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摘要： 目的研究朝鲜产东北红豆杉树皮中提取紫杉醇后残液的化学成分。方法采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱分离,通过理化常数和光谱分析鉴定化合物的结构。结果 分离并鉴定了10个化合物的结构,分别为β-谷甾醇（1）、7-表-紫杉醇（2）、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（3）、胡萝卜苷（4）、7-木糖-紫杉醇（5）、2-（4-hydroxyphenyl）propane-1,3-diol（6）2、-（3-methoxy-4-hydroxyphenyl）propane-1,3-diol（7）、20,22-异丙叉基β-蜕皮甾醇（8）、4-O-β-D-xylopyrano-syl dihydrodehydrodiconiferyl alcohol（9）、3,5,3′-三羟基-7,4′-二甲氧基黄酮（10）。结论化合物610为首次从该属植物中分得。
关键词: 东北红豆杉 ；7-表-紫杉醇 ；3,5,3′-三羟基-7,4′-二甲氧基黄酮
被引量
2
摘要： 目的进一步明确东北红豆杉（Taxus cuspidata）愈伤组织中的化学成分,为开发可持续利用的红豆杉资源提供物质基础。方法采用硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱等手段对愈伤组织的甲醇提取物进行分离和纯化;根据化合物的理化性质和波谱数据并结合相关文献对化合物结构进行鉴定。结果从东北红豆杉愈伤组织甲醇提取物中分离得到7个紫杉烷型二萜类化合物,分别鉴定为taxusin（1）、2α-acetoxytaxusin（2）、14β-hydroxytaxusin（3）、2-deacetyltaxuyunnanine C（4）、10-deacetyltaxuyunnanine C（5）、7-表-紫杉醇（7-epi-taxol,6）、cephalomannine（7）。结论化合物1~5,7为首次从东北红豆杉愈伤组织中分离得到,化合物3~5尚未在东北红豆杉中发现。
关键词: 东北红豆杉 ；愈伤组织 ；紫杉烷型二萜 ；结构鉴定
被引量
2
摘要： 目的对栽培于我国辽宁本溪的曼地亚红豆杉(Taxus media)针叶的化学成分进行研究。方法采用大孔树脂、硅胶柱色谱、ODS柱色谱、凝胶柱色谱及MDS柱色谱等方法进行分离纯化,通过NMR数据分析鉴定化学结构。结果从曼地亚红豆杉针叶的乙醇提取物中分离得到8个化合物,分别鉴定为二萜类化合物:紫杉宁(taxinine,1)、东北红豆杉素(taxacin,2)、紫杉欧吉酚(taxa-gifine,3)、2-去乙酰氧基紫杉宁J(2-deacetoxytzxinine J,4)、东北红豆杉素I5-O-桂皮酰基三乙酸酯(5-O-cinnamoyltaxacin I triacetate,5);黄酮类化合物:芹菜素(apigenin,6)、银杏双黄酮(ginkget-in,7)、金松双黄酮(sciadopitysin,8)。结论化合物2、5、7、8为首次从栽培曼地亚红豆杉针叶中分离得到。
关键词: 曼地亚红豆杉 ；紫杉烷二萜 ；黄酮类化合物 ；化学成分 ；结构鉴定
被引量
12
摘要： 目的明确东北红豆杉(Taxus cuspidata)愈伤组织中的化学成分,为开发可持续利用的红豆杉资源提供理论依据。方法采用硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱等手段对愈伤组织的正己烷和乙酸乙酯提取物进行分离和纯化;根据化合物的理化性质和波谱数据并结合相关文献对化合物结构进行鉴定。结果从东北红豆杉愈伤组织中分离得到11个紫杉烷类化合物,分别鉴定为tax-uyunnanine C(1)、2α,5α,10β-triacetoxy-14β-propionyloxy-4(20),11-taxadiene(2)、2α,5α,10β-tri-acetoxy-14β-isobutyryloxy-4(20),11-taxadiene(3)、2α,5α,10β-triacetoxy-14β-(2′-methyl)butyrylo-xy-4(20),11-taxadiene(4)、云南红豆杉甲素(yunnanxane,5)、紫杉醇(paclitaxel,6)、taxol C(7)、baccatin VI(8)、1β-deoxybaccatin VI(9)、taxayuntin C(10)、baccatin I(11)。结论化合物9、11为首次从东北红豆杉愈伤组织中分离得到,化合物1-4、8-10尚未在东北红豆杉中发现。
关键词: 东北红豆杉 ；愈伤组织 ；紫杉烷类化合物 ；结构鉴定
被引量
6
摘要： 目的研究朝鲜产东北红豆杉树皮中紫杉烷类的化学成分。方法采用乙醇提取、液-固萃取以及硅胶柱色谱分离，通过理化常数和光谱分析鉴定化合物的结构。结果从朝鲜产东北红豆杉的干燥树皮中分得8个化合物。经理化性质及波谱分析，鉴定了其中的7个化合物的结构，分别为紫杉醇（taxol，Ⅰ）、三尖杉宁碱（cephaolmannine，Ⅱ）、7-表-紫杉醇（7-epi—taxol，Ⅲ）、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB Ⅲ，Ⅳ）、7-木糖基-紫杉醇（7-xylose—taxol，Ⅴ）、2-deacetoxydecinnamoyl taxinineJ（Ⅵ）、β-谷甾醇（psitosterol，Ⅶ）。结论化合物Ⅰ～Ⅵ为首次从朝鲜产东北红豆杉树皮中分得，化合物Ⅵ为首次从该种植物中分得。
关键词: 朝鲜产东北红豆杉 ；紫杉烷类化合物 ；紫杉醇
被引量
4
摘要： 目的研究东北红豆杉Taxuscuspidata针叶中的化学成分。方法采用硅胶柱色谱及制备薄层色谱法分离、纯化化学成分,用一维和二维核磁共振技术鉴定化合物结构。结果从东北红豆杉针叶的甲醇提取物中分离出两个罕见的双重排紫杉烷内酯类化合物wallifoliol()和tasumatrolH()。结论此两种化合物为首次从东北红豆杉中分离得到,在氘代氯仿溶液中化合物在室温下可以转化成5α-乙酰基-2α-苯甲酰氧基-4α,7β,9α,13α,20-五羟基-11(15→1),11(10→9)双重排紫杉烷-11-烯-10,15-内酯()。
关键词: 东北红豆杉 ；紫杉科 ；双重排紫杉烷内酯
被引量
4
摘要： 东北红豆杉是国家一级保护植物,其针叶中含有紫杉烷二萜类化合物,具有较强的抗肿瘤活性。然而,东北红豆杉成分复杂,紫杉烷类化合物的结构相似且含量很低,对紫杉烷类化合物的高效提纯具有一定难度。因此,本文以东北红豆杉为原料,采用超声波提取法对东北红豆杉针叶、愈伤组织和悬浮细胞中的紫杉烷类化合物进行提取,并采用反溶剂重结晶法和制备型高效液相色谱法(PrepHPLC)对紫杉烷类化合物进行纯化,旨在建立一种高效提纯东北红豆杉中紫杉烷类化合物的方法,并获得高纯度的产物。紫杉烷类化合物对肺癌有着非常显著的疗效,但其作用机制尚不明确,本文采用网络药理学的方法对紫杉烷类化合物治疗肺癌的作用机制进行了解析。通过系列相关实验结果分析,主要的研究结论如下:1、超声波提取法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的高效提取(1)采用超声波提取法从东北红豆杉中提取紫杉烷类化合物(紫杉醇(PTX)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)、巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇(7-Xyl-10-DAT)、三尖杉宁碱(CEPH)、多烯紫杉醇、7-表紫杉醇),比较不同提取条件对目标化合物提取量的影响。Box-Behnken响应面试验得出最佳提取工艺如下:当液固比为20.88倍,超声功率为140.00 W,超声时间为47.63 min,溶剂中乙醇含量为83.50%时,针叶中紫杉烷类化合物的提取量达到最大值,为342.27μg/g±15.34μg/g。扫描电镜(SEM)结果表明:超声波提取后的针叶局部区域破损严重,出现孔隙。超声波提取后的愈伤组织和悬浮细胞的整体结构被破坏,形成细胞碎片。东北红豆杉成分复杂,建立的高效液相色谱法(HPLC)适用于快速有效地分离检测东北红豆杉中的紫杉烷类化合物。系统比较了东北红豆杉针叶、愈伤组织和悬浮细胞中紫杉烷类化合物的产量,通过悬浮细胞的培养提高了紫杉烷类化合物的产量。2、反溶剂重结晶法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的粗提纯(1)建立了反溶剂重结晶法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的粗提纯工艺。试验筛选出最佳的萃取剂为乙酸乙酯,最佳的重结晶溶剂为甲醇,最佳的重结晶反溶剂为水。