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摘要： 对于固相多肽合成来说,防止消旋化是一个十分重要的问题。为了保证多
肽产物的光学纯度,除了在合成过程中严格控制消旋化的发生以外,还必须严格
采用光学纯的原料-N-Fmoc 保护氨基酸。因此, N-Fmoc 保护氨基酸对映体的
检测对于光学活性多肽的合成至关重要。
本文选取具有代表性的五种保护氨基酸,根据保护氨基酸的结构与性质的
差异,分别采用毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱以及非水毛细管电泳进行
了手性拆分。不同毛细管电泳拆分体系的选择与运用,为建立拆分 N-Fmoc 保护
氨基酸方法提供了可能。具体内容如下:
1、毛细管区带电泳拆分
选择 DM-β-CD 为手性选择剂实现对 Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Val-OH 的
毛细管区带电泳分离。对毛细管电泳的分离条件进行了优化,最终获得分离色谱
条件为:毛细管 50μm×40 ㎝(有效长度为 30 ㎝);电解液:40mmol·L-1磷酸二
氢钠溶液,内含商品化 20mmol·L-1 2,6-二甲基-β-环糊精,用 Tris 调 pH 为 5.0;
电压:20kv;温度:毛细管柱温 25℃,样品恒温 25℃;电极:正向;检测波长:
λ=214nm。在此色谱条件下,Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Val-OH 对映体的分离
度分别为 2.54 和 1.62。并对 Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Val-OH 的实验方法进行
了验证,结果显示该方法准确,可行。
同时对环糊精拆分原理进行了初步的推测:对于两种 N-Fmoc 保护氨基酸
对映体来说,有可能是保护氨基的疏水骨架-芴甲氧羰酰基从粗端口进入环糊精
内部疏水空腔中,形成主-客体复合物。在环糊精的空腔外的氨基酸的羧基和侧
链,与环糊精的空腔外缘仲羟基之间形成氢键而达到手性识别。
2、毛细管胶束电动色谱拆分
选择γ-CD 为手性选择剂实现对 N-Fmoc-Lys(Boc)-OH 的毛细管胶束电动
色谱分离。对毛细管电动色谱的分离条件进行了优化,最终获得分离色谱条件为:
毛细管 50μm×40 ㎝(有效长度为 30 ㎝);电解液:40mmol·L-1磷酸二氢钠溶液,
内含商品化 60mmol·L-1γ-环糊精,100 mmol·L-1十二烷基磺酸钠(SDS),用氢
I
摘 要
氧化钠调 pH 为 8.3;电压:18kv;温度:毛细管柱温 35℃,样品恒温 25℃;电
极:正向;检测波长:λ=214nm;在此色谱条件下,N-Fmoc-Lys(Boc)-OH 的
分离度为 1.2;对 N-Fmoc-Lys(Boc)-OH 的实验方法进行了验证,结果显示该方
法准确,可行。
3、非水离子对毛细管电泳拆分
选择奎宁为手性选择剂,实现对 Fmoc-Tyr-(tBu)-OH 和 Fmoc-Trp-(Boc)-OH
对映体的非水体系逆流离子对毛细管电色谱分离。其分离原理为:在测定的 pH
范围内分离时,保护氨基酸带负电,朝检测窗口方向运动;奎宁带正电,与电渗
流相同背向检测窗口运动。游离的手性选择剂奎宁和待分析物则分别向阴极或阳
极迁移,形成逆流分离过程,从而形成逆流离子对手性电色谱。在二者相互运动
过程中,保护氨基酸与奎宁形成离子对,并通过其它氢键、疏水作用等因素实现
对映体的手性识别。分离是建立在不同的离子对平衡常数的基础之上。
通过对非水体系逆流离子对毛细管电色谱的原理分析,对色谱的分离条件进
行了优化,最终获得分离色谱条件为:石英未涂层毛细管 50μm×40 ㎝(有效长
度为 30 ㎝);电解液:乙醇:甲醇(60:40),四丁基氢氧化铵 12.5 mmoL/L;用
乙酸调节 pH 约为 6.5 ;手性选择剂:奎宁 10 mmoL/L;电压:25kv;温度:毛
细管柱温 20℃,样品恒温 25℃;电极:反向;检测波长:λ=254nm。在此色谱
条件下,Fmoc-Tyr-(tBu)-OH 和 Fmoc-Trp-(Boc)-OH 的分离度分别为 1.64 和 1.23;
对 Fmoc-Tyr-(tBu)-OH 和 Fmoc-Trp-(Boc)-OH 的实验方法进行了验证,结果显示
该方法准确,可行。
关键词: N-Fmoc ；保护氨基酸 ；手性拆分 ；毛细管区带电泳 ；毛细管胶束电动色谱 ；非水离子对毛细管电泳
被引量
3
摘要： The separation of enantiomers is of great importance in biology, pharmaceutics, agriculture and environment. The different separation modes (i.e. capillary zone electrophoresis (CZE), micellar electrokinetic chromatography (MEKC), capillary electrochromatography (CEC), etc) and many chiral selectors available make capillary electrophoresis (CE) technique a powerful tool for chiral analysis[1]. On the basis of ligand-exchange (LE) mechanism introduced by Davankov and Rogozhin[2] in the early 1970s for high performance liquid chromatography (HPLC), the first application of CE in chiral separation was reported by Zare's group[3,4]. Using Cu(Ⅱ) complexes of L-histidine or aspartame as chiral selectors, 14 dansyl amino acids (Dns-AAs) were resolved. The authors observed a significant improvement in resolution when a micelle forming surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) was added to the electrolyte performing MEKC. The method was called as ligand-exchange micellar electrokinetic capillary chromatography (LE-MEKC). As a hybrid mode of possessing both the advantage of high enantioselectivity in ligand-exchange mechanism and the main advantages of MEKC, LE-MEKC allows the manipulation of the selectivity for large classes of neutral and charged compounds, making possible separation that otherwise are not feasible by using only the mode of LE or MEKC. Using this combined separation mode, hydroxy acids and dipeptides, as well as 16 positional and optical isomers of tryptophan derivatives could be optically resolved[5]. The same group also proposed a method for the determination of the critical micelle concentration (CMC) of anionic surfactants based on LE-MEKC principle[6].
