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摘要： 目的探讨氯离子通道阻滞剂—5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸5-nitro-2-(3-phenyl-propylamino)-benzoic acid,NPPB对人眼小梁细胞吞噬功能的影响。方法培养人眼小梁细胞,对其进行免疫化学染色鉴定,采用RT-PCR技术检测小梁细胞CLC-2mRNA的表达,然后应用流式细胞仪定量检测不同浓度NPPB作用下,小梁细胞对乳胶株的吞噬指数。结果体外培养的人眼小梁细胞NES染色阳性,且成功检测出CLC-2mRNA表达。当加入10μmol/L的NPPB作用6h后,小梁细胞对乳胶株的吞噬指数与对照组相比无明显改变(P>0.05),而50μmol/L的NPPB作用后,小梁细胞对乳胶株的吞噬作用明显降低(P<0.01),低于对照组,且随着加入NPPB浓度的增加,吞噬指数逐渐降低。结论氯离子通道阻滞剂浓度依赖的抑制小梁细胞的吞噬功能,且氯离子通道CLC-2可能参与调节小梁细胞吞噬过程。
关键词: 5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸 ；小梁细胞 ；吞噬
被引量
3
摘要： 背景氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）对家兔心肌细胞缺血-再灌注损伤时的细胞凋亡有促进作用，而小梁细胞上也存在C1C型氯离子通道及容积敏感性氯离子通道，但NPPB究竟会对小梁细胞的形态和功能产生什么影响尚不清楚。目的探讨氯离子通道阻滞剂NPPB对人眼小梁细胞增生及细胞周期、细胞凋亡的影响。方法将处于对数生长期的永生株人眼小梁细胞进行培养并以1×10^6个／ml的密度接种于96孔培养板，将不同浓度（10、50、100μmol／L）的NPPB分别加入小梁细胞培养基中，通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组小梁细胞的增生情况以吸光度（A）值表示；采用流式细胞术测定小梁细胞的细胞周期。将100mg／L5-氟尿嘧啶（5-Fu）加入培养的细胞中，而另-组培养的细胞中加入100mg／L5-FU＋100μmol／LNPPB，用AnnexinV—PI法检测各组小梁细胞的凋亡情况；罗丹明123法检测细胞线粒体膜电位（Adam），分别评估各浓度NPPB对培养的人小梁细胞生长和存活的影响。结果3种不同浓度的NPPB与小梁细胞共同孵育48h后4个组小梁细胞的增生率差异有统计学意义（F=7．230，P=0．006），50Izmol／L、100Fxmol／LNPPB作用后小梁细胞的A值明显低于10μmol／LNPPB组，50μmol／LNPPB组、100μmol／LNPPB组与空白对照组比较差异均有统计学意义（t=1．610，P=0．025；t=12．270，P=0．001）。小梁细胞培养基中加入NPPB48h后，G0／G1期的细胞比例增多，S期细胞比例减少，各细胞周期小梁细胞的比例与未加NPPB的组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。用5-FU作用24h及48h后，100mg／L5-Fu组和100mg／L5-FU＋100μmol／LNPPB组的细胞凋亡率均较其各自空白对照组增加（t24h=2．130，P=0．023；t48h=4．810，P=0．011）；100mg／L5-Fu＋100μmol／LNPPB组细胞凋亡率明显高于100mg／L5-Fu组，差异均有统计学意义（t24h=1．980，P=0．037；t48h=1．290，P=0．028），小梁细胞线粒体膜电位降低，差异均有统计学意义（t24h=1．580，P=0．029；F48h=6．200，P=0．015）。结论氯离子通道阻滞剂NPPB可抑制小梁细胞增生，抑制小梁细胞通过G1／S期限制点进入s期；NPPB对5-Fu诱导的小梁细胞凋亡有促进作用，与内源性线粒体凋亡通路相关。
关键词: 氯离子通道阻滞剂 ；5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸 ；小梁细胞 ；凋亡 ；增生
被引量
1
摘要： 目的探讨氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸〔5-nitro-2-（3-phenyl-propylamino）-benzoic acid,NPPB〕对体外培养人眼小梁细胞增殖的影响。方法RT-PCR检测体外培养人眼小梁细胞ClC-3mRNA表达,用不同浓度的NPPB作用体外培养的人眼小梁细胞,台盼蓝染色细胞计数法检测细胞存活率,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测其增殖能力。结果体外培养人眼小梁细胞存在ClC-3mRNA表达;不同浓度NPPB作用后小梁细胞存活率无显著差异;在一定浓度范围内（50-100μmol/L）,NPPB均可使体外培养的人眼小梁细胞增殖能力下降,其中100μmol/LNPPB的作用最强。结结论一定浓度的NPPB可降低体外培养的人眼小梁细胞增殖能力。
