检测结果显示,PRE组大鼠海马区兴奋性突触较PSE组及CON组大鼠显著增多,此外,采用多种方法检测了兴奋性突触中的关键调节因子PSD95,结果显示,PRE组大鼠PSD95表达较PSE组及CON组显著上调(P<0.05),此结果提示PRE模型突触结构与功能均发生重塑,驱动神经微环境向兴奋-抑制失衡方向转变。上述结果表明,本研究通过反复癫痫发作、特征性脑电图改变及神经微环境变化证据,成功构建了符合临床特征的PRE大鼠模型。本研究统计并分析了4组间PRE的筛出率,结果显示组间差异无统计学意义(P>0.05),提示构建癫痫模型前LPS诱导的颅内炎症及系统炎症不是PRE形成的直接驱动因素。 5.本研究检测了PRE大鼠脑组织炎症因子及炎症反应中的关键分子。结果显示PRE组大鼠脑组织炎症因子IL-6和TNF-α的表达显著高于PSE组和CON组(P<0.05),此外,损伤相关分子模式HMGB1及炎症小体NLRP3的表达也显著上调(P<0.05),小胶质细胞重要的标志物IBA-1的表达也较CON组显著上调(P<0.05),此结果提示PRE大鼠神经炎症反应增强,结合前期LPS诱导的颅内炎症及系统炎症不是PRE形成的直接驱动因素的研究结论,PRE大鼠高神经炎症反应可能是癫痫发作的继发性后果。通过TEM观察发现,PRE组大鼠海马区凋亡细胞数量显著高于PSE组和CON组。H&E染色和Nissl染色进一步证实PRE组大鼠海马区细胞丧失较PSE组和CON组显著增加,且受损细胞数目明显增多,尤其是在CA1和CA3区。以上结果表明,细胞丧失/死亡与炎症反应共同参与PRE病理进程。 6.蛋白质组学分析结果显示,PRE组与PSE组相比上调的蛋白在突触信号的调控、认知、学习及反式突触信号的调控等通路显著富集(富集倍数5,P<0.05),PRE组与PSE组相比下调的蛋白在谷氨酸受体信号通路、Ephrin受体信号通路、胞吞作用及细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶信号通路等显著富集(富集倍数15,P<0.01)。c AMP信号通路、谷氨酸能突触、钙信号通路、MAPK信号通路、ras信号通路、TNF信号通路、炎症介质对TRP通道的调节及胞吞作用等信号通路被显著富集出来。Tyro3、MerTK、Egr3及Syk等蛋白参与了细胞信号传导和免疫调节等多个生物过程,其中包括细胞表面受体酪氨酸激酶的信号传递、白细胞活性的调节、细胞活化的控制、淋巴细胞功能的调节、自然杀伤细胞的激活以及B细胞活化的调控,被显著富集。从蛋白质表达角度揭示细胞死亡、胞吞作用、炎症及突触调控参与PRE病理进程。本研究对蛋白质组学富集出来的、在炎症反应及死亡细胞清理过程中具有核心作用的胞葬受体MerTK采用多种方法进行了验证,结果显示,PRE组大鼠脑组织胞葬受体MerTK表达较PSE组及CON组大鼠显著减少(P<0.05)。此结果表明PRE组大鼠脑组织中存在明显的胞葬缺陷,结合前期PRE大鼠神经炎症反应增强的结果,揭示了PRE病程中胞葬缺陷与神经炎症反应间的密切关联。本研究采用Y迷宫及Morris水迷宫测试了各组大鼠的认知水平,结果显示,PRE组大鼠索行为减少,潜伏期延长,穿越中心平台的次数减少,且学习和适应环境的能力较PSE组及CON组大鼠显著减弱(P<0.05),表明PRE伴有显著的认知功能受损。 7.成功转染MerTK 3周后,进行为期2周的视频监控,结果显示,UPRE组癫痫发作频率及持续时间较PRE组显著降低(P<0.05),DPRE组与PRE组间无显著差异(P>0.05)。H&E染色和Nissl染色结果显示,UPRE组大鼠CA1、CA3及DG区细胞较PRE组细胞数量显著增加,
关键词: 耐药性癫痫 ；痫性发作 ；炎症 ；胞葬 ；MerTK ；NLR
摘要： 大量的动物实验和临床数据表明,反复癫痫发作会导致海马神经元损伤甚至死亡。海马神经元的损伤会诱发苔藓纤维芽生、抑制性神经元丢失等,从而形成新的异常神经网络导致癫痫再发作,并进一步损伤海马神经元。海马神经元损伤不仅是癫痫发作的结果,更重要的是,它促进了癫痫的发生和进展。因此,修复癫痫发作后神经元损伤是癫痫治疗中亟待解决的问题。本研究旨在通过体外PC12细胞的氧化应激损伤模型和体内PTZ点燃癫痫大鼠模型的实验研究,验证旋转恒定磁场对癫痫发作诱导的神经元损伤是否具有保护作用,并探讨其神经元保护机制是否与AMPK-PINK1-Parkin信号通路相关,为癫痫患者癫痫发作后神经元损伤提供一种无创的物理治疗方法。实验一:旋转恒定磁场抑制PC12细胞的氧化应激损伤的研究目的:本研究拟应用H2O2制备PC12细胞氧化应激损伤模型,观察旋转恒定磁场抗氧化应激损伤的效果。方法:使用不同浓度H2O2体外处理PC12细胞24小时后,选取半抑制浓度(IC50)构建PC12细胞氧化应激损伤模型。选取不同磁场强度和作用时长的旋转恒定磁场进行干预,CCK8法检测PC12细胞活性,以选取最佳磁场刺激参数。采用Western blot检测凋亡相关蛋白、流式细胞术检测ROS水平,Elisa检测氧化应激相关参数和线粒体呼吸链复合酶活力以及使用JC-1通过免疫荧光检测线粒体膜电位水平。结果:1.