关键词: 手性分离 ；配合体交换胶束电动色谱 ；微乳液电动色谱 ；毛细管区带电泳
被引量
3
摘要： 氨基酸是人和动物体内不可或缺的一类重要的化合物,在生命的催化、免疫以及新陈代谢等过程中起到了极其重要的作用。目前氨基酸已广泛应用于食品添加剂、药物合成、农药制造、化妆品、化学工业以及生物工程等重要领域。氨基酸的两种手性对映体在立体环境或者人体内常常表现出不同甚至相反的生物活性,因此氨基酸的手性拆分不仅关系到人的身体健康和生命安全,同时也对许多的重要研究领域具有重要的影响。目前众多的手性拆分方法在规模化、低成本、简单快速等方面还远不能满足现实的需要,因此探索建立一种简单、快速、低成本的手性拆分方法对手性化合物分离分析具有十分重要的意义。磁性纳米材料由于在粒径、比表面、生物相容性以及磁性等方面具有明显的优势,目前作为一种理想的载体已经在生物分离、样品前处理、酶的固定化、环境保护以及靶向给药等多个领域得到广泛的应用。在本论文的研究中,以磁性材料Fe304为基础,围绕手性识别功能化的磁微球的制备、表征及在手性对映体的拆分三个方面展开研究,初步构建了简单、快速、低成本的手性化合物分析方法,为手性识别功能化磁微球与毛细管电泳联用实现手性化合物的在线识别与分离奠定了一定的基础,具体的研究内容如下：(1)以热液合成法制备的Fe304磁微球为基础,通过Stober法和蒸馏沉淀法依次在其表面进行二氧化硅和N,N-亚甲基双丙烯酰胺复合修饰,并以此功能化磁微球为载体进行马来酸-p-环糊精(MAH-β-CD)的键合,从而制备出MAH-β-CD修饰的磁微球。将制备的MAH-β-CD功能化的磁微球用于氨基酸和手性药物的拆分,以此来评价手性识别功能化磁微球的手性识别能力。实验结果表明所制备的MAH-β-CD功能化的磁微球具有三层核壳式结构、良好的分散性、较窄的粒径分布、较强的磁响应性以及较高的MAH-β-CD固载量等特点。旋光度值和对映体过量值都显示所制备的MAH-β-CD修饰的磁微球能够对氨基酸和手性药物选择性作用,具有良好的手性识别能力,可作为一种潜在的手性选择剂功能化的磁微球广泛用于手性对映体的手性拆分。(2)利用双官能团试剂环氧氯丙烷(EP)与p-CD发生聚合反应制备了p-环糊精环氧氯丙烷(β-CDEP)聚合物,并将其加入到热液合成Fe304磁微球的反应中,一步法制备了β-CDEP聚合物修饰的Fe304磁微球。通过对一步法中β-CDEP聚合物加入量和反应时间两个因素的考察解释了β-CDEP聚合物修饰的Fe304磁微球的形成机理。实验证明了β-CDEP聚合物在反应中充当表面活性剂的作用,不仅抑制了Fe304磁微球的团聚,同时还促进了Fe304晶粒的增长。将制备的β-CDEP聚合物修饰的Fe304磁微球用于色氨酸溶液的立体选择性吸附,并优化了吸附平衡时间和缓冲溶液的pH。实验结果显示300 mgβ-CDEP聚合物修饰的Fe304磁微球作用后的上清液中对映体过量值达到了44.2%,显示所制备的β-CDEP聚合物功能化磁微球对色氨酸良好的手性歧视能力。(3)采用微波辅助法将聚酰胺-胺(PAMAM)树枝分子快速键合在磁性微球表面,并将此功能化磁微球用于L-缬氨酸(L-Val)的固定化。实验考察不同代数PAMAM树形分子聚合物修饰的磁微球对L-缬氨酸固定量的影响。将L-缬氨酸键合的3.0代树枝分子功能化的磁微球(L-Val@G3.0-PMMPs)用于氨基酸衍生物的手性分离分析,研究了手性识别功能化磁微球的用量和作用次数对手性拆分的影响。实验结果表明所制备的L-Val@G3.0-PMMPs磁微球具有清晰规整的核壳式结构和良好的磁响应性。在磁微球表面的引入PAMAM树枝分子明显提高了L-Val的键合量,而且随着磁微球表面树枝分子代数的增长,L-Val的键合量也逐渐增加。L-Val@G3.0-PMMPs磁微球通过手性配体交换原理实现了对丹酰化氨基酸的手性识别,表现出较强的手性拆分能力。此外本实验初步完成功能化磁微球在毛细管内的固定,为实现毛细管电泳在线分离分析手性化合物奠定了一定的实验基础。
关键词: 磁微球 ；手性识别剂 ；毛细管电泳 ；氨基酸 ；对映体过量值
被引量
3
摘要： 随着现代分离技术的发展,环糊精化学在手性分离领域正发挥着日益增长的作用。正电型环糊精其正电中心可以与酸性药物或氨基酸形成静电作用,与天然或中性环糊精相比,正电型环糊精展现了良好的水溶性及优异的手性识别性能。通过调节取代基的类型以及位置,选择性地化学修饰,可以获得结构确定的环糊精衍生物。本论文的研究内容是合成一系列单一异构的正电型β-环糊精(单、双或全取代),以构建静电作用和氢键作用来增强手性识别驱动力为理念,在环糊精的6-位引入单个或两个正电中心、正电侧基引入含氧基团构建氢键作用。以高效毛细管电泳或高效液相色谱为分析手段,考察了设计的正电型环糊精对酸性、氨基酸、中性甚至碱性外消旋体的手性拆分能力,通过优化分离条件、结合分子模拟,揭示了多重驱动力增强手性识别的机理。首先,设计并合成了八种6-位单取代烷铵基-β-环糊精氯化物。以6A-(2-羟乙铵基)-β-环糊精氯化物(HEtAMCD)为手性选择剂,成功地在毛细管电泳中对超过20多种酸性药物和丹磺酰氨基酸消旋体实现了基线分离。对多数外消旋体而言,HEtAMCD浓度为10 mM、pH 6.0的背景电解质为最佳分离条件,并且通过一维和二维(ROESY)核磁共振技术考察了 HEtAMCD与扁桃体酸对映体络合物的作用方式;针对六种代表性外消旋体的手性分离,在研究的手性拆分剂浓度范围内(1～20 mM),HEtAMCD、6A-(3-羟丙铵基)-β-环糊精氯化物(HPrAMCD)、6A-(4-羟丁铵基)-β-环糊精氯化物(HBuAMCD)和6A-(3-甲氧基丙铵基)-β-环糊精氯化物(MPrAMCD)的手性拆分性能最佳。