Box-Behnken响应面试验得出了反溶剂重结晶法纯化东北红豆杉中紫杉烷类化合物的最佳工艺条件如下:当粗提物浓度为555.28 mg/m L,反溶剂与溶剂体积比为28.16倍,沉积温度为22.91℃,沉积时间为1.76 min时,紫杉烷类化合物的纯度达到最大值,针叶中紫杉烷类化合物的纯度为23.238%,悬浮细胞中紫杉烷类化合物的纯度为7.76%。扫描电镜(SEM)结果表明:反溶剂重结晶法可以有效降低东北红豆杉粗品的粒径,控制颗粒形貌。X射线衍射(XRD)实验表明:东北红豆杉粗提物的无定型态在重结晶过程中没有改变,始终保持在无定型态,拉曼光谱实验进一步证实了反溶剂重结晶法没有将东北红豆杉粗提物的结构改变。该重结晶方法可有效提高东北红豆杉中紫杉烷类化合物的纯度,适用于对紫杉烷类化合物的粗提纯。(2)采用电喷雾电离-高分辨质谱(ESI-HRMS)技术对东北红豆杉针叶和悬浮细胞重结晶产物进行化学成分分析,针叶重结晶产物主要检测出85种非紫杉烷类物质,主要为糖类、糖苷类、酯类、酮类、酸类、酚类、醇类物质以及生物碱。悬浮细胞重结晶产物主要检测出18种非紫杉烷类物质,主要为糖类、酯类、酮类、酸类、酚类物质以及生物碱。3、制备型高效液相色谱法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的精提纯建立了一种有效的制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)来纯化东北红豆杉中含量最高的两种紫杉烷类化合物(10-DAT和PTX)。在试验操作中,考察了流速、进样量和柱温对10-DAT和PTX纯度的影响,正交试验结果表明:当流速为10 m L/min,进样量为0.5 m L,柱温为30℃时,10-DAT和PTX的纯度达到最高,分别为95.33%和99.15%。通过SEM、HPLC和ESI-HRMS对纯化的终产物进行表征。结果表明:制备型高效液相色谱法能有效从东北红豆杉中纯化10-DAT和PTX,适用于对10-DAT和PTX的精提纯。4、基于网络药理学和分子对接探讨紫杉烷类化合物治疗肺癌的作用机制通过网络药理学和分子对接研究紫杉烷类化合物治疗肺癌的靶点、通路的作用机制。利用Pub Chem数据库确定紫杉烷类化合物的靶点,构建有效成分-靶点网络。利用Gene Cards数据库确定肺癌的疾病靶点,获取药物靶点与疾病靶点的交集,对交集靶点进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析,筛选出核心靶点,并对紫杉烷类化合物与核心靶点之间的亲和力进行分子对接验证。结果表明:紫杉烷类化合物共有444个靶点,与肺癌疾病靶点映射后共获得131个交集靶点。PPI分析得到的核心靶点为TP53、EGFR、AKT1。GO生物功能富集分析获得1795个生物过程(BP)条目,101个细胞组分(CC)条目,164个分子功能(MF)条目。KEGG通路富集分析获得179条信号通路,筛选出前20条信号通路,主要为癌症信号通路、癌症中的蛋白聚糖通路、癌症中的微小RNA通路等。分子对接结果表明:紫杉烷类化合物与TP53、EGFR、AKT1靶点的分子对接结合能均≤-8.8 kcal/mol,紫杉烷类化合物通过癌症信号通路、癌症中的蛋白聚糖通路、癌症中的微小RNA通路作用于TP53、EGFR、AKT1靶点,在蛋白结合、酶结合、相同蛋白结合等生物功能中发挥治疗肺癌的作用。
关键词: 东北红豆杉 ；紫杉烷类化合物 ；高效提纯 ；分离 ；网络药理学
被引量
3
摘要： 红豆杉属(Taxus)是当今世界上公认的濒临灭绝的一种野生珍稀植物,因含有高效抗癌物质紫杉醇(Paclitaxel)而倍受瞩目。紫杉醇现已被广泛用于治疗多种癌症并取得显著效果,也因此使红豆杉种群遭到严重的人为破坏。在现有阶段,由于野生资源的匮乏,人工培育红豆杉成为一个红豆杉作为中药资源发展的整体走势。山东省境内的红豆杉种植初具一定的规模和研究价值,但是目前有关研究较少。因此,本文以山东省威海市荣成天一红豆杉种植园培育的红豆杉作为研究对象,从其外部基源、化学成分、种内变异以及其水提液(根据临床应用汤剂口服给药途径)安全性评价的方面进行实验,以期为山东威海红豆杉达到中药临床应用标准提供理论依据。1.对山东威海红豆杉进行基源鉴定以及茎叶组织横切面的显微观察;采用薄层色谱、液相色谱-质谱联用技术分别对山东威海红豆杉的紫杉醇成分进行定性和定量分析。山东威海红豆杉与现有红豆杉研究结果存在性状差异,这主要是因为红豆杉的遗传变异和生长环境存在一定的关系。薄层色谱结果显示,在展开剂为三氯甲烷和甲醇12:1(v:v)的实验条件下,样品的Rf值为0.6,该点证明山东威海红豆杉提取物中存在紫杉类化合物。液相色谱-质谱联用实验结果显示山东威海红豆杉树皮、茎、叶内的紫杉醇浓度分别为38.838 mg/kg、0.482 mg/kg、5.082 mg/kg。本部分实验为红豆杉内主要药用成分紫杉醇的高效分离纯化提供新方法和思路,也完成对山东威海红豆杉的紫杉醇的定性定量实验,结果表明不同地区不同部位的紫杉醇含量存在显著差异,这为山东威海红豆杉的中药临床应用与合理开发提供科学依据。2.通过DNA分子遗传标记技术,确定核基因ITS序列和叶绿体基因trnL-F序列对于红豆属植物的鉴别能力,以及对山东威海红豆杉的亲缘关系远近做出初步判断。本部分实验发现红豆杉ITS序列相对于trnL-F序列存在略为丰富的遗传变异,前者的鉴别能力存在相对优势;根据K2P模型以及对比分析ITS与trnL-F构建的NJ树和ML树后,发现山东威海红豆杉与东北红豆杉和曼地亚红豆杉均具有较高支持率,初步确定山东威海红豆杉与东北红豆杉和曼地亚红豆杉有较近的亲缘关系。本部分研究旨在为不同种红豆杉植物作为中药材的鉴别提供一种快速有效的鉴定方法,对山东威海红豆杉的亲缘关系初步鉴定可为后续探究影响近缘红豆杉中药品质变异的生态因子提供理论依据。3.为山东威海红豆杉做出安全性评价,本研究以大鼠与小鼠设计动物模型进行急性毒性实验和亚慢性毒性实验;通过研究受试动物的血液学常规、血液生化学各项指标及病理组织学切片,确定山东威海红豆杉水提液经口服给药途径时的临床治疗指数范围。在14 d连续给药的急性毒性实验中,给药剂量为水提液组17.50 g/kg时,小鼠死亡率为10%,即水提液组的LD50远大于17.50 g/kg,该部分研究结果显示在一定剂量范围内,山东威海红豆杉安全性可控,按照国际标准可判为低毒。亚慢性毒性实验中,在30 d给药期内大鼠体重无明显变化,给药剂量最高为7.40 g/kg时,也未出现毒性现象或者动物死亡现象;血液学生化指标出现少部分生物化学参数变化记录,但不具有给药剂量依附性。对比实验组和对照组的病理组织切片观察发现山东威海红豆杉实验组未出现明显的病理性改变。通过亚慢性毒性实验研究,证实红豆杉提取物的毒性小,为临床安全用药提供理论依据。
关键词: 山东威海红豆杉 ；紫杉醇含量 ；DNA分子遗传标记 ；毒性实验 ；安全性评价
被引量
3
摘要： 东北红豆杉(Taxus Sieb.et Zucc.)为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物,广泛分布于我国东北地区长白山一带及俄罗斯,朝鲜和日本。但是东北红豆杉自然种群生境破碎化严重,现存种群规模极小,为濒危物种。目前关于东北红豆杉的研究主要集中在其化学成分、生理生态以及繁殖培育等几个领域,而关于造成其濒危的遗传机理研究较少。本文通过双亲遗传的限制性酶切位点相关的 DNA 测序(Restriction site-associated DNA sequencing,RADseq,又称简化基因组测序)对东北红豆杉进行种群遗传学和景观基因组学分析。首先使用Taqa I+MseI两种酶对26个居群共179个个体中提取的高质量东北红豆杉DNA进行酶切建库,然后对其进行简化基因组测序,通过对原始序列质量控制分析和过滤,得到31,343个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点信息。其次通过基于遗传分化(FST)的异常值检测(BAYESCAN)和基于等位基因频率与环境梯度相关的异常值检测(LFMM)等挑选出了受到选择的单核苷酸多态性位点,并将基于FST挑选出的受方向性选择的SNP位点摘取出来作为异常值SNP数据(其中所有种群检测出184个SNP,自然种群检测出158个SNP)用于种群遗传学分析。通过对东北红豆杉进行种群遗传学分析发现,东北红豆杉遗传多样性高,种群遗传分化低(FST=0),种群间没有明显的遗传结构。利用森林梯度模型(Gradient Forests,GF)分析东北红豆杉遗传变异对环境梯度的响应模式,结果表明,地理因素是对东北红豆杉遗传变异影响最大的因素,最寒冷季节的温度对遗传变异的影响相对大于其他气候因子。本文通过针对东北红豆杉遗传机理研究提出了合理的保护策略:对东北红豆杉种群的保护要重点关注其遗传多样性高的种群,此外还要加强对东北红豆杉原生境的保护,维持其频繁的基因交流。
关键词: 东北红豆杉 ；单核苷酸多态性 ；种群遗传学 ；简化基因组测序 ；景观基因组学