关键词: 5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB) ；小梁细胞 ；青光眼 ；RT-PCR ；MTT法
被引量
2
摘要： 原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是一种慢性进行性视神经病变,病理性高眼压伴有典型的视神经凹陷、萎缩及视野缺损,房角是开放的[1]。POAG患者眼压升高,主要是由于房水排出的阻力增加,而产生阻力的部位主要位于小梁网。小梁细胞作为小梁网内皮细胞,其数量、结构及功能的异常,必然会引起眼压升高,导致POAG的发生、发展[2]。因此,我们致力于通过研究小梁细胞数量以及功能变化的调节因素,来揭示POAG的发病机制。
氯离子通道是一种跨膜蛋白,通过细胞膜内外存在的跨膜浓度梯度,使氯离子参与细胞的体积、增殖、PH、静息电位、兴奋的调节等各种生理过程[3]。ClC型氯离子通道即电压门控氯离子通道,是目前研究最多的一类氯离子通道。ClC-2作为ClC型氯离子通道的一个亚型,具有分布广泛的特点,目前已证实氯离子通道ClC-2在脑、小肠、结肠、胃、肾、心脏等组织上均有表达[4]。有研究显示:胶质瘤细胞上ClC-2的表达上调,且ClC-2基因表达受抑制后,细胞增殖能力降低[5];使用ClC-2的特异性抑制剂Cd+可以抑制神经胶质瘤迁移[6];特发性全面性癫痫家系中发现了CLCN2的3种不同杂合子突变[7];ClC-2基因敲除小鼠小脑白质空泡变性严重[8];ClC-2缺陷使视网膜色素上皮细胞跨细胞膜运输障碍[9]。由此可见,氯离子通道ClC-2不仅在多种疾病的发生、发展中起重要的作用,而且其功能在不同组织、细胞上也并不完全相同。
细胞凋亡(Apoptosis)是指有核细胞在一定条件下,通过启动其自身内部机制而发生的一种细胞自然死亡过程。已有实验证实:糖皮质激素诱导的小梁细胞凋亡是激素性青光眼发病的重要机制[10];TGF-β导致的小梁细胞凋亡增加是其促进POAG发生、发展的重要因素[11];而氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸( 5-nitro-2-(3-phenyl-p ropylamino)-benzoic acid,NPPB)可以促进心肌细胞凋亡,增加缺血诱导的心肌梗死面积[12];使用氯离子通道阻滞剂NPPB可以诱导皮质神经元凋亡[13]。由此可见,不仅小梁细胞凋亡的发生,会对POAG的发生、发展产生重要影响,而且作为ClC型氯离子通道的一种亚型,氯离子通道ClC-2极有可能通过参与对小梁细胞凋亡的调节,进而在POAG的发生、发展中发挥重要作用。
因此本实验拟通过研究氯离子通道ClC-2对人眼小梁细胞活力、凋亡的影响,及ClC-2能发挥相应作用的调节因素,来论证ClC-2与POAG之间的关系。
关键词: 小梁细胞 ；ClC-2 ；青光眼 ；Hsp90
被引量
1
摘要： 原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是主要的不可逆性致盲眼病之一,其中高眼压是青光眼性视神经损伤的主要危险因素。大量研究表明,眼压升高的原因是房水外流阻力增高,其病理部位已锁定小梁网。而小梁细胞作为小梁网的内皮细胞,其形态、结构和功能的异常将引起房水外流受阻,导致POAG的发生和发展[1]。
POAG的主要病理变化包括小梁细胞数量、细胞间连接、细胞外基质的改变,以及小梁细胞的凋亡等。而有关离子通道,尤其是ClC(chloride channel)氯离子通道的研究表明,氯离子通道具有维持细胞的容积平衡、调节细胞电活动的功能,并且在细胞增殖、迁移、凋亡等多种生理、病理过程发挥重要作用[2-3],而这些作用与POAG的主要病理改变密切相关。氯离子通道广泛分布于哺乳动物的组织、器官和各种细胞中,目前已克隆出从ClC-1到ClC-7及ClC-ka、ClC-kb等九种ClC氯离子通道家族成员。通过RT-PCR已证实人小梁细胞表达ClC-2、ClC-3、ClC-5等多种氯离子通道[4];David指出氯离子通道在维持小梁细胞体积、调节房水外流易度、保持小梁细胞体内平衡等方面发挥重要作用[5]。
本研究以小梁细胞及氯离子通道家族的一个亚型ClC-3作为研究对象,探讨ClC-3氯离子通道在小梁细胞中的作用。首先应用RT-PCR及细胞免疫化学方法,检测ClC-3氯离子通道在永生株人眼小梁细胞中的表达。然后应用氯离子通道阻滞剂NPPB,通过MTT法、细胞周期同步化、5-FU诱导细胞凋亡、罗丹明123细胞线粒体膜电位(△Ψm)检测及建立小梁细胞吞噬乳胶株模型等方法,分别研究NPPB对小梁细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电势及细胞吞噬功能的影响。由于氯离子通道阻滞剂NPPB对于多数氯离子通道均有阻断作用,对于ClC-3氯离子通道只具有相对特异性,因此我们采用反义寡核苷酸技术,特异性地抑制ClC-3氯离子通道蛋白在小梁细胞的表达,进而检测ClC-3氯离子通道在小梁细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电势及细胞吞噬中的作用,从而为原发性开角型青光眼发病机制提供进一步的实验依据。
关键词: ClC-3 ；小梁细胞 ；反义寡核苷酸 ；增殖 ；凋亡 ；吞噬
被引量
2