随着H2O2浓度增高,PC12细胞死亡增加,存活减少,IC50浓度约为300μmol/l,使用该浓度构建PC12细胞氧化应激损伤模型。2.对比不同参数组合旋转恒定磁场干预对PC12细胞存活率的影响,筛选出最佳旋转恒定磁场刺激参数4Hz,0.2 T,2h/d。3.Western blot结果显示,与sham组比较,H2O2组PC12细胞内Cleaved-caspase3蛋白表达水平明显升高、Bcl2蛋白表达水平降低;与H2O2组比较,给予旋转恒定磁场干预后,Cleaved-caspase3蛋白表达水平降低、Bcl2蛋白表达水平升高。4.用DCFH-DA检测PC12细胞内ROS的聚集,结果显示H2O2组,荧光强度明显增高,PC12细胞中ROS生成增多。使用旋转恒定磁场干预后能够一定程度降低H2O2诱导的PC12细胞内ROS的产生。同时,与sham组相比,H2O2组PC12细胞中MDA和GSSG水平显著升高,SOD活性和GSH含量显著降低。与H2O2组比较,旋转恒定磁场干预后显著降低了H2O2诱导的PC12细胞中MDA和GSSG含量以及提高了SOD和GSH水平。5.JC-1免疫荧光结果显示与sham组相比,H2O2组PC12细胞线粒体膜电位水平明显下降,H2O2+RMF组PC12细胞线粒体膜电位水平较H2O2组升高。线粒体呼吸链复合酶活力的比较结果显示,与sham组相比,H2O2组PC12细胞线粒体呼吸链复合酶I、II、III、IV的活力下降,RMF干预后H2O2+RMF组PC12细胞线粒体呼吸链复合酶I、II、III、IV的活力较H2O2组升高。结论:1.旋转恒定磁场具有神经元保护作用。2.旋转恒定磁场对神经元的保护作用可能是通过抗凋亡、抗氧化应激、保护线粒体功能来实现的。实验二:旋转恒定磁场修复癫痫大鼠海马神经元损伤的机制研究目的:研究旋转恒定磁场对PTZ点燃癫痫大鼠的保护作用及其对线粒体自噬和AMPK通路的影响,探究旋转恒定磁场修复癫痫大鼠海马神经元损伤的分子机制。方法:对亚惊厥剂量PTZ多次腹腔注射建立点燃癫痫大鼠模型,每天使用旋转恒定磁场干预。观察大鼠行为学特征及病理学变化。采用Western blot检测凋亡、线粒体自噬相关蛋白以及AMPK、p AMPK蛋白表达水平、免疫荧光检测神经元与Cleaved-caspase3、LC3B的共定位以及Tomm20与Lamp2、Parkin的共定位、流式细胞术检测线粒体膜电位水平、Elisa检测氧化应激参数以及线粒体呼吸链复合酶参数。结果:1.直至末次腹腔注射PTZ后,PTZ组大鼠完全点燃率为80%,PTZ+RMF组大鼠完全点燃率为53.33%,与PTZ组相比,RMF干预可降低大鼠痫性发作等级,显著延长了完全点燃潜伏期以及末次发作等级≥4级的发作潜伏期,缩短了癫痫发作的持续时间。2.水迷宫实验结果表明,与PTZ组相比,PTZ+RMF组大鼠的逃避潜伏期明显缩短。在空间探索实验中,与PTZ组相比,PTZ+RMF组大鼠在目标象限停留时间和穿越虚拟平台次数明显增加。3.透射电子显微镜及Nissl染色观察海马各区神经元结构显示,RMF干预后神经元损伤减轻,神经元存活数量明显增加。4.免疫荧光染色与Western blot结果一致,结果表明,与sham组比较,PTZ组海马各区神经元中Cleaved-caspase3蛋白表达明显增加,RMF干预后,Cleaved-caspase3蛋白表达减少。5.各组大鼠海马氧化应激参数检测结果显示,PTZ组中总SOD活力、CAT活力以及GPx的活力较sham组降低,而PTZ+RMF组较PTZ组升高。与sham组相比,PTZ组大鼠海马中MDA含量、GSSG含量明显升高,GSH的含量明显降低。与PTZ组相比,PTZ+RMF组MDA含量、GSSG含量明显降低,GSH含量升高。6.透射电子显微镜观察海马线粒体超微结构发现PTZ+RMF组线粒体比PTZ组损伤减轻。线粒体膜电位结果显示PTZ+RMF组大鼠海马组织线粒体膜电位水平较PTZ组升高。另外,线粒体呼吸链复合酶活力检测结果表明,PTZ+RMF组大鼠海马组织线粒体呼吸链复合酶I、II的活力较PTZ组升高。7.免疫荧光染色共定位结果显示,与PTZ组比较,PTZ+RMF组海马神经元中LC3B表达增加,Tomm20与Lamp2共定位增加以及Tomm20和Parkin共定位增加。Western blot结果显示,与PTZ组比较,PTZ+RMF组大鼠海马中LC3B、PINK1、Parkin蛋白表达水平升高。8.与PTZ组比较,PTZ+RMF组大鼠海马中p AMPK/AMPK比值增加。结论:1.旋转恒定磁场干预能够降低PTZ致痫大鼠的癫痫易感性,改善PTZ致痫大鼠的认知功能。2.旋转恒定磁场干预对PTZ致痫大鼠,具有抗凋亡、抗氧化应激以及保护线粒体结构和功能的作用。3.旋转恒定磁场干预能够促进癫痫大鼠海马神经元PINK1-Parkin介导的线粒体自噬以及激活AMPK信号通路。实验三:旋转恒定磁场通过调控AMPK-PINK1-Parkin修复PC12细胞氧化应激损伤的机制研究目的:探讨旋转恒定磁场对PC12细胞氧化损伤保护作用的分子机制是否与AMPK-PINK1-Parkin相关。