- 首页
- 产品推荐个人精选服务科研辅助服务教育大数据服务行业精选服务学科系列服务产品服务
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
- 首页
- 产品服务
- 知识脉络
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
智能检索
二次检索
任意字段
在结果中检索
在结果中去除
暂无数据
共
12
条结果 ，以下是1
-
12条
1 / 1
已选:0 清除
批量下载
批量引用
相关度
摘要： 目的研究新型二氢叶酸还原酶抑制剂iclaprim对金黄色葡萄球菌(金葡菌)的体外抗菌活性及其与磺胺类药物的协同作用。方法收集2016年1月—2018年12月上海交通大学附属第一人民医院分离的非重复金葡菌498株,采用头孢西丁纸片扩散法检测细菌对甲氧西林耐药性,肉汤微量稀释法检测iclaprim、iclaprim-磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的最低抑菌浓度(MIC),比较其抗菌活性的差异。结果金葡菌对iclaprim的不敏感率较低(7.0%),并与甲氧苄啶、磺胺甲噁唑和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。iclaprim对全部金葡菌、MRSA和MSSA的MIC50分别为0.25、0.25、0.12 mg/L,MIC90分别为0.5、0.5、0.25 mg/L。根据MIC50、MIC90,iclaprim对相应菌株的抗菌活性是甲氧苄啶的8~32倍,是磺胺甲噁唑的256~512倍,但与甲氧苄啶-磺胺甲噁唑差别不大。对于甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和磺胺甲噁唑耐药菌株,iclaprim也显示出较弱的抗菌活性(MIC90≥16 mg/L)。磺胺甲噁唑与iclaprim具有协同作用,其可使iclaprim的MIC50、MIC90值(0.015、0.03 mg/L)降低4个稀释梯度。结论iclaprim对金葡菌(包括MRSA)有较强的体外抗菌活性,并与磺胺类药物具有协同效应,具有潜在的临床应用前景。
关键词: iclaprim ；二氢叶酸还原酶抑制剂 ；金黄色葡萄球菌 ；最低抑菌浓度 ；体外活性
被引量
1
摘要： 目的测定12种二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制剂(培美曲塞新型衍生物A1~A12)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌活性。方法通过优化实验条件,建立适合评价化合物对细菌及真菌抑制作用的MTT法,测定培美曲塞新型衍生物A1~A12对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的半数最低抑菌浓度(MIC_(50))。结果化合物A4、A7、A11、A12对金黄色葡萄球菌的MIC_(50)分别为7.05±4.67,1.11±0.21,14.12±0.54,9.86±2.31μmol/L;所有化合物对大肠杆菌和白色念珠菌均无抑制作用。结论化合物A4、A7、A11、A12对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用,其中A7抗菌活性较好,可作为候选化合物进行深入研究。
关键词: 培美曲塞衍生物 ；MTT法 ；半数最低抑菌浓度(MIC50) ；抗菌活性
被引量
1
摘要： 金黄色葡萄球菌是引起医院获得性肺炎(Hospital-acquired pneumoni,HAP)常见的病原体之一。近年来,金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性明显增加,针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染新型抗菌药物的研究受到广泛关注。艾拉普林(Iclaprim)属于二氢叶酸还原酶抑制剂,可阻断细菌的叶酸代谢,对引起HAP的革兰氏阳性病原体,包括金黄色葡萄球菌、肠球菌和链球菌属,具有良好的抗菌活性[1]。
关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ；医院获得性肺炎 ；二氢叶酸还原酶抑制剂 ；Iclaprim ；革兰氏阳性 ；抗菌药物 ；MRSA ；链球菌属
摘要： 抗生素的广泛使用导致了耐药性的日益严重,尤其是多重耐药菌的出现使现有临床药物的治疗效果逐渐降低,因此急需开发新型抗菌药物来保障人类健康安全。含有苯并吡喃酮的香豆素在结构上类似于临床抗菌药物喹诺酮(苯并吡啶酮),具有开发成为抗菌药物的潜力。此外,唑环能够通过非共价作用与生物体内的酶和受体结合,可改善生物活性,提高药代动力学性质,并广泛存在许多抗微生物药物中,对抗微生物感染做出了巨大贡献。鉴于此,本论文基于香豆素化合物在抗微生物领域的研究现状以及本课题组对唑类化合物的研究基础,设计合成了三个系列的香豆素唑类新化合物,并运用波谱技术对其结构进行表征,测定了所有目标化合物的抗微生物活性,筛选出了高活性分子,并通过一系列的化学生物实验研究了其成药潜力和抗菌机理,这可为临床提供新的抗菌候选分子。主要的研究工作如下:
1.香豆素噻唑烷酮类新化合物的合成及其抗微生物研究:以间氨基苯酚为起始原料,通过亲核反应、环化反应和缩合反应得到了31个亚胺共轭的香豆素噻唑烷酮类新化合物。大部分目标化合物能够有效地抑制细菌或真菌的生长,也表现出较好的抗鲍曼不动杆菌活性。其中吲哚衍生的噻唑烷酮共缀物II-14a对大部分细菌(MICs=0.25–2μg/m L)和真菌(MICs=0.25–4μg/m L)显示出较好的抑制效果,都分别强于临床药物诺氟沙星和氟康唑。高活性分子II-14a具有良好的药代动力学性质和生物利用度,不仅具有低的细胞毒性和溶血活性,而且对鲍曼不动杆菌的耐药性发展缓慢。此外,化合物II-14a可以破坏细菌细胞膜的完整性,通过活性氧介导的氧化应激抑制细菌生长,同时也能与DNA促旋酶发生相互作用和嵌入DNA发挥抗菌活性。
