- 首页
- 产品推荐个人精选服务科研辅助服务教育大数据服务行业精选服务学科系列服务产品服务
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
- 首页
- 产品服务
- 知识脉络
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
智能检索
二次检索
任意字段
在结果中检索
在结果中去除
暂无数据
共
11
条结果 ，以下是1
-
11条
1 / 1
已选:0 清除
批量下载
批量引用
相关度
摘要： 登革病毒（Dengue virus,DENV）引起的登革热是一种急性传染病。近年来,由于流动人口的增加以及全球变暖,登革热的流行趋势日益严重。登革热被世界卫生组织列入被忽视的热带病之一,至今无特异性抗登革病毒药物上市。本研究首先选用利巴韦林作为阳性药物,通过DENV-Ⅱluc+病毒复制子检测荧光素酶活性进行化合物初步筛选,筛选到的有效化合物通过噬斑实验进行复筛;再通过蛋白印迹实验验证化合物的有效性,最后采用MTT法检测该化合物的细胞毒性,从而建立抗登革病毒体外药物筛选模型。研究结果显示利巴韦林抑制DENV-Ⅱ的EC50为40.78±1.02μM,结果与其他报道接近,成功建立稳定可靠的抗登革病毒体外药物筛选模型。利用该模型筛选了807个化合物,发现阿兹夫定（Azvudine,FNC）具有良好的抗DENV-Ⅱ活性。其次对FNC、盐酸阿兹夫定（Hydrochloride salt of azvudine,FNC-HCL）和三磷酸酯阿兹夫定（Triphosphate azvudine,FNC-TP）作用于DENV的体外抑制活性进行研究。结果发现FNC、FNC-HCL和FNC-TP抑制DENV复制的EC50在25.42±6.70-0.54±0.29μM之间,同时测得阳性药物利巴韦林抑制DENV-Ⅱ的EC50为40.78±1.02μM。蛋白印迹实验及定量结果显示FNC、FNC-HCL和FNC-TP均能抑制DENV E蛋白的表达,并且显著地抑制DENV病毒RNA的复制。说明F NC、FNC-HCL和FNC-TP在细胞水平和蛋白水平均能抑制DENV的复制,且抑制作用优于利巴韦林,通过对FNC进行分时给药及分时撤药实验,发现其作用于登革病毒RNA的合成阶段。FNC有望成为抗登革病毒的候选药物。最后对FNC的体内抗登革病毒活性进行研究。首先选用4-6周龄的BaBb/c小鼠脑内注射接种DENV-ⅡD1090病毒株,小鼠出现体重减轻、弓背、后肢瘫痪等症状,成功建立小鼠感染模型。BaBb/c小鼠感染DENV后,以每天2mg/kg的剂量灌胃给药,发现FNC在感染DENV后的BaBb/c小鼠体内治疗效果欠佳。
关键词: 登革病毒 ；抗病毒活性 ；阿兹夫定 ；体内 ；体外
被引量
4
摘要： 抗病毒药物的研究是当今最紧迫的健康问题之一。海洋来源的次级代谢产物结构新颖、生物活性多样,是抗病毒药物研发的重要来源。本研究建立了基于MDCK细胞的抗H1N1病毒体外筛选模型、基于BHK细胞的抗登革病毒体外筛选模型和基于J-Lat A2细胞的HIV-1潜伏激活筛选模型,开展海洋抗病毒活性天然产物筛选工作。利用质谱、核磁共振等光谱技术鉴定了抗病毒活性化合物的分子结构,利用GC-MS/MS技术对抗病毒活性混合物进行主成分分析,来筛选具有抗病毒潜力的先导化合物。研究结果如下:(1)首次发现α-吡喃酮类化合物和环二肽Cyclo-(Pro-Phe)具有抗H1N1流感病毒活性,同时筛选到具有多种抗病毒活性的2种海洋核苷类化合物(尿嘧啶核苷和胞嘧啶核苷)对H1N1流感病毒具有抑制作用;(2)首次发现环二肽Cyclo-(Pro-Leu)具有抗登革病毒活性,同时筛选到应用广泛的p-Hydroxybenzaldehyde 和海绵甾醇 Ergosta-5,24(28)-dien-3-ol 在抗登革病毒方面表现较显著的活性;(3)实验发现1个来源于人工养殖蓝海绵Desmacidon sp.的活性组分具有激活潜伏HIV-1病毒表达的活性;(4)通过GC-MS/MS技术对混合物样品进行初步分析,得到6种可能具有抗H1N1流感病毒活性的物质结构,4种可能具有抗登革病毒活性的物质结构。综上所述,海洋来源化合物的抗病毒潜力巨大。通过丰富海洋化合物库,可以筛选出更多具有抗病毒活性的物质。同时对抗病毒活性粗组分进一步分离分析研究,可以开发更多具有抗病毒活性潜力的海洋来源物质。
关键词: 海洋天然产物 ；H1N1 ；登革病毒 ；HIV-1
摘要： 登革病毒（Dengue virus,DENV）是一种重要的蚊媒传染病病毒。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊的叮咬在人群中扩散,引起的临床症状轻重不一,从温和的登革热（Dengue fever,DF）到严重的登革出血热（Dengue hemorrhagic fever,DHF）和登革休克综合征（Dengue shock syndrome,DSS）,其中以登革热病例最常见。全球128个国家有25亿人面临登革病毒感染的风险,每年感染者中大约有50万人需要住院治疗,病死率在2.5%左右。热带和亚热带地区是登革病毒感染流行的主要区域,我国南部的广东、海南和云南都属于疫区,几乎每年都有登革病毒感染病例,其中2014年我国广东省爆发登革热疫情,感染病例达到46864人,其中6人死亡,造成严重的公共卫生安全问题。目前针对登革病毒感染的防治药物匮乏。赛诺菲-巴斯德公司研制的四价减毒活疫苗Dengvaxia从2015年底开始在墨西哥、菲律宾和巴西等三个国家获得批准使用,但是由于保护效果不理想且可能会对登革病毒血清抗体反应为阴性的人群造成更严重的后果,2017年底菲律宾卫生当局已经要求停止接种该疫苗。此外,目前市场上还没有登革病毒感染的特效治疗药物,临床上主要以对症治疗为主。因此,需要开发更有效的对抗登革病毒感染的防治手段。针对埃博拉、呼吸道合胞病毒感染的临床实践已经证明中和抗体是一种有效的应对病毒感染的治疗方法,研究表明抗登革病毒的中和抗体也可以快速有效地中和小鼠体内的登革病毒,达到抑制病毒增殖的目的,所以利用抗登革病毒中和抗体治疗登革病毒感染,应该是一种理想而有效的抗登革感染治疗策略。基于单细胞PCR的抗体筛选制备方案是最近几年发展起来的一种全人源的抗体制备技术,其基本原理是采集患者或者疫苗免疫人群的外周血并分离单个B细胞,PCR扩增单个细胞的抗体基因,进行表达和筛选。该技术可以快速获得全人源抗体,而且所获得的抗体经过了体内亲和力成熟,具有非常大的优势。为了快速获取抗登革病毒的抗体,本研究采用单B细胞抗体制备技术,利用从恢复期登革热患者外周血中分选得到的抗体分泌细胞扩增抗体基因,开展了针对登革病毒的中和抗体的研制工作。本研究首先从3例恢复期登革热患者采集了30mL外周血,利用密度梯度沉降法,分离淋巴细胞,然后根据B细胞表面分子标记对分离获得的淋巴细胞进行荧光标记,流式细胞术分选CD19high/CD20low to negative/CD3negative/CD27high/CD38high的单B细胞,共计1056个。