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摘要： 观察替米沙坦（Telmisartan）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌细胞肥大及p-ERK1/2表达的影响.通过培养新生大鼠心肌细胞、用相差显微镜计数心肌细胞搏动频率、细胞图像分析系统测量细胞体积、考马斯亮蓝法测定心肌细胞总蛋白含量、[~3H]-亮氨酸掺入法测定蛋白合成速率作为心肌肥大指标;以ERK免疫沉淀活性试剂盒测定ERK活性;用Western-blot测定p-ERK1/2表达.实验结果显示Telmisartan能显著降低AngⅡ诱导的心肌细胞搏动频率、体积、总蛋白含量、蛋白合成速率上升,同时对p-ERK（1/2表达具有剂量、时间依赖性抑制作用.因此考虑Telmisartan可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其机制与抑制p-ERK1/2表达有关.
关键词: 心肌细胞肥大 ；替米沙坦 ；细胞外信号调节激酶 ；血管紧张素Ⅱ
被引量
1
摘要： 目的:探讨人参皂苷Rg1对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导乳鼠心肌细胞肥大及能量代谢的作用,及对沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)和过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)表达的影响。方法:原代培养SD乳鼠心肌细胞,用AngⅡ0.1μmol/L诱导心肌细胞肥大,观察人参皂苷Rg112.5、25、50μmol/L及SIRT1特异性阻断剂EX5271μmol/L对肥大心肌细胞的影响。采用消化分离法及计算机图像分析系统检测细胞体积;考马斯亮蓝(Bradford)法检测细胞中蛋白质含量;Western blot法检测心肌细胞心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、SIRT1及PGC-1α的蛋白表达;酶联免疫吸附(Elisa)法检测细胞外液中三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸腺苷(AMP)及游离脂肪酸(FFA)的含量。结果:与空白组比较,模型组心肌细胞体积、蛋白及FFA含量明显升高,ATP/AMP比值降低,ANP蛋白表达显著上调,SIRT1及PGC-1α蛋白的表达显著下调。与模型组比较,人参皂苷Rg125、50μmol/L组心肌细胞体积、蛋白和FFA含量显著降低,ATP/AMP比值显著升高,ANP蛋白表达显著下调,人参皂苷Rg125μmol/L组SIRT1及PGC-1α蛋白的表达显著上调。人参皂苷Rg1的调节作用随浓度增加而增强。EX527对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大各项指标无影响,但人参皂苷Rg1对肥大心肌细胞的保护作用及PGC-1α表达上调作用可被EX527部分阻断。结论:人参皂苷Rg1对AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大有抑制作用,能改善肥大心肌细胞的能量代谢,其通过上调SIRT1及PGC-1α的表达发挥保护作用。
关键词: 人参皂苷Rg1 ；心肌肥大 ；血管紧张素Ⅱ ；沉默信息调节因子1 ；过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α
被引量
15
摘要： 目的研究1-磷酸鞘氨醇受体1型(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1PR1)信号通路在压力超负荷诱导的心室重构中的作用及其机制。方法构建小鼠主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)模型,模型建立的第2天开始经腹腔注射S1PR1激动剂SEW2871或相应的对照溶剂DMSO,持续给药30 d后观察S1PR1激动剂对TAC术后小鼠心功能的影响。体外实验:首先通过慢病毒感染建立S1PR1基因过表达(S1PR1组)或S1PR1基因沉默(sh RNA组)的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)稳定表达株及相应对照组(NC组),并检测细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的活性水平。同时,分别收集NC组、S1PR1组和S1PR1组加ERK1/2阻滞剂U0126(S1PR1+U0126组)的HUVEC细胞培养上清液,在0. 5μmol/L的血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)的刺激下将各组HUVEC细胞培养上清液分别与H9C2心肌细胞共培养,48 h后测量H9C2心肌细胞大小,分析HUVEC细胞表达的S1PR1通过旁分泌对心肌细胞肥大的影响及可能机制。结果给药30 d后,心超提示TAC术后SEW2871组左室射血分数(59. 65%±6. 12%)较DMSO组(41. 16%±11. 91%)显著提高(P<0. 05)。免疫荧光染色表明TAC术后SEW2871组较DMSO组心肌组织纤维化及心肌肥大程度明显降低(P<0. 05)。蛋白印迹结果提示S1PR1激活ERK1/2信号通路。H9C2心肌细胞的面积测量结果表明S1PR1组[(22. 52±4. 13)μm^2]较NC组[(34. 98±12. 92)μm^2]及S1PR1+U0126组[(80. 60±36. 60)μm^2]的心肌细胞的面积明显降低(P <0. 05)。结论 S1PR1可以显著改善压力超负荷诱导的心室重构,提高心功能,减轻心肌组织纤维化及心肌细胞肥大。内皮细胞表达的S1PR1能改善心肌细胞肥大,可能是通过激活ERK1/2信号通路完成。
关键词: 压力超负荷 ；1-磷酸鞘氨醇受体1型 ；心肌肥大 ；心室重构 ；血管内皮细胞
被引量
3
摘要： 目的探讨分泌型卷曲相关蛋白5(s FRP5)在大鼠心肌细胞肥大中表达的机制。方法体外培养乳鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ10-6mmol/L,48 h)诱导心肌细胞肥大。应用替米沙坦和Y27632分别阻断血管紧张素1型受体(AT1R)及Rho/Rho激酶(Rho/ROCK)信号通路;PD98059、SB203580及SP600125分别阻断p38 MAPK、ERK1/2及JNK通路;RT-PCR检测s FRP5的表达;Western blot检测s FRP5、ROCK1、ROCK2、总MYPT1、p-MYPT1表达。结果 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大致s FRP5表达上调(P<0.05),Y27632下调s FRP5的表达(P<0.05);替米沙坦下调ROCK1的表达(P<0.05);SP600125明显降低s FRP5表达的增加(P<0.05)。结论在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中,主要通过Rho/ROCK1/JNK通路上调s FRP5的表达。
关键词: 分泌型卷曲相关蛋白5 ；血管紧张素Ⅱ ；心肌细胞 ；肥大 ；JNK通路
被引量
5
摘要： 目的:探讨分泌型卷曲相关蛋白5(s FRP5)在心肌细胞肥大中的表达情况及其发挥的作用。方法:体外培养SD乳鼠心肌细胞,应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大。替米沙坦、PD123319分别阻滞血管紧张素1型受体(AT1R)、血管紧张素2型受体(AT2R)的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western bolt)检测sFRP5、脑利钠肽(BNP)及肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的表达。结果:s FRP5能够在心肌细胞中表达。sFRP5 mRNA及蛋白水平、BNP蛋白水平的表达随AngⅡ干预时间的延长而增加,48 h达到最高值(P<0.05)。与AngⅡ(10^(-6) mol/L)组相比,AngⅡ+替米沙坦(10μmol/L)组sFRP5 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05),AngⅡ+PD123319(10μmol/L)组sFRP5 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);与AngⅡ(10^(-6) mo1/L)+sFRP5(0 ng/ml)组比较,AngⅡ(10^(-6) mo1/L)+sFRP5(10 ng/ml)组及AngⅡ(10^(-6) mo1/L)+sFRP5(100 ng/ml)组BNP蛋白及TNF-a的蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中,主要通过血管紧张素Ⅱ型受体上调sFRP5的表达,且sFRP5在抑制心肌细胞肥大中发挥作用。
关键词: 血管紧张素Ⅱ ；心肌细胞肥大 ；脂肪细胞因子
被引量
3
摘要： 目的探讨替米沙坦对快速心房起搏引起猪心房结构重构的作用机制。方法18头猪随机分为3组（每组n=6）：假手术组（sham组）、快速心房起搏组（RAP组）、血管紧张素Ⅱ受体抑制剂组（起搏＋替米沙坦，ARB组）。RAP组及ARB组通过快速心房起搏建立猪的房颤模型，sham组安置起搏器但不行起搏刺激，各组均给予相同饲料喂养，同时ARB组提前3天将替米沙坦（1．5mg·kg^-1·d^-1）混于饲料中至术后2周。采用West—ernblot检测左心房钙调神经磷酸酶（calcineurin）、T细胞活化核因子3（NFAT3）蛋白表达水平，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血管紧张素1—7（Ang1-7）的表达；RT—PCR检测calcineurin、NFAT3的mRNA表达水平。结果与sham组比较，RAP组的心房组织Ang1-7的表达水平明显降低，而calcineurin、NFAT3蛋白表达和基因表达水平均明显增加（P〈0．05）；与RAP组相比，ARB组的心房组织Ang1-7的表达水平明显增加，而calcineurin、NFAT3的蛋白表达和基因表达水平均降低（P〈0．05）。结论替米沙坦可能促进Ang1-7的合成，并通过阻断其下游Ca^2＋-calcineurin—NFAT途径所致的心肌细胞肥大，从而减轻房颤时的心房结构重构。
关键词: 心房颤动 ；心房重构 ；替米沙坦 ；血管紧张素1—7 ；钙调神经磷酸酶 ；猪
摘要： 近来报道，染色体10上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10；PTEN）的产物PTEN对心肌肥大具有负性调节作用。目前PTEN负性调控心肌细胞肥大的机制还不明确，是否ERK活化激酶1（MEK1）／细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）信号通路参与其中未见报道。本实验通过构建过度表达PTEN的原代培养心肌细胞模型，检测PTEN对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激下细胞内ERK1／2和磷酸化ERK1／2（pERK1／2）蛋白表达的影响，探讨PTEN负性调节心肌肥大的可能机制。
关键词: 细胞外信号调节激酶1/2 ；PTEN基因 ；心肌细胞肥大 ；负性调控 ；信号通路 ；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) ；ERK1/2 ；负性调节作用 ；homolog ；心肌肥大
摘要： 目的:心肌肥大是心力衰竭的核心病理环节,是心血管患者不良临床结局的独立危险因素之一。因此,控制心肌肥大对延缓或逆转心力衰竭进展具有重要的临床意义。炎症机制在心肌肥大和心力衰竭病理形成中扮演重要的角色,已成为防治心肌肥大和心力衰竭的干预靶点。本研究对人参的主要成分人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1,Rb1）抗心肌细胞肥大及抗炎双重活性防治心肌肥大的药理学意义进行探讨,以期进一步理解Rb1的心血管药理作用,为人参的相关临床应用提供新的实验依据。方法:1.采用微量渗透泵持续输注血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的心肌肥大小鼠模型,观察Rb1对心肌肥大及相关炎症的影响。（1）通过经胸超声心动图分析,评估Rb1干预对Ang II小鼠心脏结构和功能的影响;（2）计算小鼠心脏质量指数:测算心脏重量/体重（Heart weight/Body weight,HW/BW）和心脏重量/胫骨长度（Heart weight/Tibia length,HW/TL）,分析Rb1干预对Ang II小鼠心脏质量指数的影响;（3）通过麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）免疫组织化学分析,标记心脏组织中心肌细胞轮廓,分析Rb1干预对Ang II小鼠心肌细胞横截面积的影响;（4）采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time q PCR）,分析心脏组织A型钠尿肽（Natriuretic peptide type A,Nppa）、B型钠尿肽（Natriuretic peptide type A,Nppb）和肌球蛋白重链（Myosin,heavy polypeptide7,cardiac muscle,beta,Myh7）基因m RNA表达水平,在分子水平进一步验证Rb1抗心肌细胞肥大的效应;（5）采用天狼星红染色观察心脏组织的纤维化情况,评价Rb1干预对AngⅡ小鼠心肌纤维化的影响;（6）采用透射电子显微镜观察心肌超微结构,分析Rb1干预对AngⅡ小鼠心肌超微结构的影响;（7）采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析小鼠血浆中炎症因子白细胞介素1β（Interleukin-1 beta,IL-1β）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）的水平,评价Rb1干预对Ang II小鼠系统性炎症的影响;（8）通过苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色对心脏组织病理改变进行分析,评价Rb1干预对Ang II小鼠心肌炎症损伤等病理改变的影响;（9）采用免疫组织化学方法,对髓系免疫细胞和巨噬细胞分子标志物CD11b和CD68在心肌组织的免疫阳性情况进行分析,评价Rb1对Ang II小鼠心脏组织免疫细胞浸润的影响;（10）采用real-time q PCR,对心脏组织炎症因子Il1b、Il6和Tnf基因的m RNA表达水平进行分析,评价Rb1对Ang II小鼠心肌组织炎症的影响。