被引量
7
摘要： 东北红豆杉(Taxus cuspidata)是我国珍稀濒危植物和极小种群保护物种,也是提取抗癌药物紫杉醇的珍贵植物资源,因此东北红豆杉的保护和利用备受关注。目前有关东北红豆杉的研究主要集中在化学成分分析、药用物质提取、人工繁殖培育等方面,其基础生态学方面的研究较薄弱。为此,本文以吉林省汪清自然保护区杜荒子林场头道沟内天然东北红豆杉种群为研究对象,通过野外实地种群调查、定株物候观测、监测雌雄球花生长发育过程等途径探索东北红豆杉种群数量动态及其有性繁殖特征。主要采用种群数量统计、静态生命表、生存函数分析法进行东北红豆杉种群现状分析,以及通过形态特征描述、统计、单因素方差分析、一元线性回归和多元回归模型拟合等方法分析东北红豆杉有性繁殖特征及其影响因素。研究结果表明:1.杜荒子林场头道沟天然东北红豆杉分布数量多,种群幼苗储备量少,死亡率高,成年植株较多并有相对稳定的死亡率。该天然种群倾向于下降型种群结构,更接近Deevey Ⅱ型存活曲线。2.东北红豆杉雄株开花物候期较短,一般从4月初萌动到5月底完全凋落历时约2个月,球花快速生长期在4月中旬和下旬,散粉期在4月下旬到5月初,历时约15～20天。雌株胚珠生长期较长,从4月萌动到10月初种子完全掉落历时约6个多月,授粉期在4月下旬到5月初,胚珠在6～7月生长速度最快。雌雄花之间不存在花期不遇。3.东北红豆杉树冠中层的雌雄球花数量显著高于树冠下层的雌雄球花数量(P<0.01),雌株在水平方向东和南方向的球花数量显著高于西和北方向的球花数量(P<0.01),雄株在水平四个方向上无显著差异(P>0.05)。4.在自然环境下,光照强度、温度、湿度等微气候因子对东北红豆杉雌球花数量分布有影响,其中光照和温度对雌球花数量作用显著(P<0.05),各微气候因子对雄球花数量分布无显著影响(P>0.05)。综上所述,杜荒子林场头道沟天然东北红豆杉种群属于下降型种群结构,种群结构不合理,需要进行种群恢复。东北红豆杉雌雄株之间不存在花期不遇,4月下旬到5月初是东北红豆杉传粉受精关键时期。微气候因子会影响东北红豆杉雌球花数量分布,从而影响东北红豆杉有性繁殖过程。
关键词: 东北红豆杉 ；种群特征 ；物候 ；球花 ；微气候
被引量
4
摘要： 东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb.et Zucc)作为世界上公认的天然珍稀抗癌植物,其内生菌是非常重要的微生物资源,对抗癌药物紫杉醇及紫杉烷类化合物的开发有着重要的价值,是重要的天然产物来源。抗生素是抗感染治疗和防治感染性疾病不可缺少的重要药物,用于抑制(抑菌)细菌生长或杀死它们(杀菌)。根据其抑菌或杀菌效果功效,将其归类为窄谱或广谱抗生素。在医药、农业畜牧业上都有着应用,极大的改善了人类生活。但是抗生素不仅在医药界被广泛滥用,在农业和畜牧业中的滥用问题也十分严重,这导致耐药性菌株的出现、抗生素残留及抗生素污染已经成为了全人类面临的严峻问题。内生真菌的代谢产物是新型化合物和药理学的潜在来源,能够帮助人类解决抗生素的耐药性、植物遭遇病虫害侵袭以及动物的健康等问题,因此分离筛选具有抗菌作用的内生真菌具有重要意义。本实验研究材料为保存于森林植物生态学教育部重点实验室的东北红豆杉内生真菌,对其发酵液萃取物进行抑菌活性分析;将活性菌株进行系统鉴定;将其萃取物成分进行初步分析;以抑菌活性为指导,使用制备薄层色谱法对萃取物抗菌活性成分进行分离纯化,并进行了结构鉴定。主要研究方法如下:1、以课题组前期分离的东北红豆杉内生真菌菌株为材料,为筛选得到抗菌活性菌株。将内生真菌液体发酵培养,通过溶剂萃取法提取发酵液代谢产物粗提物,以8株常见致病菌作为指示菌,使用滤纸片扩散法,筛选具有抗菌活性的菌株。结果有12株具有抗菌活性的内生真菌,其中J6号菌抗菌活性最好,对8种常见致病菌均有抗性且抗菌活性优于硫酸卡那霉素。根据形态学观察,结合分子生物学方法鉴定J6菌株为曲霉属烟曲霉Aspergillus fumigatus,命名为烟曲霉J6(Aspergillus fumigatus J6)。2、以东北红豆杉内生真菌烟曲霉J6为供试菌,考察其对8种植物病原真菌的抑制作用。首先对其代谢产物主要抗菌成分所在最佳极性部位进行了确定,以石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)和正丁醇(NBA)三种不同极性溶剂作为萃取溶剂,通过HPLC分析其化合物丰富度并对抗菌活性进行比较,选取EA作为发酵液的最佳萃取溶剂;确定活性成分所在极性部位后,对内生真菌J6的发酵时间进行考察,对其生物量和代谢产物量的增长分析,并且结合HPLC确定J6菌株最佳发酵培养时间为8 d;最后通过加药培养基的方法,检验对内生真菌J6代谢产物粗提物对植物病原真菌的抑制作用,结果显示烟曲霉J6代谢产物对8种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。3、对烟曲霉J6内生真菌的代谢产物粗提物进行初步分析。通过GC-MS对其中挥发性成分进行分析,结果显示可能含有两种具有活性的物质,分别为六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和环(脯氨酸-亮氨酸)二肽;通过UPLC-orbitrap-MS/MS方法分析其非挥发性物质,根据mzcloud数据库比对分析,匹配度≥90且具有活性的物质共有9个,其中有4种哌嗪二酮类化合物和1个环酯肽类抗生素,具有抗菌等活性;并且通过分子生物学方法证明了内生真菌J6中含有NRPS与PKS基因,可能与抗菌活性成分的合成有关。证明了该菌株有巨大的开发研究潜力。4、通过薄层色谱法,以抑菌活性为指导对内生真菌烟曲霉J6代谢产物粗提物进行分离鉴定。摸索化合物分离条件,然后大量发酵萃取得到粗提物,用制备薄层色谱板进行物质的分离,以抗菌活性为指导确定活性部位。本研究共得到了五个有活性的部分,采用HPLC和紫外光谱对其纯度进行分析,获得单体化合物,采用红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱和质谱等技术进行化合物的结构鉴定,结果为已知哌嗪二酮类化合物二(甲硫基)焦霉毒素(Bisdethiobis(methylthio)gliotoxin)。其余纯度不够的物质需通过柱层析等技术手段方法进行更细化的分离。综上所述,本文从东北红豆杉内生真菌中筛选得到了一株高活性广谱抗菌的菌株烟曲霉J6(Aspergillus fumigatus J6),验证了其对8种常见致病菌和8种植物病原真菌的抑制作用;初步分析了内生真菌J6的发酵液提取物的化学成分;并且通过制备薄层色谱法分离并鉴定出了一种抗菌活性单体化合物,为二(甲硫基)焦霉毒素(Bisdethiobis(methylthio)gliotoxin),这是首次从东北红豆杉内生真菌中分离出此化合物。本研究发现了一株有巨大开发潜力的内生真菌菌株,为天然开发新型抗生素和生防治剂提供了新的可能和微生物物质基础。
关键词: 东北红豆杉 ；内生真菌 ；抗菌活性 ；制备薄层色谱法 ；代谢产物
摘要： 红豆杉科红豆杉属植物分布于北半球,全世界约有11种,我国有4种和1变种,分别是西藏红豆杉,云南红豆杉,红豆杉,东北红豆杉和南方红豆杉(美丽红豆杉)。 早在1856年国外就曾从浆果红豆杉的叶中提得粉末状碱性成分。到1971年又从短叶红豆杉的树皮中分离出紫杉醇,药理实验表明该成分具有较强抗癌活性。之后,中国、美国等医药专家对红豆杉属植物化学成分进行了深入的研究,共分离得90多种化学成分,其中58种属于紫杉烷类二萜和生物碱,都程度不同的具有抗癌活性。到1992年,紫杉醇成为美国治癌专利药品,1995年在中国获得卫生部新药证书,其价值高达80-100万美元/公斤。
关键词: 红豆杉属植物 ；紫杉醇 ；抗癌活性 ；云南红豆杉 ；美丽红豆杉 ；南方红豆杉 ；开发利 ；组织培养 ；西藏红豆杉 ；紫杉烷