通过反转录PCR和巢式PCR两步从单B细胞中扩增抗体基因,最终获得了496个H链,707个κ链,222个λ链可变区基因片段,经分析发现轻重链配对的共有285对,占初始细胞总数的27%左右,其中轻链为?的有223对,轻链为λ的有62对。随后将扩增获得的基因插入表达载体构建真核表达质粒,转染FreeStyleTMM HEK293-F细胞进行抗体表达,成功表达261株抗体。以灭活的四种血清型的登革病毒等量混合作为抗原,通过ELISA筛选获得88株可以特异结合灭活的登革病毒的抗体,阳性率为33.7%。进一步的体外中和活性评价显示有24株抗体在浓度为10μg/m L时可以中和50%以上的DENV-1,其中1G5、3A6、6B1和9C7的中和活性最好,1G5和9C7的抑制率达到100%,3A6和6B1也都在95%以上。根据抗体对DENV-1体外中和活性评价的结果,我们选取中和活性最好的四株抗体进行了亲和力、交叉保护效果及体内外活性评价。以灭活病毒为抗原,利用ELISA评价抗体的亲和力,结果显示1G5对DENV-1的亲和力较高,基本不与其他三种血清型病毒结合,3A6、6B1和9C7则均可结合四种血清型登革病毒,只是9C7对DENV-4的亲和力较低,6B1对DENV-3和DENV-4的亲和力较低。随后我们利用蛋白免疫印迹初步分析四株抗体所识别的病毒抗原,结果显示其中三株抗体（1G5、6B1和9C7）识别登革病毒的E蛋白,而3A6识别登革病毒的prM蛋白。另外,1G5和9C7均不结合原核表达的重组E蛋白,推测这两株抗体识别的抗原表位可能是空间表位,也可能是具有糖基化等修饰的表位;6B1既可以识别病毒的E蛋白,又可以识别重组E蛋白,推断6B1结合的位点可能是E蛋白上的线性表位。体外中和实验结果显示1G5针对DENV-1有非常好的保护效果,与其他三种血清型的病毒没有交叉保护效果;9C7、3A6和6B1可以同时中和四种血清型的病毒,但是9C7的中和活性比3A6和6B1高10倍以上,因此我们选择1G5和9C7进行了体内抗病毒活性评价。研究结果发现1G5可有效预防和治疗致死剂量的DENV-1对乳鼠的攻击。9C7可有效预防和治疗致死剂量的四种血清型登革病毒对乳鼠的攻击。登革病毒抗体引起的抗体依赖的感染增强作用（antibody dependent enhancment,ADE）是限制其临床应用的重要因素,我们利用K562细胞作为感染模型检测抗体依赖的感染增强效果,结果显示:1G5和9C7在亚中和浓度时,均可增强登革病毒的感染,产生ADE作用。为了降低这两株候选抗体的ADE活性,我们分别在其Fc段引入突变,检测结果显示改构后的抗体分子在亚中和浓度时对登革病毒的感染增强作用均显著降低或消除。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素受体基因缺失(Ifnar1-/-Ifngr1-/-)的免疫缺陷模型小鼠是登革病毒感染和评价抗体体内抗病毒活性的首选模型动物。我们利用CRISPR-Cas9技术成功构建Ifnar1-/-Ifngr1-/-的免疫缺陷模型小鼠,为抗登革病毒中和抗体研制工作的进一步顺利开展奠定了基础。综上所述,本研究建立了从单个B细胞制备抗体的方法,可以从感染患者或疫苗免疫人群的外周血中快速高效的制备中和抗体,研究筛选到2株具有良好的体内外中和活性的抗登革病毒全人源单克隆抗体,抗体经过改造后,已检测不到明显的ADE作用,经过进一步的评价和优化,具有开发为治疗登革病毒感染的被动免疫制剂的潜力。
关键词: 人源单克隆抗体 ；登革病毒 ；包膜蛋白 ；抗体依赖感染增强 ；中和抗体 ；单细胞PCR
被引量
4
摘要： 人体在感染任何一型登革病毒(Dengue virus,DENV)通常只会引起较轻型的发热并能产生特定的终生抗体,大部分只有在感染异种血清型DENV才会导致登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合症(Dengue shock syndrome,DSS)。现如今,研发出抗DENV药物是疾病防治的主要措施。病毒的生命周期主要分为病毒感染的早期阶段、进入细胞后复制阶段和子病毒的成熟和释放阶段。因此,抗DENV药物主要从病毒的吸附和进入阶段阻断病毒与细胞受体结合;病毒进入细胞后抑制病毒基因组RNA的复制、转录和蛋白质的合成;子代病毒装配完成后抑制胞吐的方式释放这几个阶段进行研究。此外,还可以通过增强机体的免疫反应来提高抵御病原体的入侵。目前尚无抗DENV的特效药被批准用于临床,需要加大使用新颖的药物化学策略及化合物数据库筛选技术,提高特异性强、毒性作用小的抗DENV药物的筛选率。研究方法:本研究通过已建立的药物体外筛选模型,对植物中分离的化合物进行抗DENV活性筛选。首先,噬斑形成实验进行初步筛选,选出其对DENV-2的半数有效浓度(50%effective concentration,EC50)值小于50μM的化合物,初步判定为具有抗DENV活性。然后结合MTT染色实验检测化合物对细胞的毒性作用,计算出细胞毒性浓度(50%cytoxic concentration,CC50)。初筛结果表明从石栗中分离出的石栗酸(CHY-5和CHY-8)具有抗DENV活性。继而,对CHY-5和CHY-8进行如下研究:(1)噬斑法:在Vero细胞感染4种DENV血清后,分别检测CHY-5和CHY-8对其抑制效果;(2)MTT染色实验:检测CHY-5和CHY-8分别对Vero和Huh7的细胞活力影响;(3)通过qRT-PCR实验检测CHY-5和CHY-8分别在Vero和Huh7细胞感染DENV后,上清中RNA的表达水平;(4)Western blot检测CHY-5和CHY-8对DENV E蛋白表达的抑制作用;(5)病毒的复制依赖宿主提供酶和底物,因此,DENV E蛋白与细胞表面的特异性受体相互识别介导进入细胞完成复制。绿茶中得到的多酚类物质表没食子儿茶素没食子酸(EGCG),可能具有直接阻断病毒颗粒与靶细胞的结合过程。将EGCG作为阻断DENV与靶细胞结合的抑制剂,qRT-PCR实验检测CHY-5或CHY-8是否能降低DENV E RNA的表达水平;(6)DENV的生命历程分为3个阶段,病毒感染前、病毒进入细胞和释放病毒颗粒。分时给药(Time of drug addition)设置不同的加药时间从而判断CHY-5或CHY-8抑制DENV复制的具体阶段;(7)DENV进入宿主后通过模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)来识别病原体,激活先天性免疫反应,刺激感染细胞和免疫细胞释放炎症因子和趋化因子。DENV感染宿主后可激活RIG-I信号通路,诱导I型干扰素的产生;探究CHY-5和CHY-8的抗病毒作用机制。在HepG2细胞中感染DENV后,加入CHY-5/CHY-8通过RT-PCR技术检测RIG-I和MDA-5基因的表达量;(8)有研究报道二萜类化合物最主要的功效是抗肿瘤作用,除此之外,还有具有抗炎和抗病毒作用。CHY-5和CHY-8均是从大戟科植物石栗中分离出的石栗酸,属于二萜类物质。