通过实验结构计算得到了这四种环糊精与每种单一对映体络合物的稳定络合常数(K),理论选择性(αcplx)和理论最佳添加剂浓度(Copt)。其余四种环糊精由于水溶解性较差,手性拆分能力也有限。对比发现三个碳链和单一烷基取代的环糊精的手性分离能力最为优异,甲氧基和羟基在不同的烷基链中表现出不同的手性识别优势。其次,以盖布瑞尔反应为路径合成出6-位单取代、咪唑鎓基和铵基兼具的双正电型环糊精。合成路线中使用咪唑烷基取代的邻苯二甲酰亚胺为亲核试剂前驱体,通过调节胺基脱保护的顺序得到两种不同的亲核试剂,分别合成了 6A-[3-(铵基烷基)-1-咪唑鎓基]-β-环糊精氯化物和6A-咪唑基烷铵基-β-环糊精氯化物两个系列的正电型环糊精。以6A-[3-(4-铵基丁基)-1-咪唑鎓基]-β-环糊精氯化物为代表,探究了其不同浓度下对八种丹磺酰氨基酸和七种酸性药物的手性分离情况。在2.5 mM浓度下的所有消旋体即能实现基线分离,比单一正电荷的咪唑鎓基或铵基环糊精具有一定的手性分离优势。再次,创新地采用了点击反应制备出用于毛细管电泳流动相的6-位AC双取代正电型环糊精。区别于传统的"盖帽"法制备双取代环糊精,采用亲核性更强的均三甲基苯磺酰氯对6A-叠氮基-β-环糊精进行取代,由于空间位阻效应得到了 6-位AC双取代的环糊精前驱体。紧接着对均三甲基苯磺酰基进行亲核取代及对叠氮基点击反应,可以得到6-位AC双取代正电型环糊精。其中,6A-[4-(2-羟乙基)-1,2,3-三唑基]-6C-[3-(3-甲氧基丙基)-1-咪唑鎓基]-β-环糊精氯化物具有两个共轭功能团,5 mM时对丹磺酰氨基酸的展现出优异的手性拆分性能。6A-[4-(2-羟乙基)-1,2,3-三唑基]-6C-(3-甲氧基丙铵基)-β-环糊精氯化物能对酸性药物和丹磺酰氨基酸都能实现很好的分离,与MPrAMCD相比,三唑基的引入在一定程度上能改善环糊精对丹磺酰氨基酸的手性识别能力。最后,以3-氯-4-甲基苯异氰酸酯对6-位AC双取代正电型环糊精进行全取代,再通过点击反应共价键合至炔基化硅胶表面,获得了用于高效液相色谱的苯甲酰胺功能化环糊精手性固定相。在纯甲醇的流动相条件下,可以对除橙皮素和柚皮素外的7种黄烷酮类消旋体实现手性拆分,其中,对7-甲氧基黄烷酮的分离度超过了 8.0。进一步研究发现,流动相中甲醇与水的比例,可有效调节该固定相的手性拆分性能。添加不同pH缓冲液情况下,手性固定相对其它中性、酸性及碱性药物,都展现出一定的分离能力。尤其对酸性药物,通过构建正电型环糊精与负电性药物分子间的静电作用力,可有效地促进其手性分离。在正相的二元体系或者三元体系中,通过改变流动相中极性溶剂的比例,外消旋体的手性拆分可以被很好地调控。研究结果表明,苯甲酰胺功能化环糊精手性固定相其手性拆分能力主要由包络作用及其它作用力(如氢键、共轭、静电和偶极作用等)共同决定。因此,通过增强手性拆分剂的识别驱动力是提升其手性拆分性能的有效方法。
关键词: 正电型环糊精 ；单一异构体 ；外消旋体 ；手性分离
被引量
3
摘要： 高效毛细管电泳(HPCE)是在传统电泳技术与色谱技术的基础上发展起来的一种强有力的分离技术。它具有高效、快速、样品用量少等优点,广泛应用于分析化学、生命科学、药学、环境科学等各个领域。
毛细管电泳作为一种强有力的分离技术,已经成功的分离了多种不同类型的化合物,尤其在氨基酸、肽、蛋白质以及药物的手性拆分领域应用最广,显示了其独特的优势。此外,电泳具有多种灵活变换的分离模式,方法开发较为容易,操作费用低。
当前,在线的紫外检测仍是毛细管电泳中最为常用的一种检测手段,但是由于大多数的氨基酸和肽没有或只有很弱的紫外吸收,直接紫外检测满足不了低含量组分测定的要求。衍生试剂的研究和应用不仅可以克服仪器分析方法在某些方面的局限性,而且在化学方法的分离、富集和检测中起着重要的作用。目前广为应用的衍生试剂主要有9-芴甲氧羰基氯(FMOC)、邻苯二甲醛(OPA)和5—二甲氨基萘—1—磺酰氯(DNS—C1)。但是这些衍生试剂本身的一些特性决定了其应用的局限性。为此,本文采用新型衍生化试剂,改变被测化合物的特性,进行了氨基酸和二肽的毛细管电泳的分离,结果令人满意。
论文分三章:
第一章:
简单介绍了毛细管电泳的发展及其基本理论。综述了毛细管电泳在手性物质和生物分子如氨基酸和肽的分离分析中的应用。
第二章:
氨基酸和二肽的毛细管电泳分离研究,包括两部分:
2.1 采用新型衍生试剂1,2-苯并-3,4-氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯(BCEOC)作为柱前衍生试剂,利用毛细管电泳在胶束电动模式下对氨基酸进行了分离,考察试剂用于氨基酸分离的几个关键条件,实现了14种氨基酸的快速基线分离。
2.2 以咔唑-9-乙基氯甲酸酯(CEOC)作为柱前衍生试剂,在胶束电动色谱模
关键词: 毛细管电泳 ；氨基酸 ；二肽 ；手性分离
被引量
1
摘要： 毛细管电泳是近年来迅速发展起来的一类分离分析技术,它具有高效、快速、样品用量少等特点,能用于多种化合物的分离,如氨基酸、手性药物、维生素、杀虫剂、无机离子、有机酸、染料、肽和蛋白质、甚至整个细胞和病毒颗粒。被广泛应用于生命科学、生物技术、医学药物、环境科学、法医科学等诸多领域。