2.采用AngⅡ和苯肾上腺素（Phenylephrine,PE）刺激的H9c2心肌细胞肥大模型,研究Rb1抗心肌肥大的直接细胞学效应与可能的机制。（1）通过罗丹明-鬼笔环肽（Rhodamine phalloidin）染色标记心肌细胞骨架,观察Rb1对AngⅡ和PE诱导的心肌细胞肥大的干预效应;（2）通过细胞免疫荧光染色,观察Rb1对AngⅡ和PE诱导的心肌细胞中ANP水平的影响;（3）采用JC-1荧光探针进行细胞染色,分析Rb1对AngⅡ和PE诱导的心肌细胞线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）改变的影响;（4）采用膜通透性荧光探针钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）进行细胞染色,分析Rb1对AngⅡ诱导的心肌细胞线粒体膜通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,m PTP）开放程度的影响。（5）采用western blotting,分析Rb1对AngⅡ刺激的H9c2心肌细胞中信号传导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）表达及磷酸化的影响。3.采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型和AngⅡ诱导的骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDM）炎症模型,研究Rb1的直接抗炎效应与机制。（1）采用ELISA分析RAW264.7巨噬细胞培养上清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF的含量,直接评价Rb1的抗巨噬细胞炎症的效应;（2）采用real-time q PCR分析Rb1对RAW264.7巨噬细胞以及BMDM中炎症因子Il1b、Il6和Tnf编码基因m RNA表达水平的影响;（3）采用Western blotting分析Rb1对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白细胞外信号调节激酶（Extracellular-signal-regulated kinase 1/2,Erk1/2）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、p38以及上游蛋白丝裂原活化蛋白激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2,MEK1/2）磷酸化的影响;（4）采用real-time q PCR分析Rb1对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞以及AngⅡ刺激的BMDM中mi R-155表达的影响;（5）采用western blotting分析Rb1对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞STAT3磷酸化的影响;（6）采用real-time q PCR分析Rb1对转染agomir-155或agomir-NC的RAW264.7巨噬细胞炎症因子Il1b、Il6和Tnf编码基因m RNA表达的影响。结果:1.（1）心脏超声结果表明:与假手术（Sham）组相比较,AngⅡ组小鼠心脏室间隔厚度（Interventricular septal thickness,IVS）增加（P<0.05）,左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室短缩分数（Fractional shortening,FS）均代偿性增加（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1高剂量（Rb1-H,100 mg/kg）组小鼠心脏IVS降低（P<0.05）,Rb1低剂量（Rb1-L,6.25 mg/kg）、Rb1中剂量（Rb1-M,25 mg/kg）小鼠LVEF和FS与Sham组基本一致,未见代偿性增加。各组左室舒张末期后壁厚度（Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd）、左室舒张末期内径（Left ventricular end-diastolic internal diameter,LVIDd）和左室舒张末期容积（Left ventricular end-diastolic volume,LVEDV）均未见明显变化（P>0.05）。（2）心脏质量指数分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组HW/BW和HW/TL显著增加（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组HW/BW和HW/TL均不同程度降低（P<0.05）。（3）WGA染色结果表明:Sham组小鼠心肌细胞轮廓清晰;与Sham组相比较,AngⅡ组小鼠心肌细胞轮廓增大,部分心肌细胞边界染色加深,或边界不清,心肌细胞横截面积显著增加（P<0.05）;Rb1-L、M、H组小鼠心肌细胞轮廓未见显著异常,细胞边界较为清晰,心肌细胞横截面积较AngⅡ组有不同程度的减小（P<0.05）。（4）心脏组织real-time q PCR分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组小鼠心脏组织Myh7基因m RNA表达显著升高（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1组小鼠心脏组织Myh7基因m RNA表达显著降低（P<0.05）,Nppa和Nppb基因m RNA表达水平各组未见显著差异（P>0.05）。（5）天狼星红染色结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组可见心脏大血管周围以及心肌组织间明显的纤维化改变;与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组心脏大血管周围纤维化呈不同程度减轻（P<0.05）,其中Rb1-H组心脏大血管周围纤维化减轻最为显著。Rb1-M、H组心肌组织间纤维化改变也显著减轻（P<0.05）,Rb1-L组心肌组织间纤维化较AngⅡ组未见显著改变（P>0.05）。（6）电镜结果表明:Sham组心肌纤维排列有序,Z线清晰可见,线粒体形态大小正常,线粒体嵴致密;与Sham组相比较,AngⅡ组可见形态受损的线粒体（P<0.05）,线粒体嵴的形状破坏和密度降低;相比之下,Rb1各组结构受损的线粒体数量显著减少（P<0.05）。同时,AngⅡ组的Z线明显紊乱且数量减少（P<0.05）;与Ang II组相比较,Rb1各组Z线形态均较为完整,Rb1-M、H组Z线数量显著增加（P<0.05）。（7）ELISA分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组血浆IL-6水平增高（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组血浆中IL-6的水平均降低（P<0.05）;各组IL-1β和TNF血浆水平未见显著差异（P>0.05）。（8）H&E染色结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组心脏大血管周围以及心肌组织间可见大量炎性细胞浸润;与AngⅡ组相比,Rb1-L、M、H组心脏大血管周围以及心肌组织间炎性细胞浸润呈不同程度减轻,其中Rb1-H组心脏大血管周围及心肌组织间炎性细胞浸润减轻程度的最为显著。（9）免疫组织化学分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组心脏组织中浸润的CD68+巨噬细胞显著增多（P<0.05）;而与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组心脏组织中浸润的CD68+巨噬细胞均减少（P<0.05）。（10）Real-time q PCR结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组心脏组织Il6基因m RNA表达显著升高（P<0.05）;而与AngⅡ组相比较,Rb1组心脏组织Il6基因m RNA表达降低（P<0.05）;Il1b和Tnf在三组小鼠心脏组织的表达未见显著差异（P>0.05）。2.（1）Rhodamine phalloidin染色表明:AngⅡ诱导心肌细胞面积增大（P<0.05）,3.125μM Rb1干预后心肌细胞面积与AngⅡ组相比较无统计学差异（P>0.05）,12.5μM、50μM和100μM Rb1干预后心肌细胞面积显著减小（P<0.05）。此外,PE可诱导心肌细胞面积显著增大（P<0.05）,与PE组相比较,100μM Rb1干预的心肌细胞面积减小最为显著（P<0.05）。（2）免疫细胞荧光染色结果表明:与溶剂对照（VC）组相比较,AngⅡ组心肌细胞中ANP的水平显著升高（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1组心肌细胞中ANP水平显著降低（P<0.05）。在PE诱导的心肌细胞肥大模型中,Rb1干预后也观察到相似的结果。（3）JC-1染色结果表明:AngⅡ可导致心肌细胞MMP降低,表现为红色JC-1聚合物荧光强度与绿色JC-1单体荧光强度比值降低（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1组红色JC-1聚合物荧光强度与绿色JC-1单体荧光强度比值增加（P<0.05）,提示Rb1干预增加心肌细胞MMP。在PE诱导心肌细胞肥大模型中,Rb1干预后观察到相似的结果。（4）m PTP开放程度分析结果表明:AngⅡ诱导m PTP开放,
关键词: 人参皂苷Rb1 ；心肌肥大 ；心肌细胞 ；炎症反应 ；巨噬细胞 ；IL-6 ；miR-155
摘要： 心肌肥厚是心脏在应对压力或容量负荷时,为保持其原有泵血功能而进行的代偿性调节反应,长时间的病理性心肌肥厚最终会导致心力衰竭。深入研究心肌肥厚调控相关分子机制,可为心肌肥厚的干预靶点研究提供科学资料。近年来,非编码RNA在心血管疾病中的调节作用引起了广泛关注,越来越多的研究表明,环形RNA能够通过翻译蛋白等多种方式发挥生物学作用。我们前期的工作显示,心力衰竭患者心肌组织中circ0000994表达显著上调,通过在线数据库circBank预测circ0000994包含可能的内部核糖体进入位点（IRES）及开放阅读框（ORF）,提示circ0000994具有潜在的编码功能,但其对心肌肥厚的调节作用和机制尚不清楚。目的:研究环形RNAcirc0000994对心肌细胞肥厚的调控作用及分子机制。方法:1 Circ0000994在肥厚心肌中的表达1-1检测健康器官捐献者（n=17）和心力衰竭患者（n=27）心肌组织中circ0000994及其宿主基因SLC8A1的表达;1-2 Circ0000994在心肌细胞内定位和RNA稳定性鉴定。2 Circ0000994对心肌细胞肥大表型的调节作用2-1利用腺病毒介导在乳小鼠心室肌细胞（NMVCs）中过表达circ0000994,并检测对心肌肥厚相关基因表达的影响;2-2通过鬼笔环肽染色实验,检测过表达circ0000994对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的NMVCs肥大反应的影响。3 Circ0000994抑制心肌细胞肥大的分子机制3-1通过双荧光素酶报告基因实验检测circ0000994中IRES的活性;3-2采用质谱shot-gun技术鉴定翻译蛋白SLC8A1-605aa的特征性肽段序列;3-3 在 NMVCs 中分别过表达 circ0000994、circ0000994-ORF 及circ0000994-ATG-mut,检测SLC8A1-605aa表达对心肌肥厚相关基因表达及心肌细胞肥大反应的影响;3-4 在 NMVCs 中过表达 circ0000994 并转染 siRNA-SLC8A1-605aa,检测SLC8A1-605aa表达对circ0000994抑制心肌肥厚相关基因表达及心肌细胞肥大反应的影响;3-5 SLC8A1-605aa在心肌细胞内定位及RNA-seq表达谱分析;3-6 在 NMVCs 中分别过表达 circ0000994、circ0000994-ORF 及 SOD2,检测SLC8A1-605aa及SOD2表达对心肌肥厚相关基因表达及NF-κB信号的影响。结果:1在心力衰竭患者心肌组织中,circ0000994及其宿主基因SLC8A1表达显著增加;Circ0000994具有较高的稳定性,其主要定位于心肌细胞胞质中。2 Circ0000994能够抑制NMVCs中心肌肥厚相关的肌球蛋白重链7、骨骼肌α-肌动蛋白1和钠尿肽的表达,并能够抑制Ang Ⅱ诱导的NMVCs肥大反应。3双荧光素酶报告基因实验结果提示circ0000994包含的IRES具有介导蛋白翻译的作用;质谱shot-gun分析结果显示circ0000994可翻译产生SLC8A1-605aa蛋白;过表达circ0000994和SLC8A1-605aa可一致地抑制心肌肥厚相关基因表达及心肌细胞肥大反应;抑制SLC8A1-605aa的表达可逆转circ0000994对心肌肥厚相关基因表达及对心肌细胞肥大反应的抑制作用;SLC8A1-605aa主要定位于心肌细胞核中,可通过上调心肌细胞中超氧化物歧化酶2（SOD2）,抑制NF-kB信号激活来发挥抑制心肌细胞肥大表型的作用。结论:环形RNA circ0000994通过翻译蛋白SLC8A1-605aa发挥抑制心肌细胞肥大的作用。
关键词: 心肌肥厚 ；心肌细胞 ；环形RNA ；circ＿0000994 ；翻译
被引量
1