方法:制备H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤模型,给予旋转恒定磁场干预,并使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1和AMPK抑制剂Compound C对PC12细胞进行预处理,采用CCK8检测细胞活力,Western blot检测凋亡相关蛋白、QPCR检测线粒体自噬相关m RNA的表达以及流式细胞术检测凋亡、ROS水平。结果:1.线粒体红色探针与自噬体标志物LC3B荧光共定位结果显示,与H2O2组比较,给予RMF干预后,PC12细胞内线粒体与LC3B共定位增加。Western blot实验检测线粒体自噬相关蛋白,结果显示,与H2O2组比较,RMF干预后,PC12细胞内LC3B、PINK1、Parkin蛋白表达水平升高。2.与H2O2组比较,RMF干预后,p AMPK/AMPK比值增加。3.使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1对PC12细胞进行预处理后结果显示,与H2O2组相比,添加Mdivi-1加剧了PC12细胞的死亡,与H2O2+RMF组相比,添加Mdivi-1部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞活力的提高。同时,Western blot结果显示,与H2O2组相比,添加Mdivi-1后加剧了PC12细胞内Cleaved caspase-3表达的增加以及Bcl2表达的减少,与H2O2+RMF组相比,添加Mdivi-1部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞的抗凋亡作用。4.使用AMPK抑制剂Compound C对PC12细胞进行预处理后结果显示,与H2O2组相比,添加Compound C降低了PC12细胞中LC3B/LC3A m RNA比值以及PINK1 m RNA、Parkin m RNA的表达。与H2O2+RMF组相比,添加Compound C部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞线粒体自噬相关m RNA表达的增加。同时,流式细胞术结果显示,与H2O2组相比,添加Compound C后加剧了PC12细胞内凋亡和ROS水平的升高,与H2O2+RMF组相比,添加Compound C部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞抗凋亡、抗氧化作用。结论:1.旋转恒定磁场干预后促进H2O2诱导的神经元PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,激活AMPK信号通路。2.旋转恒定磁场对神经元的保护作用可能部分依赖于AMPK-PINK1-Parkin的调控。
关键词: 旋转恒定磁场 ；癫痫 ；氧化应激 ；神经元损伤 ；AMPK-PINK1-Parkin
摘要： 研究背景与目的癫痫是严重危害人类健康的常见病,其终生患病率为7.5‰,严重影响了病人的身心健康。癫痫发作一般可用药物控制,但尚有20%-30%的病人经过抗癫痫药物(AEDs)治疗后,发作仍难控制,成为药物难治性癫痫。随着癫痫手术的开展可以帮助50%难治性癫痫患者控制癫痫,但术后仍需要服用药物。因此探索癫痫的发病机制,寻找新型抗癫痫药物是神经科临床工作亟待解决的问题。D-serine具有类似神经递质的功能,胶质细胞通过突触小泡释放D-serine,通过与NMDA受体结合实现对神经元的调节。D-serine参与神经系统多种疾病如脊髓侧索硬化、精神分裂症、阿尔茨海默病、癫痫等的发生,发展过程。D-serine的代谢主要依靠丝氨酸消旋酶(serine racemase,SR)和D型氨基酸氧化酶(DAAO)。SR具有催化从左旋丝氨酸到右旋丝氨酸的消旋作用,多分布于星型胶质细胞和神经元中。因此SR的分布和数量变化能够在一定程度上反映D-serine作用的部位和功能特点。以往研究已经证实NMDA受体甘氨酸位点拮抗剂具有抗惊厥作用以及在癫痫小鼠脑中D-Serine的合成增多,D-serine的分布与磷酸化的NMDA受体一致。据此,我们提出假设:癫痫发作时可能伴有脑内星型胶质细胞中SR表达增多,星型胶质细胞合成和分泌d-serine增多,d-serine可能通过活化nmda受体参与癫痫发作。本研究的目的是应用pilocarpine大鼠模型,探讨d-serine在癫痫发作中的作用及其相关信号效应机制,为探索新的癫痫治疗靶点提供依据。材料与方法1.免疫组织化学方法:应用幼年、成年大鼠和癫痫患者的海马组织切片,免疫组织化学和激光共聚焦显微镜方法,观察d-serine合成酶sr的组织分布、细胞定位和变化。2.pilocarpine大鼠模型方法:采用技术成熟的锂-匹鲁卡品注射方法,进行大鼠癫痫模型制备。3.药物干预方法:采用大鼠侧脑室埋管、安装海马电极1周后进行注射抑制剂(sr抑制剂;daao抑制剂;生理盐水对照)及腹腔注射nmda受体广谱抑制剂,观察不同处理方法对于癫痫发作的影响。4.癫痫模型的动物行为学与脑电检测:采用racine(1972)标准,进行动物模型的癫痫发作的评分,视频监测脑电变化。