研究指出诱导I型干扰素(IFN-α/β,IL-12和IL-15)的表达并协同NK细胞发挥抗DENV作用。为了确定CHY-5和CHY-8是否具有上调IFN表达,我们进行了IFN-βRNA表达的测定。本研究在人肝癌细胞(HepG2)感染DENV,加入CHY-5或CHY-8共同培养6h后,RT-PCR检测CHY-5和CHY-8诱导I型干扰素IFN-βRNA的表达;(9)有研究指出诱导IFN的表达能促进炎症因子TNF-α的释放,增强机体的免疫反应。研究结果:建立噬斑法和四甲基偶氮唑盐(MTT)染色实验抗DENV活性初筛模型,对中国科学院昆明植物研究所刘海洋研究员送检的51个从植物中分离出的化合物进行抗DENV活性筛选,比较阳性药利巴韦林对DENV-2的EC50=40.78±1.02μM,获得两个化合物CHY-5、CHY-8具有抑制DENV的有效浓度低于利巴韦林且对细胞毒性作用小。然后,降低化合物浓度设置浓度梯度,噬斑法形成细胞的病变结果表明能有效抑制4种DENV血清型的复制。CHY-5对DENV-(1、2、3、4)的EC50分别为2.72±0.39μM、10.99±5.18μM、18.72±0.79μM、0.48±0.28μM。CHY-8对DENV-(1、2、3、4)的半数有效抑制浓度分别为12.21±5.23μM、21.71±7.89μM、>50μM、13.99±1.63μM。MTT染色实验检测结果表明CHY-5对Vero细胞的半数毒性浓度为501.11±25.59μM,Huh7细胞的CC50值>200μM。CHY-8对两种细胞的CC50均大于200μM,表明两个化合物对细胞的毒性作用很低。为进一步验证从石栗中分离的石栗酸(CHY-5和CHY-8)2个二萜类化合物对DENV的抑制作用,通过qRT-PCR检测化合物在不同细胞中对DENV E RNA的表达,结果表明两者对DENV RNA抑制强度呈剂量依赖性。病毒吸附实验比较了阻断剂EGCG和给药组DENV E RNA的表达,结果表明CHY-5、CHY-8均不影响病毒的吸附过程。分时给药实验研究设置感染时(0～2h)和感染后(2～6、6～12h和12～24h)给药,qRT-PCR检测结果显示CHY-5、CHY-8于DENV感染后0～2h和2～6h这两个阶段DENV E RNA的表达显著降低,可能通过阻断病毒的吸附或病毒进入后阶段。病原体进入宿主受体识别后激活先天性免疫反应,因此,对RIG-I样受体检测结果表明RIG-I和MDA-5基因的表达均上调。抗病毒基因的上调能有诱导I型干扰素(IFN-β)的表达,刺激炎症因子(TNF-α)的释放,增强机体抵抗病毒的能力。
关键词: 登革病毒 ；二萜类化合物 ；石栗酸 ；抗病毒活性
摘要： 研究背景与目的登革热（dengue）是登革病毒（dengue virus,DENV）经伊蚊（Aedes）传播引起的急性虫媒传染病。登革病毒感染后具有隐性感染、登革热和登革出血热等多种临床表现形式。比较典型的登革热临床表现为起病急骤,高热,头痛,肌肉和关节剧烈酸痛,部分患者会出现皮疹、出血、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等症状。本病主要在热带和亚热带地区流行,我国云南、广东、香港、澳门等地是登革热流行区,曾出现多次局部登革热流行。目前临床上的抗病毒药物存在研发困难,而且效果普遍较差的特点。与一般传染病不同,登革病毒是通过虫媒传播方式在人群中流行的,被登革病毒感染的患者目前大多数只能采取对症治疗的处理方法,然而对症治疗达不到抑制病毒复制和抗病毒的作用,登革热患者临床症状严重,病程长,影响正常生活。因此登革热目前亦尚无特效的抗病毒治疗方法。因此,亟需一种特效的抗登革病毒药物为此类疫情防控提供技术手段。反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides,ASOs）(以下简称ASO)是指与靶基因或m RNA互补并产生特异性基因变构效应的一段单链类DNA或RNA序列,通常由15-30个核苷酸组成的靶基因配对的单链DNA或RNA序列,通过化学合成和生物修饰的方式生产。其作用是沉默或降解基因从而抑制基因表达。ASO因具备高度特异性、高效性和安全低毒等优势,在基因治疗等领域展现出了广阔的应用前景。如:诺西钠生是首个获批用于脊髓性肌萎缩症的药物,也是首个证明脊髓性肌萎缩症患者增加体内特定蛋白表达可以改善运动功能的药物。伊诺特生已被证明可以用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病。依特立生在人体内可以使肌营养不良蛋白纤维的数量增加,肌营养不良素的平均染色强度也相应增加,因此被证明可以治疗杜氏肌营养不良症。本研究旨在筛选可高效抑制登革病毒的ASO靶点,进一步评估和优化其抗病毒效率,最后获得抗登革病毒的反义寡核苷酸候选靶点,为后续研发相关的药物提供靶点建议和技术支撑。研究内容（1）抗登革病毒ASO靶点的设计与筛选。通过序列比对,我们在登革病毒基因组相对保守的区域选择10条长度为28bp的ASO候选靶点,同时利用靶向地中海贫血患者中基因组中发生突变的特异性序列作为无关靶点对照。分别将上述靶点合成相应的ASO靶点,同时在ASO靶序列的两端分别修饰吗啉代环和二氨基磷酸酯基团。随后,利用荧光定量PCR,在感染了登革二型病毒的Vero细胞模型中分别评价含有不同靶点的ASO对登革病毒载量的抑制效率。筛选出抑制病毒载量效率最高的反义寡核苷酸。（2）ASO抗登革病毒条件优化及效果评价。为了获得反义寡核苷酸最佳的抗登革病毒条件,我们分别对ASO抗登革病毒的最适剂量、最佳给药时间进行了评价。同时,我们利用病毒空斑实验,进一步验证了ASO对登革病毒活性的抑制。此外,为了验证其在不同细胞系中的抗病毒效果,我们分别在Vero,Hep G2等细胞系中评价了ASO的抗病毒效率。（3）反义寡核苷酸对登革病毒各亚型抑制效果分析。为了进一步评估ASO对不同型别登革病毒复制的抑制效果,我们分别建立了登革一、三、四型病毒感染细胞模型,随后利用上述研究中筛选出的ASO分别对不同型别登革病毒的病毒载量进行抑制效率检测,评估其对于登革病毒各亚型的抑制效果。研究结果（1）筛选出了抗登革病毒效果最好的靶向UTR区域的反义寡核苷酸（后续简称为ASO-UTR）。用靶向登革病毒十个基因靶点的反义寡核苷酸以相同的浓度进行抗病毒实验,可以观察到ASO-UTR的抗病毒效果最好,ASO-UTR实验组细胞生长状态与细胞对照组相似,提示病感染较少,72h病毒载量下降了99.8%。（2）筛选出了反义寡核苷酸抗登革病毒最佳给药浓度,用不同稀释倍数的ASO-UTR进行抗病毒实验,结果显示0.01μM,0.1μM,1μM,10μM浓度的ASO-UTR对登革二型病毒抑制效率分别为:0.01μM,84.46%±4.23%;0.1μM,97.48%±3.96%;1μM,99.58%±3.48%,10μM,99.97%±3.46%。可以看出,10μM浓度的ASO-UTR对病毒抑制效率最高,达到了99.97%±3.46%。