摘要： 东北红豆杉(Taxus cuspidata)属红豆杉科红豆杉属,主要生长于中国东北地区、日本、朝鲜和俄罗斯。由于其天然种质遭到极大程度的破坏,现存种群规模极小,已被我国列为珍稀濒危保护植物。东北红豆杉不仅能提取良好的抗癌药物紫杉醇,其材质坚硬,树形美观,即是高质量的用材树种又是珍贵的绿化树种。近年来,众多学者的研究热点主要在于东北红豆杉的繁育特性、生理特点以及其内在的化学成分,而对东北红豆杉在栽培条件下的变异及其遗传机理研究尚不完善。本研究通过利用SLAF-seq测序技术,构建了东北红豆杉的SLAF文库,获取了大量的SLAF标签和SNP位点,分析了东北红豆杉的遗传多样性,分析品种之间的亲缘关系;同时针对东北红豆杉存在形态变异,对其种源、叶片颜色及大小、果实颜色及大小、叶密度、分枝强度、种子被假种皮包裹位置等主要性状进行分析,为东北红豆杉的遗传改良提出可供参考的必要理论依据。本研究获得以下主要结果:1.实验选择Hin CII酶切东北红豆杉基因组,将日本水稻晴作为对照组,利用Illumina测序平台对61份东北红豆杉实验样本进行了测序。本实验获得1 788 524个SLAF标签,标签的平均测序深度为11.20x。其中,多态性SLAF标签有470 725个,共获得3 084 611个SNP标记。2.61份东北红豆杉样本材料群体遗传结构分析。观测等位基因数、期望等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、Nei's多样性指数、香浓指数、多态性信息含量范围分别为:2、1.5636～1.6538、0.2391～0.4074、0.3315～0.3756、0.3414～0.4133、0.5019～0.5557、0.2672～0.2983;都高于红豆杉属(Taxus)植物的2、0.3015、0.2320、0.3015、0.3043、0.4657、0.2460。表明东北红豆杉个体遗传多样性高于红豆杉属种群水平。3.对61份东北红豆杉材料遗传多样性分析和PCA分析,绘制系统发育树,将61份样品分成2组,与交叉验证后的K值为2和主成分坐标分析结果一致。4.形态变异分析研究得出12份东北红豆杉材料主要来源于野生东北红豆杉、日本红豆杉和韩杉。对叶片分析结果显示,叶片颜色由深至浅依次为日本红豆杉,韩杉,野生东北红豆杉;叶片长度依次为野生东北红豆杉,韩杉,日本杉;分枝强度依次为日本杉,韩杉,东北杉。三大品系中都存在叶片颜色突变体-黄金杉。对果实分析结果显示,野生东北红豆杉果实最大,其次为韩杉,最小是日本红豆杉;日本红豆杉果实密度最大,其次是韩杉,东北红豆杉果实密度最小。初步分析,果实大小与果实密度呈负相关。东北红豆杉的果实颜色多为鲜红色,但调查中发现在韩杉系列中出现果实颜色变异为金黄色的个体,称为黄果红豆杉;东北红豆杉种子深陷假种皮内,日本红豆杉多数露出假种皮,但非稳定特征。
关键词: 东北红豆杉 ；遗传多样性 ；形态变异
被引量
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摘要： 红豆杉属植物作为世界56种濒危珍稀药用植物之一,化学成分类型丰富,其中特征性和主要活性物质紫杉烷二萜具有抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌、抗惊厥、抗血小板聚集、抗阿尔茨海默症等多方面药理作用。2017年Nguyen H X等发现其还具有优越的降糖活性。欧洲红豆杉(Taxus baccata L.)为红豆杉科红豆杉属植物,主要分布于欧洲各国,是紫杉醇原料药的一大来源。鉴于近五年国内外对欧洲红豆杉的研究空白,且暂无国内栽培品种的相关报道,本文对国内栽培欧洲红豆杉工业下脚料的化学成分和药理活性展开系统研究,合理利用植物资源,并进一步为新药开发提供科学依据。利用柱层析、薄层层析,重结晶、高中压制备色谱等分离纯化手段,HR-ESI-MS、NMR、IR等波谱技术从欧洲红豆杉下脚料中共分离鉴定21个单体化合物,其中包括3个新化合物(1-3)和18个已知化合物(4-21),分别为Liangxiaotane(1)、Baccataxinine(2)、Baccalignan(3)、紫杉宁B(Taxinine B,4)、O-cinnamoyltaxicin I(5)、Ocinnamoyltaxicin I triacetate(6)、紫杉宁(Taxinine,7)、Decinnamoyltaxinine E(8)、紫杉宁E(Taxinine E,9)、1β,2α,9α-Trihydroxy-10β-acetoxy-5α-cinnamoyloxy-3,11-cyclotaxa-4(20)-en-13-one(10)、5-O-cinnamoyl-9-O-acetylphoto-taxicin I(11)、1-Hydroxyltaxuspine C(12)、紫杉欧吉酚(Taxagifine,13)、东北红豆杉素(Taxacin,14)、Taxchinin B(15)、Taxin B(16)、紫杉平W(Taxuspine W,17)、2α,7β,13α-Triacetoxy,5α,9α-dihydroxy-2(3→20)abeotaxa-4(20),11-dien-10-one(18)、紫杉醇(Taxol,19)、山萘酚(Kaempferol,20)、槲皮素(Quercetin,21)。化合物1是自然界发现的第一个具有螺环结构的紫杉烷二萜类新骨架化合物,6/8/6型紫杉烷二萜化合物2的C1-C2位存在1,3-二氧戊烷环,化合物3是一个苯并呋喃类新木脂素。此外,已知化合物8-10,15,16和18为首次从该植物中分离得到。采用Nguyen H X报道的方法在体外测试了化合物1-19对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,结果表明均无明显的抑制活性。采用MTT法检测了化合物1-3对肿瘤细胞HCT116和MCF-7的细胞毒活性,结果表明均无明显活性。
关键词: 欧洲红豆杉 ；紫杉烷二萜 ；生物活性
被引量
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摘要： 第一部分萜类化合物抗肺癌活性筛选 萜类化合物紫杉醇(Taxol?)是美国学者Dr. Wall最早于1971年从太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到的萜类抗肿瘤活性成分,1992年美国FDA批准了紫杉醇用于卵巢癌的治疗,1994年又批准其用于乳腺癌的治疗,此后,紫杉醇很快应用于多种常见恶性肿瘤,并取得了显著的疗效,成为抗癌的主要明星药物,引起了肿瘤界的极大关注和期望。但是,紫杉醇取自红豆杉的树皮,红豆杉全世界仅有11种,分布范围狭窄,生长极为缓慢,加上紫杉醇在树皮中的含量很低,这就大大地限制了紫杉醇的开发利用。为此,本实验对多种植物来源的萜类化合物进行了抗肺癌活性筛选,目的是寻找有效的植物来源抗癌成分,以缓解紫杉醇对环境资源的破坏以及紫杉醇来源受限的局面。 目的:为了缓解紫杉醇供不应求的局面,寻找到活性更强毒性更小的化合物,本研究对东北红豆杉和加拿大红豆杉可再生针叶中提取纯化得到的16种非紫杉醇二萜类化合物为对象,对人肺肿瘤细胞增殖抑制活性进行了筛选,并进行了肿瘤细胞增殖抑制活性和结构之间构-效关系的探讨。同时为了扩大药源,筛查更多的有效抗癌成分,本研究还对来自菊科植物中的18种倍半萜类化合物进行了抗肺癌肿瘤细胞的活性筛选。 方法:应用MTT比色法进行活性筛选。细胞接种于96孔板,每孔含1×104个细胞,分别加入溶剂对照(终浓度0.1% DMSO)、阳性对照顺铂和各种实验用化合物,终浓度为100μmol/L、10μmol/L和1μmol/L,每组设3复孔,置于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h,各培养孔加入5 mg/mL MTT 10μL。实验终止测定各孔吸光度值(OD值),测定波长λ= 570 nm,参考波长λ= 630 nm,并计算细胞增殖抑制率或存活率。细胞增殖抑制率(%)=(1-给药组OD值/对照组OD值)×100;细胞存活率(%)=(给药组OD值/对照组OD值)×100;实验用化合物对肿瘤细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合,计算实验用化合物的半数抑制浓度(IC50)值。 结果:34种萜类化合物抑制人肺肿瘤细胞的增殖活性的筛选结果为:二萜类化合物taxinine (3)对实验用五种人肺肿瘤细胞的增殖均有较强的抑制活性,其中对A549细胞的增殖抑制率在浓度为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L时分别为23.81 %,60.40 %和90.18 %;2α,10β-diacetyl-5- cinnamoyl-phototaxicin II (12)和taxuspine A (16)除对RERF-LC-KJ细胞外的四种人肺肿瘤细胞的增殖均有较强的抑制活性,其中化合物12对A549细胞的增殖抑制率在浓度为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L时分别为18.31%,48.73%和68.19%;化合物16对A549细胞的增殖显示较强的抑制活性,半数抑制浓度(IC50)为9.54μmol/L。倍半萜内酯类化合物17 (异土木香内酯)、22 (泽兰内酯)、23 (3β,9β-diacetoxy- 1β,10α-epoxy-11α,13- dihydrocostunolide)、29 (achillinin A)和30 (dehydrocostuslactone)对三种人非小细胞肺肿瘤细胞的增殖均显示较强的抑制活性,化合物32 (dihydrodehydro-costuslactone)对QG-56细胞的增殖抑制率为90.75%;化合物22、23、29和30对人小细胞肺癌PC-6细胞的增殖均显示较强的抑制活性,化合物17、22、23、29和30对人小细胞肺癌QG-90细胞的增殖显示较强的抑制活性。 