在手性拆分方面;毛细管电泳作为一种强有力的手性分离技术,已经成功的分离了多种类的手性物质,尤其在氨基酸、肽的衍生物以及药物的手性分离领域应用最广,显示了其独特的优势。此外,电泳的方法开发较为简单,具有多种灵活变换的分离模式,样品用量少,而且几乎没有有机废液。
在氨基酸和二肽类物质的手性拆分研究领域,由于这些生物分子没有或者仅有微弱的紫外吸收,直接紫外检测满足不了低含量组分测定的要求,化学衍生化法应运而生。目前广为应用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛(OPA)、9-芴甲氧羰基氯(FMOC-Cl)和6—氨基喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC)。但是这些衍生试剂本身的一些特性决定了其应用的局限性。为此,本研究采用新型衍生化试剂,改变被测化合物特性,进行了毛细管电泳的氨基酸和二肽对映体的手性拆分,结果令人满意。论文分三章:
第一章:
简单介绍了毛细管电泳的发展及其在医学药物、生命科学、生物技术、法医科学等领域的应用情况。对手性拆分的意义和毛细管电泳手性拆分相关的基础知识进行了简述。综述了毛细管电泳用于手性拆分的研究现状。
第二章:
1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯(BCEOC)用于氨基酸毛细管电泳手性拆分,包括三部分。
2.1 研究了毛细管区带电泳模式下氨基酸BCEOC衍生物的手性拆分情况。在毛细管区带电泳模式下,考察并优化了氨基酸BCEOC衍生物的手性分离条件,在15min内实现了七种单一氨基酸衍生物的对映体的基线分离,分离度均在1.2以上。所建立的方法简单、快速,拆分环境友好,获得的结果较为满意。
关键词: 毛细管区带电泳 ；毛细管胶束电动色谱 ；手性拆分 ；氨基酸 ；二肽
摘要： 高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展起来的一种简便、高效、灵敏、快速和微量的液相微分离分析技术,广泛应用于生命科学、化学和药学等研究领域,特别是在手性化合物分离、药物分析、生物大分子分析和环境分析等领域受到人们越来越多的关注,现已成为手性药物分离中有效的检测手段之一。在毛细管电泳手性分析中,通常是将手性选择剂加入背景电解质中构建手性分离环境,在分离过程中由于不同构型的对映体与手性选择剂的相互作用不同,导致不同对映体的有效电泳淌度不同,最终达到分离的目的。
本论文以天然β-环糊精（β-CD）为基础,合成了4种新型手性选择剂,并用于毛细管电泳分离和测定手性邻二醇、手性芳香仲醇和手性氨基酸等多种手性化合物,并对手性分离的原理进行了初步探讨。主要研究工作有以下几个方面:
1.在文献基础上,以CaH2为缚酸剂,合成了用于不对称双羟基化反应（AD反应）的手性配体（QN）2PHAL,将其用于8种潜手性烯烃的AD反应,取得了良好的实验结果。在此基础上,以天然β-CD作为毛细管电泳手性选择剂,建立了快速有效的分离8种烯烃AD反应产物对映体的新方法,并探讨了影响手性分离的若干原因。在优化的电泳条件下,所有邻二醇对映体在15min内都实现了基线分离。用所建立的方法测定了AD反应合成样品的化学纯度和百分对映体过量值（%ee）。该法的测定结果与HPLC测定结果相一致。
2.通过对β-环糊精结构中C6-位的修饰,合成了2种阳离子型氨基化-β-环糊精（β-CDen和β-CDdien）手性选择剂。对氨基化-β-环糊精合成过程中的重要中间体（6-OTs-β-CD）的合成方法进行了改进,简化了操作步骤,将化学产率从11%提高到23%。然后在DMAP催化作用下该中间体分别与过量的乙二胺和二亚乙基三胺作用,分别以50.3%和51.6%的产率得到β-CDen和β-CDdien。在此基础上,将合成的二种氨基化-β-环糊精用于手性拆分中性邻二醇对映体,取得了良好的手性分离效果,其手性识别能力明显优于天然中性β-环糊精,特别是对端基手性邻二醇表现出更加独特的手性识别作用。以β-CDen为优选的手性选择剂,建立了毛细管电泳分离分析8种手性邻二醇的新方法,在优化条件下8种手性邻二醇均得到基线分离。用建立的方法测定了8种不对称二羟化反应产物的百分对映体过量值（%ee）,并与HPLC方法的测定结果比较,二者完全一致。
3.以高磺化-β-CD作为毛细管电泳手性选择剂,建立了有效分离7种手性芳香仲醇对映体的新方法,在优化的电泳条件下,所有芳香仲醇对映体均实现了基线分离。用所建立的方法测定了芳香酮不对称氢转移反应产物芳香仲醇的百分对映体过量值（%ee）,其测定结果与GC和HPLC测定结果完全一致。
4.以天然L-（+）-酒石酸为原料,经酯化、羟基保护、还原、与MsCl酯化、叠氮化、催化还原等六步反应合成了（2S,3S）-（+）-2,3-O-异丙叉-1,4-丁二胺。再以（1R,2R）-（-）-1,2-二氨基环己烷和（2S,3S）-（+）-2,3-O-异丙叉-1,4-丁二胺为原料,在天然β-环糊精结构中引入二类不同的手性基因中心,分别合成了二种新的阳离子型手性胺-β-环糊精手性选择剂,将二者用于毛细管电泳手性拆分阴离子化合物。在100mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲体系中,20℃柱温,15kV操作电压下,对10种丹酰化氨基酸和N-乙酰苯丙氨酸对映体进行了手性拆分,取得了良好的分离效果,同时,对4种氨基酸混合样品进行分析,亦取得了满意的对映体分离。