（3）进行了不同给药时间抗病毒效果的差异性分析,以接毒时间为准,接毒后2h,6h和12h给药后,24h病毒抑制效率分别为:2h:99.88%±20.84%;6h:99.89%±20.84%;12h:98.99%±20.84%。48h病毒抑制效率分别为:2h:99.99%±26.23%;6h:99.98%±26.23%;12h:99.63%±26.23%。72h病毒抑制效率分别为:2h:99.94%±10.98%,6h:99.82%±10.98%;12h:98.78%±10.98%。得出结论为实际用药时间越早,效果越佳。（4）验证了ASO在不同细胞系中对于登革病毒均有抑制效果。在Vero细胞中,ASO-UTR对登革病毒的抑制效率为72h下降99.99%±10.66%。在Hep G2细胞中,ASO-UTR对登革病毒的抑制效率为72h下降99.99%±29.89%。（5）验证了靶ASO-UTR对于登革病毒各亚型均有抑制效果。ASO-UTR对登革一型病毒的抑制效率为24h下降了98.69%±15.22%,48h下降了99.83%±12.03%,72h下降了99.99%±11.82%。ASO-UTR对登革三型病毒的抑制效率为24h下降了99.71%±21.14%,48h下降了99.96%±29.92%,72h下降了99.99%±8.26%。ASO-UTR对登革四型病毒的抑制效率为24h下降了99.75%±4.89%,48h下降了99.99%±13.45%,72h下降了99.99%±18.94%。研究结论本研究发现靶向登革病毒基因组UTR区域的ASO可以高效抑制登革病毒复制,该ASO在细胞模型中将登革病毒的病毒载量降低了99.99%±29.89%,且对4种亚型的登革病毒均有抑制作用。本研究还探究了ASO的最佳使用剂量和给药时间。因此,本研究将为后续基于ASO的抗登革病毒药物的开发使用提供候选靶点和技术支持。
关键词: 登革病毒 ；反义寡核苷酸 ；靶向UTR区域
被引量
1
摘要： 目的:登革热是由登革病毒引起的经蚊媒传播的急性传染病。目前,登革热治疗无特效药物,中医药在临床上治疗登革热显示出较大优势。本课题主要研究从清热解毒中药紫花地丁中分离得到的化合物木犀草素的抗登革病毒作用并试图阐明其抑制作用机制。方法:1.木犀草素抗登革病毒的活性评价及其抑制病毒靶点研究:Cel Titer-Glo试剂盒检测木犀草素对Huh-7（人肝癌细胞系）,BHK-21（幼年叙利亚地鼠肾细胞）,Vero（非洲绿猴肾细胞）,HEK-293T（人胚肾细胞）和A549（人非小细胞肺癌细胞）细胞的毒性;采用空斑法检测木犀草素对DENV 1-4病毒感染Huh-7细胞的病毒抑制作用。采用空斑法检测木犀草素对DENV 2病毒感染BHK-21、Vero、HEK-293T及A549等不同细胞的抑制作用。利用登革病毒感染PBMC的抗体依赖增强（ADE）模型,检测木犀草素抗ADE介导登革感染的活性。使用ELISA试剂盒检测木犀草素对受登革病毒感染的PBMC细胞释放的炎症因子IL-6的影响,评价其抗炎作用。以病毒E、NS3、NS5蛋白和病毒ds RNA为指标,采用间接免疫荧光法分析,从蛋白水平考察木犀草素对登革病毒的抑制作用。使用ADE-DENV-2病毒感染AG129小鼠致死模型,分析血清中病毒复制情况,评价木犀草素在体内的抗登革活性。采用空斑实验检测DENV-2病毒感染Huh-7细胞后不同时间（-2,0,2,6,12,24,48h）加入木犀草素的病毒复制情况,判断木犀草素抑制登革病毒增殖的时间阶段,考察木犀草素对登革病毒复制周期的影响。DENV-2病毒在Huh-7细胞里建立起感染后（即感染12小时后）加入木犀草素,收集感染后24、36、60小时的样本,使用实时荧光定量PCR仪分析细胞内和细胞外的病毒RNA水平、使用空斑法测定病毒滴度、使用western blot分析细胞上清液病毒蛋白成分,初步确定木犀草素作用于病毒的生命周期阶段、预测作用蛋白靶点。采用体外蛋白酶活性抑制实验探讨木犀草素对宿主furin蛋白和病毒NS2B/NS3pro抑制能力及预测其结合方式。采用Autodock软件分子对接技术对木犀草素与furin的结合方式进行预测。2.木犀草素耐药株的筛选及耐药机制研究:建立细胞模型,通过在逐渐增加木犀草素浓度的条件下对DENV-2病毒多次传代,筛选对木犀草素耐药的突变株,全基因测序确定病毒基因突变位点,评价木犀草素的耐药性及确定其对病毒的作用靶点。反向遗传法将突变位点引入感染性克隆,将重组的体外转录RNA电转染进C6/36细胞,获得病毒液供后续实验使用。将不同耐药突变株病毒感染Huh-7细胞,检测感染后6-48h病毒复制情况,评价耐药突变株的复制能力。DENV-2 wildtype及不同突变株病毒在Huh-7细胞里建立起感染后（即感染12小时后）加入木犀草素,收集感染后60小时的样本,使用空斑法测定病毒滴度、使用western blot分析上清病毒蛋白成分,考察木犀草素对不同耐药突变株的耐受性。体外模拟furin在高尔基体剪切不成熟病毒（不同耐药株）prM蛋白,使用western blot及间接免疫荧光分析木犀草素对prM蛋白剪切的抑制作用及其感染力,初步研究木犀草素对耐药株的耐药机制。结果:1.木犀草素抗登革病毒的活性评价及其抑制病毒靶点研究:在药物浓度为0.01～100μM范围内,木犀草素在Huh-7、HEK-294T、BHK-21细胞的毒性相似,CC50分别是45.89、38.89、34.73μM;在A549和Vero细胞的毒性相似,CC50为分别是93.64和大于100μM。木犀草素对不同血清型登革病毒具有显著抗病毒作用,以剂量-效应依赖方式抑制DENV 1-4,EC50分别为4.36、5.19、5.69和8.38μM,选择指数（SI）分别为6.37、8.84、8.07和5.48。木犀草素在不同的细胞系上也能抑制DENV-2,包括A549、HEK-293T、BHK-21和Vero细胞,EC50分别为39.16、12.26、14.04和9.36μM,SI分别为2.39、3.17、2.47和10.68。SI均大于2,表明木犀草素抗登革病毒效能为低毒高效。木犀草素对抗体依赖增强介导的登革病毒感染PBMC细胞具有抑制作用,以剂量-依赖方式抑制ADE-DENV-1,EC50为15.61μM、SI为3.23,SI大于2,表明木犀草素抗登革病毒效能为低毒高效。木犀草素能抑制病毒感染宿主细胞分泌的炎症因子IL-6,表明木犀草素可有效调节炎症因子的分泌。间接免疫荧光结果表明木犀草素在浓度为10μM时能一定程度上减少登革病毒ds RNA的合成及E、NS3、NS5蛋白的表达,抑制率为50%左右,表明木犀草素可能通过其它途径阻碍登革病毒的增殖。分别在感染前2小时和0、2、6、12、24、48小时加入木犀草素,在感染时加入木犀草素效果最显著;在感染24小时后即病毒已完成第一轮增殖,加入木犀草素依然能有效减少感染性病毒颗粒的释放,表明木犀草素可能主要影响病毒生命周期的后期阶段如包装、成熟、释放及阻碍病毒的二次感染。在感染12小时后才加药,分析木犀草素对病毒复制不同时间的影响。木犀草素处理组的细胞内外病毒RNA水平和病毒对照组的无显著差异,但是木犀草素处理组上清液病毒滴度相比病毒对照组显著减少（60 h p.i,减少15.5倍）,释放的病毒颗粒含有更多的prM蛋白,提示木犀草素处理组细胞分泌的病毒颗粒大多是携带prM蛋白、不成熟且不具有感染性。