摘要： 研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病导致的一种严重的心血管并发症,是由代谢紊乱引起的除外冠状动脉性心脏病、高血压性心脏病、心脏瓣膜病等其他心脏病变的心肌疾病。目前,DCM已成为导致糖尿病患者死亡的主要并发症,占总死亡率70%左右。早期DCM患者临床症状不显著,超声心动图检测可显示心脏舒张功能受损,病程后期可出现收缩功能障碍及充血性心力衰竭。研究表明,心室重构是导致DCM主要的病理机制,表现为心肌间质纤维化、心肌细胞肥大及心肌细胞凋亡。近年来,DCM的发病机制尚未完全明确,心肌细胞代谢紊乱、肾素-血管紧张素系统(RAS)激活、氧化应激、自噬、钙稳态失衡、胰岛素抵抗及炎症反应等被认为参与其发生和发展。其中RAS激活是诱导DCM心室结构重构的重要发病机制。经典的RAS主要通过调节外周血管收缩阻力来调控血容量及血压。近年来的研究发现,多种组织中存在RAS成员的表达,尤其是心脏内局部RAS的激活,可引起心脏结构重塑。RAS中重要的成员包括血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1受体)、血管紧张素Ⅱ 2型受体(AT2受体)、血管紧张素转化酶2(ACE2)、血管紧张素(1-7)及血管紧张素(1-7)的Mas受体。RAS的平衡主要由ACE-AngⅡ-AT1受体轴和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴来调节。AngⅡ作为RAS的核心成员,在DCM的胶原合成、细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等过程都起到重要作用。众多研究表明缬沙坦作为AT1受体拮抗剂具有改善DCM心室重构的作用。另一些研究表明,ACE2作为ACE的同工酶降解AngⅡ生成Ang(1-7),过表达ACE2基因明显改善AngⅡ诱导的心室肥厚及纤维化且作用优于ARB。然而ACE2作为一种酶易被降解,具有不稳定的特点,因此,通过促进ACE2合成来抑制DCM心室重构有望成为新的治疗方式。转录因子CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)是结合于DNA增强子的反式作用因子,属于亮氨酸拉链转录因子家族。C/EBPβ通过调节多种靶基因转录活性,影响细胞增殖与分化,调控细胞周期,调节癌细胞的生成与凋亡等。有研究表明,降低C/EBPβ表达水平,可以增加多种心肌肥厚相关基因的表达,如GATA相关蛋白4、a-肌球蛋白重链、肌钙蛋白T和T-box转录因子5等。在我们之前的研究中发现,C/EBPβ可结合于ACE2基因启动子序列并调控ACE2蛋白的表达,过表达C/EBPβ可上调动脉粥样硬化(AS)斑块内ACE2的表达,从而降低斑块易损性,抑制AS的进展。然而,对于C/EBPβ在DCM中的作用尚未报道。因此,本研究应用注射链脲佐菌素(STZ)的实验方法,建立1型糖尿病动物模型,探讨C/EBPβ在DCM中的表达及对RAS和心室重构的作用。研究目的1.研究C/EBPβ及RAS主要成员在糖尿病小鼠心肌组织中的表达水平;2.研究C/EBPβ基因过表达、干扰及缬沙坦给药对糖尿病小鼠心脏功能、心肌纤维化及心肌细胞凋亡的影响;3.比较过表达C/EBPβ与缬沙坦对DCM的作用。研究方法1.构建小鼠C/EBPβ慢病毒载体设计3对小鼠C/EBPβ基因siRNA序列,转染至小鼠原代心肌成纤维细胞(CFs)中,采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)筛选出RNA及蛋白水平干扰效率最显著的siRNA序列,由公司依据所筛最优序列构建合成慢病毒载体,其中包含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,C/EBPβ过表达慢病毒由公司直接包装合成。2.糖尿病动物的建立及分组将100只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(体重23±5g)随机分为糖尿病组(80只)和正常对照组(20只)。糖尿病组小鼠给予连续5天的腹腔内STZ-柠檬酸缓冲液注射,STZ剂量为50mg/kg,正常对照组(Control组)仅注射等体积柠檬酸缓冲液。一周后连续3天检测糖尿病组随机血糖,血糖大于16.7mmol/l被认为1型糖尿病模型已成功建立。于造模成功12周后,将糖尿病组小鼠随机进行分组,设立4组:糖尿病空载体对照组(DM + sh-N.C.)、糖尿病+ C/EBPβ基因过表达慢病毒组(DM + C/EBPβ)、糖尿病+ C/EBPβ基因干扰慢病毒组(DM+sh-C/EBPβ)、糖尿病+缬沙坦组(DM+valsartan)。其中空载体、过表达及干扰慢病毒转染通过小鼠尾静脉注射的方法,转染病毒滴度为每只小鼠1×107UT/30μl。缬沙坦组的糖尿病小鼠采用灌胃的方式给药,给药量为30mg/kg。小鼠于慢病毒转染和给药4周后行安乐死,留取心脏组织及血液并适当保存。实验期间采用尾静脉取血的方法,分别于STZ注射0周、1周、12周及16周取材前检测糖尿病小鼠随机血糖水平。采用鼠尾血压计于STZ注射0周、16周检测各组小鼠心率及血压水平。3.心脏功能检测STZ注射16周后,使用高分辨率小动物超声仪对小鼠心脏室壁厚度、左心室收缩及舒张功能进行检测和评价。4.组织形态学及免疫组织化学染色取材后的小鼠心脏组织使用4%多聚甲醛进行浸泡固定,并制备4.5μm石蜡切片,用于H&E染色及Masson染色。前者可观察心脏组织大体形态、心肌细胞形态、大小及排列,后者用于观察心肌间质胶原含量。应用免疫组织化学染色法,检测C/EBPβ、ACE2、ACE、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平。5.血清酶联免疫吸附测定(ELISA)使用ELISA检测AngⅡ、Ang(1-7)在心肌组织及血清中表达水平,检测白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的血清含量。6.蛋白质印迹实验(Western blot)提取小鼠左室心肌组织蛋白,用Western blot法检测C/EBPβ、ACE2、ACE、AT1受体、AT2受体、Mas受体、胶原 I、胶原 IⅢ、TGF-β1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax的表达水平。7.原代CFs的分离与培养本实验使用的原代CFs提取自1-3天的C57BL/6J乳鼠心脏并使用含10%胎牛血清的DMEM进行培养。8.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)应用实时荧光定量qPCR技术测定siRNA干预后原代CFs中C/EBPβ的mRNA表达水平。9.统计学分析应用SPSS v18.0软件对所有数据结果进行统计分析,多组间比较采用one-way ANOVA检验,数据显示使用均数±标准差,p<0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.C/EBPβ干预对糖尿病小鼠的血糖及血压水平无显著影响所有糖尿病小鼠随机血糖均显著高于正常对照小鼠,而4组糖尿病小鼠间血糖无统计学差异。各组小鼠之间血压亦无显著的统计学改变。2.C/EBPβ过表达显著改善糖尿病小鼠心室肥大和心功能障碍STZ注射16周后,糖尿病小鼠心脏重量(HW)和心身重量比(HW/BW)增加,心脏大小明显增加,H&E染色观察发现心肌结构异常,心肌细胞肥大,排列紊乱。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达及缬沙坦给药组可显著改善心脏形态及心肌结构,并且C/EBPβ过表达的改善作用要优于缬沙坦组。C/EBPβ干扰组较空载体组无显著变化。与正常对照小鼠相比,4组糖尿病小鼠均出现不同程度的收缩与舒张功能障碍,其中左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)和E/A显著降低,而左心室后壁厚度(LVPWd)增加,并且左心室舒张末内径(LVEDd)显著扩大。C/EBPβ过表达及缬沙坦治疗组可明显改善DCM的心功能异常,且C/EBPβ过表达作用更显著。C/EBPβ干扰组较空载体组无显著变化。3.C/EBPβ过表达显著改善糖尿病小鼠心肌组织纤维化心肌组织Masson染色显示,与正常组比,4组糖尿病小鼠间质中胶原表达显著增加,并且Western blot检测及免疫组织化学显示,心肌组织纤维化相关蛋白如胶原I、胶原Ⅱ和TGF-β1表达水平增加。与糖尿病空载体组比较,C/EBPβ基因过表达和缬沙坦治疗可以降低胶原的表达,而C/EBPβ干扰组无明显改变。Western blot检测显示,高血糖降低心肌组织MMP-2蛋白表达水平,C/EBPβ过表达和缬沙坦治疗可以增加MMP-2的表达从而降解心肌间质的胶原,C/EBPβ干扰组MMP-2蛋白水平较空载体组无统计学差异。各组小鼠间MMP-9表达水平无明显差异。与缬沙坦治疗组相比,C/EBPβ过表达组抑制胶原表达和促进胶原降解的能力更为显著。4.C/EBPβ过表达抑制糖尿病小鼠心肌细胞凋亡和炎症因子的分泌与正常组比,糖尿病空载体组的小鼠心脏组织中Bax/Bcl-2比值明显增加,提示心肌细胞凋亡水平增加。C/EBPβ过表达和缬沙坦治疗较糖尿病空载体处理比,可显著降低Bax/Bcl-2比值。有研究表明,AT2受体作为AngⅡ作用的另一受体,其表达水平的增加与细胞凋亡有关。相对于正常小鼠而言,糖尿病小鼠AT2受体明显增多。与糖尿病空载体组相比,增加C/EBPβ表达可以显著减少AT2受体的表达,而缬沙坦对AT2受体表达无明显作用。C/EBPβ干扰组较糖尿病空载体组无统计学差异。糖尿病小鼠血清IL-6和MCP-1水平明显增加。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达组和缬沙坦治疗组可以降低血清炎症因子的水平,C/EBPβ干扰组较糖尿病空载体组的炎症因子水平无明显变化。5.C/EBPβ蛋白在糖尿病小鼠心肌组织中呈低水平表达与正常组比,糖尿病空载体组的小鼠心脏组织中C/EBPβ蛋白表达水平明显降低,C/EBPβ基因干扰慢病毒在C/EBPβ低水平表达的情况下不能进一步降低其表达,而过表达慢病毒可显著增加C/EBPβ蛋白表达。缬沙坦组C/EBPβ的表达较糖尿病空载体组无明显变化。6.C/EBPβ过表达上调糖尿病小鼠心肌组织中ACE2表达水平糖尿病空载体组心肌组织中的ACE2表达含量与正常组相比明显减少。与糖尿病空载体组相比,过表达C/EBPβ可以显著增加ACE2的表达,而C/EBPβ基因干扰组与缬沙坦治疗组ACE2表达含量无明显差别。7.C/EBPβ过表达降低糖尿病小鼠AngⅡ并增加Ang(1-7)含量糖尿病空载体组的小鼠心肌组织及血清中AngⅡ含量较正常组明显升高,而Ang(1-7)含量降低。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达可降低AngⅡ含量并升高Ang(1-7)水平,而缬沙坦治疗可增加Ang(1-7)表达,但程度较C/EBPβ过表达低,并增加AngⅡ的含量。C/EBPβ干扰慢病毒处理较空载体组无明显变化。8.C/EBPβ过表达下调DCM心肌组织中ACE和AT1受体并上调Mas受体表达水平体内实验结果显示,高血糖上调ACE和AT1受体并下调Mas受体表达。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达可逆转高血糖诱导的ACE、AT1受体及Mas受体表达变化,而缬沙坦处理后并无此作用。C/EBPβ干扰处理较空载体组无显著变化。研究结论1.1型糖尿病小鼠心肌组织中C/EBPβ蛋白表达水平明显减低;2.C/EBPβ基因过表达通过抑制心肌肥厚、纤维化、凋亡及炎症反应显著改善DCM心室重构及心功能;3.C/EBPβ基因过表达调控RAS主要成员在糖尿病小鼠心肌组织中的表达含量;4.C/EBPβ基因过表达对DCM的改善作用要明显优于缬沙坦治疗。研究背景糖尿病(DM)作为三大非传染性慢性疾病之一,已严重威胁人类健康,其致死率仅次于癌症、心血管疾病、感染及创伤等。1972年,Rubler等人发现一些心力衰竭患者除糖尿病之外并无其他致病因素,首次提出糖尿病性心肌病(DCM)这一概念。目前认为,DCM是在血糖升高的基础上,引起显著心脏结构改变和心功能减退,除外其他致心脏病变因素的心肌疾病。心室重构是DCM发生和发展的重要机制,研究表明,DM患者心脏重构的主要机制包括细胞内能量及物质代谢障碍,肾素-血管紧张素系统(RAS)过度激活,心脏微血管障碍及自主神经病变等。心肌组织的纤维化合并心肌细胞凋亡是DCM主要病理改变。
关键词: 糖尿病性心肌病 ；C/EBPβ ；肾素-血管紧张素系统 ；心室重构 ；缬沙坦 ；C/EBPβ ；ACE2 ；高糖刺激 ；胶原合成 ；细胞凋亡
被引量
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摘要： 目前心血管疾病已超过肿瘤成为全球首位死亡因素。随着城镇化进程不断加快和人口老龄化程度不断加深,加上一些不健康的生活方式,我国居民的心血管疾病发病率和死亡率持续增高,因而,对心血管疾病的早期防治刻不容缓。心肌重构是多种心血管疾病发生的共同病理表现,通常以心肌肥厚为起始。心肌肥厚是机体对神经体液因素(如肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS)激活、内皮素增加、交感神经兴奋性增强等)、牵张刺激(如压力负荷、容量负荷增加)以及氧化应激等外界刺激做出的反应,表现为心脏大小和质量的增加,长此以往会发展为失代偿性心肌肥厚,以致心力衰竭,最终导致死亡。因此,心肌肥厚的早期干预具有重要意义。
然而,由于导致心肌肥厚的疾病和因素众多、发病机制复杂,针对其中某一因素的药物如氯沙坦(血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂)等疗效均较为有限。血管紧张素Ⅱ、内皮素-1和去甲肾上腺素等与其相应受体后,均需通过分子开关G蛋白的信号转导,最终导致心肌肥厚。因此,针对分子开关G蛋白的新药研发具有广阔的前景。
ACTY116多肽为本团队自主研发的针对Gαq分子设计的抗心肌肥厚药物,既往研究表明ACTY116注射液在多个心肌重构动物模型上均有良好的防治效果。但其同样具有多肽药物的国际共性问题即半衰期短,导致给药次数频繁(2次/日,连续多日)。为进一步方便病人用药的同时维持药物疗效,在前期的研究中,课题组成功制备了具有长期稳定性、能够缓慢释药的ACTY116多肽原位凝胶注射剂;但与其他已上市原位凝胶制剂一样,具有较明显的突释现象。本文在较好解决原位凝胶突释问题新处方的基础上制备了原位凝胶注射剂,进一步考察ACTY116多肽原位凝胶注射剂在NE诱导的小鼠左心肥厚和SU5416/低氧诱导的小鼠右心室肥厚模型中的抗心肌肥厚作用,并对其偏向性信号转导机制进行了探索,旨在进一步减少病人的用药次数、提高临床用药依从性,为ACTY116的后续研发提供新的实验依据。
因此,本课题的工作主要包括两种ACTY116多肽原位凝胶注射剂的制备、抗心肌肥厚作用考察及ACTY116多肽抗心肌肥厚作用偏向性信号机制的探索。
方法与结果:
1.ACTY116多肽原位凝胶注射剂及其抗心肌肥厚作用
