- 首页
- 产品推荐个人精选服务科研辅助服务教育大数据服务行业精选服务学科系列服务产品服务
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
- 首页
- 产品服务
- 知识脉络
- 期刊大全
- 充值
- 会员
- 职称材料
智能检索
二次检索
任意字段
在结果中检索
在结果中去除
暂无数据
共
201
条结果 ，以下是1
-
20条
1 / 11
已选:0 清除
批量下载
批量引用
相关度
摘要： 对一类新的抗生素 ,即含有四氢 2H 1 ,3,5 噻二嗪 2 硫酮 (tetrahydro 2H 1 ,3,5 thiadiazine 2 thione ,THTT)环的化合物进行研究。根据其基本药效结构 ,该类抗生素的抗菌活性强弱主要取决于C3 位取代基 ,故设计在C3 位进行不同基团取代 ,共设计了 1 4种 3 取代 5 丝氨酸 四氢 2H 1 ,3,5 噻二嗪 2 硫酮化合物 ,经文献检索均未见报道 ,可视为新型化合物。化合物的化学结构经熔点测定、元素分析法、紫外光谱、红外光谱、1H 磁共振加以确定。抗菌活性采用微生物敏感实验进行测定。体外抑菌实验表明 ,大部分化合物对所选常见致病菌有较好的活性及抗菌谱 ,特别是苄基取代的化合物 ,其初步的体外抑菌活性优于阳性对照磺胺嘧啶钠 ,提示对该类化合物值得进一步深入研究。
关键词: 抗菌活性 ；噻二嗪硫酮 ；构效关系 ；合成工艺 ；巯基蛋白酶抑制剂 ；抗生素
摘要： 藻类不仅对生态和环境的平衡起着重大作用,同时还为人类提供了食物、药物、能源、化工产品等资源。蓝藻含有特殊的非核糖体肽合成酶和聚酮合成酶,从而可以合成多种独特的化合物,尤其是各种肽类、聚酮和聚醚类,其中许多化合物具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗氧化和抗疟疾等生物活性。这些具有抗癌活性的化合物作用于丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶在人体中起着十分重要的作用,包括涉及到癌症等疾病。蓝藻是高活性蛋白酶抑制剂的丰富来源。从阿氏颤藻得到的Aeruginosins 205A和205B是最有效的胰蛋白酶抑制剂之一(IC_(50)值均为0.07μg/mL);从淡水蓝藻铜锈微囊藻分离得到的Cyanopeptolin954,抑制胰凝乳蛋白酶的活性非常强(IC_(50)值为31 nmol);从实验室培养的微囊藻中得到的Microviridins B和C抑制弹性蛋白酶的IC_(50)分别为25和48 nmol;从红浮丝藻分得的Anabaenopeptins B、F和C抑制TAFla的IC_(50)分别为1.5,1.9和1.5 nmol,并抑制TAFla刺激纤维蛋白凝块的降解,有助于防止血栓的形成,等等。本文详细地介绍了蓝藻中分离得到的14类56个高活性蛋白酶抑制剂的来源、化学结构、特性、抑制蛋白酶活性以及构效关系。
关键词: 蓝藻 ；非核糖体合成酶 ；聚酮合成酶 ；抗癌 ；蛋白酶抑制剂 ；丝氨酸蛋白酶 ；构效关系
被引量
3
摘要： 为了解抗血吸虫药物研发工作进展,总结了近年来有机小分子化合物抗血吸虫活性与作用机理,以期为新型抗血吸虫药物研发提供依据。从化学合成小分子化合物和酶抑制剂两方面,对有机小分子化合物的抗血吸虫抗虫活性及作用机理的最新进展进行了评价。总结了噻唑、喹啉、咪唑类化合物以及具有抗肿瘤、抗炎、抗组胺和利尿剂等活性化合物和重要酶抑制剂的抗血吸虫活性、构效关系和对虫体的影响,指出了抗虫活性最佳的先导化合物。利用现代生物技术,发现血吸虫生长、发育和繁殖相关的重要酶、蛋白抑制剂是今后抗血吸虫药物研发的重要途径。
关键词: 抗血吸虫活性 ；化学合成小分子化合物 ；酶抑制剂 ；作用机理
摘要： 针对最小二乘支持向量机最佳算法参数难以确定的缺陷,提出了基于文化差分进化算法的最小二乘支持向量机(Cultural Differential evolution Algorithm Least Square Support Vector Machine,CDE-LSSVM)。该算法通过新型的文化差分进化算法优化确定最小二乘支持向量机核宽度参数和惩罚系数,建立具有良好预测性能的模型。同时,针对药物定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationships,QSAR)模型具有高度非线性、变量之间存在相关性的特征,采用CDE-LSSVM建立HIV-1蛋白酶抑制剂的药物定量构效关系模型。模型具有很好的拟合精度与预测精度,且优于最小二乘支持向量机、BP神经网络和径向基神经网络。
关键词: 文化差分进化算法 ；最小二乘支持向量机 ；药物定量构效关系 ；HIV-1蛋白酶抑制剂
被引量
5
摘要： 目的 :研制针对各种耐药病原微生物的有效新药 ,合成一类新的含有四氢 -2 H-1,3 ,5 -噻二嗪 -2 -硫酮环的化合物(Tetrahydro-2 H-1,3 ,5 -thiadiazine-2 -thione,THTT) ,并研究其抗微生物活性。方法 :用 5种 G+菌和 1种 G-菌对 10种新合成的化合物进行了生物活性实验。结果 :大部分化合物对供试菌株均具有不同程度的抑制作用 ,对常见肠道菌如大肠杆菌、志贺菌对甲型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌的抑菌活性较好 ;而对 G+菌的金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强。其中化合物 1,7,8,9,11,13抗菌活性较好。与阳性对照药物磺胺嘧啶钠注射液相比 ,10种化合物的抗菌活性均强于对照物。但是 ,铜绿假单胞菌对10种化合物均不敏感。结论 :大部分化合物对所选常见致病菌有较好的抑菌活性 ,同时表明有较宽的抗菌谱 。
关键词: 抑菌活性 ；噻二嗪硫酮类化合物 ；抗菌谱 ；抗生素
摘要： 综述了近年来甜菜夜蛾Spodopteraexigua(H櫣bner)、寄主植物和寄生蜂互作关系方面的研究进展。介绍了甜菜夜蛾取食诱导的植物抗虫性产生的原因和机制;阐述了诱导植物产生抗性的甜菜夜蛾激发子volicitin的合成途径和功能,以及虫害诱导的植物挥发物和蛋白酶抑制剂对甜菜夜蛾及其寄生蜂的生态学功能;展望了植物诱导抗虫性在甜菜夜蛾的生物防治和新型抗虫品种开发等领域的应用前景。
关键词: 甜菜夜蛾 ；寄主植物 ；寄生蜂 ；三级营养关系 ；植物抗虫性 ；生物防治
被引量
32
摘要： 对以往小分子蛋白酶抑制剂及多肽毒素的研究成果作一历史性回顾,重点介绍了Bowman-Birk家族的绿豆胰蛋白酶抑制剂,对此抑制剂的Lys活性功能区作了解析.它是双头抑制剂,有两个功能区,用蛋白与基因测序、基因表达、突变、肽段合成等手段证实,其核心结构是一个由两个相连九元环组成的16肽,与天然14环肽的向日葵抑制剂极类似.另一深入研究的抑制剂是27肽的天花粉胰蛋白酶抑制剂,属于南瓜族,介绍了该家族的基因序列.多肽毒素的研究包括蝎毒毒素及芋螺毒素.本文介绍了多种东亚马氏钳蝎新的钾通道毒素,有的是钙离子依赖的BK或SK钾通道毒素,有的是电压门控毒素,有的具有两个不同的功能区,阐明了它们的构效关系.表达的重组蝎氯毒素有望用于恶性胶质瘤的治疗.芋螺毒素分子量小、序列多变、功能广泛,有更好的应用前景.从中国南海16种芋螺中纯化了50个结构新的芋螺毒素,克隆了134个新基因;确定了3个新超家族,命名为V,Y,K超家族;研究发现,在某些芋螺毒素一级结构中有新的二硫键骨架和二硫键配对、独特的模板(motif)、氨基酸的D型化等;分析了A超家族的基因组结构,在内含子的3′端有一非常保守的序列,可用作引物克隆更多新的芋螺毒素基因;阐明了个别芋螺毒素的生理功能.
关键词: 活性多肽 ；舒缓激肽增强肽 ；南瓜族蛋白酶抑制剂 ；Bowman-Birk家族 ；蛋白酶抑制剂 ；大肠杆菌耐热肠毒素 ；东亚马氏钳蝎毒素 ；中国南海芋螺毒素
被引量
5
摘要： 酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,PPO),是一种含铜糖蛋白,广泛存在于自然界中.它是生物体合成黑色素的关键酶,而且与果蔬褐化、昆虫表皮鞣化、人的色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有重要关系.目前,酪氨酸酶抑制剂已被用于果蔬保鲜、化妆品中的增白剂、生物农药的杀虫剂添加物.对酪氨酸酶抑制剂的研究已引起国内外的广泛重视,现已研究出许多具有新型结构的酪氨酸酶抑制剂.为了得到高效的酪氨酸酶抑制剂,对各种类型的化合物构效关系及抑制机理的研究是非常必要的.