2.香豆素氨基膦酸酯类新化合物的合成及其抗微生物研究:在前面的基础上,将柔性的噻唑烷酮等排为刚性片段噻唑,得到了亚胺桥联的噻唑香豆素III-1,为改善其溶解度,引入磷酸酯片段得到了噻唑膦酸酯III-2。此外,通过不同的氨基香豆素、亚磷酸二乙酯和各种芳香醛在乙腈中经过Kabachnik-Fields反应得到了22个香豆素氨基膦酸酯化合物。部分化合物对金黄色葡萄球菌显示出优良的抗菌效果,其中3-羟基苯基膦酸酯衍生物III-4f(MIC=0.001 m M)的效果最好,是诺氟沙星(MIC=0.050 m M)的50倍。成药性评估发现化合物III-4f具有低溶血的性质,且能有效的清除生物膜从而降低细菌耐药性的产生。同时,化合物III-4f在与诺氟沙星联合使用时能够以协同作用对抗金黄色葡萄球菌感染。机理探索揭示了III-4f能靶向细菌细胞膜,破坏其完整性,导致蛋白质泄漏,而且能通过诱导活性氧和活性氮的产生破坏氧化还原平衡,阻止细菌生长。此外,化合物III-4f也能与DNA形成超分子络合物。
3.香豆素磺胺类新化合物的合成及其抗微生物研究:基于前一章基础,将氨基膦酸酯片段等排为磺胺片段,同时对香豆素环修饰合成了16个香豆素磺胺类化合物。大部分目标化合物的抗菌效果不明显,而硝基咪唑衍生的杂化物IV-7c能够在低浓度下(1μg/m L)有效的抑制大肠杆菌的生长,优于参考药物诺氟沙星和头孢唑肟。后续研究发现具有耐药性发展趋势缓慢的高活性化合物IV-7c能够通过多靶向作用如破坏细胞外膜和内膜、抑制正常代谢、诱导活性氧的产生和与二氢叶酸还原酶和DNA促旋酶结合来发挥抗菌功效。
本论文将香豆素与噻唑烷酮、氨基膦酸酯和磺胺杂合合成了三个系列的香豆素抗微生物分子,共合成了93个化合物,包括71个新目标化合物和22个中间体。生物活性评估发现部分目标化合物显示出强于临床药物或与之相当的抗菌效果;高活性化合物具有低毒性和低溶血性、低的耐药性发展趋势,与临床药物联用时也显示出协同作用;初步的抗菌机制显示高活性化合物能破坏细胞膜的完整性、导致细胞内容物泄露、打破细胞内氧化还原平衡、抑制正常代谢和插入DNA。以上研究表明高活性化合物II-14a和III-4f能够作为临床抗菌候选分子值得深入研究。
关键词: 香豆素 ；噻唑烷酮 ；咪唑 ；抗微生物 ；耐药性
摘要： 席夫碱基配合物是一类十分重要的晶体材料,长期以来在诸多领域都有着广泛的应用前景。席夫碱基配合物通过具有优越抗菌活性的金属离子与具有优良生物活性的席夫碱配体进行合成。这既可以使化合物的稳定性得到提高,又可使其具备优异的抗菌性能。
本研究以合成新型席夫碱基配合物来提高抗菌性能为目的,采用应用较为广泛的水热法、常规溶液法制备了5例具有新型结构的席夫碱基配合物抗菌材料[Zn（L1）(H2O)]1、[Ni（L1）]2、[Co（L2）2（H2O）]·2H2O 3、[Zn（L3）(phen)]34、[Ni（L3）(phen)（Me OH）]5（L1=3,5-二氯水杨醛缩邻苯二胺、L2=3,5-二氯水杨醛缩吖嗪、L3=3,5-二氯水杨醛缩氨基硫脲、phen=1,10-邻菲啰啉）,并将其应用于抗菌领域,具体研究内容如下:
1.首先以3,5-二氯水杨醛和邻苯二胺为原料,通过冷凝回流的方法制备了L1。进一步以L1、Zn（CH3COO）2·2H2O和Ni（CH3COO）2·4H2O为原料,使用常规溶液法制备了两种新型3,5二氯水杨醛缩邻苯二胺类席夫碱配合物,即[Zn（L1）(H2O)]1和[Ni（L1）]2。通过核磁氢谱确定了配体L1的结构,进一步使用密度泛函理论（DFT）对配体L1进行了结构优化,并通过分子静电势图预测了反应活性位点。解析了配合物1-2的结构,进一步使用Hirshfled表面分析研究了结构内的弱相互作用。此外,通过能量框架研究了配合物1-2中的能量组成。抗菌实验结果表明,配合物1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有潜在的抗菌活性（抑菌圈直径:15 mm）。借助离子释放实验评估了配合物1-2的离子释放能力。分子对接结果表明配合物1-
2与细菌中UDP-N-乙酰烯醇丙酮基葡萄糖胺还原酶（Mur B）和二氢叶酸还原酶（DHFR）存在相互作用。配合物1-2的潜在的抗菌机理被研究。
2.由于配合物1-2的抗菌效果有限,因此为了提升配合物的抗菌效果,采用了改变金属离子与引入水热合成的方法进行了配合物[Co（L2）2（H2O）]·2H2O 3的制备。首先,以3,5-二氯水杨醛和氨基硫脲为原料,通过冷凝回流的方法制备席夫碱配体L3,进一步在水热的条件下让L3与Co Cl2·5H2O反应制备具有新型结构的配合物3。单晶解析结果显示L3通过水热原位反应最终生成配体L2参与配位。同样对配体L2和配合物3进行了类似的理论计算与性质表征。抗菌实验结果表明配合物3对两种细菌均具有抑制效果[大肠杆菌（E.coli）:10 mm,MRSA:13 mm],且对于MRSA的抑制效果更明显。与配合物1-2相比,分子对接结果显示配合物3还可以与细菌中DNA发生作用。配合物3潜在的抗菌机理被研究。
3.纯席夫碱作为有机配体制备而来的配合物的抗菌效果是有限的,因此在配合物的合成中引入了抗菌性能优越的phen,使用常规溶液法制备了配合物[Zn（L3）(phen)]3 4和[Ni（L3）(phen)（Me OH）]5。同样对配体L3和配合物4-5进行了类似的理论计算与性质表征。抗菌实验结果表明配合物4-5具有较为优越的抗菌效果（4:E.coli:18 mm,MRSA:17 mm;5:E.coli:15 mm,MRSA:16 mm）。分子对接结果显示配合物4-5与细菌中蛋白质和DNA均可发生作用。此外,在配合物4-5存在下检测到细菌中产生了活性氧（ROS）。配合物4-5潜在的抗菌机理被研究。