关键词: 毛细管电泳 ；手性选择剂 ；对映体分离 ；手性配体 ；手性邻二醇 ；不对称双羟化反应 ；手性芳香仲醇 ；手性氨基酸 ；对映体过量 ；硼酸盐络合物
摘要： 近年来,手性药物的研究已经成为国际新药研究的新方向之一,其市场逐年扩大。所以,用于手性分离的手性固定相自然引起了大家的关注。不对称合成是获得手性物质的重要方法之一,而要实现不对称合成必须得向反应体系中引入手性源。在天然存在的手性源中,α-氨基酸成为最重要的一类。
本文首先以N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)为缩水剂、4-二甲氨基吡啶(DMAP)为酰化催化剂,以N-Boc-L-丙氨酸、N-Boc-L-苯丙氨酸、N-Boc-L-亮氨酸、N-Boc-L-异亮氨酸、N-Boc-L-缬氨酸、N-Boc-L-脯氨酸、N-Boc-L-色氨酸为手性源,与正丁胺反应合成了酰胺类化合物。
然后在弱酸条件下,脱除第一步产物的N-Boc保护基,游离出氨基。
第三步以酰氯为酰化剂、三乙胺为缚酸剂,以第二步产物与不饱和酰氯反应,制备了7种酰胺类手性可聚合单体。
通过实验确定出制备手性单体的最佳反应条件和物料配比,并对反应机理进行了探讨。通过红外光谱、核磁共振及有机元素分析对产物进行了表征。
研究了其中几种单体的均聚及其与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯的共聚反应。通过红外光谱、自动旋光仪对手性聚合物进行了表征。拟作为手性拆分试剂或者毛细管电泳的手性涂层。
关键词: 手性源 ；氨基酸 ；手性拆分 ；酰胺 ；聚合物
摘要： 第一部分：人甲状旁腺素1-34肽的制备
第一章：人甲状旁腺素1-34肽的化学合成
目的 以wang树脂为载体，应用Fmoc/tBu方法合成人甲状旁腺素。方法 Fmoc保护氨基酸用TBTU/HoBt活化后，进行缩合反应。合成的多肽用TFA处理，从wang树脂上切除。所得粗肽用SP-Sepharose-FF层析柱和半制备型HPLC分离纯化。结果 用RPHPLC和毛细管电泳法鉴定纯度在92%以上。通过电喷雾质谱法测定其分子量为4116Da，与计算值相符。总收率为8%。结论 本工艺简单，易于扩大，适合于规模化生产。
第二章：人甲状旁腺素1-34肽的基因工程表达
采用全基因分段合成和补丁连接相结合的方法构建了人甲状旁腺素（hPTH）（1～34）肽基因，并利用GST融合表达系统，在大肠杆菌中克隆和可溶性表达了hPTH（1～34）肽基因。融合蛋白表达量占菌体总蛋白质的25%以上，经高密度发酵、亲和纯化后，融合蛋白的纯度达到了90%以上。融合蛋白分别经过酶切后加工后，可以得到天然的人甲状旁腺素（1～34）肽纯品，样品的理论回收值达到了24.4%和48.75%。产物的纯度和性质经HPLC、毛细管电泳、质谱分析、N端测序等得到证明，并与化学合成产物的结果相吻合。兔肾皮质细胞测活表明，重组产物与化学合成人甲状旁腺素（1～34）肽具有相近的腺苷酸环化酶激活活性。
第二部分：人胸腺素α1的制备及其与人干扰素α-1b的融合表达研究
第一章：人胸腺素α1的化学合成
本文以Fmoc保护氨基酸和wang树脂为原料，TBTU-HoBt为缩合剂。采用固相多肽合成方法制备胸腺素α1。用TFA切肽后，产品的平均总收率可达13%以上。本工艺简单，易于扩大，适合于规模化生产。
第二章：人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达
利用基因工程表达的方法，在大肠杆菌中通过融合方式高效表达了胸腺素α1前体基因，随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式，得到了胸腺素前体肽段31肽和N-端未经乙酰化的28肽。其中融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%-40%，样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定，分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明，所构建的GST-Tα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用，其中N-端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近，均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。
第三章：人胸腺素α1与人干扰素α-1b的融合表达研究
为了构建人胸腺素α1与干扰素α1-b的融合蛋白(TA1-IFN)，以获得高活性免疫功能的新型基因工程药物。本文采用了3'-末端互补高温聚和酶延伸与PCR相结合的方法，人工合成了TA1-IFN融合基因。在融合基因中，5'端为人胸腺肽α基因，3'端为干扰素α1-b基因，两者中间采用GGGGSSGGGG连接肽段进行连接。在基因构建的过程中，还同时修改了融合基因中的部分密码子，尤其是精氨酸密码子，将这部分在大肠杆菌中比较稀有的密码子转换成大肠杆菌的优选密码子。合成的基因克隆到pET-22b(+)载体中，获得了表达质粒pET-TIN，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得了高效表达工程菌。表达后的融合蛋白以包含体的形式存在，其含量达到了菌体总蛋白的20%左右。包含体蛋白复性后经Q-Sepharose柱和Hiload 26/60 Sephadex75柱分离纯化，可得到TA1-IFN融合蛋白产物，其纯度达到95%以上。融合蛋白在保留了TA1和IFNα1-b活性的同时，还表现出一定程度上的协同增强作用。另外，还在文中对TA1-IFN融合蛋白的二级结构进行了模拟预测