关键词: 酪氨酸酶 ；抑制剂 ；构效关系 ；抑制机理 ；应用
被引量
136
【会议论文】 • 邓莉平
会议时间： 2011-11-17
摘要： 天然产物的结构优化一直是新药研发的重要途径之一。本课题以具有抗肿瘤活性的蛋白磷酸酶抑制剂--天然产物斑蝥素为研究对象,在总结前期研究成果的基础上,根据蛋白磷酸酶PP1和PP2A的结构特点,利用分子杂合、化学空间分析、类药性分析等合理药物设计方法及计算机辅助设计方法,设计新型去甲斑蝥素衍生物,并在虚筛及初步类药性评价的基础上,定向合成目标分子,分别从细胞和分子水平筛选目标分子的抗肿瘤活性及PP1、PP2A抑制作用,分析构效关系,深入探讨其作用机制;在动物体内抗肿瘤活性评价的基础上,力争发现具有开发前景的新颖抗肿瘤候选药物。
关键词: 抗肿瘤活性 ；去甲斑蝥素 ；蛋白磷酸酶PP1 ；蛋白磷酸酶PP2A
【会议论文】 • 梁广
会议时间： 2013-09-15
摘要： 甾体类和环氧化酶抑制剂被长期用于治疗性抗炎药物,但是它们均显示出严重的副作用。因此,发展独特的抗炎药物有着重要的价值和意义。姜黄素是中药姜黄中的一个主要的活性化合物。近30年来,姜黄素被发现具有多种药理活性,如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、心血管保护等;同时,有研究发现姜黄素抑制炎症因子表达是通过直接作用于LPS-TLR4炎症信号通路中的MD-2或IKKβ靶点而实现的。然而,极差的药代性能和体内快速降解限制了姜黄素的临床应用。本研究中,我们根据之前的构效关系研究结果,合理地设计了以一系列具有肉桂酰胺结构的单羰基姜黄素类似物。我们共合成了37个新化合物,并评估了它们在原代巨噬细胞中抑制LPS诱导TNF-α释放的能力,根据测试结果,我们进一步分析了这类化合物的构效关系和定量构效关系。其中4个活性化合物被用于进一步地研究,它们剂量依赖性地抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6表达。化合物D33被发现是活性最好的化合物。随后,我们发现D33可以抑制LPS诱导的TNF-α,IL-1β,IL-6,COX-2和PGES等炎性蛋白基因的mRNA表达,并逆转LPS诱导的IκBα降解,干扰NF-κB p65浆核转移,以及剂量依赖性抑制ERK和p38的磷酸化激活。在体内,D33显著缓解LPS诱导的脓毒血症小鼠死亡,说明D33是一个有着开发前景的抗炎化合物。更重要的是,我们进一步的数据显示D33可以直接与MD-2蛋白发生相互作用而结合,且这种结合在细胞以及分子层面上均可阻断脂多糖LPS与MD-2蛋白的结合,同时D33在体外激酶实验中并没有表现出对IKKβ抑制活性。这些数据表明D33的抗炎活性可能来自于其对MD2的直接作用,而不是对IKKβ的抑制。这些实验结果提出了一类新型MD2靶向的抗炎先导物和候选药物。
关键词: LPS-TLR4炎症信号通路、MD-2 ；肉桂酰胺结构 ；单羰基姜黄素类似物
摘要： 第一部分水母(Jellyfish)属刺胞动物门,是海洋中一类分布广泛、生物总量庞大的无脊椎动物。水母毒素是多肽/蛋白类混合物,主要储存于触手上的一类特化细胞器——刺丝囊(nematocyst)中。由于水母种类、地域分布及捕食对象的不同,其毒素的组成、生物活性也存在一定的差异。为了更好地研究和比较不同种属水母刺丝囊毒性组分的差异,本论文的第一部分以我国近海大规模暴发的发形霞水母(Cyanea capillata,C.capillata)和越前水母(Nemopilema nomurai,N.nomurai)为研究对象,首先构建高质量的水母触手转录组数据库;其次优化这两种水母最主要的捕食性刺丝囊纯化以及毒素提取的方法,进一步利用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass chromatography,LC-MS/MS)组学方法对两种水母刺丝囊毒素的蛋白组成进行比较分析。主要结果如下:1.本课题组前期已成功构建C.capillata触手组织cDNA文库,此次利用RNA-seq和de novo组装,基于Illumina Hi SeqTM 2000平台成功构建了N.nomurai触手组织转录组,得到118,243条有效Unigenes序列。使用Blastx算法将组装好的unigenes 与公共数据库(Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO 和 KEGG)进行比对,其中15,927个unigenes得到同源注释。在KOG注释中,25,733个unigenes被分为25个功能类别。GO注释中,26,933个unigenes根据生物学进程、细胞成分和分子功能进行了注释和分组。KEGG注释中,有19,423个unigenes富集于包括机体系统、代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程等不同的功能类别中。2.采用优化后的方法从C.capillata和N.nomurai分离纯化到了两种主要的捕食性刺丝囊,利用光镜和扫描电镜观察其形态学差异,结果发现来自C.capillata的主要是isorhiza型刺丝囊,而来自N.nomurai的主要是mastigophore型刺丝囊。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析刺丝囊内毒素蛋白条带的差异,显示N.nomurai刺丝囊毒素(Nemopilema nomurai nematocyst venom,NnV)中大分子量蛋白(>40 kDa)较C.capillata刺丝囊毒素(Cyanea capillata nematocyst venom,CnV)更多,且 NnV 的蛋白分子量范围更广。CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测两种刺丝囊毒素的毒性差异并计算IC50值,结果表明NnV的细胞毒性约为CnV的5倍。3.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳-液相色谱-电喷雾质谱(Liquid chromatography-electrospray ionization/tandem mass spectrometry,LC-ESI/MS)联用 的方式,获得 CnV和NnV蛋白组分的初始肽段,在CnV和NnV中分别产生了 189,309和267,286个MS/MS肽段。肽段匹配数据库分别为:C.capillata和N.nomurai触手转录组数据(自建)、Uniprot 动物毒素数据库(Uniprot animal toxin and venom database)、Uniprot分类学刺胞动物门数据库以及通过文献查找的其它已报道的生物毒素信息。通过检索匹配,最终在CnV和NnV中分别鉴定和注释到345和329个蛋白,其中结构蛋白、酶和毒素类蛋白数量最多。经过进一步分析,最终在CnV和NnV中分别鉴定出53和69个毒素相关蛋白。这些毒素亦常见于其他有毒动物,包括一些刺胞动物(Nematostella vectensis,Hydra vulgaris))、蛇(Gloydius ussuriensis,Naja annulifera)、蜘蛛(Loxosceles intermedia、Lycosa singoriensis)、蝎子(Mesobuthus martensii、Lychas mucronatus)等。4.比较分析后可以将CnV和NnV中共有的蜇伤中毒相关的毒素蛋白大致分为10类:蛋白酶类、磷脂酶、神经毒素、cysteine-rich分泌性蛋白、凝集素、孔道形成毒素、蛋白酶抑制剂、离子通道抑制剂、杀虫活性成分和其他毒素。以上毒素在CnV和NnV之间的构成比例存在明显差异。例如,NnV占比最高的三类毒素是金属蛋白酶、蛋白酶类以及孔道形成毒素,分别占NnV毒素的27.5%、18.8%和8.7%。CnV中最多的三类毒素分别为磷脂酶、神经毒素和蛋白酶类,分别占22.6%、17.0%和 11.3%。该部分结果揭示了我国两种常见的暴发性水母刺丝囊毒素分子的多样性,同时还提示不同水母刺丝囊毒素组分构成比例的不同与其蜇伤效应间可能存在的关系,有望为不同水母蜇伤的治疗提供指导。第二部分在多组学分析结果的指导下,本课题组致力于水母毒素的分离纯化及生物学活性研究。在前期分离纯化过程中,我们发现水母刺丝囊粗毒组分疏水性强、稳定性差(对热不稳定、pH变化敏感),目前全球也仅有少数几种毒素分子被成功分离、鉴定。但是本课题组在分离纯化NnV的过程中发现了一个有趣现象:从刺丝囊提取的粗毒具有高水溶性,而将粗毒水溶液置于截留分子量为10 kDa的透析袋中,在纯水中透析24 h后发现透析袋内有沉淀产生,即毒素的水溶性明显降低;若将粗毒样品直接进行离子交换、凝胶过滤分离,则发现第一个蛋白洗脱峰均为紫外吸收明显的大峰,而之后的洗脱峰紫外吸收很低。