小结:从东北红豆杉和加拿大红豆杉中提取的3种二萜类化合物和从菊科植物中提取的5种倍半萜类化合物对人肺肿瘤细胞具有较强的增殖抑制活性;人肺肿瘤细胞的增殖抑制活性不仅与紫杉烷类化合物的骨架结构密切关系,而且该类化合物的抑制人肺肿瘤细胞增殖活性可能还与C-5位具有的肉桂酰基侧链密切相关。 第二部分异土木香内酯体内外抗癌活性及构-效关系研究 菊科植物在我国资源丰富,富含倍半萜类化学成分,其结构类型多,具有多种生物活性。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花属植物,为多年生草本,从土木香中提取的单体化合物异土木香内酯,具有抗结核、抗炎和抗肿瘤的效果。 目的:为较系统地研究异土木香内酯的抗肿瘤活性,并探讨异土木香内酯抗瘤活性与结构的关系,本实验室采用体外培养的人小细胞肺肿瘤细胞株和人非小细胞肺肿瘤细胞株以及人多种其他器官由来的肿瘤细胞株对从土木香的根中纯化的六种倍半萜内酯化合物进行了体外增殖抑制实验。为探讨其对正常细胞的毒性作用,应用MTT法对正常仓鼠肺成纤维细胞(CHL)抗增殖活性进行观察,并构造裸鼠人肺癌A549移植性肿瘤模型,观察异土木香内酯体内抗瘤活性及对体重和免疫器官脾的影响。 方法:采用MTT比色法观察异土木香内酯对人多器官由来的肿瘤细胞及CHL的增殖抑制活性,具体方法与第一部分相同。利用人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤动物模型,检测异土木香内酯体内抗人肺癌的效果。选取6-8周龄,体重18-22 g之间雌性裸鼠,接种人肺腺癌细胞A549于裸鼠右前腋下,1周后肿瘤平均达6×6 mm,随机分为5组,每组6只。空白对照组:按照0.1 mL /10 g体重腹腔注射生理盐水。阳性对照组:给予顺铂干预,2 mg/ kg体重给药,连续腹腔注射7天。实验组为异土木香内酯,灌胃给药,分为实验低剂量组:1 mg/ kg体重给药;实验中剂量组:10 mg/kg体重给药;实验高剂量组:100 mg/ kg体重给药;连续给药10天。于给药后12天脱颈处死裸鼠,迅速剥离瘤块及脾脏,称重记录。按照公式:肿瘤抑瘤率=(1-给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重)×100%,计算药物抑瘤率。按照公式:脾指数=平均脾重/平均体重×1000,计算脾指数。 结果:异土木香内酯作用于人肺癌细胞株,具有较强的抗细胞增殖作用,对人非小细胞肺癌细胞A549和QG-56增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为3.01μmol/L和9.39μmol/L,对人小细胞肺肿瘤细胞(PC-6和QG-90)的增殖抑制作用与阳性对照顺铂相同,与空白对照组比较有显著差异(p<0.05)。异土木香内酯对人脑神经胶质瘤细胞U251SP细胞增殖的IC50为10.55μmol/L,对人肝癌细胞株HLE和人黑色素瘤细胞株MM1-CB细胞的增殖均显示明显抑制作用,化合物2-Hydroxy-11,13- dihydroxy-isoala ntolactone (20)、11α,13-Dihydroxyisoal anto-lactone(21)、2α-hydroxy- 11α,13-dihydroisoalantolactone(25)、britannila ctone(27)和1-O-acetylbritanni lactone(28)对本实验用细胞的增殖不显示抑制活性,IC50均大于100μmol/L。用100μmol/L异土木香内酯处理CHL细胞,对其增殖的抑制率为46.33%,异土木香内酯对CHL的IC50大于100μmol/L。 体内抗人肺癌裸鼠模型实验,于实验结束后处死裸鼠剥取瘤重,称取体重。空白对照组平均体重27.5 g,平均瘤重0.53 g;阳性对照顺铂组平均体重为26.5 g,平均瘤重0.42 g;异土木香内酯高剂量组(100 mg/kg)、中剂量组(10 mg/kg)、低剂量组(1 mg/kg)平均体重分别为26.6 g、27.0 g和27.2 g;平均瘤重分别为0.38 g、0.44 g和0.47 g。抑瘤率分别为:顺铂组20.8%,实验药物高剂量组为28.3%,中剂量组为17%,低剂量组为11.4%。各组的裸鼠模型脾指数分别为:空白对照组5.81,顺铂组3.37,异土木香内酯高剂量组5.19,中剂量组6.51,低剂量组5.12。 小结:异土木香内酯具有明显的抗多种恶性肿瘤细胞增殖活性,并具有浓度依赖性;异土木香内酯具有明显的体内抗瘤活性,一定浓度下其抑瘤效果优于顺铂,并对体重和脾脏没有明显的损伤作用;异土木香内酯对仓鼠肺成纤维细胞的增殖抑制作用低于顺铂;异土木香内酯活性与其具有的α,β-不饱和五员内酯环的结构有关,不饱和的环外双键氢化饱和后形成饱和五员内酯环,可能是抗肿瘤活性消失或减弱的原因,A-环开环可能是导致其体外抑制肿瘤细胞增殖作用消失或减弱的另一原因。 第三部分异土木香内酯抗肺癌作用机制研究 离体和在体实验均已证明,许多抗癌药物均可对不同类型的敏感瘤细胞诱导凋亡,临床上应用的放疗、热疗以及一些生物治疗的目的也主要是引发细胞凋亡。中国传统药物中最近发现很多成分具有抗瘤作用,并且报道发现,这些成分多通过诱导细胞凋亡而发挥作用。基于此,本实验对异土木香内酯的抗瘤活性机制进行了研究。 目的:在发现异土木香内酯对肺癌细胞具有明显抗增殖活性的基础上,首先对其是否引起肺癌细胞凋亡进行了研究,并对其作用于肿瘤细胞引起的细胞因子变化进行了探讨,以明确异土木香内酯的抗肺癌活性机制。 方法:1.吖啶橙(acridine orange, AO)染色观察凋亡形态变化。用终浓度为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L异土木香内酯处理A549细胞,48 h后弃去培养液,滴加吖啶橙工作染液染色,荧光显微镜下用紫蓝光激发滤片,观察,拍照。2.流式细胞术(flow cytometry, FCM)观察异土木香内酯作用A549细胞后凋亡情况和细胞周期变化。用直径100 mm的培养皿培养A549细胞,1×106个,三枚加入异土木香内酯,终浓度为20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L,一枚为对照组。继续培养24 h后,胰酶消化后收集细胞,加入10%鸡红细胞作为内参标准,与样品同步染色,加入碘化丙啶一步插入DNA荧光染色,以500目铜网过滤,采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪进行DNA检测。3. DNA Ladder技术观察凋亡DNA片段。用直径60 mm的培养皿培养A549细胞,3×105个,一枚为对照组,三枚加入异土木香内酯,终浓度为5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。继续培养48 h后,收集全细胞,细胞裂解液裂解细胞后用酚氯仿法提取DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,50V,2 h。DNR MiniBIS Pro照相系统拍照。4. Western Blotting技术观察异土木香内酯作用肺癌细胞后7种蛋白因子Caspase-3、Bax、Bcl-2、HSP、Akt、P53及P21变化。用直径100 mm的培养皿培养A549细胞,1×106个,一枚为对照组,一枚加入顺铂,终浓度为20μmol/L,四枚加入异土木香内酯,终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L。化合物作用人肺癌细胞48 h后,收集全细胞。裂解细胞后,聚丙烯凝胶电泳,牛奶封闭,转膜,依次与一抗和二抗孵育,化学发光,显影。5.利用MTT法,检测了半胱天冬酶抑制剂对异土木香内酯抑制人肺癌细胞增殖的翻转作用。使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的异土木香内酯处理A549细胞,加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与土木香内酯共同孵育48 h后,MTT法测定OD值。 结果:1.吖啶橙染色显示,经异土木香内酯作用后的A549细胞,细胞数目减少,核染色质浓缩,细胞膜皱缩,并形成凋亡小体。2.经异土木香内酯处理A549细胞后,与对照组相比,凋亡峰随浓度升高而逐渐增加,异土木香内酯在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L浓度时凋亡细胞比率分别为0.85%、0.82%、6.59%和15.32%。细胞周期分析显示,随异土木香内酯浓度升高,G1期细胞数随之升高,其他各期细胞数随之降低,异土木香内酯在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L浓度时处于G1期细胞比率分别为33.