关键词: 胸腺素α ；干扰素α ；大肠杆菌 ；甲状旁腺素 ；PTH ；双酶切 ；肠激酶
摘要： 毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管电分离法（CESM）,是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力、依据样品各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的高效、高选择性的新型液相分离分析技术。该方法具有高效、快速、自动化程度高、试剂消耗少、环境污染小等优点,在十几年的时间中,特别是在最近几年,受到分离分析科学家的极大关注,已成为生物化学和分析化学中最受瞩目,发展最快的分离分析新技术之一。
糖是自然界和生物体中广泛存在的物质。长期以来人们认为糖的主要功能是提供能量,而新兴的糖生物化学研究发现糖类物质除了提供能量外还有其它多方面的生物活性与功能。氨基酸是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位,与生物的生命活动有着密切的关系,它在抗体内具有特殊的生理功能,是生物体内不可缺少的营养成分之一。氨基酸、糖类是生命有机体的重要组成部分,研究其毛细管电泳分离对生物、医药、食品、卫生等领域都具有重要意义。
在糖类和氨基酸的研究领域,由于这些生物分子没有或者仅有微弱的紫外吸收,直接紫外检测满足不了低含量组分测定的要求,化学衍生化法应运而生。目前广为应用的糖类衍生试剂主要有酰肼类、氨基吡啶类、苯胺类等,氨基酸衍生化试剂主要有邻苯二甲醛（OPA）、9-芴甲氧羰基氯（FMOC-Cl）和5-二甲氨基萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）等,但是这些衍生试剂本身的一些特性决定了其应用的局限性。为此,本文采用实验室自行合成的新型衍生化试剂,改变被测化合物的特性,进行了糖类物质和氨基酸的毛细管电泳分离,结果令人满意。
论文分三章:
第一章
简单介绍了毛细管电泳的发展及其在药物分析、生物分子分离、基因工程研究、临床医学等各方面的应用,详细介绍了其在糖类、氨基酸分离方面的应用,并对毛细管电泳分离被分析物的策略及其相关的基础知识进行了阐述。
第二章
新型衍生试剂1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮（NMP）用于单糖的毛细管电泳分离,分为四部分。
2.1研究了毛细管区带电泳模式下单糖NMP衍生物的分离情况。考察并优化了单糖NMP衍生物的分离条件,在18min内实现了九种单糖衍生物的基线分离,并在此基础上进行了白刺和蜂花粉实际样品的测定,获得的结果令人满意。
2.2以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）作为柱前衍生试剂,在毛细管区带电泳模式下,考察并优化了单糖衍生物的分离条件,实现了九种单糖衍生物的基线分离。
2.3对毛细管区带电泳模式下单糖NMP衍生物和PMP衍生物的分离进行了比较与总结。通过比较两种试剂的异同及两种试剂衍生单糖分离效果的异同得出结论:NMP衍生单糖在毛细管电泳分离中具有更高的检测灵敏度。
2.4研究了胶束电动毛细管色谱模式下单糖NMP衍生物的分离情况。考察并优化了单糖NMP衍生物的分离条件,在10分钟内实现了八种单糖衍生物的基线分离。分离快速、简单,结果令人满意。
第三章
2-（11H-苯[a]咔唑）乙基氯甲酸酯（BCEC-Cl）作为柱前衍生试剂用于氨基酸的毛细管电泳分离,分为两部分。
3.1以2-（11H-苯[a]咔唑）乙基氯甲酸酯（BCEC-Cl）作为柱前衍生试剂,在甲酰胺为溶剂,醋酸-醋酸铵为缓冲体系,毛细管柱长58.5 cm（有效长度50 cm）,18℃,30 kV,压力进样12s,279 nm二极管阵列检测（DAD）条件下,采用非水毛细管电泳模式考察并优化了氨基酸衍生物的分离条件,在不加任何添加剂的情况下实现了16种氨基酸的基线分离。
3.2以2-（11H-苯[a]咔唑）乙基氯甲酸酯（BCEC-Cl）作为柱前衍生试剂,在β-环糊精（β-CD）作为手性拆分试剂,Tris-H3PO4为缓冲体系,十二烷基硫酸钠（SDS）为表面活性剂,毛细管柱长58.5 cm（有效长度50 cm）,20℃,20 kV,压力进样10s,279 nm二极管阵列检测（DAD）条件下,采用胶束电动毛细管色谱模式考察并优化了氨基酸对映体的分离条件,实现了15种氨基酸的手性拆分。
关键词: 毛细管电泳 ；糖类 ；氨基酸 ；1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)
被引量
4
摘要： 毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。它具有高效、快速、样品用量少等特点，被广泛应用于生命科学、生物技术、医学药物、环境科学、法医科学等诸多领域。