5.westernblot定量方法:采用免疫荧光双标方法观察癫痫模型海马内星形胶质细胞和神经元的反应,采用westernblot方法定量分析akt,erk,jnk等信号分子的表达与变化。研究结果1.幼年、成年大鼠和癫痫患者海马内sr的分布、细胞定位与变化特点:sr主要定位于神经元和星形胶质细胞;成年动物海马ca区的sr阳性细胞数量高于幼龄动物,而幼龄海马齿状回的sr阳性胶质细胞数量明显高于成年动物;药物难治性癫痫患者海马组织内sr阳性细胞的数量明显多于脑外伤组。2.干预脑内d-serine合成或降解对pilocarpine大鼠模型的癫痫发作和脑电的影响:本研究比较了pilocarpine、mk-801(nmda受体广谱抑制组)、laaβh(sr抑制剂组)、cbio(daao抑制剂组)。结果表明,与对照组比较,抑制sr的活性能够延长3级发作潜伏期和进入se的潜伏期明显延长;明显减弱脑电总功率。mk801组脑电总功率也明显减弱。3.干预脑内d-serine水平对于pilocarpine大鼠模型海马组织内erk信号分子表达和活性的影响:与对照组比较,抑制sr活性引起海马组织内p-erk的表达明显减少,抑制DAAO活性后P-ERK表达明显增多,表明D-serine水平升高可能是导致EKR信号活化的重要因素。但对于AKT和JNK的变化趋势有待进一步研究确认。初步结论1.D-serine合成酶SR主要定位于大鼠和癫痫患者海马神经元和星形胶质细胞,其数量分布特征显示其与发育或癫痫疾病状态有一定的相关性。2.通过抑制脑内D-serine合成,能够延长大鼠进入3级发作和SE的潜伏期,并减弱在SE时脑电放电总功率。3.海马内D-serine信号可能通过激活ERK信号通路、参与癫痫的发作过程。因此,本研究结果提示脑内D-serine水平的异常变化可能参与癫痫的发作机制,干预D-serine代谢可能会是在癫痫治疗新的靶点。
关键词: 右旋-丝氨酸 ；NMDA受体 ；匹鲁卡品模型 ；癫痫 ；海马
被引量
1
摘要： 第一部分 MyD88在难治性癫痫患者及癫痫动物中的表达目的：越来越多的证据表明脑内的炎症反应是癫痫发生发展的重要病理生理机制。髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88, MyD88)是细胞内的接头分子,在机体免疫和炎症反应中起关键作用。本实验首先在难治性颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)患者及急、慢性癫痫动物模型中测定MyD88的表达规律,以探讨癫痫活动是否影响MyD88的表达。方法：1.从本课题组建立的癫痫脑库中随机抽取25例难治性TLE患者和15例对照组患者的颞叶新皮质；使用免疫荧光、免疫组化、和免疫印迹法测定MyD88的表达规律。2.使用氯化锂和皮罗卡品(25mg/kg)在SD大鼠中诱导急性癫痫发作模型,在癫痫发作后6h、24h、和72h,采用免疫荧光和免疫印迹法测定大鼠海马及周围皮质中MyD88的表达规律；建立急性戊四氮(pentylenetetrazol, PTZ)模型(65mg/kg),在PTZ注射后3h、6h、和24h,采用免疫印迹法测定大鼠海马中MyD88的表达规律。3.使用氯化锂和皮罗卡品在SD大鼠中建立慢性TLE模型,在皮罗卡品注射2个月后,采用免疫组化和免疫印迹法在有慢性自发性癫痫发作(spontaneous recurrent seizures, SRS)大鼠的海马及周围皮质中检测MyD88的表达规律；建立慢性PTZ点燃模型,采用免疫印迹法在点燃大鼠脑组织中测定MyD88的表达规律。结果：1.MyD88在难治性TLE患者脑组织中表达升高,主要表达于神经元的胞浆中。2.在急性皮罗卡品模型中,MyD88在癫痫发作后24h和72h表达升高,主要与神经元共表达,没有与胶质细胞共表达；在急性PTZ模型中,MyD88在癫痫发作后6h和24h表达升高。3.在慢性匹罗卡品模型中,在有SRS的大鼠海马和皮质中MyD88表达升高；在慢性PTZ点燃模型中,MyD88在点燃大鼠海马中表达也升高。结论：MyD88在难治性TLE患者和急、慢性癫痫大鼠脑组织中表达均升高,说明癫痫活动可影响MyD88的表达。第二部分MyD88在癫痫大鼠发作中的作用目的：为了测定MyD88对癫痫发作的影响,本部分在急性匹罗卡品和急性PTZ模型中测定MyD88的小分子抑制剂ST2825及刺激分子IL-1p对癫痫发作的影响。方法：1.在急性皮罗卡品模型中,在皮罗卡品注射前20min侧脑室注射不同剂量的MyD88抑制剂ST2825 (2.5μg、5μg、10μg),在皮罗卡品注射后90min,观察ST2825对癫痫发作的行为学影响,评价指标为SE发生率、SE潜伏期、癫痫发作严重程度、和累积发作评分。2.在急性皮罗卡品模型中,在皮罗卡品注射前20min给予10ggST2825,观察其对脑电图(electroencephalogram, EEG)上癫痫发作的影响,评价指标为EEG上第一次癫痫发作潜伏期、总的癫痫发作次数、和总的癫痫发作时间；检测10μg ST2825对小胶质细胞活化的影响。3.