本部分制备了以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为基质,三乙酸甘油酯(TA)/N-甲基吡咯烷酮(NMP)为有机溶剂的两种ACTY116原位凝胶注射剂(PT-ACTY/PNACTY)。首先,考察了不同浓度的原位凝胶注射剂在人源心肌细胞AC16上的细胞毒性;随后,在去甲肾上腺素NE诱导的小鼠左心肥厚模型和SU5416/低氧诱导的小鼠右心室肥厚模型中,通过脏器指数、超声心动图和组织切片染色来观察和评价小鼠心脏结构变化和心脏功能,从而考察ACTY116多肽水溶液及PT-ACTY/PN-ACTY原位凝胶注射剂的抗心肌肥厚作用。结果发现,每周一次皮下注射ACTY116多肽原位凝胶剂与每日两次皮下注射ACTY116多肽水溶液在小鼠体内的抗心肌肥厚作用相当。
2.ACTY116多肽通过偏向性信号转导抑制去甲肾上腺素诱导的心肌肥大
本部分主要在体外考察ACTY116多肽抑制NE诱导心肌肥大的作用机制。首先,分别在小鼠心肌细胞HL-1、大鼠心肌细胞H9c2和人源心肌细胞HCM上考察ACTY116多肽的细胞毒性,以及ACTY116多肽对NE诱导不同心肌细胞肥大的改善作用。随后,通过免疫荧光验证ACTY116多肽与Gαq/α1B受体的结合作用。为进一步探究ACTY116多肽的抗心肌肥厚作用机制,在HEK293细胞内分别瞬时转染钙离子探针p CMVj GCa MP7s和质粒p CMV3-NFAT2-EGFP,考察ACTY116多肽对G蛋白信号通路的抑制作用;随后通过瞬时转染质粒plv-EF1a-ARRB2-m Scarlet3和p CMV3-α1B-GFPSpark,验证β-arrestin招募作用及α1B受体内化作用。
G蛋白和β-arrestin蛋白均会激活下游ERK1/2信号通路,使ERK1/2磷酸化,但二者发生速度不一样,以此可以来判定通过哪一条信号通路在发挥作用。分别在HEK293细胞、Sg GNAQ HEK293细胞和Sg ARRB2 HEK293细胞中,通过Western Blot考察ACTY116多肽给药不同时间对细胞内ERK1/2磷酸化蛋白表达的影响,并进行灰度值统计分析。结果表明,ACTY116多肽能够与Gαq而非α1B-AR结合,能够抑制NE诱导的G蛋白下游钙离子信号变化和NFAT2核转位,抑制NE激活的G蛋白信号介导的ERK1/2磷酸化,激活β-arrestin招募和α1B受体内化,以及激活β-arrestin信号介导的ERK1/2磷酸化。
结论:
1.PT-ACTY/PN-ACTY能够大幅减少ACTY116的给药次数(每日2次延长至每周1次),并且PT-ACTY/PN-ACTY原位凝胶注射剂与ACTY116多肽水溶液对NE诱导的小鼠左心肥厚及SU5416/低氧诱导的小鼠右心肥厚的防治作用相当,将有望在维持药物疗效的同时提高临床用药依从性。
2.ACTY116多肽及其原位凝胶注射剂良好的抗心肌肥厚作用的机制与其偏向性激活β-arrestin信号(抑制G蛋白下游信号、激活β-arrestin信号)有关。
关键词: 心肌肥厚 ；ACTY116 ；原位凝胶 ；偏向性信号转导
摘要： 目的通过观察人参皂苷Rg1对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导乳鼠心肌细胞肥大及能量代谢的调节作用,及对沉默信息调节因子1(SIRT1)和过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)表达的影响,以探讨人参皂苷Rg1对心肌肥厚调节作用的相关信号机制。方法采用AngⅡ(0.1μmol/L)诱导原代培养的SD乳鼠心肌细胞,造成离体心肌细胞肥大模型,观察给予心肌肥大模型不同浓度(12.5、25、50μmol/L)的人参皂苷Rg1及SIRT1特异性阻断剂EX527(1μmol/L)对肥大心肌细胞的细胞体积、蛋白质含量、细胞外液游离脂肪酸(FFA)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸腺苷(AMP)含量、心肌细胞线粒体中细胞色素C氧化酶(CCO)活性、心肌细胞胞浆中细胞色素C(Cyt-C)表达、心肌细胞心房钠尿肽(ANP)、SIRT1及PGC-1α表达的影响。处理完成后,消化分离各处理组心肌细胞,倒置显微镜下放大400倍结合图像分析系统测定心肌细胞直径并计算细胞体积;采用考马斯亮蓝(Bradford)法检测各处理组心肌细胞裂解液中蛋白质含量;Western blot免疫电泳法测定各组心肌细胞中ANP、SIRT1及PGC-1α的蛋白表达;采用Elisa法检测各处理组心肌细胞细胞外液中FFA、ATP及AMP含量并计算ATP/AMP比值;低温离心法分离心肌细胞线粒体,并用紫外分析法测定心肌细胞线粒体中CCO活性,Western blot法测定各组心肌细胞胞浆中Cyt-C蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型对照组心肌细胞体积、蛋白质含量及FFA含量明显升高,ATP/AMP比值降低,CCO活性下降,ANP和胞浆Cyt-C表达上调,SIRT1及PGC-1α的表达下调。与模型对照组比较,人参皂苷Rg1中、高剂量(25、50μmol/L)组心肌细胞的细胞体积、蛋白质含量和FFA含量降低,ANP和胞浆Cyt-C表达下调,ATP/AMP比值和CCO活性升高,人参皂苷Rg1中剂量(25μmol/L)组SIRT1及PGC-1α的表达上调。人参皂苷Rg1对心肌细胞体积、蛋白质含量、ANP和胞浆Cyt-C表达及心肌细胞外液FFA含量,ATP/AMP比值和CCO活性作用随人参皂苷Rg1浓度增高而增强。EX527对肥大心肌细胞各项指标的影响无统计学差异,应用EX527后人参皂苷Rg1降低肥大心肌细胞的细胞体积、蛋白质含量和ANP蛋白表达的调节作用,对于心肌细胞外液FFA含量、ATP/AMP比值、CCO活性和胞浆Cyt-C及PGC-1α表达上调作用被部分阻断。结论人参皂苷Rg1对AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大具有抑制作用,并能改善肥大心肌细胞的能量代谢,其作用机制与其上调SIRT1进而上调PGC-1α表达有关。
关键词: 人参皂苷Rg1 ；心肌肥大 ；血管紧张素Ⅱ ；能量代谢 ；沉默信息调节因子1 ；过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α
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摘要： 心力衰竭是全球范围内的人类健康威胁,并且中国心力衰竭患病率逐年升高,而心肌重构(包含心肌细胞肥大)是心力衰竭的关键致病环节。近年来治疗心力衰竭取得了的重要进展,如脑啡肽酶抑制剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂等,可以进一步降低心力衰竭患者心血管事件发生率,并改善临床症状与远期预后,但上述药物治疗突破主要体现于排钠降糖、降低全身循环负荷而帮助患者获得全身综合性获益,但针对改善心肌重构、抑制心肌细胞肥大的疗效比较有限。目前可抑制心肌肥大的药物主要包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,并且应用超过数十年,但目前心力衰竭患者5年、10年生存率仍接近或低于50%。因此,在中医药领域寻找通过抑制心肌细胞肥大、保护心肌细胞治疗心力衰竭的有效方药、探究其机制,可以有效补充心力衰竭药物治疗体系,具有重要的临床意义。芪参桃红颗粒作为北京中医药大学东方医院治疗心力衰竭的协定处方,以益气活血利水为治法,取得了良好的临床疗效。研究显示,芪参桃红颗粒具有扶正祛邪、益气活血利水的功效,可改善慢性心衰患者心功能及远期预后,并且,通过良性调节自噬活性,抑制心肌重构,是其防治心衰的效应机制之一,但在细胞层面,芪参桃红颗粒是否可以抑制心肌细胞肥大,还缺乏相应的证据与机制研究。本研究以心肌重构中心肌细胞肥大作为临床问题,以中医心气虚为本的核心病机作为线索,结合大样本临床心肌组织转录组测序生物信息分析,聚焦心肌细胞肥大中的线粒体分裂-自噬异常,将临床验方芪参桃红颗粒应用于原代心肌细胞肥大模型并展开药效与机制研究,进一步丰富芪参桃红颗粒的药效机制,并提供该方抑制心肌细胞肥大的实验证据。 目的 1基于生物信息分析技术,分析心力衰竭心肌转录组的功能改变,筛选心力衰竭心肌组织中的核心致病机制。 2围绕核心致病机制,探讨芪参桃红颗粒干预乳大鼠原代心肌细胞肥大模型的药效与机制。 方法 生物信息分析研究: 通过稳健排序分析(Robust rank aggregation,RRA)、加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis,WGCNA)对 GSE57338、GSE42955、GSE52601、GSE21610、GSE76701、GSE145154(包括1项单细胞测序转录组数据)等6项心力衰竭患者心肌组织转录组测序结果进行核心致病机制筛选,对差异表达基因进行基因功能富集分析,参考的数据库包括:基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)、基因本体数据库(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG),并通过肥大心肌细胞模型对部分关键基因进行RT-qPCR实验验证。 细胞实验研究: 使用大鼠肠管外翻模型制备芪参桃红颗粒肠吸收液(Intestinal absorption solution of Qishentaohonggranule,QIAS)及空白肠吸收液,并使用非靶向代谢组学和液相色谱/质谱(LC/MS)技术对芪参桃红颗粒溶液与QIAS进行成分分析。基于药物组成检索《中国药典(2020版本)》、中国知网,确定芪参桃红颗粒组方药物中的特征性药理成分;然后从总离子流色谱图(Total Ion Chromatography,TIC)相似度、化合物重叠程度、芪参桃红颗粒药物特征性药理成分重叠程度等三个层次对比芪参桃红颗粒溶液与QIAS之间的成分相似度。 制备血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)致乳大鼠原代心肌细胞肥大模型,通过设立空白对照组(Ctrl组)、血管紧张素Ⅱ致肥大心肌细胞模型组(AngⅡ组)、芪参桃红颗粒肠吸收液治疗组(QIAS组)、沙库巴曲/缬沙坦治疗组(LCZ696组),探究QIAS对肥大心肌细胞横截面积肥大程度、细胞核横截面积、B型利钠肽(B-type Natriuretic Peptide,BNP)蛋白表达量、BNP mRNA、肌球蛋白重链 7(Myosinheavy chain 7,MYH7)蛋白表达、MYH7 mRNA、细胞活力、细胞总活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)、线粒体跨膜电位Δψ、细胞凋亡的影响,评价QIAS抑制心肌细胞肥大的药效。 基于Ctrl组、AngⅡ组、QIAS组,通过多时段免疫荧光检测动态观察QIAS对肥大心肌细胞线粒体分裂标志蛋白DRP1 S616、线粒体自噬标志蛋白mito-LC3B的影响,应用RT-qPCR观察QIAS对肥大心肌细胞线粒体分裂-自噬关键基因mRNA的影响(包括CaMKⅡδ、DRP1、FIS1、PINK1、PRKN、MFF、BNIP3、LC3B、P62、FUNDC1),以Western blot检测观察QIAS对上述关键蛋白在肥大心肌细胞线粒体中、细胞质中的影响,以评价其对线粒体分裂-自噬的干预作用。 在Ctrl组、AngⅡ组、QIAS组的基础上,增加设立CaMKⅡδ抑制剂组(KN93组)、KN93+QIAS 组、DRP1 抑制剂组(Mdivi-1 组)、Mdivi-1+QIAS 组、PINK1 抑制剂组(siRNA-PINK1组)、siRNA-PINK1+QIAS 组,通过Western blot检测BNP蛋白表达,并基于透射电镜观察心肌细胞线粒体形态,探究QIAS抑制心肌细胞肥大的机制。 结果 1 通过RRA、WGCNA方法筛选心力衰竭核心致病机制,联合分析了 6组临床心力衰竭患者心室组织的转录组测序数据(包括1项单细胞测序分析),结果显示,分别以心室组织全转录组差异表达基因、全转录组协同表达基因群、单细胞心肌细胞转录组协同表达基因群为研究范围,心力衰竭核心致病基因逐渐趋向性地富集于线粒体损伤相关的机制通路,如线粒体自噬调节、有机化合物氧化产能、低氧应答、葡萄糖代谢、呼吸链电子运输、丙酮酸代谢等生物过程;并且这些核心基因所在主要定位是线粒体基质、线粒体内膜、泛素连接酶复合物、氧化还原酶复合物、线粒体膜成分等处;承担的分子功能富集于泛素样蛋白连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白肽酶结合、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、电子转移活性等功能。提示线粒体损伤机制,如线粒体分裂-自噬,可能是心力衰竭心肌细胞的核心致病机制。同时本研究结果也进一步支持了心力衰竭心气虚为中医基本病机的理论学说。 2LC/MS结果显示,芪参桃红颗粒溶液肠吸收液在主要药理成分的种类与含量方面与芪参桃红颗粒溶液保持较高一致性,如芥子碱、羟基红花黄色素A、隐丹参酮、苦杏仁苷、黄芪甲苷Ⅳ、羟基丹参酮、黄芪素、木犀草素、红花黄色素A、阿魏酸、黄芩素、橙皮苷、山奈酚、党参炔苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、熊果酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷。此外,基于对含药血清法与含药肠吸收液法的优劣对比分析,确定含药肠吸收液法更加适合作为本研究的干预方法。 3 AnⅡ 1μM干预乳大鼠原代心肌细胞24小时可以成功建立心肌细胞肥大模型,显著增加原代心肌细胞横截面积、核横截面积,导致心肌细胞ROS升高、线粒体跨膜电位损伤以及细胞凋亡增加,而QIAS及LCZ696可以抑制AngⅡ导致的心肌细胞肥大,QIAS可以降低BNP mRNA、MYH7mRNA表达以及BNP、MYH7蛋白表达,并且QIAS在细胞ROS含量、线粒体跨膜电位、细胞凋亡方面对心肌细胞产生保护作用。 4 AngⅡ促进线粒体分裂,增强DRP1 S616磷酸化,但同时表现出对线粒体自噬的抑制作用,具体表现为促进DRP1 S616磷酸化程度及相应蛋白表达,促进MFF表达,降低 PINK1 mRNA、PRKN mRNA、BNIP3 mRNA、FUNDC1 mRNA,抑制PINK1 Ser228磷酸化、Parkin蛋白、mito-LC3B蛋白、P62蛋白;QIAS同时促进线粒体分裂与线粒体自噬,提高 DRP1 mRNA、PINK1 mRNA、ParkinmRNA、BNIP3mRNA、LC3B mRNA、P62 mRNA、FUNDC1 mRNA,上调 PINK1 Ser228 磷酸化、DRP1 S616 磷酸化,降低CaMKⅡδ T287 磷酸化与其表达,促进 MFF、FIS1、PINK1、Parkin、LC3B、FUNDC1、P62表达。 5基于透射电镜观察线粒体超微结构与本研究其他结果,发现AngⅡ致肥大的心肌细胞中线粒体分裂-自噬失衡,表现为分裂过度而线粒体自噬抑制;芪参桃红颗粒肠吸收液通过促进PINK1 Ser228磷酸化,抑制CaMKⅡδ T287磷酸化,良性调节DRP1 S616磷酸化,介导线粒体分裂-自噬平衡,是其发挥抑制心肌细胞肥大机制之一;并且中医心气虚证的科学实质可能是心肌细胞线粒体分裂-自噬失衡及其分子机制。 结论 线粒体损伤是心力衰竭心肌组织的核心致病机制,其中线粒体分裂-自噬失衡及分子机制是心肌细胞肥大的关键致病原因,并可能是中医心气虚证的部分科学内涵。芪参桃红颗粒可以通过促进PINK1 Ser228磷酸化,抑制CaMKⅡδ T287磷酸化,良性调节DRP1 S616磷酸化,介导线粒体分裂-自噬平衡,抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。