一天4次、每次100mg/kg的木犀草素剂量未能保护DENV-2感染小鼠死亡,也不能降低血清中病毒RNA水平,但是空斑实验测定的病毒滴度（感染性病毒颗粒水平）在第3天却比对照组减少2倍,*P<0.05,表明木犀草素也能在体内抑制成熟登革病毒的释放,体内体外数据具有一致性。体外蛋白酶活性抑制实验表明木犀草素抑制宿主furin的剪切活性呈剂量依赖型,在浓度为200μM能达到大于95%的抑制作用,木犀草素对furin是反竞争抑制剂,抑制常数Ki为58.6μM。木犀草素抑制病毒NS2b-NS3pro的切割活性呈剂量依赖型,在浓度为200μM能达到约65%的抑制作用。木犀草素对NS2b-NS3pro为非竞争抑制剂,抑制常数Ki为140.36μM,抑制能力比较弱。通过分子对接技术预测木犀草素与furin的N310、Q488的侧链和G265的酰胺键以中等至弱的静电相互作用结合,与P-结构域的W531以疏水作用结合。木犀草素与P结构域的b3和b6、及催化结构域灵活的环区a4、b5和b6结合破坏了P domain的稳定性,并使底物结合不稳定。2.木犀草素耐药株的筛选及耐药机制研究:P10代病毒液出现了木犀草素耐药突变株,分别在prM蛋白79位由酪氨酸T突变为精氨酸R、在NS2B蛋白114位由异亮氨酸I突变为蛋氨酸M,PrM T79和NS2B I 114在DENV1-4中均为高度保守,保守率分别是100%和98.15%-100%。反向遗传法获得耐药突变株（prM T79R,NS2B I114M,prMT79R-NS2B I114M）,体外转录RNA电转染进C6/36细胞,将上清液获得的耐药突变株病毒液感染Huh-7细胞,与DENV-2 wildtype相比,prM T79R突变株复制得比较慢,NS2B I114M复制得比较快,而prMT79R-NS2B I114M的复制情况与WT相似。同样的,在突变株感染Huh-7细胞12小时后才加木犀草素,感染60小时后的相对病毒滴度分别为9.78%（WT）、41.19%（prM T79R）、33.20%（NS2B I114M）和54.10%（prM T79R-NS2B I114M）。各突变株经木犀草素处理后含有比WT更少的prM蛋白,表明prM T79R、NS2B I114M及prM T79R-NS2BI114M突变株均能减少对木犀草素的耐受性。木犀草素可在胞外抑制furin对WT或NS2B I114M突变株prM蛋白的切割,可部分抑制对prM T79R（减少73%）和prM T79R-NS2B I114M（减少87%）突变株prM蛋白的切割。木犀草素不能恢复WT或NS2B I114M不成熟病毒的感染力,可部分恢复prM T79R和prM T79R-NS2B I114M突变株的感染力。结论:木犀草素在Huh-7细胞上能抑制4种不同血清型登革病毒,半数有效浓度具有相似性,提示木犀草素对不同血清型的登革病毒作用靶点可能是同一种成分或者相同的通路。木犀草素在不同的细胞系上具有不同的抗病毒效能,在HEK-293T、A549和BHK-21上相似,在Huh-7和Vero细胞上相似。木犀草素的抗病毒作用也适用于抗体依赖增强介导的登革病毒感染,并能在一定水平上抑制IL-6的分泌,从而抑制病毒感染导致的细胞因子分泌失调,减轻炎症损伤。木犀草素也能抑制登革病毒感染AG129小鼠体内感染性病毒颗粒的生成,体内体外实验数据具有一致性。木犀草素能减少第二轮感染性病毒颗粒的释放,可能主要影响病毒生命周期的后期阶段。木犀草素虽然不能抑制病毒RNA复制和蛋白的合成,但是可以减少感染性病毒颗粒的释放,阻止prM向M蛋白的转化从而抑制病毒的成熟阶段。宿主furin及病毒NS2B/NS3与病毒的成熟阶段相关,木犀草素对furin是反竞争抑制剂,对NS2B/NS3是较弱的非竞争抑制剂。耐药突变株的筛选确定编码PrM和NS2B病毒蛋白的两个基因产生突变:prM T79R和NS2B I114M。反向遗传法将突变位点引入感染性克隆获得耐药突变株,prM T79R突变株的复制能力比WT弱,而NS2B I114M突变株的复制能力比WT强,prM T79R-NS2B I114M突变株与WT的复制能力相当。PrM T79R和NS2BI114M突变对病毒复制能力具有补偿作用,不同突变株复制能力不同的机制有待进一步研究。PrM T79R或NS2B I114M突变点均对木犀草素减少敏感性,木犀草素对furin蛋白酶切活性的抑制可能涉及到宿主furin和不成熟的病毒颗粒交界面的相互作用,其允许病毒通过使关键的氨基酸突变、改变交界面的结构,从而使得病毒逃逸木犀草素的抑制作用。综上,木犀草素抑制furin的活性可能是通过调控furin和prM蛋白之间的结合界面及与NS2B/NS3相互作用,揭示了病毒成熟过程的可塑性。通过干扰宿主furin蛋白酶活性及与病毒prM和NS2B蛋白相互作用来抑制病毒的成熟阶段是潜在的抑制登革病毒感染的靶标。
关键词: 木犀草素 ；登革病毒 ；成熟阶段 ；Furin蛋白 ；prM蛋白
被引量
4
摘要： 登革病毒(dengue virus, DV)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群,依病毒包膜蛋白E的抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型,其中2型传播最广泛,同一型中不同毒株也存在一定抗原差异。登革热(dengue fever, DF)是由登革病毒感染引起的急性虫媒传染病,临床特点为高热、头痛、肌肉、骨关节剧烈酸痛、皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少和血小板减少等。重者可表现为登革出血热(dengue haemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS),登革病毒可直接侵犯心脏,高热、缺氧可引起休克,病死率较高。近几十年来,随着旅游和经济的发展,DF发病率大幅度上升,据WHO估计,全球约有超过2/5人口受到其威胁,每年约有亿计的人感染该病毒。登革热发病人数逐年增加,但由于登革四价减毒活疫苗诱发体内中和性抗体滴度的不平衡性、抗体依赖性感染增强作用(Antibody dependent enhancement,ADE)的存在病毒毒力问题、抗登革病毒小分子药物的透膜及特异性等问题的困扰,截止目前临床尚无预防与治疗登革热的有效措施。虽然报道多种有应用前景的登革热疫苗和抗病毒药物正在研究开发,但却没有一个被正式批准在临床应用。可见,登革病毒仍是当前严重影响人类健康的重要病原之一。本研究的目的在于筛选具有抗登革病毒作用的天然产物,并从中选择抑制效果显著的天然产物,分离其有效组分,并对其抗病毒的机制进行初步探讨,研究结果将为开发有效的防治登革热药物奠定基础。首先在细胞病变抑制试验的基础上,结合细胞病变作用(cytopathic effect,CPE)观察试验、MTT染色试验和病毒载量测定试验三种评价方法,建立一种快速可靠的多种指标联合筛选抗登革病毒药物方法。