表明刺丝囊毒素易聚合形成絮凝物,大部分蛋白在初期即同时被洗脱,因而分离效果不佳。由此我们推测,水母刺丝囊中存在一类水溶性好、吸附力强、有助于提升毒素蛋白亲水性的小分子物质,对毒素蛋白结构稳定、活性维持起着至关重要的作用。基于上述推测,我们将水母刺丝囊提取液经脱盐、HPLC(high performance liquid chromatography)反相C18柱分离后,ESI-MS检测发现一组相对分子质量等差 129 的系列小分子(依次为:516 Da、645 Da、774 Da、903 Da、1032 Da、1161 Da、1290 Da、1419 Da)。该系列小分子的分子量均为129的倍数(4～11×),提示是以129为结构单元的聚合物,且该系列聚合物没有起始单元,为均一的聚合。进一步的氨基酸组成分析发现其仅由谷氨酸(glutamic acid,Glu)一种氨基酸组成。Glu的相对分子质量为147,谷氨酸残基相对分子质量为129,要形成分子量为129倍数的分子结构,有两种可能性:①N端是分子内封闭(焦谷氨酸)的肽链;②环谷氨酸。考虑到谷氨酸的特殊性,其可以γ-羧基形成肽键,因此可能的分子结构有4种类型,即环α、环γ、焦谷α、焦谷γ。为了进一步明确其分子结构类型,我们以6个谷氨酸残基组成的6元肽为代表,化学合成了其所有可能的四种结构类型。最终比对确定,该系列小分子是一组环γ-聚谷氨酸(cyclo-y-polyglutamic acid,cyclo-γ-PGA),分别由4-11个谷氨酸残基组成。我们进一步验证了 cyclo-y-PGA确实具有增加毒素蛋白亲水性和稳定性的作用,且对离体细胞和整体动物均无毒性作用。可见cyclo-γ-PGA具备了优质生物材料的特点,因此本课题第三部分即利用cyclo-y-PGA作为涂层材料包裹纳米胶束,并深入分析cyclo-γ-PGA作为纳米胶束涂层的潜在优势。第三部分常用化疗药物水溶性低、稳定性差、体内循环时间短、缺乏肿瘤靶向性,影响治疗效果,甚至引起严重毒副作用。而纳米载体可以增强药物的肿瘤靶向性,提升药物稳定性并延缓药物释放。本课题第二部分,从水母刺丝囊分离鉴定了一组全新的小分子cyclo-γ-PGA,与链状γ-聚谷氨酸一样存在大量游离羧基,但又具有环肽结构,性能更加稳定。因此,本部分首先以光敏剂原卟啉(Protoporphyrin Ⅸ,PpⅨ)和含二硫键的硫辛酸(alpha lipoic acid,LA)为疏水基团,亲水肽(NLS)为亲水基团,设计制备了双重响应性纳米胶束NLS-LA-PpⅨ。其次,利用从水母刺丝囊分离鉴定到的全新环状小分子cyclo-γ-PGA包裹前期设计合成的载阿霉素(doxorubicin,DOX)纳米胶束,制备cyclo-γ-PGA涂层的载阿霉素纳米胶束NLS-LA-PpⅨ-DOX@cyclo-γ-PGA,评价cyclo-γ-PGA作为生物涂层在提升纳米胶束稳定性以及利用γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)介导的内吞途径增加细胞对胶束的摄取等方面的优势,明确该纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能,并检测其体内外抗肿瘤效应。主要结果如下:1.采用溶剂共挥发法制备纳米胶束,马尔文粒径仪检测显示cyclo-y-PGA涂层后的纳米胶束的粒径稍增大,聚合物分散性指数(polymer dispersity index,PDI)降低,同时电位发生翻转;透射电镜显示加入cyclo-y-PGA后纳米胶束周围出现一圈淡色涂层,胶束呈球形,粒径较均一,以上结果表明cyclo-γ-PGA可以成功包裹于纳米胶束周围。2.cyclo-γ-PGA涂层胶束在高离子浓度以及含血清的培养基条件下,24 h累积释放率较未涂层纳米胶束低,说明cyclo-γ-PGA涂层可以增加纳米胶束在不同介质中的稳定性;类似地,溶血实验显示cyclo-γ-PGA涂层可以减少纳米载体与红细胞相互作用,降低溶血率,加强纳米胶束在血液中的稳定性。3.细胞摄取试验结果表明,cyclo-γ-PGA涂层能够增加细胞对纳米胶束的摄取;进一步利用GGT酶抑制剂GGsTop后证明,cyclo-γ-PGA涂层是通过GGT酶介导的细胞内吞途径来增加细胞对纳米胶束的内化。4.纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能研究显示,当纳米胶束处于pH 5.0/10 mM GSH条件(模拟肿瘤细胞内环境),72 h的累积释放率显著升高,证明纳米胶束具备良好的还原响应特性。光敏效应研究显示,当施加短时光照时,内涵体膜会发生光化学破裂,引发光化学内在化(photochemical internalization,PCI)效应,从而增强纳米胶束的逃逸,促使药物在细胞质内传递。活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测结果显示,cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束处理后的细胞内ROS含量较游离PpIX以及其他纳米胶束组更高,一方面证明cyclo-γ-PGA涂层增加了细胞对纳米胶束的摄取,另一方面也表明更多的光敏剂进入细胞产生更多单线态氧(singletoxygen,1O2),为下一步研究纳米胶束光动力治疗奠定了基础。5.体外抗肿瘤研究表明,cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束较之非涂层纳米胶束展现出更强的肿瘤细胞杀伤作用。活体成像分析显示cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束组展现出良好的肿瘤靶向能力,可以有效减少DOX在其他器官的蓄积,从而降低DOX的毒副作用。体内抗肿瘤试验显示,NLS-LA-PpIX-DOX@cyclo-γ-PGA协同光动力治疗能显著提高DOX的在体肿瘤抑制效果,在显著提高疗效的同时,NLS-LA-PpIX-D6.OX@cyclo-γ-PGA极大地降低了 DOX毒副作用,表现出良好的安全性。总之,本部分研究基于水母刺丝囊来源的新型聚阴离子环状小分子cyclo-γ-PGA,构建了一个在血循环中稳定性良好,具有还原/光刺激双重响应性以及GGT受体靶向功能,化疗与光动力治疗协同作用的聚合物纳米给药体系,为抗肿瘤化疗药物输送体系研究提供新思路。
关键词: 水母 ；刺丝囊 ；转录组学 ；蛋白质组学 ；纳米胶束 ；生物涂层
被引量
4
摘要： 雌激素（Estrogen）是一种重要的内分泌激素,在机体的组织和器官中发挥着重要的作用,如维持正常组织和生殖器官发育,中枢神经和骨骼系统中的组织特异性基因的调节等。雌激素的紊乱会造成激素依赖性疾病的产生,如乳腺癌,子宫内膜癌,骨质疏松症和卵巢癌,以及炎症等。雌激素主要通过雌激素受体（ER）ERα和ERβ的调节来发挥其作用。ERα被认为是乳腺癌发病的主要因素,同时也与癌细胞周围的非可控性炎症反应有关。而ERβ的生理作用主要在免疫系统,心血管系统,神经系统和前列腺等组织中,且其不会引起乳腺或子宫内膜组织的增殖。目前,基于雌激素受体信号通路的药物应用十分广泛,当长期服用会引起严重的耐药性和一些不良反应,这些副作用是造成该类药物治疗效果不理想的主要原因。在药物开发方面,以ERα为靶点的药物在临床上有着广泛的应用。与ERα相比,目前仍没有以ERβ为靶点的药物进入临床应用。同时对于多发性硬化症,阿兹海默症等与ERβ相关的疾病目前也没有有效治疗的药物。因此,开发新型高效且具有低毒副作用的雌激素类药物具有重要的意义。通过对雌激素受体的研究背景和现状的研究,结合本课题组ER配体的研究工作,本论文主要围绕以下三个部分进行展开:1)为了探索三维拓扑结构在雌激素受体配体中的重要性,我们系统性探究了7-氧代硫杂双环庚烯类衍生物（SOBHSA）生物活性。我们采用植物雌激素香豆雌酚（Coumestrol,CS）作为示踪分子构建了一种新颖的受体结合亲和力测定方法。随后采用双荧光报告基因系统研究化合物对ERs的转录调节作用,检测了该系列化合物在转染雌激素受体ERα后介导的转录激活或者拮抗活性,并进行了详细的构效关系研究。研究发现大部分的7-氧代硫杂双环庚烯类衍生物（SOBHSA）具有良好的ERα亲和力和优异的ER激动剂活性。通过构效分析发现,酚环上的甲基可以增加ER的受体亲和力,而磺酰胺上N-甲基对ER转录活性具有关键作用。化合物???-12f和???-12g显示出最高的ERα选择性,均为333。化合物???-11b,???-11f和???-12f显示出最佳的ERα激动活性,EC50均表现为纳摩尔水平。通过分子对接分析,我们发现化合物???-11f能与母体化合物SOBHS具有相似的结合构象,这也是化合物对ER产生激动活性的原因。同时磺酰胺上的苯基能推挤螺旋11使其向外移动,并靠近螺旋12,从而能展现出抗炎活性的结合构象。