关键词: 席夫碱 ；配合物 ；抗菌材料
摘要： 磺胺是第一类人工合成的抗菌药,广泛地应用于预防和治疗微生物感染。对母体结构的化学修饰,成功地开发出了许多临床磺胺药物。然而,细菌与磺胺类药物反复接触后,对药物的敏感性降低甚至消失,尤其在用量不足时更易出现。产生抗药性的原因,可能是细菌改变代谢途径,如产生较多二氢叶酸合成酶,或能直接利用环境中的叶酸。因此已有许多研究致力于对磺胺核心骨架进一步修饰以克服耐药性的产生,这促进了磺胺类化合物作为抗菌药物的发展。本论文基于磺胺类化合物的结构特点以及国内外研究现状,设计合成了三个系列具有抗菌潜力的唑类磺胺新衍生物,运用现代波谱手段对其结构进行了表征,探究了其高效制备方法。研究了目标化合物的抗菌活性,探讨了其构效关系,进一步探究了高活性化合物的成药潜力,并初步探索了其抗菌作用机制。研究工作总结如下:1.三个系列唑类磺胺新衍生物的合成:（a）咪唑磺胺类新衍生物的制备:以磺胺、亚磷酸二乙酯分别与一系列的商业醛或者自制芳香醛经Mannich反应“一锅法”制备唑类磺胺新衍生物Ⅱ-2–10。（b）噻唑磺胺类新衍生物的制备:以磺胺为起始原料与2-（2-氨基-4-噻唑基）-2-（甲氧亚氨基）乙酸硫代苯并噻唑酯Ⅲ-1反应得到（Z）-2-（2-氨基噻唑-4-基）-2-（甲氧基亚氨基）-N-（4-氨磺酰基苯基）乙酰胺Ⅲ-2。然后再将中间体Ⅲ-2分别与卤代烯烃、卤代炔烃和2,4-二氯嘧啶反应得到目标化合物Ⅲ-3a–c。此外,化合物Ⅲ-1与一系列磺胺类化合物反应得到噻唑磺胺类新衍生物Ⅲ-4–10。（c）噁二唑磺胺类新衍生物的制备:乙酰苯胺Ⅳ-1与氯磺酸通过磺酰化反应得到对乙酰氨基苯磺酰氯Ⅳ-2,然后与碳酸氢钠和亚硫酸钠反应得到对乙酰氨基苯磺酸钠Ⅳ-3。将化合物Ⅳ-3与溴乙酸乙酯反应得到2-(（4-乙酰氨基苯基）磺酰基)乙酸乙酯Ⅳ-4,进一步与水合肼发生肼解反应得到N-(4-(（2-肼基-2氧代乙基）磺酰基)苯基)乙酰胺Ⅳ-5,随后与二硫化碳经过成环反应得到中间体磺胺巯基噁二唑Ⅳ-6。将中间体Ⅳ-6与分别一系列的卤代烃、卤代醇、卤代羧酸和苄卤等反应得到噁二唑磺胺类新衍生物Ⅳ-7–9。2.使用1H NMR、13C NMR、31P NMR、HRMS和/或X-ray单晶衍射等现代波谱手段证实了所有新制备的化合物的结构。3.研究了三个系列唑类磺胺新衍生物的抗菌活性:（a）咪唑磺胺类新衍生物Ⅱ-2–10中的部分化合物对测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌显示出良好的抗菌活性。其中氟苄衍生物Ⅱ-5d对于大肠杆菌显示出优良的抑制效果,最小抑菌浓度为2μg/m L,其抗菌能力是临床药物诺氟沙星的4倍,氯霉素的8倍。（b）噻唑磺胺类新衍生物Ⅲ-2–10中的部分化合物对测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌显示出相当甚至优于临床药物诺氟沙星的抗菌活性。苯甲酰磺胺衍生物Ⅲ-10c能够有效地抑制大多数所测试菌株的生长,尤其对鲍曼不动杆菌的抗菌效果最好,最小抑菌浓度为0.25μg/m L,其抗菌能力是临床药物诺氟沙星的16倍。（c）噁二唑磺胺类新衍生物Ⅳ-7–9能够选择性的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。其中己基衍生物Ⅳ-8b对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1μg/m L,其抗菌能力是临床药物诺氟沙星的16倍。4.探讨了三个系列唑类磺胺新衍生物的构效关系:（a）咪唑磺胺类新衍生物Ⅱ-2–10的构效关系研究发现,在咪唑中引入不饱和片段的引入有利于抑制微生物的生长,然而引入不同长度的烷基链的对生物活性没有积极的影响。除此之外,当咪唑被具有更大共轭体系的芳杂环取代后,目标化合物的抗菌活性有所降低。（b）噻唑磺胺类新衍生物Ⅲ-2–10的构效关系研究发现,炔基的引入对革兰氏阴性菌的生长抑制有积极作用,此外,乙酰基的引入提高了目标化合物的抗菌能力。（c）噁二唑磺胺类新衍生物Ⅳ-7–9的构效关系研究发现,在巯基噁二唑中引入己基可以显著改善目标分子的抗菌能力,然而延长或者缩短碳链都会降低抗菌活性。5.研究了三个系列高活性化合物的成药潜力:（a）咪唑磺胺类新衍生物Ⅱ-2–10中氟苄衍生物Ⅱ-5d能够在短时间内快速杀灭大肠杆菌,并且没有明显的耐药性诱导趋势。此外,该分子对人类正常肾上皮细胞293T和红细胞几乎没有损伤。（b）噻唑磺胺类新衍生物Ⅲ-2–10中苯甲酰衍生物Ⅲ-10c能够快速杀死鲍曼不动杆菌,并且没有明显的耐药性诱导趋势,而且对人类哺乳细胞几乎没有毒性。药物联用研究发现化合物Ⅲ-10c与诺氟沙星对于鲍曼不动杆菌的抑制具有协同作用。体外药代动力学研究发现该分子显示出良好的药代动力学性质和较高的口服生物利用度。（c）噁二唑磺胺类新衍生物Ⅳ-7–9中己基衍生物Ⅳ-8b对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌没有明显的耐药性,体外药代动力学研究发现化合物Ⅳ-8b在计算机模拟中具有可观的药代动力学特征和极好的药物相似性。6.初步探索了三个系列高活性化合物的抗菌作用机制:（a）氟苄衍生物Ⅱ-5d显示出良好的清除大肠杆菌生物膜的能力,还可以诱导活性氧的产生,对细菌细胞膜造成损伤,进而与脱氧核糖核酸形成稳定的Ⅱ-5d-DNA络合物,从而导致细菌死亡。分子模拟发现该化合物可以与二氢叶酸还原酶通过非共价键相互作用结合。（b）苯甲酰衍生物Ⅲ-10c能够清除鲍曼不动杆菌形成的生物膜,有助于耐药性的降低。