采用上述方法检测了40多种药用植物和海洋微生物,获得了抗登革病毒(DV-2)效果较好的提取物5种,其中菘蓝样品水提物的IC50为84μg/mL, TI为55.83,将其选为进一步研究的对象。通过进一步分离纯化菘蓝地上部分的成分,获得单体化合物,采用体内、外两种试验方法对单体化合物抗登革病毒效果进行研究。体外试验包括DV-2对C6/36细胞CPE观察试验、MTT染色试验和病毒载量测定试验。体外细胞试验过程中采用先感染病毒后给药、先给药后感染病毒和药物与病毒同时作用三种方式进行抗病毒机制的初步探讨。体内试验采用小鼠染毒试验。体外试验结果显示,菘蓝地上部分分离化合物GB-7和GB-8对DV-2在细胞水平均有较好的抑制作用,初步研究表明菘蓝地上部分分离化合物抗登革病毒机制与其对病毒在细胞内复制增殖的抑制作用有关,而与其对病毒吸附细胞的阻断作用及对病毒的直接灭活作用相关不大。体内试验结果显示：菘蓝地上部分分离化合物GB-7和GB-8给药组,与未给药的对照组相比,小鼠的存活率、生存时间均有提高,尤其是化合物GB-7组,说明菘蓝单体化合物对登革病毒感染的小鼠具有保护和治疗作用,能明显延长感染登革病毒小鼠的存活时间,提高生存率。从菘蓝地上部分水溶部分分离得到的化合物GB-7,经一系列化学反应检测呈阳性,可确定其活性成分为苯甲醚类化合物。核磁共振检测其1H谱、13C谱,结合谱库检索表明,化合物GB-7为新单体,主要成分为苯甲醚类。在Scifinder数据库中搜索,明确化合物GB-7为新单体。本研究取得的主要成果：1、建立了一种快速可靠的筛选抗登革病毒药物的模型,并对40多种天然产物样品进行筛选,获得3种对DV-2有不同抑制作用的样品。其中菘蓝地上部分水溶部分对DV-2均有较好的抑制作用。2、菘蓝地上部分分离化合物GB-7对DV-2在体内和体外均有较好的抑制作用。3、菘蓝地上部分分离化合物抗登革病毒机制与其对病毒在细胞内复制增殖的抑制作用有关,而与其对病毒吸附细胞的阻断作用及对病毒的直接灭活作用相关不大。4、初步确定.菘蓝地上部分提取物中DV-2的有效组分为苯甲醚类物质。5、菘蓝地上部分分离化合物GB-7为新单体,主要成分为苯甲醚类。
关键词: 天然产物 ；登革病毒 ；抑制作用 ；筛选 ；有效组分
被引量
3
摘要： 本论文由两个部分组成：第一部分是基于结构的药物设计和优化。对前期计算机虚拟筛选得到的药物先导化合物,通过合理药物设计和化学合成手段得到一系列衍生物,测试其药理活性,并总结构效关系。分别针对RhoA蛋白酶和登革病毒NS2B-NS3蛋白酶这两种靶标,开展小分子抑制剂的设计、合成与药理活性研究。
RhoA蛋白酶是Ras超家族中的一员,作为抗癌、神经系统疾病和心脑血管疾病的治疗药物靶标被广泛研究,然而其小分子抑制剂尚无报道。因此,我们探讨了RhoA蛋白酶小分子抑制剂的设计、合成与药理活性研究。
在前期计算机虚拟筛选和SPR技术的基础上,我们发现了3个有较好结合活性的化合物(化合物8-10)。结合化合物的结合活性和可合成性,选取了化合物8作为RhoA抑制剂的先导结构进行优化,通过合理药物设计和化学合成手段,进行三轮结构改造,得到41个化合物(8,A1-22,B1-8和C1-10)。通过测试其酶水平活性,发现8个具有较强活性的抑制剂(微摩级)；测试其组织水平活性,最终发现了两个目前活性最强的RhoA小分子抑制剂,值得一提的是我们发现的RhoA抑制剂为第一代RhoA小分子抑制剂。这些研究结果为发展心血管疾病的治疗药物奠定了结构基础。
登革病毒是黄病毒属的成员之一,具有极强的感染性,在全世界超过100个国家流行,但目前尚无有效的治疗药物和疫苗报道。登革病毒NS2B-NS3蛋白酶是一个新型的、至关重要的药物靶标,目前关于它的小分子抑制剂研究仍十分有限。因此,我们研究了登革病毒NS2B-NS3蛋白酶抑制剂的设计、合成与药理活性研究。
首先,基于登革病毒NS2B-NS3蛋白酶晶体结构,我们构建了虚拟筛选模型,结合酶抑制活性测试实验,最终发现3个化合物(化合物26-28)有较好的酶抑制活性,我们结合化合物的抑制活性、结构多样性和可合成性,选取化合物26作为登革病毒NS2B-NS3抑制剂的先导结构进行优化,为进一步提高药物活性,通过骨架跃迁得到新的分子骨架,合理设计并合成了两类具有全新分子骨架的化合物。两轮结构改造共合成了36个NS2B-NS3抑制剂(26,D1-14,E1-13和F1-8),分别测试了这些化合物的酶抑制活性和病毒复制子抑制活性,其中17个化合物具有酶抑制活性(微摩级),4个化合物显示较好的治疗指数和抗病毒活性。最终发现了目前最强的NS2B-NS3小分子抑制剂,为发展抗登革病毒药物奠定了结构基础。同时,第二轮结构改造的药物活性较第一轮的有明显提高,证明了从虚拟筛选到骨架跃迁的结构优化方法的有效性。
第二部分是两种有机小分子不对称催化反应研究。发展了两种有机小分子不对称催化反应方法,应用这些方法可以快速构建优势骨架分子,为药物筛选研究提供较好的分子库。
其一,以各种取代靛红和吲哚为原料,在金鸡纳碱类催化剂的作用下,通过一步傅-克反应,高效制得手性3-吲哚基-3-羟基-2-吲哚酮类优势骨架化合物,产率68-97%,对映选择性为76-91%。
其二,在吡咯烷类催化剂的作用下,以烯醛和羰甲基-2-吡啶砜为原料,高对映选择性(89-100%)地制备3-取代-1,5-醛基酯类化合物,以此为中间体,经一勺烩的缩合-还原-内酰胺化串联反应或还原-内酯化串联反应,分别制得取代六元内酰胺和内酯类优势骨架分子。
综上所述,通过综合运用计算机虚拟筛选、化学合成和生物测试的方法,针对两种不同药物靶标,我们设计并合成了77个化合物(8,26, A1～22, B1～8, C1～10, D1～14, E1～13和F1-8),最终发现了这两个靶标目前最强的小分子抑制剂。另外,发展了两种高效的有机小分子不对称催化反应方法,快速构建了两类优势分子骨架。这些研究为我们开发新药奠定了基础。
关键词: 基于结构的药物设计 ；RhoA蛋白酶 ；登革病毒NS2B-NS3蛋白酶 ；小分子抑制剂 ；有机小分子催化 ；合成方法学 ；傅-克反应 ；迈克尔加成
被引量
3
摘要： 登革病毒是黄病毒属、有包膜的单正链RNA病毒,根据其包膜的抗原性不同,分为四种血清型(DENV1-4),主要以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,广泛流行于热带和亚热带地区。临床上主要引起登革热(Dengue Fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。其中,DF是自限性发热性疾病;而DHF/DSS则引发血管通透性显著增加,导致血浆渗漏引发休克,严重威胁患者的生命。世界上约有半数的人口生活在登革热疫区,每年有超过5000万的感染病例,其中有50万人发展为严重的登革出血热和登革休克综合征。但是,临床上缺乏预防和治疗DENV感染的有效疫苗和药物,主要以对症支持治疗为主。基于临床上针对DENV感染无有效防治手段的现状,治疗性抗体策略获得了广泛关注。大量体内、外实验证明:中和抗体能有效阻止DENV的感染,不仅能发挥病毒感染前的预防作用,而且在病毒感染后的一段时期内,依然能发挥治疗病毒感染的作用。