关键词: 芪参桃红颗粒 ；肥大心肌细胞 ；生信分析 ；线粒体分裂 ；线粒体自噬
摘要： 心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)是各种心脏疾病发展到某个阶段的常见病理变化。病理情况下,心肌损伤伴有正常的心肌细胞坏死和心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)的激活,后者持续增殖并释放导致MF的纤维化因子。发生MF时,心室壁的顺应性降低,心室舒张受到限制,进一步损害心肌功能。因此,减少或延缓MF并探索可能的机制已成为心血管疾病中亟待解决的问题。心脏受到病理刺激时,激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin-aldosterone system,RAAS),产生血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ),诱导MF的发生和细胞外基质的胶原累积。有研究表明,在许多心脏疾病中存在类AngⅡ的物质——血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体(autoantibodies against angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1-AA),该自身抗体可通过与血管紧张素Ⅱ 1型受体的细胞外第二环肽段(AT1R-ECⅡ)特异性结合发挥Ang Ⅱ样激动作用。那么,AT1-AA是否也能引起心肌纤维化及如何影响待进一步探讨。心肌纤维化是一种慢性的炎症反应,心脏受损时,促进诸如白介素家族等因子的激活和释放,其中白介素-1β(IL-1β)是与炎症相关研究最多的因子之一,且对心血管疾病具有重要影响。当受到刺激时,IL-1β被IL-1β转化酶(Caspase1)裂解并激活。Caspase1可被NLRP3炎症体激活,使两个相邻的Caspase1发生自身水解,裂解为P10和P20片段以发挥生物学活性。研究发现,AngⅡ可以诱导炎症反应和IL-1β分泌。那么,AT1-AA是否也可诱导IL-1β分泌,NLRP3炎症体是否参与其中,又是如何影响心肌纤维化呢?哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是酵母雷帕霉素靶蛋白的同源物,其主要通过调节胶原蛋白分泌促进心肌纤维化的发展。在许多疾病中,mTOR可以激活NLRP3炎症体的表达,如果AT1-AA能诱导NLRP3炎症体的激活和MF,那么mTOR在此过程中是否发挥作用?因此,本研究探讨AT1-AA长期存在是否可以诱导MF,以及mTOR-NLRP3炎症体-IL-1β途径是否参与了这一过程。目的:1.建立AT1-AA阳性大鼠模型,观察大鼠心脏形态、功能以及mTOR,NLRP3炎症体和IL-1β变化。2.证实mTOR-NLRP3-IL-1β通路在AT1-AA诱导心肌纤维化中的作用。方法:1.AT1-AA阳性大鼠模型的建立:用佐剂(第一次用完全佐剂,以后用不完全佐剂)、Na2CO3溶液和生物合成的AT1R-ECⅡ抗原肽段按比列配制乳浊液,对SD大鼠进行主动免疫;对照组用生理盐水溶于佐剂做对照。免疫方式为:背部皮下注射(第一次为皮下多点注射,以后加强免疫为皮下单点注射)。2.分离提纯AT1-AA。3.小动物超声检测心脏结构和功能的损伤。4.HE染色观察心脏结构变化。5.Masson染色检测心脏的胶原沉积。6.免疫组织化学染色法观察心脏胶原蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ和NLRP3蛋白的表达水平。7.Western blot检测p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC、Caspase1蛋白的表达水平。8.ELISA检测AT1-AA滴度和IL-1β分泌量。9.免疫荧光染色法检测心肌成纤维细胞胶原蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达。结果:1.成功建立AT1-AA阳性大鼠模型用人工生物合成的抗原肽段主动免疫SD大鼠,2周(week,w)一次。ELISA实验表明,与Vehicle组相比,大鼠血清中的抗体滴度随着免疫时间的增加而逐渐增加。第2w时其滴度即增加(P<0.05),第8w时AT1-AA抗体滴度达到峰值随后一直维持(P<0.01),以上结果提示AT1-AA阳性大鼠模型成功构建(图1)。2.AT1-AA阳性大鼠出现心肌纤维化超声检测结果显示,与Vehicle组相比,AT1-AA阳性大鼠在12w时心脏结构就有所破坏。具体表现为代表心脏功能的指标EF和FS以及代表心脏结构的指标IVSd和IVSs降低(P<0.05)。到免疫16w时,心脏的结构损伤和功能进一步降低(图2A-2E)。HE染色显示,与Vehicle组相比,AT1-AA阳性大鼠的心脏结构在免疫早期没有明显损伤;免疫12w时大鼠心肌纤维破裂,细胞排列紊乱,大鼠心肌细胞增大,细胞核大小出现明显不同,部分心肌细胞溶解;免疫16w时心脏损伤更为明显(图3)。Masson染色显示,与Vehicle组相比,AT1-AA阳性大鼠从第4w开始出现胶原沉积。随着免疫时间的延长,到第12w和第16w,心肌细胞间隙增加,且沉积在心肌间隙中的胶原纤维增加(P<0.05,图4)。免疫组织化学染色(IHC)检测结果显示,与Vehicle组相比,随着免疫时间的延长,AT1-AA阳性大鼠的Ⅰ型胶原蛋白CollagenⅠ(ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白CollagenⅢ(ColⅢ)都增加,且ColⅠ/ColⅢ比值增加(P<0.01,图5A,5B)。以上结果提示AT1-AA可以促进心肌纤维化。AT1-AA阳性大鼠心脏结构和功能受损,胶原沉积。3.AT1-AA促进心脏NLRP3炎症体表达和IL-1β分泌IHC结果显示,与Vehicle组相比,AT1-AA组的大鼠心脏NLRP3蛋白的表达随免疫时间的增加而增加(P<0.05,图6A,6B)。Western blot结果表明,与Vehicle组相比,NLRP3炎症体各蛋白NLRP3,ASC,P10和caspase 1的表达随免疫时间的增加而增加(P<0.05,图6C-6G)。ELISA检测结果表明,随着免疫时间的增加,免疫大鼠血清中IL-1β的分泌逐渐增加(P<0.01,图7)。以上结果提示AT1-AA可以促进心脏NLRP3炎症体的表达和血清中IL-1β的分泌。4.NLRP3炎症体参与了AT1-AA诱导的心肌纤维化IHC结果显示,与AT1-AA组相比,NLRP3炎症体的抑制剂MCC950可以抑制免疫大鼠心脏NLRP3蛋白的表达下降(P<0.05,图8A,8B)。Western blot结果表明,与AT1-AA组相比,给予MCC950后,免疫鼠的心脏NLRP3炎症体表达下降(P<0.05,图8C-8G)。ELISA检测结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组中大鼠心脏的IL-1β分泌明显下降(P<0.01,图9)。以上结果提示,MCC950可以抑制NLRP3炎症体的表达并减少IL-1β的分泌。超声结果显示,与AT1-AA组相比,MCC950改善了AT1-AA引起的心脏功能下降和结构的损伤。具体表现为EF,IVSs和IVSd有所恢复(P<0.05),FS有所改善但无统计学意义(P<0.05,图10A-10E)。HE染色结果表明,与AT1-AA组相比,给予MCC950后心肌纤维断裂现象明显改善,心肌细胞相对致密,排列较整齐,核大小均一,胞间质较少(图11)。Masson染色显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组大鼠的心肌细胞染色更整齐,心肌基质中沉积的胶原蛋白较少(P<0.05,图12)。IHC染色结果表明,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组大鼠的心脏组织中ColⅠ和ColⅢ都减少,且ColⅠ/ColⅢ比值下降(P<0.05,图13A,13B)。以上结果提示NLRP3炎症体参与了AT1-AA诱导的心肌纤维化。5.AT1-AA阳性大鼠心脏组织中p-mTOR/mTOR蛋白的表达增加Western blot结果表明,与Vehicle组相比,随着免疫时间的增加,AT1-AA组心脏组织中p-mTOR/mTOR的表达增加(P<0.05,图14)。结果提示AT1-AA可以激活mTOR的表达。6.mTOR参与AT1-AA诱导的心脏NLRP3炎症体表达、IL-1β分泌和胶原沉积分离大鼠心脏成纤维细胞,通过Western blot检测不同组别的表达。与AT1-AA组相比,加入mTOR抑制剂——雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)后,p-mTOR/mTOR和NLRP3炎症体各蛋白的表达都降低(P<0.05,图15A-15F)。ELISA结果显示,与AT1-AA组相比,加入RAPA后,IL-1β分泌明显减少(P<0.01,图16)。细胞免疫荧光染色结果显示,与Vehicle组相比,加入AT1-AA的心脏成纤维细胞中ColⅠ和ColⅢ的表达增加,而加入RAPA后,AT1-AA诱导的ColⅠ和ColⅢ的表达降低(图17A,17B)。以上结果提示,mTOR参与AT1-AA诱导的心脏NLRP3炎症体表达、IL-1β分泌和胶原沉积。7.AT1-AA致心脏组织炎症体的产生、IL-1β分泌及心肌纤维化是由血管紧张素Ⅱ1型受体(Angiotensin Receptor,AT1-R)介导Western blot结果表明,与AT1-AA组相比,加入血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(Angiotensin Receptor Blocker,ARB)类药物替米沙坦(telmisartan,TM)的大鼠心脏的NLRP3炎症体的表达降低,p-mTOR/mTOR的表达也降低(P<0.05,图18A-18F)。ELISA结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组的大鼠血清中IL-1β的分泌减少(P<0.01,图19)。超声结果表明,ARB可以改善AT1-AA引起的心脏功能下降和结构损伤。具体表现为,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组的大鼠心脏IVSs和IVSd增加;FS和EF也有改善,但无统计学差异(P<0.05,图20A-20E)。HE染色结果表明,ARB可以改善AT1-AA诱导的心肌结构损伤和心肌纤维断裂(图21)。Masson染色结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组大鼠的心肌细胞排列更整齐,心肌间质中的胶原沉积较少(P<0.05,图22)。IHC结果表明,与AT1-AA组相比,AT1-AA+ARB组的大鼠心脏组织中ColⅠ和ColⅢ都减少,且ColⅠ/ColⅢ比值下降(P<0.05,图23A,23B)。以上结果提示ARB可以减少由AT1-AA诱导的NLRP3炎症体的表达,IL-1β的分泌和心肌纤维化。AT1-AA可以通过AT1-R诱导NLRP3炎症体表达,IL-1β分泌并增强心肌纤维化。结论:1.AT1-AA长期存在可导致大鼠心肌纤维化、心脏结构和功能受损,同时可促进心脏组织m TOR、NLRP3炎症体以及IL-1β的水平升高。2.m TOR-NLRP3-IL-1β信号途径参与AT1-AA诱导的心肌纤维化。3.AT1-AA通过AT1-R发挥作用,激活m TOR-NLRP3-IL-1β通路参与AT1-AA诱导的心肌纤维化。
关键词: 血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体 ；mTOR ；NLRP3炎症体 ；心肌纤维化
摘要： 研究目的:唾液酸化对人胚胎心脏发育和心脏功能有重要的调节作用,研究表明心肌肥厚发生时唾液酸化会进一步增强。唾液酸化的发生需要唾液酸转移酶的参与,研究发现在三种不同基因背景的高血压心肌肥厚大鼠模型中,当基因检测关联到高血压、心肌肥厚与染色体分布时,只有编码唾液酸转移酶7A(Sialyltransfe rase7A,Siat7A)的基因均持续过表达,但Siat7A对高血压心肌肥厚的发生和发展是否有调控作用,目前尚无相关报道。因此,本研究意在探求Siat7A在高血压心肌肥厚形成过程中对血压、心功能及心肌肥厚因子等方面的调节作用,以期为其临床治疗发现新的作用靶点。材料方法:选取8周龄雄性Wistar大鼠,心肌原位注射携带sh Siat7A质粒的腺相关病毒,或颈外静脉注射携带over Siat7A质粒的腺相关病毒来制备敲低或过表达Siat7A基因的大鼠模型,背部埋泵持续灌注血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)复制高血压心肌肥厚模型。采用生物发光成像技术检测各组大鼠心脏的腺相关病毒侵染情况;使用小动物血压测量仪测量各组大鼠血压变化;运用小动物心动超声仪观察各组大鼠的心功能情况及左心室肥厚程度;造模结束后取材时分别称量各组大鼠的体重及心脏湿重,计算得出心重/体重比(Heart weight/Body weight,HW/BW);制备心肌病理组织切片,HE染色观察大鼠心肌组织病理学改变;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织中Siat7A的表达情况;通过实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测心肌组织中Siat7A、心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)和B型利钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)的表达情况。实验结果:生物发光成像显示,与注射生理盐水的离体大鼠心脏相比,注射腺相关病毒的各组大鼠离体心脏均有明显的绿色荧光蛋白表达,表明腺相关病毒成功侵染心脏。持续的血压监测和心动超声证实高血压心肌肥厚模型构建成功,表现为AngⅡ的持续灌注能明显引起平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP)升高,MAP在后期过程中一直维持较高水平。心动超声显示AngⅡ可明显引起左心室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic dimension,LVID-s)减小、左心室后壁收缩期厚度(Left ventricular end-systolic posterior wall thickness,LVPW-s)增加、左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,EF%)和左室短轴缩短率(Left ventricular fractional shortening,FS%)明显升高。而且AngⅡ的持续灌注可明显引起心肌细胞肥大,心肌排列紊乱,细胞核增大且畸形,HW/BW增加,Siat7A的表达明显升高及心肌肥厚因子ANP和BNP在mRNA水平表达显著增加;敲低Siat7A基因后,Siat7A在蛋白和mRNA水平表达减少,明显抑制了LVID-s的减小及LVPW-s的增加,减缓了EF%与FS%的升高,使心肌细胞肥大的症状减轻,HW/BW相对正常,并明显减少ANP和BNP在mRNA水平的表达;过表达Siat7A基因后,Siat7A在蛋白和mRNA水平表达明显增加,进一步升高了EF%与FS%,加重了心功能紊乱,HE染色及HW/BW显示有进一步肥厚的趋势,在心肌肥厚因子检测方面,进一步促进了ANP和BNP在mRNA水平的表达。实验结论:1.AngⅡ诱导的高血压心肌肥厚的大鼠心肌组织中Siat7A表达增加。2.敲低Sait7A能显著抑制AngⅡ诱导的高血压心肌肥厚发生发展。3.过表达Sait7A能促进AngⅡ诱导的高血压心肌肥厚发生发展。