化合物Ⅲ-10c能够有效破地坏细菌细胞膜,干扰乳酸脱氢酶的正常生理功能,从而导致细胞内蛋白质的泄漏。此外,该分子还可以诱导活性氧和活性氮的产生,使细胞内的氧化还原稳态受到破坏,进一步促进了鲍曼不动杆菌呼吸通路的失活和谷胱甘肽活性的降低,从而导致细菌的死亡。（c）己基衍生物Ⅳ-8b能够有效损伤耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的细胞膜,与脱氧核糖核酸发生相互作用,形成稳定的Ⅳ-8b-DNA络合物,这可能是细菌代谢失活的原因。此外,分子对接表明Ⅳ-8b与DNA拓扑异构酶Ⅳ发生氢键相互作用。本文共合成了82个化合物,其中新化合物67个,包括新目标化合物65个和新中间体2个。抗微生物活性实验发现部分目标化合物的抗菌效果优于临床药物诺氟沙星或者与之相当。成药性研究发现高活性化合物显示出低耐药性,低毒性、快速杀菌能力以及良好的药代动力学性质。初步的抗菌作用机制表明高活性分子能够破坏细菌细胞膜,引起细胞内蛋白质的泄漏,嵌入脱氧核糖核酸,造成细胞内氧化应激,导致细菌代谢失活。分子模拟研究发现高活性化合物可以与酶发生相互作用。这些结果表明高活性化合物值得作为抗菌候选药物进一步研究。
关键词: 磺胺 ；唑 ；抗菌 ；耐药性 ；DNA
被引量
6
摘要： 磺胺类抗菌药是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化合物,在临床上常用于预防和治疗微生物感染。近年来,磺胺类化合物以其结构简单、抗菌谱广且不易引起二重感染等特点,新型磺胺类化合物的开发引起了科研工作者的关注。通过对其母核结构的修饰,已成功研发出多种临床磺胺类抗菌药。然而随着药物的使用,抗药性问题也愈发严重。因此,创造合成结构新颖、多样的磺胺类抗菌剂刻不容缓。本论文利用药物化学分子拼合设计原理,将具有潜在抗菌活性的二芳基甲烷片段与上市药物磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶等结构单元进行拼合,通过1,6-插烯迈克尔加成反应合成一系列新型二芳基类磺胺衍生物,并选取p-QMs-磺胺甲恶唑系列化合物为代表进行体外抗菌活性测试,对其生物活性进行初步探讨。具体研究内容如下:首先,以对亚甲基苯醌（1）和五种上市磺胺类药物（2）为底物,采用1,6-插烯迈克尔加成反应,成功构筑了一系列新型二芳基类磺胺衍生物。其中,考察了碱种类、催化剂种类及用量、反应温度、溶剂等条件,确定最优反应条件,并对底物进行拓展,验证了该方法的通用性。最终在绿色无溶剂条件下,利用Al Cl3催化该反应获得结构多样的32种目标化合物（3）,并经1H NMR、13C NMR波谱手段证实结构。其次,为进一步研究目标化合物是否具有生物活性,选取13种p-QMs-磺胺甲恶唑系列化合物为代表,选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为测试菌株,以临床药物氯霉素、诺氟沙星作为阳性对照进行最小抑菌浓度（MIC）测试。结果显示大多数化合物具有中等的抑菌活性,其中化合物3oa、3la、3fa对大肠杆菌的MIC值与诺氟沙星相当,是氯霉素的2倍。而后以Aotudock 4.0分子对接软件为工具,采用刚性半柔性对接方式,以活性分子3oa为例与二氢叶酸还原酶（PDB:3DRC）分子对接。结果显示3oa中酚羟基、恶唑环、磺酰胺基中氧原子的氧原子通过氢键与蛋白质氨基酸残基相互作用,从理论上分析了化合物与细菌作用的可能机制。这些结果表明,二芳基甲烷片段的引入对提高生物活性有一定的贡献,化合物（3）值得作为抗菌候选药物进一步研究。
关键词: 磺胺类药物 ；二芳基甲烷 ；迈克尔加成 ；抗菌 ；分子对接
被引量
1
摘要： 磺胺类药物是兽医临床治疗家畜呼吸系统、泌尿系统及细菌性痢疾等疾病的主要品种。由于临床上长期大量使用,导致临床疗效欠佳,耐药性严重。目前临床解决细菌对磺胺类药物耐药主要通过抗菌药和抗菌增效剂联合使用的方式以增强细菌敏感性。艾地普林（Aditoprim,ADP）是一种新型选择性细菌二氢叶酸还原酶（Dihydro fol-ate reductase,DHFR）抑制剂,ADP的细胞毒性分级为低毒,不具有致畸、致突变作用。同类抗菌增效剂包括甲氧苄啶（Trimethoprim,TMP）,二甲氧苄啶（Diaveridine,DVD）、奥美普林（Ormetoprim,OMP）、巴喹普林（Baquiloprim,BQP）,除BQP外,其它现有抗菌增效剂都存在半衰期短、生物利用度低等缺点。ADP在山羊、猪、火鸡等多种养殖动物体内的药动学特征显著优于TMP,其在机体的血药浓度高,维持有效时间长。因此,本研究主要开展了引起呼吸系统疾病和细菌性痢疾主要病原菌的流行病学调查、测定临床分离病原菌抗菌活性,选取耐药菌筛查艾地普林对磺胺类药物抗菌增效作用,验证艾地普林与磺胺类药物联合抗菌机制,体内验证艾地普林与磺胺类药物对猪巴氏杆菌病治疗效果,以期为延缓耐药菌的产生以及新型抗菌增效剂的研发提供理论基础。
1.猪临床病原菌的分离鉴定及流行病学调查
采用常规流行病学调查方法从采集病原种类、疾病感染类型及地域分布等方面对2022～2024年期间送到湖北省华中农业大学协同生猪健康创新中心检测病原的样品进行样本采集,共收集来自全国各地区（山西、山东、湖北、湖南、广东、广西、福建等省、市、自治区）487份发病猪的肺组织、197份小肠组织。通过形态学观察、革兰氏染色、PCR扩增、16S引物测序等结果进行菌株的分离鉴定。结果表明,分离的致病菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和沙门氏菌。统计并分析各省肠道样本和呼吸道样本中病原菌的分离情况。结果表明,分离的病原菌主要分布在湖北、河南、河北、江西地区。其中湖北地区的分离率最高,一共分离细菌55株,分离率为18.2%。北京、黑龙江、吉林的分离率较低,均为2%。