DENV基因组编码3个结构蛋白(核蛋白C,膜结合蛋白M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白( NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中,包膜E蛋白是病毒的主要结构蛋白,位于成熟病毒颗粒表面,排列成平行二聚体结构,构成病毒颗粒的主要突起。E蛋白在空间结构上形成3个不同的结构域(ED1,ED2和ED3),其中,第3个结构域(ED3)介导了病毒与靶细胞的吸附,包含最重要的中和表位。
但是,E蛋白上中和性表位知之甚少,同一血清型登革病毒内不同基因型病毒株之间的差异对抗体保护作用的影响也还有待于进一步分析。这些问题都阻碍了登革病毒致病机理的阐明及防治手段的开发。因此,确定登革病毒E蛋白的中和性表位,阐明抗体中和作用的机制,进一步探讨病毒致病性相关的关键氨基酸残基,不仅能促进对其致病机制的了解,也为登革热的防治提供重要信息;无论从DENV发病机理,还是研发疫苗和治疗药物,都具有重要意义。
在登革病毒致病机制及其抗体治疗策略的研究过程中,人们发现交叉反应性非中和抗体以及亚中和浓度的抗体能够通过抗体的Fc段产生抗体依赖的感染增强作用(ADE),进而促进疾病的进展,这种现象阻碍了疫苗和单克隆抗体在登革热及其他相关病毒防治中的应用。登革热常发生几种血清型的交叉感染,因此,抗体要应用于治疗,必须能同时对四种血清型病毒均能产生有效的保护。现有的强中和活性的单克隆抗体,多为单个型或只针对少数几个型的单克隆抗体,虽也有多株交叉反应性抗体,但针对不同血清型病毒的保护效价不一;而几种抗体的混合应用又存在成分复杂以及需进行多次临床试验的问题。双可变区抗体技术( Dual-Variable-DomainImmunoglobulin, DVD-Ig)可以通过将2株不同抗体可变区构建于一株抗体分子上并保持原有抗体的亲和力和保护活性,大大简化了多株抗体混合应用带来的麻烦;获得的抗体可进一步经过基因工程改造,将抗体的Fc断改造以消除ADE。在针对四种血清型登革病毒的抗体治疗过程中,通过将只针对几个型的具有强中和活性的单克隆抗体进行重新构建,可获得同时针对四种血清型登革病毒具有广谱中和活性的双可变区抗体。
本项研究旨在利用杂交瘤筛选技术筛选获得具有中和活性的单克隆抗体,验证其体内外中和活性,进一步分析登革病毒ED3蛋白的中和表位,明确了抗体结合的关键位点,初步阐明其中和作用的机制;进一步采用基因工程方法构建嵌合抗体及无ADE活性的广谱中和性抗体。研究主要包括四个部分:
一、登革病毒ED3区特异单克隆抗体的制备及功能鉴定
我们以重组串联的四种血清型登革病毒ED3蛋白作为免疫原,采用常规方法建立分泌针对登革病毒ED3区的杂交瘤细胞系。最终获得了14株登革病毒ED3区特异单抗(1B12、1E12、1G6、1H8、2F9、2G9、2H12、3A10、3H12、4H10、5C10、6E1、6H7和7G5)。
为了对这14株单抗所针对的病毒进行鉴定,我们以四种血清型病毒感染的BHK细胞制备的抗原片对其进行免疫荧光检测。结果证实,这14株杂交瘤细胞所分泌的单抗均特异性针对登革病毒,对其他黄病毒属成员不具有交叉反应;14株单抗对不同血清型登革病毒的交叉反应测定结果显示,1B12、1E12、2H12、3A10、5C10、6H7和7G5是登革1型病毒特异的单抗;1H8和2G9为登革3型病毒特异单抗;1G6为登革4型病毒特异单抗;2F9可交叉结合登革1、3型病毒;3H12和4H10可交叉结合1-3型登革病毒;6E1可交叉结合四种血清型病毒。上述结果表明,我们获得了ED3结构域特异的针对四种血清型登革病毒的单抗,为ED3蛋白的抗原表位分析、登革病毒的诊断以及新型疫苗和抗病毒药物研究提供重要信息和工具。
采用蚀斑中和减少试验检测这14株登革病毒特异单抗的体外中和活性,获得一株登革4型病毒特异的中和抗体;其次,对体外有中和活性的单抗采用乳鼠颅内保护模型观察其体内保护作用。结果显示,其中一株特异性针对登革4型病毒的单抗1G6具有较强的体外中和活性和体内保护作用,单一50μg剂量的抗体可以可在登革4型病毒感染4h和24h后分别使90%和30%的小鼠存活,表明它对登革病毒的感染具有一定治疗作用。
为了确定中和抗体的作用机制,我们采用吸附前后蚀斑实验测定其在病毒感染周期中发挥作用的方式。结果显示,1G6主要通过抑制登革病毒与靶细胞的吸附来发挥中和作用;当病毒与靶细胞吸附之后,其中和效价大大降低。
二、中和表位的筛选与鉴定
为了分析登革4型病毒特异性中和抗体的中和表位,我们首先采用噬菌体随机12肽库对单抗1G6抗原表位进行筛选获得了其一致表位序列,并进行了每5个氨基酸的系列缺失突变进一步证实了肽库的筛选结果。序列比对结果显示,该单抗表位所对应的多肽序列位于登革4型病毒E蛋白第3结构域387LTLH390区域。在一级结构上,登革4型病毒E蛋白第388和390位氨基酸与登革1-3型病毒ED3蛋白存在不同;从已有结晶的三维结构上分析,发现,位于第390位的组氨酸,含有一个与其它型登革病毒所不同的咪唑环结构。
为了确定单抗1G6与E蛋白结合的关键位点,我们进一步进行了定点突变并以间接ELISA方式测定不同氨基酸位点的突变对抗体结合力的影响。结果显示,当T388G和H390G单独突变时,单抗1G6与ED3蛋白的结合力有显著下降;当二者联合突变时,其结合力完全丧失,表明登革病毒E蛋白T388和H390位是1G6与其结合的关键位点。
三、嵌合抗体的构建及其生物学特性
为了减弱鼠源抗体的异源反应及下一步构建具有广谱中和活性的双可变区抗体,首先用5’RACE法获得了鼠源抗体1G6的轻重链可变区序列,并全基因合成了具有交叉中和登革1-3型病毒的抗体1A1D-2的轻重链可变区序列。在此基础上,将轻重链可变区分别与人重链(IgG1)和轻链(κ)恒定区连接构成全长人-鼠嵌合抗体后分别装入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了嵌合抗体轻重链的表达载体,共转染CHO细胞,经G418压力筛选获得可稳定分泌人-鼠嵌合抗体的稳转细胞株。实验证明,该抗体具有与亲本鼠源抗体相同的抗原结合活性和体外中和活性,为下一步构建双可变区中和抗体奠定了基础。
四、无ADE活性的双可变区抗体的构建及功能鉴定
采用基因工程技术,以overlap PCR的方式将单抗1A1D-2和1G6的轻重链可变区序列分别以9个氨基酸的linker进行前后连接,构建成DVD1A1D-1G6-VL、DVD1G6-1A1D-VL和DVD1A1D-1G6-VH、DVD1G6-1A1D-VH片段,分别与人IgG 1的轻重链恒定区连接后装入表达载体表达载体pcDNA3.1(+),共转染CHO细胞,G418筛选获得2种结构的DVD抗体稳转细胞株,无血清大量培养及抗体纯化,体外结合实验证实,DVD1A1D-1G6的结合活性要优于DVD1G6-1A1D。体内外实验证明,DVD1A1D-1G6抗体保持了双价抗体的体内外中和活性,实现了抗病毒谱的扩大,具有抗四种血清型登革病毒活性。进一步将介导ADE效应的Fc段缺失突变后,其ADE活性消失,同时Fc段的突变对其中和活性无明显影响,表明我们成功构建了具有广谱抗登革病毒的无ADE中和抗体。