关键词: 红豆杉 ；土木香 ；萜类化合物 ；抗肿瘤活性 ；肺癌 ；凋亡
被引量
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摘要： 本论文包括两个部分,第一部分为曼地亚红豆杉愈伤组织化学成分研究;第二部分为喜树碱生物合成中间体分离。 第一部分:曼地亚红豆杉愈伤组织化学成分研究 紫杉醇是从红豆杉中分离得到的广谱高效抗肿瘤紫杉烷二萜,因具有独特的作用机制和复杂的化学结构而成为热点分子,并直接导致了红豆杉属植物化学成分研究高潮。曼地亚红豆杉(Taxus ×media)是红豆杉科红豆杉属植物,为东北红豆杉((?))和欧洲红豆杉((?))的天然杂交种,是一种十分有潜力的紫杉醇提取材料。截至2020年,从红豆杉属植物中分离鉴定的紫杉烷二萜类化合物已高达700余种,然而曼地亚红豆杉的化学成分却少有研究。同时,人工诱导培养的植物愈伤组织因其与自然环境不同的生长环境和生理状态,具有形成新颖结构紫杉烷二萜的潜力。基于上述两个原因,本论文选择曼地亚红豆杉愈伤组织为研究对象,对其化学成分进行研究。 利用多种分离纯化手段从曼地亚红豆杉愈伤组织中得到17个紫杉烷二萜类化合物,其中8个为新化合物,包括结构新颖的4-羰基-20-降碳yunnanxane、sinenxan C和sinenxan B(Tm1-Tm3)、两个罕见位点(2位,16位)羟基化的sinenxan C(Tm4,Tm5)、4,20-环氧sinenxanC(Tm6)、9-乙酰氧基/5-去乙酰sinenxan B(Tm7,Tm8);已知化合物9个,包括9-乙酰氧基/2-去乙酰/5-去乙酰 sinenxan A(Tm9-Tm11)、4,20-环氧sinenxanA(Tm12)、9-乙酰氧基sinenxan C(Tm13)、10-去乙酰sinenxan C/yunnanxane(Tm14,Tm15)和14位取代基团为2'-羟基-3-甲基丁酰氧基的sinenxan D/E(Tm16,Tm17)。新化合物平面结构和绝对构型由1D NMR、2D NMR、HRESIMS和X-ray单晶衍射技术(Tm1,Tm2,Tm4)确定,已知化合物通过核磁数据文献比对确定。这些化合物是曼地亚红豆杉愈伤组织中大量存在的Sinenxan A/B/C和Yunanxane的不同程度氧化或乙酰化的类似物,或是14位取代基团不同的类似物。体外药理学评价结果显示mediataxaneD(Tm4)对人宫颈癌细胞系具有较强毒性(HeLa,IC50=4.5μM),对人胃癌、肾癌细胞系具有中等毒性(BGC823,IC50=15.3 μM;Ketr3,IC50=18.6 μM)。上述结果表明,植物愈伤组织是一个非常有潜力的新颖结构或活性天然产物来源。 第二部分:喜树碱生物合成中间体分离 喜树(Camptothecaacuminata Decne.)为蓝果树科喜树属落叶乔木,是我国的特有物种,广泛分布于长江流域及西南各省。喜树具有极高的药学应用价值,从中分离得到的喜树碱和其化学衍生物是目前常用的抗肿瘤药物。喜树碱因其独特的作用机制、特征的化学结构和显著的临床应用价值,成为备受关注的热点分子。然而,喜树碱来源问题已经成为限制其发展的关键因素之一:植物提取虽然简便易行成本低,但有周期长和土地资源占用量大等问题;化学合成虽可大规模生产,但也有污染大和成本高的弊端。合成生物学技术的发展,为高效、绿色、可持续地获取喜树碱提供了新策略。然而喜树碱生物合成途径尚未解析,主要原因之一是其核心生物合成过程不清晰,中间体底物结构不明确。早期对产喜树碱植物(喜树、短小蛇根草等)的化学成分研究提示了喜树碱的生物合成过程可能由异胡豆苷酸到异长春花苷内酰胺,经环骨架重排形成短小蛇根草苷,再到脱氧短小蛇根草苷,经D环芳构化形成喜树碱苷,之后经多步反应生成喜树碱。但仍有一些关键过程缺少中间体,例如D环芳构化的过程和21位糖基脱去的节点等。因此,在生源途径假设导向下对喜树中化学成分进行定向分离,寻找可能的CPT生物合成中间体,是喜树碱的完整生物合成途径解析和异源合成的重要前提条件,对最终实现其高效、绿色、可持续生产具有重大意义。 针对喜树碱类似物具有的特征性紫外吸收,采用HPLC-HRESIMS和多种分离纯化手段从一年生喜树幼苗中定向分离得到5个喜树碱类似物,包括从喜树中首次分离鉴定的3S/R-脱氧短小蛇根草苷(Ca1,Ca2)、2个新颖结构化合物3-去氢脱氧短小蛇根草苷(Ca3)和3,6'-O-脱氧短小蛇根草环苷(Ca4),以及3S-短小蛇根草苷(Ca5),并用多种波谱技术确认了其化学结构。已知化合物Ca1/Ca5是喜树碱生物合成途径中的关键中间体,为后续解析工作的进行提供了底物。化合物Ca3/Ca4提示了该类结构的3位是活泼位点,可能为D环芳构化的过程提供参考。 本论文从从曼地亚红豆杉愈伤组织中分离出17个紫杉烷二萜类化合物,提示了植物愈伤组织具有产生新颖结构天然产物的潜力;从一年生喜树幼苗中分离得到5个喜树碱类似物,它们可能是喜树碱生物合成相关中间体,这些发现可能有助于喜树碱生物合成途径的解析。
关键词: 曼地亚红豆杉 ；喜树 ；植物培养组织 ；紫杉烷二萜 ；喜树碱类似物 ；喜树碱生物合成中间体
摘要： 第一部分东北红豆杉针叶的化学成分研究 东北红豆杉,也称紫杉、赤柏松、朱树,为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物,主要分布于中国东北、日本、朝鲜、俄罗斯等温带针阔叶混交林区。以茎、枝、叶、根入药,有抗癌功能,并有抑制糖尿病及治疗心脏病的效用。 东北红豆杉(Taxus cuspidata)主要化学成分有二萜类、萜类生物碱、木脂素及黄酮类等,其中最引人注目的化学成分就是二萜类化合物紫杉醇。紫杉醇以其独特的抗肿瘤作用机制及显著的抗癌疗效引起了药学工作者对紫杉烷类化合物的研究热潮,目前紫杉醇已成为全世界癌症药物销售量最大的药物之一。红豆杉全世界仅有11种,分布范围狭窄,生长又极为缓慢,加上紫杉醇在树皮中的含量又很低,这就大大地限制了紫杉醇的开发利用。为减少对野生红豆杉资源的破坏,缓解紫杉醇供不应求的局面,我们对东北红豆杉针叶的化学成分进行研究。 目的:以东北红豆杉(Taxus cuspidata)可再生针叶为研究对象,利用现代分离手段对其化学成分,尤其是紫杉烷类化学成分进行系统研究,并采用波谱学及光谱学方法,包括:1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY、UV、IR、MS等对分离得到的单体化合物进行平面结构和立体结构的鉴定,为寻找新的抗癌活性先导化合物或药物奠定基础。 方法:取干燥后的东北红豆杉针叶约3.2 Kg,用95%的乙醇冷浸提取,浓缩后得到总提物。将总提物分散于蒸馏水中,石油醚脱脂后用乙酸乙酯进行萃取,得到乙酸乙酯部位。依次用5% HCl水溶液、5% Na2CO3水溶液对乙酸乙酯部位进行萃取,得到东北红豆杉针叶的碱性部位约4.2 g、酚性部位约3.4 g、中性部位约82 g。采用硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、制备薄层色谱法和制备高效液相色谱法对以上三个部位的化学成分进行分离,得到的单体化合物利用薄层色谱法及高效液相色谱法进行纯度检识。单体化合物采用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY等光谱学和波谱学方法进行化学结构的鉴定。 结果:从东北红豆杉针叶中分离并鉴定了41个化合物,包括:37个紫杉烷类化合物,2个木脂素类化合物,1个倍半萜类化合物和1个苯丙素类化合物。鉴定结果如下: 2'-Hydroxy taxine II (1)、2α, 9α, 10β, 13α-Tetraacetoxy-5α-(3'-methyl- amino-3'-phenyl)-propionyloxy-taxa-4(20), 11-diene (2)、9α-Hydroxy-2α, 10β, 13α-triacetoxy-5α-(3'-dimethylamino-3'-phenyl) butanoate-taxa-4 (20), 11-di- ene (3)、10β-Benzoxy-5α-(3'-dimethylamino-3'-phenyl) propanoxy-1β-hydr- oxy-7β,9α,l3α-triacetoxy-11(15→l)abeotaxa-4(20), 11-diene (4)、Taxinine (5)、1β-Acetoxy isodrimeninol (6)、9α, 10β, 13α-Triacetoxy-5α-cinnamoyl-taxa- 4(20), 11-diene (7)、2-Deacetoxyltaxinine J (8)、Taxinine B (9)、9α, 10β-Di- acetoxy-5α-cinnamoyltaxa-4(20), 11-dien-13α-ol (10)、Taxezopidine G (11)、7-Deacetoxytaxuspine