2.艾地普林对磺胺类药物抗菌增效作用筛查
采用微量肉汤稀释法、棋盘法及杀菌曲线对临床分离病原菌进行抗菌活性测定,分析病原菌耐药情况,选取耐药菌进行艾地普林对磺胺类药物抗菌增效作用筛查。测定ADP、TMP、DVD与13种磺胺类药物对临床病原菌的MIC。结果表明,6种病原菌对磺胺类药物的耐药严重,MIC90均>512μg/m L。除沙门氏菌外,其他细菌对3种抗菌增效剂的耐药率均超过40%,其中金黄色葡萄球菌的耐药性最高为100%。棋盘法测定艾地普林等3种抗菌增效剂与13种磺胺药物的联合抑菌效果。结果表明,艾地普林对13种磺胺类药物都有抗菌增效作用。联合使用时对猪沙门氏菌、猪大肠杆菌和猪金黄色葡萄球菌的0.5球菌、猪多杀性巴氏杆菌FIC指数≤0.5,表现为协同抗菌作用。其中艾地普林
与磺胺间甲氧嘧啶（Sulfa-monomethoxine,SMM）联合使用时对猪多杀性巴氏杆菌的F IC指数为0.185,表明二者联合使用时对猪多杀性巴氏杆菌抑菌效果最好。进行AD P单药和ADP-SMM复方对猪多杀性巴氏杆菌P-23-12-1时间-杀菌曲线测定。结果表明,药物浓度高于1 MIC时具有杀菌作用,并随着时间的推移杀菌药物作用效果越来越明显。在8-12 h时,与ADP单方相比,ADP-SMM复方的杀菌作用使得细菌数量减少约为两个数量级。在12 h后,细菌减少速度变慢。在相同浓度的ADP作用下,ADP-SMM联合使用时的杀菌效果远远强于ADP单药使用的杀菌效果,A DP与SMM联合用药时有明显的协同作用。
3.艾地普林与磺胺间甲氧嘧啶联合抗菌机制
采用酶联免疫吸附测定和q RT-PCR的方法测定叶酸代谢途径中关键酶活性和关键基因的表达量的变化,验证艾地普林与磺胺间甲氧嘧啶联合抗菌机制。测定叶酸代谢途径中二氢叶酸还原酶和二氢叶酸合成酶的表达量,验证药物对细菌叶酸代谢途径的作用。结果表明,ADP与SMM联用导致猪多杀性巴氏杆菌二氢叶酸还原酶和二氢叶酸合成酶的含量显著降低。测定叶酸代谢途径中关键基因和耐药基因的表达量。结果表明,ADP-SMM联用显著下调了fol A、fol P的表达量,同时显著降低了耐药基因sul2的表达。
4.艾地普林与磺胺间甲氧嘧啶对猪巴氏杆菌病临床疗效研究
采用人工感染猪多杀性巴氏杆菌感染试验仔猪,建立猪巴氏杆菌病感染模型,观察并记录给药前、给药后和停药后各组动物的体温、临床症状,剖检病死仔猪,观察病变器官形态,并进行病理组织学检查,计算试验猪不同给药方案下的死亡率、有效率、治愈率、增重情况。结果表明,ADP-SMM联合用药对猪巴氏杆菌病的治愈率更高,能达到100%;ADP-SMM联合组的相对增重率最高能达到89.5%,ADP:SMM配伍比例为1:5（ADP为4 mg/kg+SMM为20 mg/kg）口服给药治疗猪巴氏杆菌病效果好,每天2次,给药时间至少3天。
综上所述,本研究开展了2022～2024年临床病原菌流行病学调查和磺胺类药物的耐药性分析,筛查出磺胺间甲氧嘧啶与艾地普林联用时抗菌活性显著提高,二者联用对猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌产生协同抗菌作用,对猪沙门氏菌、猪大肠杆菌和猪金黄色葡萄球菌具有相加抗菌作用。证实了艾地普林与磺胺间甲氧嘧啶联用后对耐药猪多杀性巴氏杆菌的杀菌作用显著。进一步验证了艾地普林-磺胺间甲氧嘧啶双靶点抑制叶酸代谢途径关键酶活性,降低叶酸代谢途径关键基因和磺胺耐药基因的表达。建立猪巴氏杆菌病感染模型,体内进一步验证磺胺间甲氧嘧啶与艾地普林联用对猪巴氏杆菌病的治疗效果。为治疗耐药菌感染中艾地普林与磺胺类药物配伍使用提供了理论依据。
关键词: 艾地普林 ；抗菌增效剂 ；猪多杀性巴氏杆菌 ；耐药性 ；磺胺间甲氧嘧啶
摘要： 艾地普林属于二氨基嘧啶类药物,主要通过抑制二氢叶酸还原酶的活性抑制四氢叶酸的合成,从而影响细菌的叶酸代谢。与同类药物甲氧苄啶相比,艾地普林的半衰期长,表观分布容积大,且低毒、安全,无致突变性,具有良好的应用前景。然而,艾地普林药效学方面的研究较少,且没有对其代谢物的抗菌活性进行过研究。本课题立足本实验室前期关于艾地普林合成工艺及残留消除等研究成果,测定了艾地普林对多种动物源细菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并对MIC50、MIC90、MBC50和MBC90进行统计,初步制定了抗菌谱;测定了艾地普林主要代谢物,即N-单脱甲基-ADP(ADP1)、N-双脱甲基-ADP(ADP2)和3'-羟基-ADP(ADP3)对其中两种敏感菌即猪源链球菌和鸡源沙门氏菌的抗菌活性;选取猪源链球菌,进行艾地普林对猪链球菌病的II期临床治疗试验。本研究的完成旨在补充艾地普林药效学相关资料,为该药的进一步推广应用提供理论依据。1艾地普林的体外抗菌活性根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)所制定的抗菌药物敏感性试验执行标准,以甲氧苄啶为对照药,测定了艾地普林对猪、鸡、鱼、牛和羊源常见致病菌的MIC和MBC。由于体内病原菌基本处于缺氧甚至无氧的环境,因此同时测定了有氧条件下和厌氧条件下艾地普林对兼性厌氧菌的抗菌作用,并进行了对比。抑菌效果相关参数表明,艾地普林的抗菌谱与甲氧苄啶相同,对大多数的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较好的抑制作用,为广谱型抗菌药物。对艾地普林较敏感的细菌包括猪源沙门氏菌和链球菌,鸡源大肠杆菌和沙门氏菌,牛源大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌和巴氏杆菌,羊源的链球菌、曼氏杆菌,鱼源的大肠杆菌、柱状黄杆菌、鲍曼不动杆菌和鲁克氏耶尔森菌;中度敏感菌包括副猪嗜血杆菌,牛源和羊源克雷伯氏菌,鱼源金黄色葡萄球菌、肠型点状气假单胞菌、结核分枝杆菌、无乳链球菌;耐药菌包括猪源大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌,鸡源金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌和-牛源的金黄色葡萄球菌。