毛细管电泳的一个分支----非水毛细管电泳(nonaqueous capillary electrophoresis，NACE)，不但具有毛细管电泳的优点，而且与水相毛细管电泳相比它拥有自己独特的特点与优势。其研究范围也在不断扩大，其中包括无机离子、中性物质、有机酸、多肽、聚糖、药物及其代谢物的分离等，涵盖了基础研究和分析应用两个方面。但目前很多非水溶液的物理化学性质还不是很清楚，而且有机试剂的种类繁多，这都给试剂的选择带来一定的困难。对溶剂系统选择的规律和优化方法的研究应是今后一段时间研究的重点，可为研究者提供不少课题。
氨基酸、二肽是生命有机体的重要组成部分，研究其非水毛细管电泳分离对蛋白质多肽的研究、以及医药、食品、卫生等领域都具有重要意义。但由于大多数的氨基酸和肽没有或只有很弱的紫外吸收，直接紫外检测满足不了低含量组分测定的要求。衍生试剂的研究和应用不仅可以克服仪器分析方法在某些方面的局限性，而且在化学方法的分离、富集和检测中起着重要的作用。目前广为应用的衍生试剂主要有9-芴甲氧羰基氯(FMOC)、邻苯二甲醛(OPA)和5—二甲氨基萘—1—磺酰氯(DNS—Cl)。但是这些衍生试剂本身的一些特性决定了其应用的局限性。为此，本文采用新型衍生化试剂，改变被测化合物的特性，进行了氨基酸和二肽的非水毛细管电泳的分离，结果令人满意。
论文分三章：
第一章：
简单介绍了非水毛细管电泳的发展及其在药物分析、手性拆分、无机离子分离等各方面的应用。并对非水毛细管电泳分离被分析物的策略及其相关的基础知识进行了阐述。
第二章：
二肽衍生物的非水毛细管电泳分离研究，采用新型衍生试剂1，2-苯并-3，4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯(BCEOC)作为柱前衍生试剂，利用非水毛细管电泳模式对二肽进行了分离，考察试剂用于二肽分离的几个关键条件，实现了11种氨基酸的快速基线分离。
第三章：
非水毛细管电泳对氨基酸衍生物的分离研究，包括两部分：
3．1非水毛细管电泳对BCEOC氨基酸衍生物的分离研究，以1，2-苯并-3，4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯(BCEOC)作柱前衍生试剂，考察了不同有机溶剂及不同电解质对分离的影响，同时对分离过程中的相关参数进行了优化，在不加任何添加剂的情况下，实现了14种氨基酸的基线分离。
3．2非水毛细管电泳对BCEC-Cl氨基酸衍生物的分离研究，以2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)作为柱前衍生试剂，采用醋酸铵醋酸为电解质，甲醇乙腈混和液为有机溶剂对氨基酸衍生物进行了分离，实现了11种氨基酸的基线分离。
关键词: 非水毛细管电泳 ；氨基酸 ；二肽
被引量
1
摘要： 由β-氨基酸构成的拟多肽即β-肽的药理活性和构效关系的研究是近年来药物科学领域的热点问题之一。将β-氨基酸引入多肽结构中,克服了α-肽易被蛋白水解酶降解、口服可获性低等缺陷,β-肽显示出抑制代谢的活性、具有更加稳定的二级结构且与目标酶和受体显示更强的亲和力。β-肽对映异构体在体内可能表现出不同的药理活性和药代动力学性质。为了研究单一对映体的药理行为和代谢途经,首先必须获得β-肽的单一对映体。如果合成β-肽的消旋体再进行拆分,β-肽为大分子物质较难拆分;如果对其中间体β-氨基酸进行拆分,由于β-氨基酸为小分子物质且含有酸性和碱性基团,可选择的分离分析模式多、方法简便,得到的单一对映体再制备β-肽就较简单易行。在本论文中我们分别采用毛细管电泳法和高效液相色谱法这两种高效、简便、快速且应用最广泛的拆分手段,对β-氨基酸外消旋体进行了手性拆分并对其拆分机理进行了探讨,而且实现了制备,并在此基础上初步探索了化学法和酶法拆分β-氨基酸。 为了快速测定消旋体中的对映体比例,我们首先建立了β-氨基酸的毛细管电泳手性分离分析方法。以酒石酸为原料,经过酯化、酰胺化、环合、脱酰胺保护等步骤合成了手性拆分试剂18-冠-6-四羧酸（18C6H4）。基于在低pH时氨基酸对映体以伯胺离子形式与18C6H4形成的两种非对映体络合物,在毛细管电泳的条件下,两者具有不同的迁移时间而得以分离。以手性冠醚为手性添加剂的毛细管电泳法成功地用于五种β-氨基酸对映体的分离,分离因子高达1.08。实验结果表明,该方法快速、简便,可以用于非色谱法拆分β-氨基酸的监测方法。 发展了β-氨基酸的高效液相色谱手性分离分析方法。首先在流动相中加入光学纯L-α-氨基酸作为手性配体,通过流动相中Cu2+与β-氨基酸的D-和L-型对映体形成两种非对映体的络合物平衡常数的差别,在反相液相色谱系统中可实现β-氨基酸对映体的拆分。该法选择性高,但系统平衡慢、基线波动大、色谱柱易堵塞。为了克服上述弊端,我们将L-α-氨基酸键合于硅胶上,制备了手性配体交换色谱固定相,用于β-氨基酸对映体的分离。结果表明该方法可实现β-氨基酸对映体的快速定性、定量分析,还可用于对映体的制备分离。 进一步研究了配体交换快速色谱制备β-氨基酸对映体的方法。选用以阳离子交换树脂和十八烷基键合硅胶为吸附剂的固相萃取法从色谱流出液组分中除Cu2+,并优化了纯化条件。 本文还对非色谱法如化学成盐法和酶法拆分β-氨基酸进行了初步的摸索,但是未取得成效,有待进一步筛选成盐手性拆分试剂和酶。
关键词: β-氨基酸 ；手性拆分 ；毛细管电泳法 ；18-冠-6-四羧酸 ；高效液相色谱法 ；快速色谱 ；固相萃取
被引量
5