在急性PTZ模型中,在PTZ(65mg/kg)注射前20min给予10μgST2825,观察其对癫痫发作的影响,评价指标为第一次阵挛发作的潜伏期、全身强直-阵挛发作的潜伏期、和全身强直-阵挛发作的持续时间。4.在急性皮罗卡品模型中,在皮罗卡品注射前20min给予ST2825,前10min给予重组大鼠IL-1β,实验分为溶剂组、IL-1β组,ST+IL-1β组,观察IL-1β是否有促惊厥作用,及ST2825对IL-1β促惊厥作用的影响。5.在急性PTZ模型中,在PTZ注射前20min给予ST2825,前10min给予重组大鼠IL-1β,实验分为溶剂组、IL-1β组,ST+IL-1β组,观察IL-1β是否有促惊厥作用,及ST2825对IL-1β促惊厥作用的影响。结果：1.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射5μg及10μg ST2825显著延长SE潜伏期,减弱癫痫发作的严重程度,降低累积发作评分。2.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射10μg ST2825显著延长EEG上第一次癫痫发作的潜伏期,减少癫痫发作的总次数,缩短癫痫发作总的持续时间；此外,10μg ST2825显著减轻由癫痫发作诱导的小胶质细胞活化程度。3.在急性PTZ模型中,侧脑室注射10μg ST2825显著延长第一次阵挛发作的潜伏期、延长全身强直-阵挛发作的潜伏期、并缩短全身强直-阵挛发作的持续时间。4.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射lng IL-1β显著缩短SE潜伏期,加重癫痫发作严重程度,增加累积发作评分；在IL-1β前10min给予ST2825, ST2825阻止IL-1β诱导的SE潜伏期缩短,减轻IL-1β诱导的癫痫发作程度加剧,减弱IL-1β诱导的累积发作评分增加。此外侧脑室注射lng IL-1β显著缩短EEG上第一次癫痫发作的潜伏期,增加总的癫痫发作时间；ST2825阻止IL-1β诱导的EEG上第一次发作潜伏期的缩短,减轻总的癫痫发作次数,减少IL-1β诱导的癫痫发作时间的增加。5.在急性PTZ大鼠模型中,i.c.v. lng IL-1β显著缩短全身强直-阵挛发作的潜伏期并延长全身强直-阵挛发作的持续时间。预先给予ST2825可阻断IL-1β诱导的潜伏期缩短及全身强直-阵挛发作持续时间的增加。结论：1.MyD88的小分子抑制剂ST2825在急性匹罗卡品模型中可减少行为学上及EEG上的癫痫发作,减轻小胶质细胞的活化；ST2825在急性PTZ模型中也能减少癫痫发作。2.IL-1β在急性皮罗卡品和急性PTZ模型中均具有促惊厥作用,ST2825能抑制IL-1β的促惊厥作用。第三部分MyD88参与癫痫发作的机制探讨目的：NR2B酪氨酸位点的磷酸化在NMDA受体功能和神经元兴奋性中发挥重要作用。上部分的研究说明MyD88在癫痫活动中起重要作用,本部分对NR2B酪氨酸的磷酸化水平改变是否参与这个过程进行探讨。方法：1.采用免疫印迹法检钡NMD A亚基NR2B酪氨酸磷酸化位点1472(NR2B Tyr1472)在不同干预条件下的磷酸化水平改变,分组：vehicle组、Pilo组、IL-1β组、IL-1β+Pilo组、ST+IL-1β+Pilo组、和ST+Pilo组。2.在急性皮罗卡品模型中,在匹罗卡品注射前20min给予NR2BTyr1472的抑制剂艾芬地尔,在皮罗卡品10min前给予重组大鼠IL-1β,实验分为vehicle组、IL-1β组、Ifen组、和Ifen+IL-1β组,观察抑制NR2B Tyr1472后对IL-1β促惊厥作用的影响。3.在急性PTZ模型中,在PTZ注射前20min给予艾芬地尔,在PTZ 10min前给予重组大鼠IL-1β,实验分为vehicle组、IL-1β组、Ifen组、和Ifen+IL-1β组,观察抑制NR2B Tyr1472后对IL-1β促惊厥作用的影响。结果：1.单独给予IL-1β或癫痫发作本身(仅皮罗卡品)增加NR2B Tyr1472位点的磷酸化,分别增加154%和134%(P<0.05)。同时给予IL-1β和皮罗卡品时,与vehicle组相比,NR2B Tyr1472的磷酸化水平增加213%,说明IL-1β和癫痫发作对其磷酸化水平增加具有叠加效应。10μgST2825显著抑制由癫痫发作引起的NR2B Tyr1472磷酸化水平增高(P<0.05)。此外,10μg ST2825有效阻止IL-1β+皮罗卡品诱导的NR2BTyr1472磷酸化水平增高(P<0.01)。2.在急性皮罗卡品模型中,侧脑室注射lng IL-1β显著缩短SE潜伏期,加重癫痫发作严重程度,增加累积发作评分；在IL-1β前10min给予NR2B Tyr1472的抑制剂艾芬地尔,艾芬地尔阻止IL-1β诱导的SE潜伏期缩短,缓和IL-1β诱导的癫痫发作程度加剧,减弱IL-1p诱导的累积发作评分增加。3.在急性PTZ模型中,与vehicle组相比,IL-1β组显著缩短全身强直-阵挛发作的潜伏期并延长全身强直-阵挛的持续时间。相反,与vehicle组相比,艾芬地尔显著增加第一次阵挛发作和强直-阵挛发作的潜伏期,减少全身强直-阵挛的持续时间,具有抗惊厥作用。