这为高选择性的ERα激动剂和抗炎活性的机制研究提供了新的思路。2)近几年,由于他莫昔芬和芳构化酶抑制剂在产生耐药性的乳腺癌患者中没有发挥治疗效果,使得一些人们对靶向ERα信号通路的药物产生了怀疑。但是,最近的分子药理学研究表明ER仍然与晚期肿瘤有着密切关系,因此ER仍然是晚期恶性肿瘤的可行治疗靶标。在ER配体的研究中,侧链是配体化合物具有ER拮抗活性的重要功能元件。基于此,我们选择使用结构和立体化学简单,且具有桥联三环刚性的核心单元-金刚烷体系代替环氟乙烯的环己烷环,对金刚烷类抗雌激素配体的侧链进行了深入的探索,设计、合成了一定数量和种类的羧酸盐类衍生物（酮,酯和酰胺）。对于该系列的化合物,我们评估了其ERα受体结合亲和力,ER阳性乳腺癌MCF-7细胞的抗增殖活性和胞内水平的蛋白降解能力。研究发现在配体的侧链末端引入极性原子能实质性提高其与受体的亲和力。该系列大部分化合物表现出理想的受体亲和力。在抗增殖活性实验中,化合物?V-11m和?V-11a表现出与现有药物氟维司群相当的抗增殖能力,并且在蛋白降解实验中,化合物?V-11a也表现出与氟维司群相当的蛋白降解能力。总而言之,?V-11m表现为优秀的选择性雌激素受体调节剂,?V-11a则表现为优秀的选择性雌激素受体下调剂,具有开发为抗耐药性乳腺癌的候选药物的潜力。同时该部分工作也证实侧链药效团在生物活性中起着主导作用。3)由于以ERβ为靶点的药物还处于研究初期,与ERβ相关的疾病如多发性硬化症,阿兹海默症等神经性疾病一直处在无药可治阶段。同时在之前研究报道中,绝大部分的SERMs都表现出对ERα的选择性。相比之下,对ERβ选择性的配体研究较少。因此设计、合成ERβ选择性的配体分子具有重要的意义,同时也具有挑战性。在本章节中,我们设计、合成了以苯并硒唑为核心化合物的ER配体,通过生物活性评估发现,苯并硒唑类衍生物是一类高选择性ERβ配体。首先,就结合亲和力和转录效力而言,化合物对ERβ显示出优秀的受体亲和力和选择性。更重要的是,大部分的化合物表现出对ERα极低的受体亲和力（均小于0.1%）。化合物V-5h和V-5j对ERβ的RBA分别是15%和24%,其中V-5j对ERβ的选择性超过50。在转录实验中,大多数化合物表现出良好的ERβ激动活性。且在后续的双氧水抗氧化实验中,化合物V-5g和V-5h均表现出良好的抗氧化能力。在细胞毒性测试中,大部分的化合物对VERO细胞不具有细胞毒性,优于现有的SERMs药物4-羟基他莫昔芬。因此,苯并硒唑系列化合物可以作为ERβ的药理学探针,用于确定ERβ的生物学重要性和生理作用。同时这类化合物表现出的ERβ激动活性和抗氧化活性,显示出ERβ的激动剂在神经细胞中具有保护作用,预示着该类化合物在神经退行性疾病的药物开发中具有良好的前景。总之,苯并硒唑类化合物为结构多样性的ERβ配体的设计提供了重要见解,为进一步寻找具有潜在成药性的ERβ靶点的药物提供了重要的研究基础。
关键词: 雌激素受体 ；选择性雌激素受体调节剂 ；选择性雌激素受体下调剂 ；氧化应激 ；抗雌激素
摘要： 艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus,HIV-1)引起的一种破坏人体免疫系统的慢性传染病。HIV-1生命周期中,逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)在病毒逆转录过程中具有关键作用,是研发抗艾滋病药物的理想靶点。根据作用机制的不同,目前临床应用的HIV-1逆转录酶抑制剂(RTIs)可被分为核苷(酸)类逆转录酶抑制剂(Nucleoside/Nucleotide reverse transcriptase inhibitors,NRTIs/NtRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)。已上市的NNRTIs具有高选择性、强抗病毒活性、低细胞毒性的优势,使得其成为高效抗逆转录疗法(Highly active antiretroviral therapy,HAART)的重要组分。但是长期服药后出现的耐药性、毒副作用等问题严重限制了其临床应用,研发高效、低毒、抗耐药性的非核苷类逆转录酶抑制剂仍然是目前抗HIV-1药物研究的重大科研任务。随着HIV相关的结构生物学快速发展,许多NNRTIs/RT复合物的共晶结构被详细解析,具有抗耐药性的抑制剂与RT的结合模式得到深刻认识,为新一代高效抗耐药NNRTIs的研发提供了有用的线索。NNRTIs结构的高度柔性与结合口袋内高度保守氨基酸残基的存在为二芳基嘧啶(DAPY)类NNRTIs的结构修饰提供了巨大的可能性。本论文根据NNRTIs与靶标的结合模式,运用结构生物学信息、计算机辅助药物设计和药物化学基本原理等,在DAPYs左翼疏水作用区部位进行了结构多样性修饰探索,开展了以下两个方面的研究工作:靶向NNIBP疏水作用区的DAPY类HIV-1 NNRTIs的设计、合成与活性评价为解决第二代NNRTIs上市药物利匹韦林(RPV)所存在的细胞毒性强(脱靶效应)、溶解度差和易产生耐药突变株等问题,根据RPV/RT共晶结构中结合口袋(NNIBP)的主要特征,采取生物电子等排策略对RPV左翼氰基乙烯基所处的NNIBP疏水作用区进行了结构多样性修饰,以期与周围保守氨基酸残基产生新的结合力,探索NNIBP的“蛋白-溶剂”界面,在保障活性的前提下改善RPV的细胞毒性,共设计合成了 1 6个结构新颖的DAPYs类HIV-1抑制剂。首先利用MTT法对所有目标化合物进行了抗HIV-1体外细胞水平活性测试。测试结果表明,该系列的大部分化合物对HIV-1野生株表现出几十个纳摩尔到亚微摩尔的抑制活性。除FS13外,其他化合物的EC50值介于16nM-0.722μM。FS2对HIV-1野生型显示出最强的抑制活性,其ECs0值为16nM,优于阳性对照药3TC(EC50=5.234μM)、NVP(EC50=0.16μM),与AZT(EC50=0.021μM)相当,但仍弱于第二代NNRTIs的ETV(EC50=3 nM)和RPV(EC50=1.3 μM)。在抗耐药株活性测试中,FS2对HIV-1临床常见单突变株K103N(EC50=39nM)的抑制活性优于上市药物3TC、NVP、EFV(EC50=2.792,6.745,0.103 μM),还对具有严重耐药性的RES056(K103N+Y181C)毒株具有一定的活性(EC50=1.463 μM)。同时,与RPV(CC50=4.38 μM)相比,有7个化合物的细胞毒性降低3.8-51.8倍,初步改善了先导化合物RPV的毒性问题。然后,我们通过HIV-1逆转录酶抑制实验进一步确认了新合成小分子的作用靶标。目标化合物的初步构效关系(SAR)与分子模拟研究等也在本章节进行了探讨。基于高效模块反应微量合成与快速筛选技术发现新型DAPY类NNRTIs通过模块反应的微量合成来构建优势片段组合库,并运用快速筛选技术是快速发现药物先导化合物的有效途径。第三章采用基于靶标结构的合理药物设计策略,靶向NNIBP的疏水作用区,利用羟胺-醛模块化反应建立了“肟”化合物组合库(116个)。首先对所得组合库的化合物进行了单一浓度下(1.0μM)抑酶活性水平测试,筛选得到5个苗头化合物(FQ53、FQ54、FQ77、FQ78、FQ79)并进行了抑酶实验测试。抗HIV-1 RT实验结果评价,有4个化合物的抗病毒效果(IC50:0.34～0.39 μM)与阳性对照RPV(IC50=0.23 μM)相当。随后,对初筛所得苗头化合物完成了毫克级的合成并经波谱确证结构。目前,苗头化合物的体外细胞(MT4)水平抗HIV-1的活性测试正在进行中。综上,为提高DAPYs对HIV-1临床常见突变株的抑制活性,降低化合物的细胞毒性的问题,我们基于靶标的合理药物设计,利用计算机辅助药物设计方法与基于点击化学和快速筛选的技术,对第二代NNRTIs中的RPV进行了结构多样性修饰,共设计合成了 16个结构全新的DAPY类NNRTIs与116个“肟”化合物的NNRTIs组合库。经细胞水平及酶水平的生物活性测试,多个化合物对HIV-1野生株及单突变株(K103N)具有较好的抑制活性,有望通过后期的修饰探索发现高效、抗耐药、且理化性质良好的先导化合物。
关键词: HIV-1 ；NNRTIs ；二芳基嘧啶 ；药物设计 ；点击化学
被引量
1