关键词: 唾液酸转移酶7A ；高血压 ；心肌肥厚
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摘要： 目的:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后导致的心力衰竭(heart failure,HF),因其发生伴随着严重的并发症和高死亡率,成为目前心血管领域研究的热点与难点。AMI后心室重构(ventricular remodeling,VR)被认为是引发HF的主要病理基础,因此,减轻AMI后的VR是治疗HF不容忽视的重要干预环节。现有治疗药物虽在临床上得到广泛应用,但其药效与安全性仍不甚满意。中医药在改善HF方面具有明显改善HF患者活动度、提高生存质量的特点,且用药安全性高,因而成为寻找HF新的治疗药物的重要领域。本研究以补气名方保元汤(Baoyuan decoction,BYD)为研究对象,拟以调控血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 11receptor,AT1)-心肌锚定重复蛋白(cardiac ankyrin repeat protein,CARP)通路为关键切入点,利用冠状动脉左前降支(left anterior descending,LAD)结扎术制备AMI后HF动物模型,结合Ang Ⅱ刺激制备心肌细胞凋亡及肥大模型,进一步构建pcDNA3.1-Ankrd1质粒并进行细胞转染制备过表达CARP细胞模型,从整体离体两个层面阐释保元汤抑制AMI后HF心肌细胞凋亡以及肥大等心室重构环节的药理机制。方法:1.采用LAD结扎术制备AMI后HF动物模型,分为假手术组,模型组,保元汤组,阳性对照药物福辛普利钠片组。于术后连续灌胃给药28d,对保元汤抗AMI后HF心肌细胞凋亡与肥大两大环节的主要药效指标进行研究:采用超声心动评价各组大鼠心功能;利用血生化检测测定各组大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量;采用酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血浆中心钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)和氨基末端脑钠肽前体(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,NT-proBNP)的含量;利用放免法检测血浆中血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)的含量;利用Haematoxylin-eosin(HE)染色检测各组大鼠心肌组织中炎性细胞浸润及细胞肥大情况;TUNEL染色检测各组大鼠心肌组织中细胞凋亡情况:天狼星红染色检测胶原沉积情况;综合以上方法完成保元汤干预AMI后HF心室重构的药效评价。2.保元汤抑制AMI后HF心肌细胞凋亡的机制研究:体内实验部分,利用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测心肌组织中Ang ⅡⅡ的含量;利用蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测心肌组织中肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)相关蛋白、CARP及其下游相关凋亡蛋白P53、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2Associated X Protein,Bax)等的表达;同时利用透射电镜观察线粒体结构。体外实验部分,采用Ang Ⅱ刺激制备H9C2细胞凋亡模型,结合CCK-8和Hoechst 33258法检测H9C2心肌细胞活力以及保元汤干预各组心肌细胞的凋亡情况;利用WB法检测心肌细胞中相关蛋白的表达;结合Rhodamine 123染色评价保元汤对Ang Ⅱ刺激导致的心肌细胞线粒体损伤的影响,综合以上结果阐释保元汤抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡的作用机制。3.保元汤抑制AMI后HF心肌细胞肥大的机制研究:体内实验部分,利用WB法检测心肌组织中AT1、Calpain 1、CARP以及其下游相关肥大蛋白钙调神经磷酸酶(Calcineurin)、GATA结合蛋白4(GATA binding protein4,GATA4)、细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signa regulated kinase 1/2,Erk1/2)的表达;体外实验部分,采用Ang Ⅱ刺激H9C2心肌细胞制备细胞肥大模型,利用罗丹明鬼笔环肽和DAPI染色法检测保元汤干预各组H9C2心肌细胞的肥大情况;利用WB法检测细胞中AT1、Calpain1、CARP以及p-GATA4、p-Erk1/2的表达;利用细胞免疫荧光法检测细胞质中CARP的表达;综合以上结果阐释保元汤抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的作用机制。4.为进一步验证CARP调控心肌细胞凋亡和肥大的途径以及保元汤能否通过干预CARP进而调控心肌细胞凋亡与肥大,在体外采用pcDNA3.1-Ankrd1质粒转染制备过表达CARP细胞模型,采用Hoechst 33258及罗丹明鬼笔环肽染色法检测心肌细胞凋亡与肥大情况;利用WB法检测心肌细胞中CARP以及相关凋亡和肥大蛋白的表达;综合以上结果阐释保元汤通过调控CARP进而调控心肌细胞凋亡与肥大的作用机制。结果:1.保元汤干预AMI后HF大鼠心室重构的药效学研究经保元汤治疗后,各组大鼠因损伤而下降的射血分数(ejection fraction,EF)和短轴缩短率(fractional shortening,FS)均得到不同程度地改善(P<0.05,P<0.01),提示保元汤能有效抑制缺血损伤引发的大鼠心功能的下降。此外,保元汤治疗还能显著抑制左心室舒张末期内径(left ventricular internal dimension diastole,LVIDd)以及左心室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)的增加(P<0.01),提示保元汤能够在一定程度上抑制HF大鼠的心室重构。心肌酶谱检测结果显示,保元汤能够抑制心肌细胞中CK、LDH(P<0.01)的释放。同时能有效抑制血浆中HF标志物以及Ang Ⅱ(P<0.05)的水平,提示保元汤能抑制AMI导致的心肌损伤。HE染色结果显示,保元汤能够显著抑制心肌组织中的炎性细胞浸润以及心肌细胞肥大(P<0.01)。TUNEL染色结果显示,保元汤能有效抑制梗死边缘区心肌细胞凋亡。天狼星红染色结果显示,保元汤能够抑制心肌间质胶原的过度沉积。以上结果提示,保元汤具有抑制AMI后HF大鼠心室重构进而改善心功能的作用。阳性对照药物福辛普利钠片也显示出较好的改善心功能、减少炎性细胞浸润及抑制细胞凋亡和肥大的作用。2.保元汤调控AT1-CARP通路抑制AMI后HF心肌细胞凋亡的机制研究IHC检测结果显示保元汤能够降低心肌组织中Ang Ⅱ的水平(P<0.01);WB结果显示保元汤能够显著下调AT1(P<0.01)、ACE1(P<0.001)以及CARP(P<0.01)的表达;同时抑制CARP下游促凋亡蛋白P53(P<0.001)、Bax(P<0.001)以及Cleaved caspase-3(P<0.001)的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2(P<0.05)与Mdm2(P<0.01)的表达。透射电镜结果显示,保元汤能抑制线粒体结构损伤。体外细胞实验部分,MTT和Hoechst 33258检测结果表明保元汤能够抑制Ang Ⅱ诱导的H9C2心肌细胞凋亡。WB结果表明保元汤能通过下调心肌细胞中AT1、CARP以及P53和Bax的表达进而抑制细胞凋亡。此外,Rhodamine 123染色结果显示,保元汤能够抑制Ang Ⅱ刺激导致的线粒体膜电位损伤。3.保元汤调控AT1-CARP通路抑制AMI后HF心肌细胞肥大的机制研究WB结果显示:保元汤能够显著下调心肌组织中AT1(P<0.01)、Calpain1(P<0.01)以及CARP(P<0.01)的表达,同时抑制CARP下游调控的促肥大蛋白GATA4(P<0.001)和Erk1/2(P<0.01)的磷酸化,对CARP下游另一肥大蛋白Calcineurin的表达没有明显的调控作用。体外细胞实验部分,罗丹明鬼笔环肽染色结果显示保元汤能够抑制Ang Ⅱ诱导的H9C2心肌细胞肥大。WB结果表明保元汤能显著下调心肌细胞中AT1、Calpain 1和CARP的表达,同时抑制CARP下游肥大蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化。此外,免疫荧光染色结果表明,保元汤能够抑制Ang Ⅱ诱导的细胞质中CARP的表达增加。4.保元汤调控CARP进而调控心肌细胞凋亡和肥大的机制验证Hoechst33258及罗丹明鬼笔环肽染色结果分别显示pcDNA3.1-Ankrd1质粒组H9C2心肌细胞发生明显的细胞凋亡并伴有细胞表面积的增加;保元汤能够显著抑制过表达CARP引发的心肌细胞凋亡,并且能够有效逆转心肌细胞的肥大。WB结果显示质粒转染组心肌细胞中CARP的表达明显上调,并且能够促进P53的表达、抑制Mdm2的表达;此外,心肌细胞中CARP相关肥大蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化水平也显著升高。保元汤不仅能够显著抑制CARP的过表达,同时也能够下调CARP下游凋亡蛋白P53的表达,并且对其调控的肥大相关蛋白GATA4和Erk1/2的磷酸化也有显著的抑制作用。结论:1.药效研究提示保元汤能有效改善AMI后HF大鼠心功能的急剧下降,同时能有效抑制心室重构引起的左心室内径增加,降低HF大鼠血清中CK和LDH的水平;有效降低循环中HF标志物及Ang Ⅱ的水平。此外,保元汤能够有效抑制心肌组织中炎性细胞浸润、心肌细胞肥大、细胞凋亡以及胶原的过度沉积。以上药效结果共同提示保元汤改善AMI后HF大鼠心功能的作用与其抑制心肌细胞凋亡和肥大等心室重构病理环节密切相关,为后续的机制研究提供方向。2.保元汤抗心肌细胞凋亡作用的体内与体外机制研究结果表明:心肌缺血导致心肌组织中Ang Ⅱ水平升高,进一步激活其受体AT1的表达,使得心肌组织中CARP蛋白出现高表达状态;进而启动P53-线粒体凋亡途径,使得心肌细胞中P53、Bax以及Cleaved caspase-3的表达升高,Bcl-2、Mdm2的表达下降。给予保元汤干预后,能够有效抑制心肌组织中Ang Ⅱ的水平,进一步下调AT1的表达,进而抑制心肌细胞中CARP的高表达;同时保元汤能够促进抗凋亡蛋白Bcl-2、Mdm2的表达,并抑制促凋亡蛋白P53、Bax以及Cleaved caspase-3的表达,进而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。同时,利用pcDNA3.1-Ankrd1质粒转染使得CARP在H9C2心肌细胞中过表达,给予保元汤进行干预,结果显示保元汤能够有效抑制心肌细胞中过表达的CARP的水平,且对其下游调控分子P53亦有相同的抑制作用。综上,保元汤能通过调控AT1-CARP通路进而抑制AMI后HF大鼠心肌细胞凋亡;CARP成为保元汤改善心功能、抑制心肌细胞凋亡的关键蛋白以及潜在靶标。3.保元汤抗心肌细胞肥大作用的体内与体外机制研究结果表明:AMI术后28 d,伴随着心肌组织持续的心肌缺血,心肌细胞中AT1-CARP通路激活的同时,CARP下游调控肥大的GATA4/Erk1/2通路被激活,进而诱导心肌细胞面积增大、加重HF程度。给予保元汤干预后,能够通过调控AT1-CARP通路,进而抑制GATA4/Erk1/2肥大途径中相关蛋白的磷酸化,保持心肌细胞的正常大小与直径,预防心室重构的发生并延缓HF恶化的程度。同时,通过在体外对CARP的过表达以及保元汤的干预,结果发现,保元汤在通过AT1调控CARP的表达量的同时,能够抑制CARP的过表达,进而抑制促肥大蛋白GATA4的磷酸化,多途径发挥抗心肌细胞肥大的作用。同时,该结果亦提示CARP为保元汤发挥抗心肌细胞肥大作用的关键蛋白与潜在靶标。4.本研究通过对补气名方保元汤抑制AMI后HF心肌细胞凋亡及肥大药效以及通过调控AT1-CARP通路抗凋亡和肥大作用机制的阐明,尤其是对CARP调控心肌细胞凋亡、肥大机制的验证以及保元汤对CARP调控作用的阐明,
关键词: 保元汤 ；心力衰竭 ；AT1-CARP ；凋亡 ；肥大 ；心室重构
被引量
16