此外,艾芬地尔可阻断IL-1β诱导的潜伏期缩短和全身强直-阵挛发作持续时间的延长。结论：1.在癫痫发作中,NR2B Tyr1472的磷酸化水平增高,IL-1β可使NR2B Tyr1472的磷酸化水平进一步增高,ST2825可降低由癫痫发作诱导的NR2B Tyr1472磷酸化水平的增加。2.NR2B亚基的选择性抑制剂艾芬地尔可抑制癫痫发作活动,并可抑制IL-1β的促惊厥作用。第四部分MyD88对癫痫形成的影响目的：越来越多的证据表明脑内的炎症反应在癫痫形成中起重要作用,抗炎治疗有可能成为抗癫痫形成治疗的新策略。前部分的研究证实MyD88在癫痫发作中起重要作用,本部分进一步研究MyD88对癫痫形成的影响。方法：1.在SD大鼠中每天给予亚惊厥剂量的PTZ (33mg/kg)建立慢性PTZ点燃模型,IL-1β在PTZ前10min给予,ST2825在PTZ前20min给予,分Con组、vehicle组、IL-1β组、和ST2825组,记录每次PTZ注射后癫痫发作的最高级别和达到完全点燃的潜伏期,完全点燃是指大鼠在PTZ注射后连续3天达到4级或4级以上的癫痫发作。2.在慢性皮罗卡品模型中,在SE结束后24h,每天侧脑室注射IL-1β和ST2825,每天一次,连续给予7天。实验分为vehicle组、IL-1β组、和ST2825组。从SE后的第21-34天,使用高清视频系统监测SRS活动。分析指标为SRS发生率、SRS发作次数、和SRS发作严重程度。结果：1.在慢性PTZ点燃模型中,IL-1β组完全点燃的潜伏期与vehicle组相比明显缩短,IL-1β组的癫痫发作级别在第5、7-9、10、12天与vehicle组相比明显加重。相反,ST2825组完全点燃的潜伏期与vehicle组相比明显延长,ST2825组的癫痫发作级别在第6-8、13-18天明显减轻。此外,Con组与vehicle组相比,达到完全点燃的潜伏期及癫痫发作严重程度没有明显差别。2.在慢性皮罗卡品模型中,SRS发生率在vehicle组、IL-1β组、和ST2825组没有明显差异。与vehicle组相比,IL-1β组SRS每天发作次数明显增加,差异有统计学意义(p<0.05),ST2825组SRS每天发作次数差别不显著(p>0.05)。与vehicle组相比,SRS的严重程度在IL-1β组明显增加(p<0.05),而在ST2825组差别不显著(p>0.05)。结论：1.在慢性PTZ点燃模型中,IL-1β可缩短PTZ完全点燃的潜伏期,并缩短点燃过程。相反,ST2825可显著延长完全点燃的潜伏期并延缓点燃过程,具有一定的抗癫痫形成作用。2.在慢性皮罗卡品模型中,IL-1β可增加SRS发作频率并加重SRS发作严重程度,而ST2825对SRS发作频率及SRS发作严重程度没有影响,说明post-SE诱导的癫痫形成过程更难被修饰,多阶段或多药联合干预可能是未来的研究方向。
关键词: MyD88 ；ST2825 ；癫痫 ；IL-1β ；脑内炎症反应
被引量
1
摘要： 研究背景： 癫痫是一种常见的神经系统疾病,其特点是神经元的异常兴奋和同步化放电。癫痫持续状态(Status epilepticus, SE)时死亡率高达20%。慢性癫痫长期反复发作也可引起不可逆的神经功能损害,导致遗留严重的认知功能损害和行为改变。虽然临床已有多种抗癫痫药物,但对于难治性癫痫的疗效仍然有限,需要进一步寻找新的治疗靶点。 5-羟色胺(Serotonin,5-HT)是一种脑内重要的神经递质,与抑制癫痫活动密切相关。5-HT受体在脑内共有超过14种亚型,其中5-HT1A受体与癫痫关系最为密切[2-4]。目前5-HT1A受体在急性和慢性癫痫动物模型中究竟是抑制还是促进癫痫作用仍存在一定的争议。这种截然相反的作用可能和各个癫痫模型的机制不同相关。pilocarpine模型相比KA模型更能全面模拟SE过程中的各种特性和长时间SE发作所带来的严重损害。而杏仁核慢性电点燃模型能较好模拟慢性颞叶癫痫发生、过程,因此采用该两种模型来研究5-HT1A受体在急性和慢性癫痫过程中的作用,能提供更好的科学价值。 5-HT1A受体在脑内分布广泛,主要分布在脑干、额叶皮层、边缘系统等区域。目前尚不清楚究竟是哪些部位的5-HT1A受体参与了对SE和癫痫形成的作用。有报道海马富含5-HT1A受体且在癫痫发生发展过程中非常重要。5-HT1A受体在颞叶癫痫患者和慢性动物模型中致痫灶、边缘系统区域密度下降,可能参与了癫痫的发生和发作机制。研究各部位5-HT1A受体在癫痫过程中的动态变化可能有助于明确5-HT1A受体的作用机制。但目前尚无在SE模型和慢性杏仁核模型中干预的研究,因此本研究拟通过皮下和海马局部干预,明确5-HT1A受体对Li-pilocarpine所致SE和杏仁核慢性点燃模型癫痫的作用,观察海马5-HT1A受体是否参与其中,为癫痫的治疗寻求新的靶点。 目前对5-HT1A受体表达变化的研究多为针对慢性癫病形成的过程,而对急性SE过程中5-HTlA受体的变化未见有报道。细胞外调节激酶(Extracelluar signal-regulated kinase, ERK)参与MAPK信号转导通路[7]。已知5-HT1A受体激活在正常大鼠中能抑制ERK激活。