摘要： 成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)是受体酪氨酸激酶FGFR家族的一员,与成纤维细胞生长因子(FGFs)相互作用,调节关键的发育和生理过程。研究表明,FGF19/FGFR4信号通路异常与肝细胞癌和乳腺癌的发生发展及不良预后密切相关,是此类癌症潜在的治疗靶点。多靶点抑制剂和Pan-FGFR抑制剂较明显的毒副作用限制其在临床中的应用。针对FGFR4胞内激酶结构域中ATP结合位点附近保守度较差的半胱氨酸(Cys552)的亚型选择性FGFR4共价抑制剂最近被开发并报道。肝癌细胞中FGFR4的快速再合成速率使得共价不可逆抑制剂需要允许频繁给药来实现其药效,不可避免会产生毒副作用。共价可逆FGFR4抑制剂显示出较大优势。全文围绕共价可逆FGFR4抑制剂,完成了三部分内容。 Roblitinib是第一个高选择性的共价可逆FGFR4小分子抑制剂,通过醛基与FGFR4蛋白铰链区的半胱氨酸共价结合。首先运用计算机模拟技术预测蛋白中水分子自由能,通过替换高能水分子的策略,并借鉴成熟的选择性抑制剂中常用的结构,设计并合成了一系列2-甲酰基四氢萘啶类抑制剂。经过结构优化,确定了化合物的初步构效关系,其优选化合物2-25d能够强烈抑制FGFR4,而对亚型FGFR1-3激酶无明显抑制活性。化合物2-25d对于肝癌细胞Hep3B和乳腺癌细胞MDA-MB-453的增殖抑制作用均强与阳性对照的抑制水平,而对于非FGFR依赖的细胞系无明显抑制作用。该类化合物可以作为新型靶向FGFR4抗肿瘤药物研发的先导化合物,为后续开发临床药物奠定基础。 通过分析已报道的共价可逆小分子抑制剂Nov-6b的结构特征,我们使用构象固定的策略,将结构中的分子内氢键环化,设计并合成了一系列5-甲酰基二氢喹唑啉酮类选择性共价可逆FGFR4抑制剂。经过结构优化,确定初步构效关系,我们将优选化合物与FGFR4蛋白的晶体复合物结构进行解析,阐明该类分子与FGFR4结合的共价作用模式。同时,使用MALDI-TOF质谱,透析分析证明该类化合物通过可逆的共价键与蛋白相互作用。在随后的结构优化中,在醛基邻位引入较大结构取代基来封闭其代谢位点以提高成药性,获得的化合物3-20a对于肝癌细胞Hep3B的细胞的增殖抑制作用明显提升。但该类型分子合成路线较长,需经过17-19步反应获得目标化合物,不利于药物开发,作为工具分子进行体外生物功能研究。蛋白免疫印迹实验证明该分子可剂量依赖性地抑制FGFR4及下游蛋白的磷酸化水平;进一步研究表明化合物3-20a可以剂量依赖地抑制Hep3B细胞的克隆形成。 醛基弹头潜在的毒性及代谢不稳定性限制其在共价可逆药物设计的广泛应用。我们开发新型三氟乙酰基弹头靶向半胱氨酸,成功地发现了一系列高效且高选择性FGFR4共价可逆抑制剂。其共价可逆结合模式已通过MALDI-TOF质谱,透析分析和X射线晶体学研究得到了验证。为了进一步探索三氟甲基酮作为新型弹头靶向半胱氨酸在其他激酶抑制剂方面的设计与广泛应用,后续相关研究正在进行当中。
关键词: 成纤维细胞生长因子受体4 ；共价 ；可逆 ；三氟乙酰基弹头
摘要： 目的:细胞色素P450 3A(CYP3A)亚家族约占肝脏P450酶总含量的28%-40%,是临床上非常重要的药物代谢酶,因为CYP3A已经被证明可以催化几乎所有治疗类药物中大量结构多样的分子代谢。而CYP3A4通常被认为是在人肝中表达的主要形式。当前,一些药物增强剂(CYP3A4抑制剂如:利托那韦)和治疗药物联合使用以增加快速代谢药物在体内的血药浓度。目前已上市的CYP3A强效抑制剂主要包括三类:蛋白酶抑制剂类、大环内酯类抗生素类、唑类抗真菌药类,但这些药物存在产生耐药、可灭活CYP3A、引发不良反应等现象。本研究发现中药中的五环三萜类化合物可强效抑制CYP3A,而这些五环三萜的几个官能团(例如C-3羟基,双键和羧酸)很容易被修饰,以产生一系列具有良好结构连通性的半合成衍生物。因此有必要系统地研究这些五环三萜及其类似物(作为CYP3A抑制剂)的结构-抑制活性关系。
方法:本研究基于建立的8种CYP亚型酶(CYP1A,CYP2A6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP3A)的液相色谱-质谱定量分析检测方法和CYP3A4亚型酶的全自动荧光酶标仪定量分析检测方法,筛选了大量中药颗粒剂/中药对CYP3A的抑制效应,并借助液相色谱-抑制效应谱相结合的策略从中药中鉴定出具有CYP3A抑制活性的成分。并通过结构-活性关系分析、计算机辅助设计等对天然的CYP3A4抑制剂进行结构改造,设计优化出安全有效的CYP3A4抑制剂。
结果:通过评价124种中药颗粒剂/中药对CYP3A4的抑制活性,发现中药苏合香可强效抑制CYP3A4。借助谱效结合手段、LC-TOF-MS/MS分析、CYP3A抑制活性评价发现苏合香中的五环三萜类化合物可强效抑制CYP3A,尤其是齐墩果酮酸抑制CYP3A的半数抑制浓度为0.63μM。抑制动力学分析和分子对接结果表明,齐墩果酮酸可竞争性地抑制CYP3A介导的睾酮-6β羟化,且齐墩果酮酸和白桦脂酸以相加的作用抑制CYP3A。三萜类化合物及其衍生物(甘草次酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸)抑制CYP3A4的构效关系分析表明:a.C-3位引入羰基/酯基均可增强其CYP3A4抑制活性,且引入羰基较强;b.C-11位上引入羰基对CYP3A4抑制活性有利;c.C-30位羧基成酯/酰胺均可增强其CYP3A4抑制活性,且以碳链最短的甲酯为优,羧基成乙酯/酰胺后对抑制活性相差不大;d.C-28位羧基成甲酯/酰胺均可增强其CYP3A4抑制活性。3-酮-甘草次酸-30-甲酯对CYP3A4的抑制效应最强,半数抑制浓度为0.04μM。
结论:上述研究结果表明,五环三萜类化合物可用作开发有效的CYP3A4抑制剂且具有良好安全性的先导化合物。且本研究表明,从中药中发现安全有效的CYP3A4抑制剂,并结合计算机辅助设计对其进行结构改造,以期设计出强效安全CYP3A4抑制剂是切实可行的。
关键词: 细胞色素P4503A ；苏合香 ；中药活性成分 ；三萜类化合物 ；构效关系
摘要： 艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的重大传染性疾病,严重威胁人类健康。以多种不同靶标药物联合应用为特征高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)是目前治疗艾滋病的主要方法,但由于HIV-1具有高突变率和基因重组率,使得其对已有靶标的药物产生了不同程度的耐药性,大大降低了 HAART的临床疗效。因此,聚焦抗HIV药物设计新靶标,发现具有新作用机制的抗HIV-1候选药物是克服目前HIV-1耐药性的有效手段。一、苯基草酰胺类HIV-1 gp120抑制剂的设计、合成及活性评价gp120与CD4的结合是HIV-1侵入细胞的第一步,理论上干扰此过程就能阻止HIV识别靶细胞,抑制病毒复制。NBD-556是一种由高通量筛选得到的小分子gp120抑制剂,其可通过抑制gp120-CD4相互作用来抑制病毒侵入,但NBD-556仅具有微摩尔级别的抗HIV-1细胞活性。NBD-556/gp120复合晶体结构解析发现NBD-556仅作用于gp120蛋白的Phe43腔,而在gp120-CD4相互作用界面上尤其是关键氨基酸Asp368残基基本没有额外相互作用,导致其与gp120蛋白结合能力较弱,活性不佳。本章以NBD-556为先导,运用多位点结合的药物设计策略,保持先导化合物苯基草酰胺结构骨架不变,将其区域Ⅲ的四甲基哌啶环进行替换和延伸,引入不同结构的含氮基团,使其同时作用于gp120蛋白的“Phe43腔”以及关键残基Asp368,设计合成了18个结构新型的化合物,所有化合物结构经质谱、1H NMR和13C NMR结构确证。利用荧光素酶分析法(TZM-b1细胞/HIV-1 pNL4.3)对目标化合物进行了体外抗病毒活性实验,结果表明化合物LL-2、LL-12、LL-14、LL-18具有微摩尔的抗病毒活性,LL-2(EC50=1.897 μM)的活性最好,是先导化合物 NBD-556(EC50=3.611 μM)的2倍。SPR实验结果显示,化合物LL-2、LL-12、LL-14、LL-18与gp120蛋白的亲和力均高于阳性对照药NBD-556,证明该系列化合物作用靶点为HIV-1 gp120。分子模拟结果显示化合物LL-2可伸入Phe43腔并与Asp368残基产生静电相互作用,与我们的设计思路一致。综上,本研究以gp120-CD4相互作用为设计靶标,进一步丰富了苯基草酰胺类抑制剂的构效关系,为发现高活、低毒的新型HIV-1 gp120抑制剂奠定了基础。二、HIV-1逆转录酶抑制剂的定量构效关系研究近年来,计算机辅助药物设计被越来越广泛地运用于药物设计中,大大加速了药物研发进程。其中,定量构效关系应用化合物理化性质和结构信息,通过定量研究化合物结构性质与目标效应之间关系,进而指导化合物结构修饰的一种方法。HIV-1 逆转录酶(Reverse Transcriptase Inhibitors,RT)能够抑制病毒单链 RNA逆转录为双链DNA,在HIV-1生命周期中发挥着重要作用。其中,非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NNRTIs)具有高效、低毒的优势,是HAART的重要组成部分。其中,二芳基嘧啶类化合物(Diarylpyrimidines,DAPYs)和二芳基烟酰胺类化合物(Diarylnicotinamides,DANAs)是两类被广泛研究非的NNRTIs。本章对DAPY和DANA两类共计42个化合物进行二维和三维定量构效关系研究,通过构建基于化合物结构的二维和三维QSAR模型,探讨了两类化合物结构优化方向,为发现具有更加高效抗耐药性的HIV-1 NNRTIs提供了设计依据。