J (12)、2-Deacetyltaxinine (13)、10-Deacetyl taxinine (14)、1-Hydroxy taxuspine C (15)、Taxagifine (16)、2-Acetoxy-5-deacetyl- taxusin (17)、2-Deacetoxy-5-decinnamoyltaxinine J (18)、2α, 9α, 10β- Triacetoxy-20-hydroxy-11,12-epoxytaxa-4-en-13-one (19)、Taxinine A 11, 12- epoxide (20)、Taxinine A (21)、5-Decinnamoyl taxinin J (22)、Decinnamoyl taxagifine (23)、10-Deacetyl-13-oxobaccatin III (24)、9-Deacetyl-9-benzoyl- 10-debenzoyl brevifoliol (25)、Baccatin III (26)、13-Oxobaccatin III (27)、Yunnanxane (28)、(3E, 7E)-10β, 13α-Diacetoxy-2α, 5α, 20-trihydroxy-3, 8- secotaxa-3, 7, 11-triene-9-one (29)、(3E, 7E)-2α, 10β, 13α-Triacetoxy-5α, 20- dihydroxy-3,8-secotaxa-3, 7, 11-trien-9-one (30)、Taxuspine G (31)、Taxezopi- dine F (32)、9-Dihydro-13-acetyl-baccatin III (33)、10-Deacetyl baccatin III (10-DAB) (34)、7, 9-Deacetyl-5-decinnamoyl taxinine J (35)、Taxol (36)、7-Epi-10-deacetyltaxol (37)、2α, 9α, 10β-Triacetoxy-13α-hydroxy-5α-O-(β- D-glucopyranosyl)taxa-4(20), 11-diene (38)、松柏醛(Coniferyl aldehyde) (39)、松脂素((-)-Pinoresinol) (40)、铁杉脂素(α-Conidendrin) ( 41)。 结论:本研究对东北红豆杉(Taxus cuspidata)可再生针叶的化学成分进行了系统研究,采用的按碱性成分、酚性成分及中性成分进行分离的方法适用于本植物的成分分离。 分离并鉴定的41个单体化合物中: 2α,9α,10β-Triacetoxy-13α-hydroxy-5α-O-(β-D-glucopyranosyl)taxa-4 (20), 11-diene (38)为自然界中首次发现的新化合物。 9α-Hydroxy-2α, 10β, 13α-triacetoxy-5α-(3'-dimethyl-amino-3'-phenyl)- butanoate-taxa-4(20), 11-diene (3)、10β-Benzoxy-5α-(3'-dimethylamino-3'- phenyl)-propanoxy-1β-hydroxy-7β, 9α, l3α-triacetoxy-11(15→l)-abeotaxa-4 (20), 11-diene (4)、2α, 9α, 10β-triacetoxy-20-hydroxy-11, 12-epoxytaxa-4-en- 13-one (19)、10-deacetyl-13-oxobaccatin III (24)、9-Deacetyl-9-benzoyl-10- debenzoylbrevifoliol (25)、13-Oxobaccatin III (27)、(3E, 7E)-10β, 13α-diace- toxy-2α, 5α, 20-trihydroxy-3, 8-secotaxa-3, 7, 11-triene-9-one (29)、(3E,7E)- 2α,10β,13α-triacetoxy-5α,20-dihydroxy-3, 8-secotaxa-3, 7, 11-trien-9-one (30)等8个化合物为首次自本植物中发现。 结合本研究中所得化合物波谱数据及查阅文献,归纳总结出不同骨架紫杉烷类化合物的核磁共振氢谱特征,为此类化合物的快速结构鉴定提供了依据。 第二部分飞机草化学成分研究 飞机草(Eupatorium odoratum L)又名香泽兰,为菊科泽兰属多年生草本植物,属入侵我国的外来植物。原产地为中美洲,在南美洲、亚洲、非洲热带地区广泛分布;在我国主要分布于广东、海南、广西、云南、贵州(西南部)。飞机草全草入药,在我国亦是民间常用草药,具有散瘀消肿、解毒、止血和杀虫功效,主要用于跌打肿痛、疮疡肿毒、皮炎和外伤出血。对于飞机草化学成分研究文献报道较少,仅报道了一些黄酮类化合物和挥发油类成分,而对其活性的研究也仅限于初提物阶段。因此全面系统的研究其化学成分并寻找到其活性成分对于该植物在药学及农业领域的开发与利用,变害为宝具有重大意义。 目的:本课题以飞机草全草为研究对象,对其化学成进行全面系统的研究,运用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY、UV、IR、MS等波谱学及光谱学方法对得到的单体化合物进行平面结构和立体结构的鉴定,通过活性筛选寻找到该植物中的活性成分,为其开发与利用提供科学依据。 方法:取粉碎后的飞机草药材19 Kg,用95%乙醇回流提取,得浸膏约1800 g。将浸膏分散于蒸馏水中,依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取,减压浓缩后分别得到石油醚部位29.5 g、二氯甲烷部位101.2 g和乙酸乙酯部位40 g。采用硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、制备薄层色谱法对以上三个部位的化学成分进行分离,得到单体化合物。采用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY等光谱学和波谱学方法对各单体化合物进行化学结构的鉴定。对飞机草中分得的16个化合物进行了9株人肿瘤细胞增殖抑制活性测试,以及对PPARγ和肝X受体激动活性的测试。 结果:从飞机草中分离得到35个单体化合物,对其中的28个化合物进行了结构鉴定,包括:8个黄酮类化合物,8个木脂素类化合物,7个醌类化合物,2个甾醇类化合物、1个酰胺醇酯类化合物、1个长链有机酸和1个萘醌衍生物。鉴定结果如下: 飞机草素(1)、β-谷甾醇(2)、金色酰胺醇酯(3)、2, 6-二甲氧基对苯醌(4)、1, 2-亚甲二氧基-6-甲基蒽醌(6)、1-羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌(9)、6或7-甲基茜草素(10)、EO-12(12)、1, 2, 4-三甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(13)、1, 2-二甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(14)、商陆素(15)、鼠李柠檬素(16)、4, 2'-二羟基-4', 5', 6'-三甲氧基查耳酮(17)、桃皮素(20)、刺槐素(21)、山柰素(22)、3', 4'-二甲氧基木樨草素(23)、1, 4-二羟基-2-甲氧基-7-甲基蒽醌(24)、(-)-松脂素(25)、天师酸(27)、7-甲氧基松脂素(28)、5, 7-二甲氧基松脂素(29)、(-)-橄榄脂素(30)、臭矢菜素C或D(31)、(-)-杜仲树脂酚(32)、(-)-丁香树脂酚(33)、臭矢菜素A或B(34)、β-胡萝卜苷(35)。 1, 2-二甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(14)对人非小细胞肺肿瘤细胞(PC-6)具有增值抑制活性(IC50,15.56μg/mL);飞机草素(1)对PPARγ具有较强的激动活性(EC50,1.10μg/mL)。 结论:从飞机草中分离并鉴定了28个化合物,其中自然界中首次发现的新化合物5个,分别为:1, 2-亚甲二氧基-6-甲基蒽醌(6)、EO-12(12)、1, 2, 4-三甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(13)、1,
关键词: 东北红豆杉 ；飞机草 ；土木香 ；提取分离 ；结构鉴定 ；活性筛选 ；微生物转化 ；指纹图谱
被引量
17