而ERK通路在SE过程中激活后,能与下游的电压依赖性钾离子通道蛋白Kv4.2结合,抑制Kv4.2在CA1区神经元突触体和细胞膜上表达及超极化电流的形成,表现为促进癫痫形成的作用[8-12]。因此,本研究拟观察海马和脑干5-HT1A受体在Li-pilocarpine模型SE过程中的表达变化及Li-pilocarpine模型中激活5-HT1A受体后对ERK通路活化的作用,分析5-HT1A受体的相关作用机制。 第一部分5-HT1A受体对大鼠癫痫持续状态的作用 目的： 通过皮下和海马局部注射5-HT1A受体激动剂或拮抗剂,观察5-HT1A受体对Li-pilocarpine大鼠癫痫持续状态发作的作用。 方法： 1.280-300g SD大鼠手术植入颅骨电极,术后休息7-10天,按照体重配对分为7个实验组,分别在pilocarpine注射前1小时给予皮下注射以下试剂：组1：磷酸盐缓冲液(PBS)1mL/kg;组2：激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg;组3：8-OH-DPAT0.1mg/kg;组4：8-OH-DPAT0.5mg/kg;组5：8-OH-DPAT1.0mg/kg;组6：拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg,组7：激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻给予拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg. 2.大鼠给予LiCl3meq/kg,22-24h后给予腹腔注射pilocarpine。记录行为学发作GS潜伏期、GS持续时间,脑电图上首次痫样放电、SE潜伏期及总放电时间。脑电记录从pilocarpine注射前半小时到后2小时为止。 3.双侧海马干预大鼠给予手术植入颅骨电和微量注射导管(AP:-3.5mm, L:±2.5mm, V:-2.9mm).术后休息7-10天。体重配对分为8-OH-DPAT组和PBS组,在pilocarpine注射前15min分别给予8-OH-DPAT1μg (1μL)和PBS1μL。其余Li-pilocarpine模型建立和脑电、行为学观察同前。 结果： 1.腹腔给予激动剂各组癫痫持续状态的发生率和急性死亡率未发现存在显著性差异。 2.行为学观察激动剂8-OH-DPAT0.5mg/kg和1.0mg/kg组的GS发作潜伏期显著增高,而GS发作累计持续时间较PBS组显著降低,且1.0mg/kg组作用效果优于0.5mg/kg组。 3.激动剂8-OH-DPAT0.5mg/kg和1.0mg/kg组的首次痫样放电和SE起始潜伏期显著增高,总放电时间较PBS组显著降低,且1.0mg/kg组作用效果优于0.5mg/kg组。 4.低剂量(0.01mg/kg和0.1mg/kg)8-OH-DPAT对行为学和脑电发作均无抑制作用。 5.激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg组的抑制作用能被拮抗剂WAY-100635有效抑制,但单纯注射拮抗剂对发作无影响。 6.海马干预中,8-OH-DPAT组GS持续时间较PBS组下降,但对GS和脑电图上放电潜伏期无作用。 结论： 1.5-HT1A受体激活对Li-pilocarpine模型癫痫持续状态形成和发作有抑制作用。 2.皮下注射低剂量激动剂0.01和0.1mg/kg对Li-pilocarpine模型癫痫发作无影响。 3.双侧海马内5-HT1A受体激活能抑制Li-pilocarpine模型癫痫持续状态发作的严重程度,但不影响癫痫持续状态形成过程。 第二部分5-HT1A受体对杏仁核点燃癫痫形成的作用 目的： 通过腹腔和海马局部给予5-HT1A受体激动剂或拮抗剂,观察5-HT1A受体对杏仁核点燃过程癫痫形成的作用。 方法： 1.280-300g SD大鼠给予手术植入基底旁杏仁核电极,术后休息7-10天。大鼠测定初始后放电阈值(ADT)后,每天给予大鼠1次电流刺激,刺激强度为ADT,共刺激16天。记录大鼠发作等级、后放电时程(ADD)等参数。 2.皮下给药大鼠按体重配对分为6个实验组,分别在每天电刺激前1小时皮下注射以下试剂：组1：磷酸盐缓冲液(PBS)1mL/kg;组2：激动剂8-OH-DPAT O.Olmg/kg;组3:8-OH-DPAT0.1mg/kg;组4:8-OH-DPAT0.5mg/kg;组5：8-OH-DPAT1.0mg/kg;组6：激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻给予拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg. 3.海马局部干预大鼠在手术时右侧海马植入微量注射导管(AP:-3.5mm, L:-2.5mm, V:-2.9mm),分为8-OH-DPAT组和PBS组,在每天点燃前15min分别给予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余同前。 结果： 1.