摘要： 生物医学的迅速发展对疾病诊断及治疗药物监测的分析方法提出了更高的要求。氨基酸类神经递质和蛋白质类细胞因子是生物体内重要的生物活性物质，也是某些神经性疾病与癌症的特征性物质。由于氨基酸类神经递质和蛋白质类细胞因子所存在的生物体系基质复杂、组分多且含量低，因此对分析方法的分离度、灵敏度和选择性均有很高的要求。手性药物口服或注射到人体内后，药物分子由血液转移到其作用靶点，药物对映体在血液中浓度的测定及与血清蛋白质结合常数的测定，对于手性药物的药理学和立体选择性药代动力学研究具有重要意义。
本论文将毛细管电泳分离技术与激光诱导荧光检测、免疫分析、电动场放大进样等技术相结合，建立了生物样品中的氨基酸类神经递质与一种蛋白质类的巨噬细胞生物活性因子（daintain／AIF1）和四种手性药物卡替诺尔、氟西汀、美多心安和苯海索的高效、灵敏和选择性好的CE分离检测方法，并研究了卡替诺尔和氟西汀与人血清白蛋白（HSA）的相互作用。在系统查阅有关文献资料的基础上，进行了以下研究工作：
（1） 以荧光素异硫氰酸酯（FITC）为衍生试剂，建立了毛细管电泳-激光诱导荧光分离测定大白鼠脑皮质中氨基酸神经递质的分析方法。对氨基酸神经递质的衍生条件和CE分离条件进行了系统的考察和优化。最佳衍生反应条件为：5mM硼砂缓冲液（pH9.6），FITC／氨基酸的比例为30：1，室温下（20℃）避光反应16小时。最佳CE分离条件为：在57cm（总长）×75μm（内径）毛细管中，以15mM硼砂缓冲液（pH9.2）为CE背景电解质，分离电压17.5kV，分离温度25℃。在此分离条件下，六种氨基酸神经递质得到基线分离，检测限在2.1×10-11-6.3×10-10M之间。用此CE-LIF法监测了脑缺血所引起的大白鼠脑皮质中各种氨基酸神经递质含量的变化和中药黄芩甙对脑皮质中各种氨基酸神经递质量的影响。研究结果初步表明：脑缺血能引起脑皮质中谷氨酸、天冬氨酸、γ氨基丁酸、甘氨酸含量显著增高；注射黄芩甙能抑制由脑缺血引起的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸含量的增高，证明黄芩甙对神经系统具有保护作用。
（2） 将竞争性免疫分析法与毛细管电泳—激光诱导荧光法相结合，首次建立了异源移植性感染因子（daintain／AIF1），一种蛋白质类的巨噬细胞生物活性因子的毛细管电泳免疫分析法。将daintain用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记，用高效液相
色谱法分离纯化标一记后的daintain。将纯化后的F工Tc一daintain与未标记的
dain七ain和daintain抗体进行竞争性的cE分析。对影响免疫结合反应的实验条件、
CE工A分离条件进行了研究和优化。最佳CEIA条件为:8.0 x 10一“M的daintain抗体、
1.Ox10一‘M FITC一daintain和样品daintain于室温下，在磷酸盐等渗缓冲溶液中温
育反应25分钟后，在37（cIn）x 50，m（内径）未涂层的毛细管中，以含0.05%经丙
甲基纤维素（HPMC）的硼砂缓冲溶液为背景电解质进行CE分析。在此CEIA分析体系中，
游离的F工TC一daintain与抗原抗体复合物在7分钟内得到分离，daintain的检测限
为3.4nM，质量检测限为17amol。定量分析相对标准偏差为2.3%一3.8%，回收率为
96.3十98.2%。该毛细管电泳免疫分析法具有灵敏度高、专一性强、无放射性污染的
优点。将此方法应用于白血病患儿血清中 dainta如的测定，结果令人满意。
（3）在毛细管电泳/紫外检测体系中，以梭甲基一p一环糊精、轻丙基一旦一环糊
精、二甲基一p一环糊精为手性选择剂，对四种手性药物:卡替诺尔（Carteolol）、氟
西汀（fluoxetine）、美多心安（metoprolol）和苯海索（trihex邓henidyl）进行了手性
分离研究。实验发现:荷电性的梭甲基一p一环糊精（CM一p一CD）对四种手性药物具有
最佳手性拆分效果。以CM一p一CD为手性选择剂，对 CE背景电解质中CM一p一CD浓度
和pH值、操作电压和温度等操作参数进行了优化，建立了四种手性药物的CE分离
方法。四种药物对映体在各自的最佳CE分离条件下，分别在13一26分钟内，得到完
全分离。苯海索、美多心安、卡替诺尔和氟西汀四种对映体的检测限分别为12.sp
M、10.1 pM、1.83协M和5.10pM。回收率在99.2一102.1之间。该分析方法具有手
性分离度高、快速和操作简单的特点。
（4）将电动场放大进样技术和毛细管电泳手性分离技术相结合，首次建立了氟
西汀、美多心安、苯海索和卡替诺尔四种手性药物的电动场放大进样/毛细管电泳
（FAS工/CE）分离检测方法。对影响灵敏度增强因子的电动场放大进样操作条件作了系
统的研究和优化。最佳条件为:采用80/20的甲醇/水混合液（含30一80 p M H3P04）作
为样品溶液;予进样水塞（0.sp.5.1，55）后，以电动进样（10一15kV， 55）的方式进样、
毛细管电泳手性分离。在该条件下，氟西汀、卡替诺尔、苯海索和美多心安对映体的
检测限分别为10.InM、1.81 nM、26.0 nM和17.snM;与普通流体力学压力进样方式
相比，四种药物对映体的检测灵敏度提高480一1000倍。该FAS工/CE分析方法具有灵
敏度高、操作简便和分析成本低的特点。将此分析方法应用于血清中卡替诺尔和氟西
汀对映体的分离测定，结果令人满意。
（5）在毛细管电泳一激光诱导荧光检测系统中，以4一氟一7一硝
关键词: 毛细管电泳 ；氨基酸神经递质 ；蛋白质 ；手性药物 ；激光诱导荧光检测