摘要： 动物实验和临床观察结果证实,各种药理学手段干预抑制心脏肥大和纤维化,可以延缓心脏功能的恶化。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要生物活性肽产物,通过与其血管紧张素II 1型受体（AT1R）的结合,对心血管系统的变化、起着重要的病理生理调节作用。尽管AngII转换酶抑制剂或受体阻断剂,已常规用于临床并取得了良好的治疗效果,但病人观察的结果表明,此类药物的使用可产生一系列的副作用。因此,寻求通过调节AngⅡ系统的变化,进而减少心脏重塑并促进心脏功能恢复的辅助疗法,仍值得进一步研究。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种肠降血糖激素,体内半衰期较短,使用外源性GLP-1协同剂利拉鲁肽已广泛用于糖尿病人的治疗。近年来的研究结果表明,不依赖降血糖调节机制的利拉鲁肽疗法,也可用于高血压,心肌梗塞,心肌病和其它多种心血管疾病的治疗。但有关GLP-1疗法对压力性负荷所致心力衰竭的疗效和作用机理,尚缺少足够的系统性评价和探索。因此,本研究选择了大鼠腹主动脉缩窄在体心脏模型,观察了利拉鲁肽对由压力负荷增加所致AngII系统活化的干预特征（研究第一部分）,包括:1)心肌氧化应激和抗氧化酶的作用;2)AngII AT1/AT2受体平衡的调节;3)纤维细胞的迁移和增生的影响;4)心肌细胞肥大和心脏收缩和舒张功能的调节。为了解调节的可能机制,实验进一步分析了利拉鲁肽疗效的作用环节（研究第二部分）,包括:1)观察血液中GLP-1水平的变化;2)心脏形态和重量的作用;3)纤维化反应调节蛋白表达如mTOR/p70S6K的影响;4)自噬调节蛋白表达如LC3,Beclin-1,p62的影响;5)心肌纤维化和心功能改变的调节。在培养的H9C2心肌细胞,观察了利拉鲁肽对AngⅡ诱导下心肌细胞反应特征的直接作用（研究第三部分）,包括:1)细胞增殖和肥大的作用;2)AngII受体表达的调节;细胞氧化反应水平如ROS和纤维化介导蛋白TGFβ1和α-SMA的调定;3)纤维化调节蛋白如mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响;4)胶原蛋白表达变化的作用。在上述研究中,为澄清利拉鲁肽调定AngII受体和纤维化的传导机制,实验采用AngII AT1受体阻断剂替米沙坦和mTOR特异性抑制剂雷帕霉素进行了对比性观察,证实了利拉鲁肽受体通路和氧化应激的直接细胞效应。本研究的结果表明,GLP-1疗法对压力负荷增加所致的心肌纤维化和功能紊乱,有显著的抑制作用;这种保护效应是通过调定AngII受体和纤维化反应过程来实现的。这些研究结果也为GLP-1疗法在心衰病人的治疗,提供了新的实验基础和应用前景。第一部分胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑并改善心脏功能目的:血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）通过引起心脏重塑和功能障碍而导致心力衰竭的发生,在心力衰竭的发病机制中具有重要的作用。已证明胰高血糖素样肽1（GLP-1）对动物和患者具有心脏保护作用。本研究想证实GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是否通过改变AngⅡ1型受体（AT1R）受体表达来抑制腹主动脉缩窄（AAC）引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）替米沙坦治疗组（Telmi组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以10mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠替米沙坦。2.定期测量大鼠体重和血糖值。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.酶标仪检测:通过丙二醛（MDA）、超氧化物歧化物（SOD）和人N端前脑钠素（NT-pro BNP）试剂盒检测大鼠心脏MDA和NT-pro BNP的含量以及SOD的活性。5.免疫组化法:定位及评估心脏组织的ACE2、巨噬细胞、肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。6.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。7.Western-blot法:测定心肌组织中AT1R、AT2R、TGF-β1、p-smad2、smad2、p-smad3、smad3、smad4、smad7、collagenI和collagenⅢ的蛋白定量表达。8.采用2D Vivid7超声仪测定大鼠的心功能。9.采用BL-410生物信号采集与处理系统:检测大鼠心率、血压及左心室血流动力学指标。结果:1.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响:从术后第2周开始定期测量大鼠体重和血糖值,随着时间的推移,虽然两种数据均出现上升趋势,但各组同一时间的数值之间并无显著的统计学差异。2.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW的比值的影响:腹主动脉缩窄术16周后,相对于Sham组大鼠HW/BW比值（3.38±0.17vs.2.46±0.05,p<0.05）和MSA（1512±99 vs.586±98μm2,p<0.05）明显升高,利拉鲁肽和替米沙坦可分别减少HW/BW比值（2.63±0.09和2.77±0.05vs.AAC组,所有p<0.05）和MSA降至766±61μm2或871±51μm2（与AAC组相比,p<0.05）。3.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭的影响:相对于Sham组,AAC组在实验16周后检测发现NT-pro BNP（48.4±8.6pg/ml）表达水平显着提高,给予利拉鲁肽和替米沙坦治疗后,NT-pro BNP的表达水平分别为（10.3±0.8pg/ml和14.8±1.3pg/ml vs.AAC组,所有p<0.05）。4.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响:与Sham组相比,AAC组心肌组织中的MDA表达显著提高（23.4±1.3vs.16.3±0.6nmol/mg,p<0.05）,SOD表达水平却降低（8.1±0.8 vs.10.4±0.4U/mg,p<0.05）。相对于AAC组,给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后可使MDA水平分别降低至15.9±1.6和17.2±1.4nmol/mg（相对于AAC组,p<0.05）,且SOD酶活性分别提高至11.9±1.2和11.6±1.1U/mg（与AAC组相比,p<0.05）,结果提示给药后心脏抗氧化能力增强。5.利拉鲁肽和替米沙坦降低术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2的影响:实验结束时,相对于Sham组,AT1R的蛋白表达水平显著提高10.55±2.5%,而AT2R的蛋白表达则降低了36.43±5.6%,p<0.05。在手术后给予利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AAC组呈现相反的表达水平。在抑制AT1R表达的同时刺激AT2R的表达,体现为AT1R/AT2R比例的降低。免疫组织化学染色显示,相对于Sham组,AAC组中血管周围和心肌间质中ACE2的表达显著减弱。相对于AAC组,在术后给予利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗可逆转ACE2的表达下降。6.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1的影响:免疫组织化学法检测AAC组心脏切片结果表明,在血管周围区域和心肌间质中聚集了大量巨噬细胞,而利拉鲁肽或替米沙坦治疗可减轻这些巨噬细胞的聚集数量,Sham组则很少见巨噬细胞在心肌组织间隙中聚集。与AAC组巨噬细胞浸润增强相一致,心肌中TGF-β1的表达也显著增加。WB检测TGF-β1的蛋白质水平,进一步证实了TGF-β1表达的变化。与AAC组相比,在腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦可使心脏中巨噬细胞浸润和TGF-β1的表达均降低。7.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白的影响相对于Sham组,AAC组在心肌血管周围出现大量的α-SMA阳性肌成肌纤维细胞。而在Sham组,在心肌细胞间隙中仅有很少的α-SMA阳性细胞表达。在进行腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦的药物治疗,α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目明显减少。在Sham组中,Smad2和Smad3几乎没有被磷酸化。然而AAC组,Smad2/3的磷酸化显著增强,与Smad2/3的总蛋白水平增加相一致。相对于Sham组,AAC组中Smad4的总蛋白水平显著上调,而Smad7的总蛋白表达下调。然而,通过利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗后明显逆转了所测Smad家族成员蛋白质表达的变化趋势。8.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响:与Sham组相比,AAC组中胶原蛋白I和Ⅲ的蛋白水平显著增加。利拉鲁肽或替米沙坦的给药组I型和Ⅲ型胶原蛋白的产生相对AAC组显著减少。AAC组Masson结果显示由胶原蛋白面积百分比来表示的沉积胶原蛋白区域在血管周围和间质心肌中显著扩展。在整个实验中,在假手术对照中均未检测到新合成的胶原蛋白。腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙药物组,心脏中血管周区域和心内膜均显示胶原沉积显著减少。9.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响:超声结果显示相对于Sham组,AAC组在实验的16周时导致LVIDd显著增加,LVEF和LVFS降低。与AAC组的结果相比,利拉鲁肽或替米沙坦治疗可增强心脏功能。BL-410生物信号采集和处理系统结果显示:相对于Sham组,AAC组中大鼠的MAP,HR和LVEDP各项指标都显着增加,LVSP降低。此外,左室压力的最大增加速率(+dp/dtmax)和左室压力的减小速率(-dp/dtmax)明显降低。利拉鲁肽和替米沙坦治疗16周可有效预防心脏功能减退,与抑制心脏肥大和纤维化的结果相一致。结论:1.利拉鲁肽对心肌重塑和心功能具有保护作用;2.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和ACE2的表达,进而减少自由基产生有关;3.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第二部分胰高血糖素样肽1通过抑制mTOR/p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用目的:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）介导组织纤维化并负面调节自噬。本部分旨在研究胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是否通过抑制mTOR/p70S6K信号传导并促进自噬活性来保护心脏免受腹主动脉缩窄引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）雷帕霉素治疗组（Rapa组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以0.2mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠雷帕霉素。2.检测大鼠血糖和血浆中GLP-1含量,利用GLP-1试剂盒酶标仪检测。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织进行固定、包埋后,HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.免疫组化法:定位及评估心脏组织的肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。5.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。6.Western-blot法:测定心肌组织中GLP-1R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、LC3、Beclin-1、p62、collagen I和collagenⅢ的蛋白定量表达。7.无创评估大鼠心脏整体功能。8.有创大鼠血流动力学测定。
关键词: AngⅡ1型受体 ；心肌纤维化 ；心脏功能 ；利拉鲁肽 ；替米沙坦 ；心肌纤维化 ；心脏功能 ；利拉鲁肽 ；mTOR/p70S6K ；自噬 ；AngⅡ ；H9C2心肌细胞 ；利拉鲁肽 ；AngⅡ1型受体 ；mTOR/p70S6K
摘要： 高血压是以系统性动脉持续血压增高为特征的疾病,对心脏、大脑、肾脏等多个重要器官造成显著的不良影响。然而由于人口老龄化和不健康生活方式,这一疾病的患病率在全球范围内呈上升趋势,目前已成为全球面临的重大卫生安全事件。众所周知,高血压仍未被有效地治疗和管理,临床上经典的降压药物已经不能满足日益增长的高血压患者人群需要,因此探索其发生的新机制和新的治疗方法对社会具有重要意义。
根据课题组前期研究结果提示,瞬时电位受体经典通道1（transient receptor potential canonical 1,TRPC1）通过调控血管新生促进心梗后心脏的恢复,与心血管疾病密切相关。此外,TRPC1也被认为是调控细胞内钙离子浓度的关键离子通道,从而参与血管功能的调节。基于这些理论,本研究分别从细胞、组织和动物层面上揭示血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）中的TRPC1在血管紧张素Ⅱ（angiotensin II,Ang Ⅱ）诱导的高血压和心血管重塑形成过程中的作用,并深入探讨其可能发挥作用的分子调控机制。得到的主要结果如下:
1.在经过Ang Ⅱ诱导高血压模型后,TRPC1血管平滑肌细胞特异性敲除小鼠(VSMC-specific TRPC1-knockout mice,TRPC1VSMC-/-)相比较于其阴性对照小鼠(TRPC1-flox mice,TRPC1fl/fl)收缩压降低。提示血管平滑肌上的TRPC1参与血压调控。与TRPC1fl/fl小鼠相比,TRPC1VSMC-/-小鼠对苯肾上腺素引起的收缩反应减弱,这一现象在经过Ang Ⅱ处理后仍存在,而内皮依赖性和内皮非依赖性舒张无明显差异。表明血管平滑肌上的TRPC1影响血管收缩功能。