本研究筛选获得了14株登革病毒特异单克隆抗体,其中一株新型登革4型病毒特异性中和抗体,发现了新的E蛋白功能表位,为阐明E蛋白的结构与功能、登革病毒致病和免疫的分子机理奠定了理论基础;进一步构建获得了无ADE活性的可同时中和四种血清型登革病毒的双可变区抗体,为研制抗登革病毒新型抗体药物作出了探索和提供了重要信息。
关键词: 登革病毒 ；E蛋白 ；抗原表位 ；中和 ；嵌合抗体 ；双可变区抗体
被引量
2
摘要： 一、黄病毒抑制剂的设计合成 黄病毒科病毒是一类有包膜的单股线型的正链RNA病毒，包括登革病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒等。其中，登革病毒经由蚊媒传播，可引起登革热和登革出血热/登革休克综合征等急性传染病，严重者可致死。近年来，该种传染病的病例迅猛增加，已威胁到全球超过一半人口的健康安全。但目前尚无有效的疫苗进行预防，也没有相应的特效抗病毒药物。因此，研究开发低毒、高效的抗登革病毒药物具有重大意义。 利用高通量登革病毒复制筛选模型对化合物库进行筛选，我们发现了几类具有抗登革病毒活性的化合物，其中喹唑啉类为新型登革病毒抑制剂。我们对其合成方法学进行了考察，设计合成了聚焦分子库。在对其苯环及嘧啶环的取代基构效关系研究中，得到多个细胞水平EC50在nM级别的先导化合物，其中化合物yhhu1157具有良好的药代性质，有望进入临床前研究阶段。另外，该类化合物还表现出一定的丙型肝炎病毒抑制作用。 二、基于色酮衍生物的多样性合成及应用研究 近年来我们课题组一直致力于以取代色酮为原料，采用多样性导向的合成策略，通过设计并利用串联、多组分及一锅反应等反应，高效地建立多样性的新型杂环小分子库，以寻找新颖的活性先导化合物。通过对化合物库进行的活性筛选，我们获得了一类呋喃并香豆素类黄嘌呤氧化酶抑制剂，其中化合物yhhu0356的活性与临床用药别嘌呤醇相当。黄嘌呤氧化酶抑制剂是治疗痛风的一条条有效途径，目前临床所使用的相关药物主要是别嘌呤醇。该抑制剂可与黄嘌呤竞争性结合黄嘌呤氧化酶，但在使用中伴有发热、过敏性皮疹和肝功能损害等副作用，已不能满足当前治疗的要求。新药非布索坦抑制活性虽活性优于别嘌呤醇，但仍表现出肝功能异常、腹泻、恶心等副作用。我们对发现的活性化合物进行了构效关系研究。通过结构优化，在分子水平上将该类化合物的IC50提高至nM级别，发现了新型先导化合物。该类化合物结构新颖，对其成药性研究工作还在进行当中。 在对基于色酮衍生物的多样性合成的进一步研究中，我们发现了一种以铜促进、3-氯代色酮与脒类衍生物参与的串联反应，通过Michael加成、缩合环化和Ullmann偶联等步骤，快速高效地获得以苯并呋喃[3，2-d]嘧啶为母核化合物的新方法。据研究，该类化合物可表现出多种生物活性，但目前已报道的合成方法具有合成路线长、原料成本高、操作繁琐等缺点。而该新型的串联方法具有原料易得、反应条件温和等特点，为该类化合物库的建立提供有效的方法学支持。
关键词: 黄病毒抑制剂 ；色酮衍生物 ；多样性合成 ；先导化合物
摘要： 黄病毒是由节肢动物传播的重要的人类致病原，能够导致人患病甚至引起死亡，但目前还没有一种有效的治疗性药物，因此开发高效的抗黄病毒感染的药物具有重要意义。环孢霉素(Cyclosporine;Cs)和布喹那(Brequinar;BQR)分别通过抑制细胞内具有肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl isomerases;PPlase)活性的亲环素蛋白(cyclophilins;CyPs)和嘧啶合成所需的二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase;DHODH)活性，从而分别抑制丙型肝炎病毒(HCV)和部分黄病毒成员的感染。
本文在研究Cs和BQR抗黄病毒的活性的基础上，对其抗黄病毒机制进行了研究，表明了宿主蛋白CyPs和DHODH可作为抗黄病毒药物的潜在靶点。在对Cs的研究中，我们发现Cs的靶点蛋白CyPs对黄病毒的复制起到了重要的作用。一方面，在敲除CyPs的细胞中黄病毒的复制水平低，这种因为CyPA敲除所导致的黄病毒低水平复制能通过表达外源野生型CyPA得到回升，而无PPlase活性的CyPA突变型的外源表达并不影响黄病毒的复制，表明CyPA的PPIase活性对于黄病毒的复制起到了关键性的作用;另一方面，CyPA能够和西尼罗病毒的基因组RNA以及病毒的非结构蛋白NS5相互作用，暗示了CyPA存在于西尼罗病毒的复制复合体中。病毒抑制、时相加样法和瞬时复制子实验结果表明，Cs作为CyPA活性抑制剂也能够明显抑制黄病毒的复制;生化分析证明，Cs能直接阻断CyPA和西尼罗病毒NS5蛋白之间的相互作用，揭示了Cs通过阻断WNV复制复合体的形成来抑制病毒RNA合成的抗病毒作用机理。BQR作为DHODH酶活抑制剂具有广泛的抗病毒活性。它不仅抑制黄病毒属成员(登革病毒，西尼罗病毒，黄热病毒以及波瓦生病毒)同时也抑制甲病毒属的西方马脑炎病毒(单股正链RNA病毒)和棒状病毒属的水泡性口炎病毒(负链RNA病毒)。我们利用登革2型病毒(dengue virus serotype2;DENV-2)作为研究模型，发现BQR能抑制病毒的RNA合成，而同时外源的嘧啶核苷能够特异性回复BQR对DENV-2的抑制效果。通过持续加药筛选获得了BQR耐药性病毒株，测序分析表明，耐药病毒株有两个氨基酸发生突变：一个突变(M260V)处在病毒的结构蛋白包膜蛋白的结构域Ⅱ的螺旋结构上，另一个突变(E802Q)在非结构蛋白NS5的聚合酶结构域的激发环上。进一步的分析表明，耐药毒株是通过NS5的突变增强聚合酶活性从而产生抗药性，包膜蛋白的突变虽然降低了病毒粒子包装和释放的效率，却在包装和释放阶段对BQR的抑制作用变得不敏感。这些结果暗示了(i) BQR能够通过消耗细胞内的胞嘧啶来抑制DENV RNA的合成;(ii)这个化合物可能通过抑制病毒粒子的包装和释放来产生抗病毒活性。以上两方面的研究结果证明CyPs和DHODH这两类蛋白可成为抗黄病毒复制的潜在靶点。为了高通量筛选出更多有效的抗黄病毒的药物，我们开发了一种崭新的高产量制备DENV-1假病毒(virus-like particle;VLP)的方法，确定了外源表达弗林蛋白酶对DENV-1 VLP的感染性起增强作用，优化了VLP感染条件，建立了以DENV-1 VLP为模型的药物高通量筛选体系。该筛选系统可以用于登革病毒的进入，翻译和复制抑制剂的筛选。384孔板中VLP感染体系应用时信号的稳定和灵敏性进一步证明了DENV-1 VLP感染系统可以快速、高通量进行登革病毒药物的高通量筛选。该筛选系统的建立将会促进抗登革病毒药物的研究和开发。
关键词: 抗病毒药 ；环孢霉素 ；生化药理 ；亲环素蛋白