关键词: 艾滋病 ；HIV-1 ；gp120抑制剂 ；计算机辅助药物设计 ；定量构效关系
摘要： 兼具类药性与多样性的高质量化合物库的构建是药物先导化合物发现中的关键环节。本课题组前期综合基于优势片段的药物分子设计理念、多样性合成策略、模块化反应、微量合成技术,发展了基于点击化学的优势片段组合库的构建与快速筛选技术相结合的方法,具有微量、灵敏、经济、高效的优点,已成为具有广阔应用前景的发现药物先导化合物的新途径。本论文在课题组前期研究的基础上,针对临床常见且严重威胁人类生命健康的心脑血管疾病及致死率极高的恶性肿瘤,选择重要的药物设计靶标(Xa因子、CDC25蛋白磷酸酶),运用基于靶点的优势片段设计,再通过CuAAC点击化学反应平行合成或微量合成构建化合物库,经快速筛选、结构优化发现新颖的药物先导化合物,主要内容分为以下两个部分:(Ⅰ)基于点击化学优势片段组合和快速筛选技术发现新型凝血Xa因子抑制剂近年来在抗凝药物研发中凝血Xa因子(Coagulation Factor Xa,FXa)作为最具潜力的靶点引起了人们的极大关注。虽然目前已有四种新型FXa抑制剂被批准上市,包括利伐沙班(Rivaroxaban)、阿哌沙班(Apixaban),伊度沙班(Edoxaban)和贝曲西班(Betrixaban),但是该类口服凝血Xa因子抑制剂普遍具有肝脏毒性,在其较大剂量给药时会发生剂量依赖性出血,小剂量给药时抗凝效果较差,因此肾功能不全患者应用此类抗凝药物易导致药物蓄积,增加出血风险;针对该类药物可能引起的过度抗凝现象,其解毒剂应运而生,然而目前仅有Andexanet alfa被批准且仅适用于利伐沙班及阿哌沙班相关的危及生命或无控制出血后的治疗,其它口服直接Xa因子抑制剂解毒剂的开发仍在进行中。综上所述,亟需开发更加安全有效且具有多种结构类型的新型FXa抑制剂来供临床选择。本论文第二章我们基于抑制剂与Xa因子的结合模式,对已有的高活性FXa抑制剂进行分析,提取核心优势片段,运用基于靶点的优势片段设计理念和多样性导向合成策略,分别建立了一个含有4个Linker与P4基团相连的优势炔片段库(A1-A4)和一个通过对P1取代基进行修饰而得到的多样性叠氮片段库,并利用CuAAC点击化学反应,微量合成了 Series Ⅰ共52个含1,2,3-三唑结构的目标化合物,经快速筛选发现了 1个苗头化合物分子A1N1。接着对筛选到的优势片段A1进行结构优化,设计合成了 6个优势炔片段(A1、B1-B5),并扩充了叠氮片段的类型,通过CuAAC微量点击化学反应,合成了 Series Ⅱ共54个1,2,3-三唑衍生物,经快速筛选发现了 6个苗头化合物分子A1N1、B1N1、B2N1、B4N1、B5N1、B5N4,其抑酶效果均表现良好(IC50:0.026～4.05 μM),但并未超过阳性药物利伐沙班(IC50=0.05 nM)。在进行Series Ⅱ设计合成的同时,我们以苗头化合物A1N1为先导化合物,结合课题组前期工作成果,利用骨架跃迁和优势片段杂合原理,通过在吲哚骨架的2,3位分别引入P4和P1片段,得到了一系列(Series Ⅲ,含18个目标化合物)吲哚类新型FXa抑制剂,并对该系列FXa抑制剂进行了抑酶活性试验,活性结果显示,Series Ⅲ化合物的活性较弱(IC50:16.45～885.17 μM),且均未超过先导化合物A1N1(IC50=4.05 μM)。然后使用Syby1软件对化合物进行对接模拟分析,探讨了化合物的构效关系,为进一步结构优化提供了参考。(Ⅱ)基于点击化学微量合成与快速筛选技术发现新型CDC25蛋白磷酸酶抑制剂细胞分裂周期蛋白25(Cell Division Cyclin 25,Cdc25)是一种高度保守的双特异性磷酸酶,在细胞周期中发挥着重要的作用,近年来许多研究表明,Cdc25磷酸酶在多种癌症组织中均呈现过表达,因此,CDC25蛋白磷酸酶已成为抗肿瘤药物设计的一个重要靶标,但是到目前为止仍未有基于该靶标的药物上市。为了发现具有更高活性和选择性的CDC25磷酸酶抑制剂,本论文第三章我们在课题组前期工作的基础上,继续以广泛报道的CDC25抑制剂NSC663284、NSC668394、Cpd5为先导化合物,提取其结构中优势的稠环对苯醌结构作为核心骨架并延长了前期筛选得到的优势片段M2的Linker长度得到了炔片段M3,通过CuAAC点击化学微量反应,快速构建了含1,2,3-三唑-1,4-喹啉二酮结构的化合物库(39个目标化合物)。初筛结果显示,化合物M3N6、M3N12、M3N23、M3N21、M3N35均表现出良好的抑酶活性及亚型选择性,具有进一步研究的价值。综上所述,本论文围绕未满足临床需求的抗凝血及抗肿瘤药物,在课题组前期研究基础上,分别以凝血级联反应中的关键凝血酶Xa因子和与肿瘤增殖密切相关的CDC25磷酸酶为药物设计的靶标,运用基于优势片段的合理药物分子设计理念和多样性导向合成策略进行结构设计,并利用模块化反应的微量(平行)合成方法来构建数量较大的化合物库,最后结合快速筛选技术,发现了具有重要开发前景的FXa抑制剂及CDC25磷酸酶抑制剂。
关键词: 抗凝血 ；Xa因子 ；CDC25蛋白磷酸酶 ；点击化学 ；快速筛选
摘要： 病毒感染对人类生命健康的危害非常严重。艾滋病,是一种由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引发的慢性感染性疾病,它可以破坏人体的免疫系统。由于HIV-1易产生耐药性且具有潜伏性,现阶段没有药物可以治愈艾滋病,因此亟需研发出新靶标、新机制的抗HIV-1药物。新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)所引起的呼吸道传染病,自2020年爆发以来,对全球人类健康和社会经济发展带来重大不利影响。当前新冠疫情现状仍不容乐观,多种病毒变异株的出现使得现有疫苗和中和抗体的临床疗效显著降低,因此研发出高效抗耐药性的抗SARS-CoV-2特异性药物具有重要意义。本论文针对HIV-1的耐药性和SARS-CoV-2缺乏特异性治疗药物的科学问题,聚焦于HIV-1的新靶标衣壳蛋白和SARS-CoV-2的关键靶标主蛋白酶,采用基于靶标的药物设计策略,并结合多样性的合成方法,最终发现了多个抗病毒活性良好的先导化合物。主要工作内容分为以下三部分:一、基于多组分反应发现新型类肽类HIV-1衣壳蛋白抑制剂HIV-1衣壳蛋白(Capsid Protein,CA)是构成形态成熟、具有感染性病毒颗粒所必需的结构蛋白,在病毒生命周期的早期(脱壳、逆转录、核输入、整合等)和晚期(组装和成熟)阶段均扮演着重要角色,是目前研究的热点。本文第二章选择靶向于CANTD-CTD的PF-74为先导化合物,通过合理药物设计,结合Ugi四组分反应最终得到了 18个类肽类目标化合物。体外抗HIV活性测试(MT-4细胞)结果显示,当R1为取代苄基,R2为取代的吲哚基团或取代的四氢吲唑基团时,如化合物I-7、I-9、I-19、I-21,其对HIV-1具有较好的抑制活性(EC50=2.53-2.93 μM)。其中化合物I-19表现出最好的抗 HIV-1 活性(EC50(HIV-1)=2.53±0.84 μM,CC50=107.61±27.43 μM)。当 R2 为 1 位萘环取代时,如化合物 I-8(EC50(HIV-2)=5.87±1.79μM,CC50>191.35μM)和化合物 I-14(EC50(HIV-2)=2.30±0.11 μM,CC50>189.32 μM),其对 HIV-2的抗病毒活性优于上市药物奈韦拉平(EC50(HIV-2)>15.02 μM,CC50>15.2 μM),值得进一步开发。分子动力学模拟实验进一步阐明了代表性化合物I-19与靶标的结合模式,为进一步的结构优化奠定了基础。二、基于点击化学微量合成和快速筛选技术发现新型SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂SARS-CoV-2主蛋白酶(Main Protease,Mpro)是一种半胱氨酸蛋白酶,对病毒的复制和转录至关重要。主蛋白酶在冠状病毒中高度保守,并且在人体内无同源性酶,是抗新冠病毒药物研究的热点靶标。本文第三章以SARS-CoV-2主蛋白酶靛红类衍生物D-75为先导化合物,针对D-75细胞活性差、毒性大(EC50>4 μM,CC50=33.1 μM)的问题,通过基于片段的药物设计策略,保留吲哚2,3-二酮优势片段,运用生物电子等排策略将萘环替换为三氮唑结构,并结合点击化学快速微量合成了 58个化合物(粗品)。