2.通过对高血压造模后的小鼠做超声心动图和染色等实验,发现Ang Ⅱ引起TRPC1fl/fl小鼠胸主动脉中膜厚度和面积增加,腹主动脉扩张,心脏重量增加,心脏/体重比增大,心肌细胞肥大和心功能损害,在TRPC1VSMC-/-小鼠中这些现象显著减轻。表明血管平滑肌特异性缺失TRPC1可以缓解Ang Ⅱ诱导的心血管重塑。
3.为研究TRPC1参与高血压和心血管损害的机制,首先通过实时定量PCR筛选出其上游作用因子是ZAST同源增强子（EZH2）。蛋白免疫印迹实验发现Ang Ⅱ通过与VSMCs上的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）结合,作用于EZH2使其表达量增加,进而上调TRPC1的表达,使细胞内钙离子水平升高,这一现象可被EZH2抑制剂GSK126逆转。此外本研究还发现Ang Ⅱ可以诱导细胞MEK/ERK1/2磷酸化水平升高,VSMCs中敲低TRPC1和使用GSK126通过抑制其磷酸化调控VSMCs的增殖和迁移。在体实验表明,对小鼠给予腹腔注射GSK126,可以降低Ang Ⅱ引起的血压升高和血管收缩能力增强,改善腹主动脉扩张和心功能损害。
综上,血管平滑肌特异性缺失TRPC1可以缓解血管收缩、高血压和心血管重塑。作用机制为Ang Ⅱ通过EZH2-TRPC1-MEK/ERK1/2通路参与高血压及心血管损害过程。
关键词: TRPC1 ；高血压 ；Ang Ⅱ ；血管平滑肌细胞 ；心血管重塑
摘要： 研究背景:
心房疾病的定义经历了从“心房颤动”、“心房心肌病”到“心房衰竭”。2016年欧洲心律协会通过专家共识正式提出心房心肌病的定义,根据心房心肌病的组织病理学特征,专家共识将心房心肌病分类为四个亚型,其Ⅰ型和Ⅲ型的主要病理特征是心房肌肥厚(心房肌细胞肥大)。心房肌与心室肌肥厚具备相似的发病机制,近年来不断有研究证实表观遗传学调控在心室肌肥厚中发挥重要作用,而心房肌肥厚,作为心房心肌病的重要病理学特征之一,表观遗传学机制是否亦在其发生发展中发挥作用?本研究旨在探讨心房心肌病心肌细胞肥大的表观遗传学机制。
研究内容与方法:
心外科手术中收集8例慢性持续性房颤和7例窦性心律患者的右心房心耳组织样本,酶联免疫吸附试验检测心房组织中血管紧张素Ⅱ含量,western-bloting检测心房肌肥大相关基因:心房利钠肽、脑利钠肽蛋白表达,染色质免疫共沉淀检测肥大相关基因启动子序列富集心肌细胞增强因子2、组蛋白去乙酰化酶、组蛋白H3K27、H4乙酰化水平。新生大鼠心房肌细胞原代培养,血管紧张素Ⅱ诱导心房肌细胞肥大,血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦拮抗AngⅡ作用,westernbloting检测心房肌肥大基因蛋白表达,染色质免疫共沉淀检测肥大相关基因启动子序列MEF-2、HDAC、组蛋白H3K27、H4乙酰化富集水平。RNA测序(RNAseq)分析基因转录组。
研究结果:
与窦性心律组患者相比,房颤患者心房明显增大,表现为房性肥厚和房性心肌病。与窦性心律组患者相比,房颤组患者心房肌组织中血管紧张素Ⅱ水平、肥大相关基因蛋白表达、肥大基因启动子序列富集的心肌细胞增强因子2、组蛋白H4、H3K27乙酰化丰度较窦性心律患者升高,但肥大相关基因启动子序列富集组蛋白去乙酰化酶减少。在原代心房肌细胞培养实验中,血管紧张素Ⅱ体外培养增加了原代心房心肌细胞的横截面面积,诱导了肥大相关基因蛋白表达增加,促进组蛋白去乙酰化酶-4和-5的磷酸化,并诱导了二者的出核转运。染色质免疫共沉淀结果同时提示:血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大基因启动子序列富集心肌细胞增强因子-2,染色质组蛋白H4、H3K27乙酰化修饰丰度的增加与在启动子上的富集的组蛋白去乙酰化酶丰度降低有关。RNA测序分析提示血管紧张素Ⅱ能够显著上调心肌能量与结构重构基因的表达。上述血管紧张素Ⅱ诱导的促肥大细胞效应均可被血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦,Ca MK(Ca(2+)/钙调蛋白依赖性激酶)抑制剂KN93和蛋白激酶D抑制剂CID755673治疗部分逆转。RNA测序分析显示,AngⅡ显著上调与心肌能量重构与结构重构相关的基因转录组转录。
结论:
房颤患者对心房肌肥大的神经内分泌易感性增加,肥大相关基因转录激活的表观遗传学特质增加。心肌细胞增强因子-2可能作为平台,通过交换组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶实现对正或负向转录信号作出应答。血管紧张素Ⅱ诱导的去乙酰化酶出核转运及由此引发的组蛋白乙酰化修饰增加可能是一种新的心房肥大调节机制,可能作为心房心肌病治疗的新策略。血管紧张素Ⅱ对心房心肌病有促肥厚作用,成部分表观遗传学依赖。因此,可以探索表观遗传干预治疗房性心肌病等心房相关临床疾病。
关键词: 心房心肌病 ；心肌肥大 ；表观遗传学 ；转录调控 ；血管紧张素Ⅱ
摘要： 心肌肥厚和心脏纤维化在心血管疾病发生发展过程中至关重要。本课题组前期一直在探索肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中重要的激素血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)及其受体在心脏纤维化过程中的作用及机制。传统用药血管紧张素转换酶抑制剂和1型血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)阻断剂,虽能明显抑制心脏纤维化产生,但其副作用的存在影响临床治疗效果,因此探寻疗效相当但副作用小的临床治疗手段仍然迫在眉睫。依达拉奉是临床用于治疗脑卒中的自由基清除剂,报道显示它有抗炎和减轻心肌肥厚的作用,本研究旨在探索其抗纤维化的作用及分子机制。醛固酮(ALDO)是RAAS中Ang Ⅱ激活的下游因子,在肾上腺它的合成分泌主要通过类固醇合成急性调节蛋白(St AR)和醛固酮合成酶(AS)来调控,但其在心脏纤维化过程中的作用与机制仍未完全阐明。鉴此本课题通过采用胸主动脉缩窄和Ang Ⅱ皮下泵注模型,利用Western-blot、免疫组化、血流动力学测定和超声心动图等手段,旨在研究依达拉奉及Ang Ⅱ/AT1R/St AR/AS/ALDO信号途径在心脏纤维化过程中的作用机制,为临床治疗心脏纤维化提供新的治疗靶点。第一部分:依达拉奉通过调节Ang Ⅱ AT1R、AT2R/ACE2通路,改善压力后负荷增加引起的心肌肥厚及心功能异常目的:利用Ang Ⅱ AT1受体阻断剂替米沙坦作为阳性对照组,观察依达拉奉改善压力后负荷增加引起的心肌肥厚及心功能异常是否与下调AT1R,上调AT2R/ACE2表达有关。实验方法:1.分组:雄性SD大鼠行左开胸胸主动脉缩窄术(TAC),术后观察8周,分为4组,6只大鼠/组。(1)Sham组:大鼠开胸但不结扎胸主动脉。(2)TAC组:大鼠开胸在左右颈总动脉分支处结扎主动脉。(3)Edara组:在TAC模型基础上,腹腔注射依达拉奉(10mg/kg/day)8周。(4)Telmi组:在TAC模型基础上,胃饲替米沙坦(10mg/kg/day)8周。2.实验结束后,取大鼠心脏,计算心脏重量/体重(HW/BW)比值;心脏组织福尔马林固定、石蜡包埋后切片,HE染色后测定长轴心肌细胞横截面积(MSA)。3.大鼠心脏组织匀浆,通过丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒测定心脏MDA含量和SOD活性。4.心脏组织匀浆提取蛋白,Western-blot法测定AT1R、AT2R蛋白表达。5.石蜡组织切片使用免疫组化法对ACE2的组织定位和表达进行评估。6.实验结束后从右侧颈总动脉插入压力换能导管,记录左心室血流动力学变化。7.采用2D Vivid7超声仪对大鼠在体心功能进行测定。结果:1.TAC8周后,大鼠心肌MSA和HW/BW比值明显增加,依达拉奉和替米沙坦都可减小MSA和HW/BW比值。2.TAC8周后,大鼠心脏AT1R表达增多、AT2R/ACE2表达下调,同时MDA含量增加而SOD活性下降;依达拉奉和替米沙坦均可抑制AT1R表达上调、增加AT2R/ACE2表达,同时减小AT1R/AT2R比值(0.57±0.2 vs 3.16±0.39,p<0.05),减少MDA含量和加强SOD活性。3.TAC8周后,大鼠心脏收缩功能下降,表现为射血分数(EF)以及左室收缩压(LVSP)下降。依达拉奉和替米沙坦均可改善心脏收缩功能,表现为增加EF(82%±3%vs 60%±5%)和LVSP(204±51 vs 110±19mm Hg,p<0.05)。小结:在不影响外周血压的情况下,TAC8周可引起心肌肥厚和心功能下降。依达拉奉通过调节AT1R、AT2R/ACE2信号途径,减少自由基产生,减轻心肌肥厚和改善心功能,其作用和替米沙坦相同。第二部分:依达拉奉通过抑制TGF-β1/SMADs信号通路,减少巨噬细胞浸润和成纤维细胞转化,改善压力后负荷增加引起的心脏纤维化目的:探讨依达拉奉保护心脏纤维化的具体机制,是否通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/SMADs信号途径,减少成纤维细胞转化起到减轻心脏纤维化的作用。实验方法:1.大鼠TAC模型的制备、分组取材与第一部分内容相同。2.采用免疫组化法对大鼠心脏巨噬细胞、α-SMA肌成纤维细胞以及I型胶原蛋白在心脏组织及血管周围的表达进行定性评估。3.Western-blot法对大鼠心脏TGF-β1、Smad2、3、4、7和ⅡI型胶原蛋白表达进行定量测定。4.Masson’s三色染色法进行心脏及血管周围胶原纤维分布情况的测定。结果:1.胸主动脉缩窄8周之后,依达拉奉和替米沙坦可以减少巨噬细胞在心脏组织间隙聚集、减少TGF-β1蛋白的表达,进而减少成纤维细胞向表达α-SMA的肌成纤维细胞转化。2.依达拉奉和替米沙坦通过下调Smad2、3蛋白、上调Smad7蛋白的表达,最终抑制压力后负荷增加引起的I型胶原蛋白表达和胶原纤维在心脏组织间隙沉积。小结:不影响外周血压的情况下,压力后负荷增加导致心脏纤维化增加,依达拉奉与替米沙坦效果相同,通过抑制AT1R减少巨噬细胞聚集和成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,同时调控TGF-β1/SMADs信号通路蛋白的表达,减轻心脏胶原沉积、逆转心脏纤维化形成。第三部分:心脏局部产生的醛固酮在Ang Ⅱ连续泵注诱导的心肌肥厚和心脏纤维化中的作用目的:通过采用盐皮质激素受体(MCR)阻断剂螺内酯、血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)阻断剂替米沙坦和肾上腺切除作为干预因素,阐明心脏局部产生的醛固酮(ALDO)在Ang Ⅱ诱导的心脏肥厚和纤维化过程中的作用原理。实验方法:1.雄性SD大鼠皮下放置Ang Ⅱ微量渗透泵4周,因不同的处理方式随机分为6组,6只大鼠/组,大鼠的组织提取、标本保存和石蜡包埋等过程与第一部分相同。(1)Sham组:皮下放置生理盐水微量渗透泵4周。(2)Ang Ⅱ组:皮下放置Ang Ⅱ微量渗透泵,泵注速度500ng/kg/min。(3)Telmi组:在Ang Ⅱ皮下泵注的基础上,胃饲替米沙坦10mg/kg/day 4周。(4)Spiron组:在Ang Ⅱ皮下泵注的基础上,胃饲罗内酯100mg/kg/day 4周。(5)T+S组:在Ang Ⅱ皮下泵注的基础上,联合胃饲替米沙坦和罗内酯4周。(6)ADX组:在Ang Ⅱ泵注的基础上,大鼠行双侧肾上腺切除术,观察4周。2.使用无创尾动脉压力测定法监测不同时间点大鼠动脉血压的变化。3.大鼠心肌MSA和HW/BW测定方法同第一部分。4.免疫组化法分析大鼠心脏巨噬细胞和肌成纤维细胞表达情况。5.Western-blot法对TGF-β1、Smad2/3、Collagen I、ⅡI的蛋白表达和磷酸化水平进行定量分析。6.Masson’s三色染色对大鼠心脏组织间隙和血管周围胶原纤维分布进行评估。结果:1.螺内酯、替米沙坦和肾上腺切除都可减轻心肌肥厚,但肾上腺切除后心肌肥厚仍明显存在,说明心脏局部产生的ALDO在Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚中起重要作用。2.螺内酯、替米沙坦和肾上腺切除都可通过减轻巨噬细胞聚集、成纤维细胞转化,抑制TGF-β1/Smad2、3信号蛋白表达来逆转心脏纤维蛋白沉积和纤维化形成,但肾上腺切除后心脏纤维化仍明显存在,并且与螺内酯组有显著差异,说明心脏局部产生的ALDO在Ang Ⅱ引起的心脏纤维化过程中起更重要的作用。小结:在Ang Ⅱ直接泵注导致的心肌肥厚和心脏纤维化过程中,ALDO起到重要的作用,通过抑制ALDO产生的上游机制、阻断ALDO与盐皮质激素受体(MCR)相互作用,以及切除肾上腺减少肾上腺来源的ALDO都可不同程度减轻心脏纤维化。其具体机制是通过减少巨噬细胞聚集、成纤维细胞转化,进而抑制TGF-β1/Smad2、3信号通路逆转心脏I型胶原蛋白沉积和纤维化形成。由于切除肾上腺消除肾上腺来源的ALDO后,心脏纤维化仍然大量存在,并其效果与螺内酯组有显著差异,证明心脏局部产生的ALDO在这个过程中起更重要的作用。第四部分:类固醇合成急性调节蛋白/醛固酮合成酶在调控Ang Ⅱ诱导心脏醛固酮产生中的作用目的:比较螺内酯和替米沙坦的作用特征,探讨类固醇合成急性调节蛋白(St AR)和醛固酮合成酶(AS)在调控Ang Ⅱ诱导大鼠心脏醛固酮产生中的作用。实验方法:1.动物模型和分组与第三部分相同。2.Western-blot法测定大鼠心脏组织中AT1R、St AR、AS、ERK1/2、p38蛋白的表达及磷酸化水平,证明Ang Ⅱ诱导产生ALDO的上游信号分子及调控机制。3.免疫组化法分析大鼠心脏组织中TNF-α的表达及定位。Western-blot法测定心脏组织中Akt和MCP-1表达水平,证明ALDO诱导巨噬细胞聚集的信号途径。结果:1.替米沙坦通过阻断Ang Ⅱ与AT1R的相互作用抑制St AR和AS蛋白的表达。2.替米沙坦通过抑制ERK1/2/p38 MAPKs信号通路下调StAR的表达。3.螺内酯通过抑制TNF-α/Akt/MCP-1信号途径减少巨噬细胞趋化。小结:Ang Ⅱ诱导心脏局部ALDO产生过程中,St AR/AS起重要的作用且其表达上调是AT1R依赖性的,同时MAPKs信号通路可能参与其表达的调节;螺内酯通过阻断MCR受体,抑制TNF-α/Akt/MCP-1信号途径,从而减少巨噬细胞趋化聚集和纤维化形成。
关键词: 血管紧张素Ⅱ ；醛固酮 ；类固醇合成急性调节蛋白 ；醛固酮合成酶 ；心脏纤维化
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