艾地普林对所测敏感菌和中度敏感菌的MBC/MIC在1-4之间,显示了较好的杀菌活性。在艾地普林的敏感菌和中度敏感菌中,艾地普林与甲氧苄啶对所测大部分病原菌的MIC和MBC相等或相差一个梯度。其中,两者对猪源大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌,鱼源柱状黄杆菌的抗菌活性相当;艾地普林对鸡源沙门氏菌,牛源和羊源的曼氏杆菌、链球菌、巴氏杆菌,鱼源的大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、鲁克氏耶尔森菌、肠型点状气假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌和无乳链球菌的活性较甲氧苄啶稍强;对鸡源和牛源大肠杆菌的抗菌活性稍弱。从单个菌株比较,厌氧条件下艾地普林对所测兼性厌氧菌的MIC值和MBC值与有氧条件下相等或相差一个梯度;从每种菌的多株细菌的MIC50、MBC50、MIC90、MBC90的统计结果比较,有氧条件和厌氧条件的这些值均相等,即在有氧条件下和厌氧条件下艾地普林对兼性厌氧菌的抗菌活性无明显的差别,均具有较好的抑菌活性和杀菌活性。因此,该药无明显厌氧选择活性。2艾地普林主要代谢物的体外抗菌活性通过艾地普林的体外抗菌活性研究,选取了 44株猪源链球菌和40株鸡源沙门氏菌,测定艾地普林主要代谢物,即ADP1、ADP2和ADP3对这两种细菌的MIC和MBC。结果表明ADP3对所测定的44株猪源链球菌和40株鸡源沙门氏菌的MIC和MBC均大于128μg/mL,没有抗菌活性。整体来说,ADP1、ADP2和艾地普林三者对所测猪源链球菌和鸡源沙门氏菌的MIC50、MBC50、MBC50/MIC50、MIC90、MBC90和MBC90/MIC90都相等。其中,对猪源链球菌的MICso为2μg/mL,MBC50为 4 μg/mL,MBC50/MIC50 为 2;MIC90 为 32 μg/mL,MBC90 为 64 μg/mL,MBC90/MIC90=2。对鸡源沙门氏菌 MIC50 为 2 μg/mL,MBC50 为 4 μg/mL,MBC50/MIC50等于 2;MIC90为 32 μg/mL,MBC90为 64 μg/mL,MBC90/MIC90等于2。因此,ADP1和ADP2的抗菌活性与艾地普林相当,均具有较强的抑菌活性和杀菌活性。3艾地普林对猪链球菌病的治疗试验将60头体重11-13 kg的断奶仔猪随机分成6组,每组10头。除空白对照组不攻毒也不给药外,其他各组均皮下注射制备好的1010CFU的链球菌CVCC607。猪链球菌疾病模型构建成功后,阴性对照组不给药,药物对照组以30 mg/kgb.w.的剂量肌肉注射复方磺胺嘧钠,其他三个组分别以10mg/kgb.w.、20mg/kgb.w.和40 mg/kg b.w.的剂量肌肉注射艾地普林,并对应命名为低剂量组、中剂量和高剂量组。各治疗组连续给药五天,每天给药两次,给药结束后观察15天。在整个试验过程中,对各猪只的精神状态、体温、临床症状进行检测,并根据评分系统进行评分。最后根据各组的死亡率、有效率、治愈率、相对增重率来对治疗效果进行评判。给药治疗后,不同组的发病动物的恢复情况不同。阴性对照组平均症状得分在给药后的第五天开始下降,第十五天时恢复正常,但个别猪只依然出现精神沉郁和咳嗽症状;平均直肠温度在给药后的第六天后开始出现明显下降,第九天时恢复至39.5℃以下。艾地普林高剂量组的猪只体温在第二天即回复正常,平均症状得分下降至2分以下,从第三天开始直至试验结束均维持在0分;中剂量组猪只的平均体温在第二天降至正常,症状分数在第三天恢复正常;低剂量组的体温和平均每头猪的症状分数分别在第三天和第四天恢复正常,所有治愈猪只在观察期内均无复发。在试验前和试验结束后对各组猪只称重并进行对比。药物对照组的相对增重率介于高剂量组和中剂量组之间,分别为93.0%、96.5%和91%,三者的相对增重率无显著差异(P>0.05);低剂量组的相对增重率为74.7%,与高剂量组和中剂量组相比有显著差异(P<0.05);而阴性对照组的净增重仅为1.77 kg,相对增重率为34.5%,与高剂量组、中剂量和低剂量组相比较低,呈显著性差异(P<0.05)。综合分析咳嗽、精神状态、体温等症状,计算艾地普林对猪链球菌病的治疗效果。阴性对照组的存活率为70%,高剂量组、中剂量组和低剂量组均无死亡猪只出现,存活率为100%。其中,高剂量组可达到100%的有效率和100%的治愈率,中剂量组的有效率和治愈率也均为90%,而低剂量组的有效率为80%,治愈率为70%,说明艾地普林各剂量组均可达到较好的治疗效果。由此可得出艾地普林的推荐剂量为20-40 mg/kg b.w.,建议以20-40 mg/kg b.w.的剂量对症状比较明显的猪只进行治疗;10mg/kgb.w.的剂量用于预防,或者治愈后的巩固。总之,本课题根据CLSI制定的抗菌药物敏感性试验执行标准和抗菌药物Ⅱ、Ⅲ期临床药效评价试验指导原则等相关文件,以及我国农业部颁发的实验临床试验技术规范,测定了艾地普林及其主要代谢物对猪、鸡、鱼、牛和羊常见病原菌的体外抗菌活性,初步制定了艾地普林的抗菌谱,并且选取敏感菌进行了Ⅱ期临床治疗试验,为艾地普林在实际的临床应用提供了合理的理论依据。
关键词: 艾地普林 ；代谢物 ；抗菌活性 ；猪链球菌病 ；临床治疗
被引量
9