皮下注射激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg和0.5mg/kg组显著延缓杏仁核点燃过程发作等级的增加,1.0mg/kg组同时缩短每天点燃的ADD,而且这种作用能被同时注射拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg抑制。 2.激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg组停留在1级的天数长于PBS组,停留在5级的天数短于PBS组。同时,达到2、3、4、5级所需要的刺激数均多于PBS组。0.5mg/kg组存在类似作用趋势,但统计无显著性差异。激动剂1.0mg/kg组比PBS组在部分性阶段(1-3级)停留更长的时间,而在全面性阶段(4-5级)停留时间更短,且该作用能被拮抗剂有效抑制。 3.激动剂加拮抗剂组停留在4级的天数长于激动剂1.0mg/kg组,而到达2、3、4、5级的天数明显短于激动剂1.0mg/kg组,其中到达3级和4级的天数两组间存在显著性差异。 4.低剂量激动剂0.1和0.01mg/kg组对发作等级和ADD各指标均无影响。 5.海马局部干预与PBS组相比对点燃过程发作等级和ADD各指标均无影响。 结论 1.皮下注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT1.0mg/kg延缓杏仁核模型点燃进程,对慢性颞叶癫痫形成具有抑制作用,且这种作用在部分性癫痫阶段最明显。 2.皮下注射低剂量激动剂0.01和0.1mg/kg对杏仁核模型癫痫形成无影响。 3.海马5-HT1A受体不参与对慢性癫痫形成的抑制作用。 第三部分癫痫持续状态中5-HT1A受体表达水平的动态变化及ERK通路的研究 目的： 明确脑干和海马5-HT1A受体在Li-pilocarpine模型SE过程中的表达变化,并观察5-HT1A受体激活后对SE过程中ERK通路活化的作用。 方法： 1.250-300g SD大鼠建立Li-pilocarpine模型。在pilocarpine给药后0小时,1小时,2小时,6小时和24小时留取海马和脑干的石蜡切片标本和蛋白组织标本,分别用于对5-HT1A受体的免疫组化和Western blot检测。 2.经微波修复后,进行免疫组化染色。切片在显微镜下拍照后将图片导入Image-Pro Plus6.0图像分析软件,测算阳性细胞数、阳性面积和平均光密度值。 3.通过Western blot方法半定量检测5-HT1A受体在各时间点的表达变化。 4.用于ERK通路研究的大鼠根据体重配比分为4组,组1：空白对照组：在给予氯化锂后24小时,给予磷酸盐缓冲液(PBS)1mL/kg替代pilocarpine注射；组2：单纯Li-pilocarpine模型组；组3：皮下激动剂干预组：建立Li-pilocarpine模型,并在pilocarpine注射前1小时皮下注射激动剂8-OH-DAPT1.0mg/kg;组4：皮下激动剂合并拮抗剂干预组：建立Li-pilocarpine模型,并在pilocarpine注射前1小时前皮下激动剂8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻给予拮抗剂WAY-1006351.0mg/kg注射。分别在pilocarpine给药后0小时,1小时,2小时,6小时和24小时留取海马蛋白标本。 4.通过Western blot方法半定量检测pERKl/2和ERK1/2在各时间点的表达变化。 结果： 1.脑干5-HT1A受体主要表达在中缝背核(DRN)和中央上核(MRN),分布在5-HT神经元细胞膜上,少部分在胞浆中可见。5-HT1A受体在pilocarpine注射后1小时表达增加,但进入SE晚期(6小时和24小时)表达减少。其中DRN受体变化的幅度大于MRN。 2.海马5-HT1A受体分布在CAl区,CA3区和DG区的锥体细胞和颗粒细胞膜上,但表达浓度不高。海马受体在pilocarpine注射后2小时表达增多,但在SE晚期期(6小时和24小时)表达下降。 3. Li-pilocarpine模型组pERK/ERK值显著高于空白对照组。其中以pERK2变化为主,在整个SE过程中持续增高。而pERKl仅在SE晚期升高明显。激动剂使pERKl/ERKl和pERK2/ERK2在SE过程各时间点均较低,而合并拮抗剂组该作用消失。 结论： 1.脑干中缝核区5-HT1A受体表达在pilocarpine注射后1小时升高,SE后期表达下降。DRN受体密度变化程度大于MRN。 2.海马5-HT1A受体在pilocarpine注射后2小时表达增高,后期表达明显减少。5-HT1A受体表达改变与神经元密度变化不完全相关。 3.5-HT1A受体激活能有效抑制Li-pilocarpine模型SE过程中的pERKl/2的表达,对ERK通路具有抑制作用。
关键词: 5-羟色胺1A受体(5-HT1A受体) ；癫痫 ；持续状态 ；Li-pilocarpine模型 ；杏仁核点燃 ；脑干中缝背核 ；中央上核 ；海马
被引量
2
已选:0 清除
批量下载
批量引用
- 1
- 2
- 3