酶水平的初筛结果显示,在1μM浓度下,目标化合物D71N8、D71N18和D71N52对SARS-CoV-2主蛋白酶的抑制率均达到了 70%以上。经毫克级制备及纯化后,复筛结果表明化合物D71N8(IC50=0.44±0.12 μM)和D71N52(IC50=0.53 ± 0.21μM)的抑酶活性与先导化合物D-75(IC50=0.30±0.14 μM)相当,化合物D71N18(IC50=1.12±0.54μM)的抑酶活性略弱于D-75。细胞水平的抗SARS-CoV-2活性结果表明,目标化合物D71N8、D71N18和D71N52在20μM浓度下没有明显细胞毒性,与先导化合物D-75相比(CC50<2.2 μM)明显下降,然而这三个化合物也未表现出对SARS-CoV-2的抑制活性。此外,通过分子动力学模拟实验探讨了化合物D71N8与SARS-CoV-2主蛋白酶的结合模式。综上,通过将疏水性的萘环替换为三氮唑环,化合物在保持靶标亲和力的同时,细胞毒性大幅降低,为后续结构优化提供了依据。三、基于靶标的新型依布硒啉类SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂的设计、合成以及生物活性评价新型抗炎药物依布硒啉(Ebselen)对SARS-CoV-2具有较好的抑制活性,且目前处于治疗新冠的临床Ⅱ期阶段。结构生物学研究表明依布硒啉是通过硒原子和SARS-CoV-2 Mpro半胱氨酸的巯基形成共价键来抑制Mpro活性。但人体蛋白中的巯基众多,这种与巯基结合的抑制剂缺乏特异性,极易产生脱靶效应。本章以依布硒啉为先导化合物,利用基于靶标的药物设计策略,在靶向S1腔的苯环侧链引入富含氢键供受体的基团,以期通过增强分子与Mpro活性位点的相互作用而增加靶标选择性,设计合成了 1 4个结构新颖的苯并异硒唑酮衍生物。抑酶活性结果表明,化合物Ⅲ-13(IC50=0.38±0.19μM)和Ⅲ-15(IC50=0.50±0.04 μM)的抑酶活性优于依布硒啉(IC50=0.62±0.08μM),化合物Ⅲ-14的活性(IC50=0.68±0.08 μM)与依布硒啉相当。细胞水平的抗新冠病毒活性结果表明,化合物 Ⅲ-15(EC50=17.26±0.13μM)与依布硒啉(EC50=3.78±2.1μM)相比,仍具有一定的差距。值得注意的是,苯环对位的N,N-二甲基磺酰胺基修饰会显著影响细胞毒性,如化合物Ⅲ-13(CC50=6.44±0.31 μM),具有较大的细胞毒性。此外,机制实验(DTT依赖性实验和时间依赖性实验)表明该系列化合物可与主蛋白酶共价结合,且呈时间依赖性。总之,该研究丰富了依布硒啉系列化合物的构效关系,为进一步的结构优化提供参考。综上所述,本研究针对目前抗艾滋病及抗新冠药物的重大临床需求,分别以对病毒复制至关重要的衣壳蛋白和主蛋白酶为靶标,运用合理的药物设计策略、采用微量合成及快速筛选技术,发现了结构新颖、活性良好的HIV衣壳蛋白抑制剂及SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂,对研发出高效低毒的抗病毒候选药物奠定了坚实的基础。
关键词: HIV-1 ；SARS-CoV-2 ；衣壳蛋白 ；主蛋白酶 ；药物设计 ；药物筛选
被引量
1
摘要： 可怕的艾滋病自被发现以来的近40余年至少造成了上千万人的死亡,且每年的感染人数仍然超过了100万人,而感染艾滋病的罪魁祸首主要是HIV-1病毒。在其体内复制过程中存在诸多生物学过程,涉及多种酶的参与,在理论上通过抑制任何一个环节就可以实现抗病毒目的。近年来大量研究表明使用HIV-1蛋白酶作为药物治疗靶点被认为是阻断HIV-1病毒在体内复制的一种潜在而有效的策略,而开发与设计新型更安全更有效的HIV-1蛋白酶抑制剂迫在眉睫。最新上市的HIV-1蛋白酶抑制剂Darunavir（DRV）可以有效地阻止HIV-1蛋白酶的二聚化过程以及催化活性,但是也存在交叉耐药性等严重问题,仍需将其作为模板进一步设计与改造。通过实验方法进行探索存在周期长、投入大的缺点,而计算机辅助药物设计（CADD）方法在节省成本和设计能力上拥有巨大优势,逐渐成为了药物研发中必不可少的重要环节之一。为解决上述问题,首先建立了一个包含了193个DRV衍生物抑制剂数据库,利用比较分子场分析（CoMFA）和比较分子相似性指数分析（CoMSIA）方法进行了三维定量构效关系（3D-QSAR）研究。结果表明最优的CoMSIA SEHDA模型拥有良好的有效性和可预测性,这一点被其统计结果所证明(Q2=0.500,R2ncv=0.882,R2pred=0.797),并且根据其等值图确定了一系列DRV衍生物作为HIV-1蛋白酶抑制剂的结构决定因素。其次利用分子对接阐明了配体与受体之间的复杂相互作用,其结果也显示出与3D-QSAR建模结果之间的良好一致性。其中数据集中活性最高分子171号抑制剂以交叉构象与残基Asp25、Gly27、Gly48、Asp124、Asp128、Asp129和不可缺少的水分子形成了氢键网络。另外根据对大量分子对接结果的分析与文献汇总确定了残基Asp25、Asp124、Asp29、Asp129、Gly27和Asp30对配体的活性构象起决定性作用,并且进一步探讨了水分子在对接过程中的重要作用及存在意义。最后依据最佳模型与分子对接结果通过局部修饰而设计了五个新型DRV衍生化合物,利用最优模型预测它们的抑制活性均高于171号抑制剂,分子对接与结合自由能计算结果表明它们与HIV-1蛋白酶之间有良好的结合亲和力,通过理论计算得出新分子均具有较好的药物代谢动力学性质和合成可行性。希望所得结果与结论可以为DRV衍生化合物药物的设计与优化与实验合成提供理论支撑与方向指导。
关键词: 艾滋病 ；HIV-1蛋白酶抑制剂 ；Darunavir衍生物 ；3D-QSAR ；分子对接
被引量
3
摘要： 研究背景与目的:在我国,每年毒蛇咬伤患者达10万人次,以五步蛇、眼镜蛇、蝮蛇、银环蛇等剧毒蛇咬伤最为常见,患者除局部肌肉损伤外,还累积肝、肾等器官,导致约25%-30%的受害者丧失劳动能力。由于现有的抗蛇毒血清疗法存在较多局限性,因而抗毒血清替代疗法成为了研究热点。五步蛇、蝮蛇属蝰蛇科,其蛇毒主要由金属蛋白酶(SVMPs)和磷脂酶(PLA2s)构成;眼镜蛇、银环蛇属眼镜蛇科,其毒液主要成分是PLA2s和三指毒素(3FTxs)。因此寻找靶向SVMPs、PLA2s和3FTxs的抑制剂,有望为抗毒血清替代疗法提供潜在的候选药物。华游蛇(Sinonatrixannularis)作为一种中国特有的游蛇科无毒蛇,在先前的研究中,我们从其肝脏克隆出了一种典型的PLA2抑制剂SaPLIγ,SaPLIγ有效减轻了五步蛇、眼镜蛇、蝮蛇毒造成的肌肉损伤。通过进一步的注毒挑战实验,我们发现华游蛇对五步蛇、蝮蛇、眼镜蛇、银环蛇毒展现了良好的耐受性,这表明华游蛇体内可能存在除SaPLIy以外的其他抑制剂。采用NHS亲和层析的方法,我们使用蛇毒从华游蛇中钓取到了包括金属蛋白酶抑制剂(SVMPI)、磷脂酶抑制剂(PLI)在内的多种抑制剂。这些结果解释了华游蛇强大抗蛇毒能力的分子基础。因此,在本研究中,我们尝试从华游蛇中分离SVMPI,以SVMPI为工具,探讨SVMP的损伤机制,并联用SVMPI和SaPLIγ,研究抑制剂混合疗法对小鼠整体的保护作用。最后,由于SaPLIγ对银环蛇PLA2神经毒性疗效较差,我们尝试使用DNA Shuffling技术对SaPLIγ和银环蛇PLIγ进行改造,以期获得一种活性更强的PLA2抑制剂。此外,天然3FTxs抑制剂未见报道,仿照NHS亲和层析的成功经验,我们尝试使用His-Tag Pulldown技术,使用3FTx蛋白从华游蛇中钓取潜在的抑制剂,为今后寻找3FTxs抑制剂打下基础。本研究有助于进一步理解中国特有蛇种华游蛇的抗蛇毒分子机制,对于理解中国常见毒蛇造成的多脏器损伤以及开发新型抗蛇毒药物具有重要意义。第一部分华游蛇金属蛋白酶抑制剂的克隆、表达及活性评估目的:华游蛇血清能有效抑制五步蛇毒造成的小鼠皮下出血,我们推测华游蛇能合成金属蛋白酶抑制剂(SVMPI),本研究拟借助离子交换层析及疏水层析对华游蛇血清中可能存在的SVMPI进行色谱分离,进一步采用5'RACE技术克隆SVMPI全序列,使用酵母进行外源蛋白表达,并在小鼠腓肠肌蛇咬伤模型中评估SVMPI对五步蛇毒肌肉毒性的抑制效果。方法:(1)华游蛇注毒耐受实验及SVMPI基因转录水平检测:根据体重,将不同剂量蛇毒肌肉注射到华游蛇体内,记录存活时间,观察24 h后处死,24 h后未造成其死亡的注毒剂量记为最大耐受剂量。取血清及肝脏,RT-qPCR检测注射不同浓度蛇毒后,华游蛇肝脏内SVMPI的表达情况。(2)华游蛇金属蛋白酶抑制剂SaMPI分离:使用离子交换层析及疏水层析从华游蛇血清中分离抗出血蛋白SaMPI。(3)SaMPI抗出血能力测定:将10 μg的五步蛇毒粗毒/金属蛋白酶DaMP分别与SaMPI混合后,皮下注射到小鼠背部,2 h后脱颈处死小鼠,分离背部皮肤,记录出血圈直径。