摘要： 丙型肝炎，全称为丙型病毒性肝炎(Hepatitis C，HC)，主要经输血、针刺、吸毒等途径感染。丙型肝炎是一种病毒性疾病，由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染，并在全球范围内影响大约1.7亿左右的病人。丙型肝炎病毒共有6种主要基因型组成，其中基因型1和2在美国、欧洲和日本最为普遍，而且对于基因型1的治疗效果比其他基因型要差。因此，对于基因型1的丙型肝炎病毒的药物研发需求更为迫切和急需。NS5B聚合酶和NS3蛋白酶是丙型肝炎病毒的研究热点。NS5B聚合酶的功能主要是在丙型肝炎病毒的复制过程中有重要作用，NS3蛋白酶在丙型肝炎病毒的成熟过程中，切割多蛋白，促使其他蛋白成熟。 本文以丙型肝炎NS5B聚合酶和NS3蛋白酶作为研究重点，收集了大量的相应酶的抑制剂，利用多种分子描述符和多种数据挖掘方法建立高低活性分类模型以及活性的定量预测模型。此后，利用分子形状与静电相似性模型和高低活性分类模型对NS3蛋白酶进行了新型抑制剂的虚拟筛选，并找到了一个具有NS3蛋白酶抑制活性的先导化合物。其次，利用化学信息学方法对中药的结构-活性关系进行研究，建立了中药寒、热药性分类模型，并取得了很好的分类效果。此外，本论文对金黄色葡萄球菌的二氢叶酸还原酶抑制剂进行了以片段分子对接为基础的虚拟筛选。论文主要研究内容如下: (1)构建了HCV NS5B聚合酶NNIⅢ变构位点的抑制剂活性的高低分类模型和抑制剂活性的定量预测模型。 (a)先构建了HCV NS5B聚合酶NNIⅢ变构位点的抑制剂高低活性分类模型。收集了已知活性的386个抑制剂，对于每一个化合物分别计算了全局描述符，二维自相关描述符和三维自相关分子描述符。根据三组不同的描述符利用支持向量机进行建模。发现基于全局和二维自相关描述符的模型2对于测试集的预测准确率达到了88.24％，MCC值达到了0.789。此后，新收集了80个不包含在训练集和测试集中的化合物作为外部测试集，对所建立的三个模型的预测能力进行进一步的评估。发现基于全局描述符的模型1对于外部测试集的准确率达到了86.25％，MCC值达到了0.732。其中，一些描述符被证明对模型的预测有重要的作用。如分子形状描述符(InertiaZ，InertiaX和Span)，可旋转键(NRotBond)，分子水溶性(LogS)和氢键相关描述符。 (b)随后建立了HCV NS5B聚合酶NNIⅢ变构位点的抑制剂活性定量预测模型。共收集了333个已知活性的抑制剂构建数据库。对每一个化合物分别计算了全局描述符和二维自相关描述符。同时，将数据库以两种方法划分训练集和测试集:随机划分和自组织神经网络方法。此后，333个NS5B聚合酶抑制剂活性的定量预测模型分别用多元线性回归和支持向量机构建。对于测试集，模型2B，即以自组织神经网络方法划分训练集测试集，并且以支持向量机方法构建模型，具有最好的预测能力，预测值与实验值之间的相关系数达0.91。同时，也证明了一些描述符的重要性。分子复杂度（Complexity），氢键供体数目(HDon)和分子的水溶性(LogS)是影响抑制剂活性的重要因素。一些原子电荷电势相关描述符也同样发挥着作用。为了进一步观察化合物与NS5B聚合酶的作用，针对两类不同的抑制剂做了分子对接。 (2)构建了HCV NS3蛋白酶的抑制剂活性的高、低分类模型和分子形状、静电相似性模型，并利用模型对数据库进行虚拟筛选。 (a)首先建立了HCV NS3蛋白酶抑制剂高低活性的分类模型，收集了已知活性的413个抑制剂，对于每一个化合物分别计算了全局描述符和二维自相关描述符。根据不同筛选描述符的方法选出的描述符，利用支持向量机进行建模。发现利用WeKa权重方法选取的描述符以及自组织神经网络方法划分的训练集测试集的模型2B对于测试集的准确率达到了90.76％，MCC值达到了0.799。根据ECFP4指纹图谱计算分析，发现一些子结构有利于提高化合物抑制NS3蛋白酶的活性，例如环丙基和砜基等。 (b)随后利用了分子形状与静电相似性原理，进行了HCV NS3蛋白酶抑制剂的虚拟筛选研究。旨在筛选出具有抑制NS3蛋白酶的新型化合物。首先选出了5个目标化合物，利用之前建立的高低活性数据库，验证出3KEE配体是理想的目标化合物。之后构建了目标化合物的分子形状与颜色模型，利用此模型对过滤过的类药化合物库进行化合物筛选。选出的化合物进一步进行静电相似性打分。根据总得分，选取前30个化合物，放入之前所构建的高、低活性分类模型中，验证出高活性化合物。最后进行化合物的活性测试。由于试剂公司以及实验验证方法问题，在10个化合物中得到了1个具有NS3蛋白酶抑制活性的先导化合物。 (3)由于不同寒、热药性的中药在治疗不同疾病时可以发挥截然不同的作用，因此中药的寒热属性分类在临床治疗中极为重要。本论文共收集了115味中药，包括每一味中药的化合物分子，以及此中药的寒、热属性。计算了三种分子描述符，分别是全局描述符、Daylight片段描述符和MACCS描述符。利用自组织神经网络原理，并采用我们制定的标准进行建模，预测中药属性分类。结果证明，MACCS描述符建立的模型在分类效果上更好。当我们只关注那些收集了大于30个化合物的中药时，MACCS模型对测试集的预测能力提升到了95％。也证明了，收集到越多的化合物，其预测结果越可信。 (4)抑制细菌的二氢叶酸还原酶可以有效的抑制细菌的繁殖。本论文以金黄色葡萄球菌的二氢叶酸还原酶作为靶标，利用了以片段分子对接为基本方法，进行其抑制剂的虚拟筛选研究。此方法可以很大程度的提高筛选速度和筛选化学空间。首先利用数据库过滤技术，在商业数据库中筛选出我们想要的酸和碱的分子，并将酸和碱分子放入二氢叶酸还原酶口袋中进行分子对接。分析其对接结果，找到酸和碱的对应基团的空间距离与角度适合形成酰胺和磺胺键，并生成新的酰胺和磺胺分子。随后利用动力学模拟技术，得到化合物在靶标口袋中的轨迹文件，并利用轨迹文件计算化合物与蛋白质之间的绑定结合自由能。在已经计算好的标准曲线上得到化合物的预测活性，并进行测活验证此方法的正确性。 综上所述，本文以丙型肝炎NS5B聚合酶和NS3蛋白酶作为研究重点，成功构建了基于NS5B聚合酶的分类和定量预测模型，以及NS3蛋白酶抑制剂的分类模型和形状、静电相似性模型，并且发现了一些对于活性提高有帮助的典型子结构。针对NS3蛋白酶，利用建立好的模型进行了大规模虚拟筛选，并得到1个具有NS3蛋白酶抑制活性先导化合物。此外，建立了中药寒、热药性分类模型，并取得了很好的分类效果;对金黄色葡萄球菌的二氢叶酸还原酶进行了以片段分子对接为基础的抑制剂虚拟筛选。此方法可以很大程度的提高筛选速度和筛选化学空间。