摘要： 功能基因组学(functional genomics)是利用结构基因组学提供的信息,应用高通量、大规模分析方法,在基因组或系统水平全面研究基因的表达、调控与功能,并探索基因间、基因与蛋白质之间、基因及其产物与生长发育相互联系和规律的科学。功能基因组学将生物学研究从单个基因或蛋白质上升至基因组,同时对多个基因和蛋白质进行系统研究。阐明药用植物生物活性成分的次生代谢途径及其调控是药用植物功能基因组学的主要内容之一。人参、西洋参和红豆杉是三种有重大药用和经济价值的药用植物,主要生物活性成分均为萜类化合物。本课题采用目前最新的技术,结合西洋参、人参、东北红豆杉的研究现状,从微观和宏观的不同角度,采用功能基因组学研究方法和地理信息系统技术,分别从转录组分析、药用天然产物生物合成途径、关键酶基因克隆与鉴定、产地适宜性等方面,有针对性地进行了研究。
西洋参(Panax quinquefolius L.)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)的名贵药材,以根入药,具有促进记忆、抗癌、降血压、降血脂、抗疲劳、抗糖尿病、强心、镇静等多种药理作用。但由于生长缓慢,连作障碍严重,西洋参药用资源的发展受到极大的限制。本研究以四年生西洋参根、叶、花为材料,构建了cDNA文库,通过5′端测序,获得了根、叶、花的表达序列标签(expressed sequence tag, EST),共有6,678条ESTs,序列拼接产生了3,349条unigenes,包括534条contigs和2,815条singletons。通过转录组分析,探讨了组织特异性基因表达模式。采用Gene Ontology(GO)功能分类,将基因产物划分到生物学过程,细胞成分和分子功能三大本体。BLAST比对发现了24条参与人参皂苷生物合成的关键酶,对甲羟戊酸途径中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)进行了克隆与鉴定。采用同源克隆的方式,克隆了达玛烷合成酶(DS)基因。克隆了人参皂苷生物合成的最后一步糖基转移酶(GT)基因。发现了63条转录因子序列,编码包括zinc finger, WRKY, homeobox和MADS-box家族蛋白。并且发现了588条SSR微卫星标记,探讨了其组成与特点。这些结果,提供了西洋参转录谱、功能基因、转录调节、花发育和分子标记方面的重要信息,对于促进西洋参及其人参属药用植物的发展具有重要意义。
红豆杉是重要的木本药用植物,是紫杉醇提取和半化学合成的重要来源之一。尽管商业和医药价值巨大,关于红豆杉属的基因组或转录组研究却很少。目前,紫杉醇生物合成途径还未完全阐明,紫杉醇和紫杉烷类生物合成的调控还不清楚。本研究应用新一代高通量测序技术454 GS FLX Titanium对东北红豆杉(Taxus cuspidata)针叶转录组进行测序,共获得表达序列标签(EST)81,148条。序列拼接得到20,557条unique sequences,包括12,957条singletons和7,582条contigs。数据库中的序列同源性比较表明,68.6%(14,095)与其它生物的已知基因具有同源性。研究发现总的序列同源性在裸子植物中高于被子植物。GO分类将11,220条序列注释到45个类目上。通过生物化学途径注释,2,403条序列注释到3,821条KEGG途径中。生物信息学分析,获得了质体赤藓糖磷酸酯途径(methylerythritol phosphate pathway)的所有酶以及参与紫杉醇生物合成的部分酶的基因。发现了可能参与紫杉醇合成未阐明步骤酶的基因,包括85条CYP450,7条epoxidase,18条CoA ligases和3条N-benzoyltransferase。从数据中还获得了291个转录因子和753个微卫星标记(SSR)。这些基因的发现为紫杉醇和紫杉烷类化合物生物合成研究和代谢调控提供了有利条件,也为红豆杉属植物种质改良奠定了基础。
石柱参是中国特有人参珍稀品种,具有较高的经济价值。为了对人参种植区划筛选提供科学依据,利用中药材产地适宜性分析地理信息系统(TCMGIS),以辽宁省宽甸县石柱参现代分布区最适宜生长环境因子为依据,区划石柱参在全国的适宜产地。结果显示适宜种植区(相似度为95%-100%)所在县区有15个,总面积为15,943.93平方公里,辽宁省占96.44%,吉林省占3.56%；较适宜种植区(相似度为90-95%)所在县区有22个,总面积20,070.83平方公里,辽宁省占73.88%,吉林省和秦岭中东部地区也有一定份额。研究结果覆盖了石柱参现代分布区,从一定程度上验证了TCMGIS系统用于石柱参适生地分析的科学性和准确性,预测了石柱参潜在适宜分布区。对于规划人参种植区域,保护优良品种,把人参生产规划在真正的适宜产地具有重要的指导作用。
本文的研究工作,分别探讨了西洋参和红豆杉两种药用植物的基因表达谱,代谢途径相关功能基因,代谢调控机制,并预测了石柱参的适生栽培区域。这些研究工作为重要药用次生代谢产物的生物合成研究,功能基因的开发和利用,药用植物的品种改良和人工引种提供了基础数据和理论支持。
关键词: 功能基因组学 ；转录组 ；西洋参 ；人参 ；东北红豆杉 ；产地适宜性 ；454测序 ；表达序列标签
被引量
8
摘要： 曼地亚红豆杉(Taxus media)是东北红豆杉(母本Taxus cuspidata)与欧洲红豆杉(父本Taxus baccata)天然杂交的品种,属于裸子植物门红豆杉科红豆杉属。红豆杉科植物中的紫杉烷类化合物紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)合成的多西紫杉醇成为当今抗癌新药,红豆杉科植物的经济价值陡增。从天然红豆杉这一濒危植物生产紫杉醇及10-DAB,远远不能满足社会对这一抗癌药物的需求,加之天然红豆杉被列为濒危保护植物,使得生产紫杉醇的原材料十分紧缺。1996年国家林业局将曼地亚红豆杉引种栽培,经数年试验,引种取得成功。目前国内建立了多个曼地亚红豆杉种植基地,为药用及研究提供了充足资源。近年又因发现红豆杉科植物所含红杉醇有降血糖的作用,有望开发成治疗糖尿病新药,成为红豆杉药用成分的又一研究热点。从红豆杉科植物中分离纯化和检测紫杉烷类化合物的工艺方法较为成熟,但从红豆杉科植物中分离纯化和检测红杉醇的相关报道较少,大多申请专利加以保护。曼地亚红豆杉中红杉醇的提取分离工艺及测定方法未见文献报道,加之我国多年来对曼地亚红豆杉引种栽培成功,种植基地材料资源充足,使得本研究内容更具意义。本研究对曼地亚红豆杉枝叶中红杉醇的提取分离进行了系统试验,对红杉醇的提取方法和粗提浸膏的纯化方法进行考察,并对提纯工艺条件进行优化;建立了提取分离过程中红杉醇的定性和定量分析方法。其主要结果如下：
(1)用正交试验优选曼地亚红豆杉中红杉醇的提取工艺。用曼地亚红豆杉枝叶为提取材料,三次提取。选取溶剂浓度(乙醇-水)、提取温度及提取时间三个因素,用提取物中红杉醇收率为评价指标,按正交设计L9(34)进行试验。确立提取的最佳工艺条件为：30%乙醇为溶媒、提取时间为2.5-2.5-2.511、提取温度为65℃,所得浸膏中红杉醇得率为0.150%。
(2)曼地亚红豆杉枝叶浸膏中含有大量的蜡质、色素等多种化合物,分离纯化困难。针对这一特点,用80%乙醇提取(所得浸膏用于生产紫杉烷类化合物)去除色素、蜡质等杂质,再通过正交试验获得的优选工艺进行提取,提取液经活性炭色谱分离,进一步去除杂质,减少杂质在重结晶过程中的不利影响。并对两种商品活性炭(粉状活性炭、颗粒状活性炭)的参数与吸附性能进行了测试,结果表明粉状活性炭除色素效果优于颗粒状活性炭。用活性炭参数有效控制工艺的稳定性。
(3)用电导方法测试肌醇的电导属性,据此推测出红杉醇为非电解质,不能用电导法来检测。该结论对色谱分离馏分中的氨基酸、蛋白质等电导大的杂质监控有重要意义。
(4)建立了曼地亚红豆杉枝叶中红杉醇的定量分析方法。定量分析方法命名为“固相萃取-分光光度协同甲氧基测定法”。该法间接测定红杉醇的甲氧基进而计算出红杉醇的含量,此方法用于曼地亚红豆杉中红杉醇含量测定,具有精密度好、准确度高,稳定可靠等优点。此方法成本低廉,比大型光谱、色谱仪器更具有成本优势,可用于红杉醇的质量监控、科学研究。
(5)创建的“固相萃取-分光光度协同甲氧基测定法”其中的“碘-淀粉显色分光光度定量分析法”实属“间接碘-淀粉显色分光光度定量分析法”,系统分析了其原理,利用该原理对“碘-淀粉显色分光光度定量分析法”进行了圆满的阐释。该基础性研究成果更具有广泛的应用价值。
(6)建立红杉醇的定性分析方法,填补了红杉醇定性分析方法的空白。
(7)分离提纯工艺制备的红杉醇样本,通过HPLC-PDA和MS检测,纯度为99.5%,化学式与CAS检索相符。该产品可作为定量分析对照品,为相关研究工作带来方便。
关键词: 曼地亚红豆杉 ；红杉醇 ；提取纯化 ；固相萃取 ；分光光度法 ；甲氧基测定法 ；固相萃取-分光光度协同甲氧基测定法 ；碘-淀粉显色分光光度定量分析法 ；间接碘-淀粉显色分光光度定量分析法
被引量
9
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