(4)5'RACE克隆SaMPI基因:设计接头引物,以华游蛇肝脏cDNA为模板经过两轮PCR扩增后得到SaMPI基因,测序后在NCBI核酸数据库中检索与SaMPI基因相似的SVMPI序列,进行同源比对分析,并标记保守位点。(5)毕赤酵母GS115真核表达外源SaMPI蛋白:将SaMPI基因装载到pPICZαA质粒上,使用高压电穿孔法将重组质粒转化至毕赤酵母GS115中,使用Zeocin筛选阳性重组子,甲醇诱导表达外源蛋白,使用Ni-NTA亲和层析分离SaMPI蛋白。(6)小鼠腓肠肌蛇咬伤模型评估SaMPI抗五步蛇毒SVMP活性:将SaMPI与DaMP/五步蛇粗毒37℃共孵育10 min后注射到小鼠腓肠肌中,24 h后处死小鼠,取血清及腓肠肌。(7)组织学检测小鼠腓肠肌损伤:制备腓肠肌石蜡切片,H&E染色观察肌肉损伤,免疫组化检测纤维化标志物TGF-β、α-SMA表达量,免疫荧光检测ISG15表达情况。(8)腓肠肌炎症及纤维化因子表达情况检测:提取腓肠肌总RNA,RT-qPCR检测MyoD、MyoG、VEGFα、Bax、Bcl-2等基因的表达情况;提取腓肠肌总蛋白,Western blot检测肌肉纤维化标志物:TGF-β及α-SMA,炎症标志物:IL-6、IFN-β、IFN-γ及肌肉损伤相关JAK/STAT、MAPK信号通路蛋白:p-STAT3、p-ERK1/2、p-P38 表达情况。结果:(1)华游蛇对五步蛇毒的最大耐受剂量为712 mg/kg(约为80倍LD50),注毒华游蛇肝脏SVMPI mRNA表达量随着注毒剂量的增加而增加,存在量效关系,表明华游蛇能根据环境改变调控SVMPI的表达。(2)经过离子交换层析和疏水层析,从华游蛇血清中成功分离出了一种金属蛋白酶抑制剂,分子量为56.05 kDa,命名为SaMPI。(3)10 μg SaMPI可以完全抑制10 μg DaMP导致的小鼠皮下出血,表明SaMPI有良好的抗出血活性。(4)使用5'RACE技术经过两轮PCR得到了 1047 bp的SaMPI基因,序列比对表明SaMPI与多种已知的SVMPI同源性为58.1-79.1%,与束带蛇(T.elegans)抗出血因子cHLP-B(XP 032081638.1)的同源性最高(79.14%),共有4个保守的糖基化位点,13个保守的Cys残基,6对二硫键。(5)H&E染色结果表明,SaMPI有效抑制了 DaMP与五步蛇粗毒造成的肌纤维溶解,减轻了肌肉肿胀坏死和炎性细胞浸润;免疫组化结果表明,SaMPI抑制了中毒小鼠肌肉中纤维化标志物TGF-β和α-SMA的表达;免疫荧光结果表明,SaMPI减少了中毒小鼠肌肉中ISG15的表达。(6)经过SaMPI处理后,中毒小鼠肌肉组织中炎症因子IL-6、IFN-β、IFN-γ表达减少;蛇毒导致的JAK/STAT、MAPK信号通路激活被SaMPI抑制;Bax、Bcl-2的表达被SaMPI处理逆转,肌肉细胞凋亡减轻;肌肉再生相关的MyoD、MyoG、VEGFα减少,这表明SaMPI处理有效减轻了蛇毒造成的肌肉损伤。第二部分蛇毒金属蛋白酶通过ISG15-JAK/STAT信号通路促进成肌细胞凋亡及分化目的:在前期研究中,我们发现小鼠肌肉中ISG15的表达被五步蛇毒所诱导,而在华游蛇血清/SaMPI干预后,ISG15的表达降低。我们推测ISG15介导了肌纤维损伤,本研究拟使用C2C12细胞模型探讨ISG15基因在蛇毒引起细胞内源性损伤中的作用。方法:(1)蛇毒剂量选择:使用不同浓度的五步蛇毒和蝮蛇毒处理C2C12细胞,CCK8法测定细胞活力,计算蛇毒IC50。(2)蛇毒对C2C12细胞的影响:使用1/4 IC50的五步蛇毒、蝮蛇毒处理C2C12细胞24 h,提取总蛋白及总RNA,Western blot检测ISG15、凋亡、氧化应激等相关蛋白的表达情况。RT-qPCR检测分化相关基因的表达情况。使用鬼笔环肽染色观察蛇毒对细胞形态的影响。(3)蛇毒SVMP调控ISG15的表达:使用SVMP抑制剂Marimastat或者PLA2抑制剂Varespladib预处理五步蛇毒,将处理后的蛇毒添加到C2C12细胞中,24 h后收取细胞,提总蛋白,检测ISG15、JAK/STAT相关蛋白(p-STAT1、IFN-β、TGF-β)及氧化应激相关蛋白(NOX4、MAO-A)的表达情况;鬼笔环肽染色观察细胞形态变化。(4)ISG15过表达C2C12细胞株构建:从C2C12细胞中克隆ISG15序列,构建慢病毒过表达载体,将慢病毒过表达载体、pMD2.G、pSPAX2三质粒共转染到293T细胞中,包装ISG15过表达慢病毒颗粒,收集慢病毒,浓缩后感染C2C12细胞,Puromycin筛选阳性克隆。(5)ISG15敲低C2C12细胞株构建:设计ISG15 shRNA序列,连接到pLKO.1 shRNA慢病毒载体中,同上所述,在293T细胞中包装ISG15 shRNA慢病毒颗粒,感染C2C12细胞,Puromycin筛选阳性克隆。(6)RT-qPCR 及 Western blot 验证 ISG15 过表达与敲低效果;Western blot检测ISG15过表达C2C12细胞凋亡、氧化应激、炎症相关蛋白表达的变化;RT-qPCR检测ISG15过表达细胞株中分化因子的表达情况。(7)使用蛇毒处理ISG15敲低的C2C12细胞株,检测分化、凋亡、氧化应激相关蛋白表达的变化情况。检测下游JAK/STATI信号通路的激活情况。结果:(1)五步蛇毒、蝮蛇毒对C2C12细胞的IC50分别为11.537 μg/mL、26.399μg/mL。(2)蛇毒处理C2C12细胞导致ISG15表达增加,蛇毒上调了 C2C12细胞分化相关基因的表达,促进了凋亡,增强了氧化应激,鬼笔环肽染色表明五步蛇毒、蝮蛇毒导致了 C2C12细胞ECM降解。(3)Marimastat处理的蛇毒组中,ISG15表达显著降低,而Varespladib处理的蛇毒组中,ISG15无明显变化,这表明SVMP是引起ISG15表达的主要刺激因子。同时,Marimastat处理显著下调了蛇毒导致的JAK/STAT信号通路的激活和ROS合成相关蛋白的表达。鬼笔环肽染色结果表明,抑制SVMP后,蛇毒导致的ECM降解减轻,这表明ECM的降解主要由SVMP主导。(4)与对照组相比,ISG15过表达后,细胞表现出与五步蛇毒处理类似的蛋白表达谱,ISG15过表达增强了细胞凋亡,促进了细胞分化因子的表达,增强了氧化应激,促进了炎症的发生。(5)与野生型细胞相比,敲低ISG15后,蛇毒引起的细胞凋亡、分化、氧化应激、炎症因子的表达均降低,JAK/STAT信号通路的激活减弱。第三部分联用SaMPI与SaPLIγ减轻多种蛇毒导致的小鼠系统损伤目的:蛇咬伤常造成患者全身性损伤,有研究表明蛇毒主要聚集在肝、肾之中;同时,肝、肾损伤是导致患者不良预后和死亡的重要因素,SVMP和PLA2是造成急性肝、肾损伤的重要原因。本研究旨在小鼠肝、肾中系统研究中国常见毒蛇五步蛇、蝮蛇、眼镜蛇造成的系统损伤,包括氧化损伤和线粒体损伤,并尝试使用华游蛇中分离到的抑制剂SaMPI和SaPLIγ靶向抑制SVMP和PLA2,对以上三种蛇毒造成的急性肾损伤(AKI)和急性肝损伤(ALI)进行预防,为临床治疗蛇咬伤提供理论基础。方法:(1)蛇咬伤小鼠模型:小鼠腹腔注射0.2倍LD50的五步蛇、蝮蛇、眼镜蛇毒,12 h后脱颈处死小鼠,眼球取血,分离肝脏、肾脏备用。(2)SaMPI与SaPLIγ对中毒小鼠肝、肾保护作用评价:蛇毒与SaMPI和SaPLIy(各100 μg)混合,37℃孵育10 min,腹腔注射到小鼠中,12 h后与蛇毒组做相同处理。(3)小鼠心肌、骨骼肌损伤标志物检测:测定小鼠血清中CK、CK-MB、LDH来评估抑制剂混合物对小鼠心脏、骨骼肌的保护作用。(4)AKI和ALI标志物检测:检测血清中肌红蛋白、游离血红蛋白、尿酸、肌酐,尿液中尿蛋白含量作为肾损伤标志物;AST和ALT作为肝功能评价指标;肝、肾组织CAT、GSH、T-SOD、T-AOC用于测定肝、肾氧化应激水平,肝、肾组织ROS、MDA用于测量肝、肾氧化损伤程度。(5)组织学检测:将肝、肾组织制成石蜡切片,H&E染色后进行损伤程度评分,评估肾小球与肝脏损伤;PAS染色用于评估肾小管损伤;免疫组化检测肾脏AKI标志物KIM1和NGAL表达情况。(6)Western blot检测肝、肾组织中与ROS生成相关调控蛋白HO-1、MAO-A和NOX4的水平,寻找抑制剂混合物减轻蛇毒氧化损伤的机制。RT-qPCR检测iNOS和ICAM的表达水平用于定量肝、肾组织炎性细胞浸润情况。(7)肝、肾组织线粒体损伤检测:分离肝、肾组织细胞质蛋白,Western blot检测胞质Cyt c含量变化用于评估线粒体破裂程度;
关键词: 华游蛇 ；金属蛋白酶抑制剂 ；磷脂酶抑制剂 ；DNA Shuffling ；3FTx抑制剂
已选:0 清除
批量下载
批量引用
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 11