关键词: 丙型肝炎 ；抑制剂 ；活性预测 ；计算机辅助分析
摘要： 在后基因组时代,基因的表达产物及基因功能的实施者—蛋白质的结构与功能成为一个新的研究热点。核磁共振(NMR)是一种很好的研究多肽和蛋白质空间结构,进而研究其结构与功能关系的研究工具。在本论文中,我们主要利用液体核磁共振技术对抗菌肽HEDISTIN和二氢叶酸还原酶突变体DHFR-W21H的溶液结构及其生物功能的作用机制进行了详细的研究。论文分为以下两个部分：
一、抗菌肽HEDISTIN在溶液中的构象及其抗菌机理研究
随着抗生素的广泛使用,耐药菌株和多重耐药菌株不断增加,病原菌的抗药性问题日益严重,迫使人们加紧寻找传统抗生素的替代品。抗菌肽是在生物体中广泛存在的一类具有生物活性的小分子多肽,这类活性多肽具有抗菌活性高、种类比较多、抗菌谱广、特别是靶菌株不易产生耐药性的特点,具备了开发成新型抗菌药物的巨大潜力。2007年从沙蚕体腔内分离得到一种新型抗菌肽HEDISTIN,它是首个从海生环节动物中发现的被溴化的抗菌肽。它对革兰氏阳性菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilin-resistant S. aureus)等表现出很好的抗菌性。但是,在抗菌作用机制尚不清楚的条件下,很难进一步开发。为了探究抗菌肽HEDISTIN的抗菌机理,我们首先应用NMR与圆二色谱(CD)技术解析了HEDISTIN在磷酸盐缓冲液和在DPC(dodecylphosphocholine)微团环境中的三维结构。结果表明,抗菌肽HEDISTIN在磷酸盐环境中没有稳定的有序构象,但在DPC微团环境下形成了独特的helix-turn-helix构象。这种helix-turn-helix构象与大多数阳离子小型多肽所具有的简单的线型螺旋构象不同,由于中间的转角而呈现出非均一性,但仍具有显著的两亲性特征。以此结构为基础,我们进一步采用分子动力学方法模拟了HEDISTIN作用于细胞膜的模拟膜—POPC脂双层膜的相互作用过程。模拟数据显示,该抗菌肽结构上的非均一性直接影响肽与膜作用的早期行为：第一段螺旋区(残基Leu5-Lys8)或第二段螺旋区(残基Val13-Alal7),通过极性作用力,最先与膜的磷脂头部区域接触,并渗透入膜的疏水性区域,中间的转角(残基Val9-Thr12),作为极性微弱的区域,则是作为最后一部分接触并进入膜中。这一现象提示,微团环境中的两亲性非均一构象相当接近当该肽遭遇菌细胞膜时的天然构象,以这种构象作用于细胞膜,提高了攻击效率。更为重要的模拟数据显示,随着抗菌肽浓度在膜表面某些局部区域的升高,肽的分子之间发生聚集,当肽和脂的比例达到或超过5/128时,聚集在一起的肽协同对膜造成较为强烈的扰动,以至于在膜中形成水分子通道。可以推测,这种水通道的形成会使细胞由于水的进入而最终胀裂破碎,抗菌肽HEDISTIN以此达到杀菌的目的。
二、二氢叶酸还原酶突变体DHFR-W21H的结构和作用机制研究
二氢叶酸还原酶(DHFR)是生物体内广泛存在的叶酸代谢关键酶,它在辅酶NADPH的作用下将二氢叶酸还原为四氢叶酸,对生物体内细胞的代谢起到重要作用。在已报道的DHFR序列中,Trp21是极其保守的氨基酸残基之一,它在空间位置上既靠近辅酶NADPH义靠近底物。对这一残基的作用在全酶功能中的透彻了解将促进有效抑制剂的进一步开发。为了探究该残基侧链的大小对于全酶功能的影响,我们的前期研究将Trp21残基突变为性质相似但是侧链更小的His残基,酶动力学测试发现,突变导致酶DHFR-W21H的催化常数Kcat随pH的变化与野生型DHFR相比明显不同,在pH<6.0时,DHFR-W21H与野生型DHFR都保持着酶催化活性,而在接近pH 7.0时,DHFR-W21H却几乎完全丧失催化活性,而这时野生型DHFR仍然具有较强的酶催化活性。我们猜测导致这一结果的原因可能是由于突变为较小残基后构象发生改变,所以我们使用核磁共振技术对突变体DHFR-W21H-MTX复合物在两个不同pH值(pH5.8和7.5)下的蛋白质溶液结构进行了研究。结果表明：(1)DHFR-W21H在pH 5.8和pH 7.5条件下都类似于野生型DHFR的结构,即主要由8个β-折叠,4个α-螺旋,和两段长的loop,即A-B loop(残基9-23)利F-G loop (残基119-135)形成相似的拓朴结构。(2)位于A-B loop上的残基Pro20-Leu23片段在溶液中存在着构象交换,具有两种较稳定的可观测构象,并且,残基Pro20-Leu23片段的动力学行为在pH 5.8利pH 7.5的DHFR-W21H-MTX复合物中不相同。
(3)突变导致了空间上靠近Trp21残基的局部区域受到了扰动,使A-B loop和F-G loop稳定性明显下降,柔性增强。(4)His21侧链咪唑环的质子化可能与酶DHFR-W21H的催化紧密相关。这些结论提示Trp 21残基在全酶中的作用不是维持整体拓朴结构,而是在于以其较大的侧链与活性中心的两个loop上的残基作用,使之趋于稳定,从而维持催化活性。同时,这一研究结果证实了另一个猜测,即DHFR的A-B loop和F-G loop稳定性直接与酶的催化活性相关。
关键词: 核磁共振 ；抗菌肽 ；Hedistin ；分子动力学模拟 ；二氢叶酸还原酶 ；DHFR-W21H
被引量
3