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摘要： 为研究海洋放线菌杀线虫活性物质,通过液体发酵对81株海洋放线菌进行杀线虫活性筛选,然后对活性菌株的发酵液进行分离纯化,并对单体化合物进行杀线虫筛选.筛选出一株海洋放线菌具有较高杀线虫活性,线虫死亡率达到89.9%.该菌株经鉴定为Streptomyces avidinii,并从其发酵液次级代谢产物中得到7个化合物,分别为pyrrole-2-carboxamide(1)、N-(3-(1H-indole-3-yl)propyl)acetamide(2)、p-hydroxybenzyl alcohol(3)、N-acetyltyramine(4)、4-methyl-1-phenylpentane-2,3-diol(5)、1H-indole-3-aldehyde(6)以及zarzissine(7),其中化合物3和4的杀线虫活性较好.
关键词: 线虫 ；海洋放线菌 ；次生代谢产物 ；发酵液
被引量
1
摘要： 筛选对松材线虫具有毒杀作用的生防放线菌。通过组织分离法从八角枫茎、叶、枝组织中共分离得到17株内生放线菌,经摇瓶培养、乙酸乙酯萃取制备胞外、胞内次生代谢产物,采用浸渍法开展内生放线菌代谢产物对松材线虫的室内毒力实验。从中筛选出2株内生放线菌(G-5和G-17)的胞外代谢产物杀线虫活性显著,G-5和G-17胞外发酵产物经24 h处理后LC_(50)值分别为0.9527和0.4196mg·mL^(-1)。通过形态学观察和分子生物学手段16SrDNA的序列分析对两株活性菌株进行鉴定,经鉴定二者均属链霉菌属(Streptomyces)。结果表明:八角枫内生放线菌G-5、G-17胞外发酵产物对松材线虫具有较高的毒杀活性,在松材线虫病的生物防治中具有潜在的应用价值。
关键词: 松材线虫 ；八角枫 ；内生放线菌 ；胞外发酵产物
被引量
2
会议时间： 2010-10-28
摘要： 根结线虫病Meloidogyne spp.是一类重要的植物病害,严重地制约了世界农业生产的发展。对于根结线虫病的防治,长期以来以化学防治为主。然而,化学杀线虫剂具有对环境污染严重,对人畜不安全和生态效益差等问题越来越引起人们的重视。国内外科学家除了继续探索一些高效、低毒、低残留、高选择性的杀线虫剂外,对植物根结线虫防治的研究越来越倾向于从生态角度寻找更有效、更安全的杀线虫活性物质。放线菌是自然界中的一类重要的资源微生物,它分布广,种类多,其次生代谢产物被广泛应用于医药、食品及农业领域,目前使用的医药及农业中抗生素60%来自于放线菌。本实验室2007年在门头沟区的土壤样本中分离到一株放线菌,室内实验发现F2菌株发酵培养滤液对根结线虫二龄幼虫有较强的毒杀活性,24h校正死亡率达到81.76%。针对上述情况,为了该高活性拮抗放线菌株在田间的进一步应用,本文拟对放线菌F2菌株进行种类鉴定和发酵条件优化研究。实验通过形态特征、培养特征、生理生化特征的观察和基于16SrDNA基因序列的相似性分析的方法对F2菌株进行鉴定;还以根结线虫二龄幼虫为靶标,通过测定菌株发酵粗提液对根结线虫二龄幼虫的致死率,来明确该菌株的最优发酵培养基配方和发酵条件。结果发现:F2菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性与《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)中描述的微白黄链霉菌Streptomyces albidoflavs的特征基本一致。通过PCR的方法克隆菌株F2的16S rDNA并进行测序,结果显示其长为1587 bp,在Gen-Bank数据库中将F2的16SrDNA序列进行相似性搜索,与菌株F2同源性最高的链霉菌属的种为微白黄链霉菌(S.albidoflavus,相似性99%),将菌株F2鉴定为微白黄链霉菌。另外,放线菌F2发酵条件的优化发现,7号培养基、pH 7.0、培养4～6d、转速180～210r/min、接种量4%、培养温度20～25℃为F2菌株杀虫活性最高的发酵条件;利用燕麦片、甘油作为碳源,黄豆粉和酵母粉作为氮源,有利于菌株F2产生杀虫活性物质,实验为F2菌株杀线虫活性物质的发酵培养提供了实验依据。
关键词: 根结线虫 ；放线菌 ；杀线虫活性 ；鉴定 ；发酵
被引量
1
会议时间： 2012-09-11
摘要： 从采自北京柳树的根际土中分离到对线虫和病害真菌具有较好生防活性的放线菌菌株BJLSH9。该菌株对烟草疫霉菌丝生长抑菌率达50.05%,48 h的杀线虫活性高达98.05%。在40 L发酵罐用38号培养基培养BJLSH9菌株,根据其生物活性及菌体生物量确定适宜的发酵时间为72 h。经16S rR NA基因分析,将BJLSH9菌株鉴定为黄抗霉素链霉菌(Streptomyces flavofungini)。从BJLSH9菌株的次生代谢产物中鉴定出一种杀线虫化合物tryptophandehydrobutyrine diketopiperazine(TDD),该化合物对线虫48 h的致死率为40%。黄抗霉素链霉菌及其产生的TDD化合物的杀线虫活性为本研究首次报道。
关键词: 黄抗霉素链霉菌 ；线虫相关复合侵染病害 ；烟草疫霉菌 ；杀线虫代谢产物
摘要： 香蕉是热带和亚热带地区重要的经济作物和粮食作物。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌热带4号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense tropical race 4,Foc TR4）引起的最为严重的病害之一。生物防治被认为是一种很有前途的防治策略。珊瑚是海洋珊瑚礁生态系统的重要组成部分,有着丰富多样的微生物群落,微生物群落具有部分物种特异性。海洋放线菌,特别是珊瑚共附生放线菌,近年来引起了人们的关注。本研究将海洋微生物特殊性与农业土传性病害相结合,选择中国南海西沙群岛5种软珊瑚为研究对象,分离、筛选和鉴定次级代谢产物具有抗Foc TR4活性的软珊瑚共附生放线菌,并对抗香蕉枯萎病活性化合物进行分离鉴定,及探究其抑菌机理;最后采用盆栽方法对活性菌株进行防效验证,及对土壤微生态环境的影响评价,以期获得新颖、独特、高活性、安全的生物防治剂。1.对中国南海西沙群岛豆荚软珊瑚（Lobophytum sp.）、短指软珊瑚（Sinlaria sp.）、冷柳珊瑚（Iciligorgia sp.）、聚裂丛柳珊瑚（Rumphella aggregata）和小月柳珊瑚（Menella woodin）进行可培养共附生放线菌的分离与鉴定,共分离到11个属132株具有代表性的放线菌,分别是Streptomyces,Ochrobactrum,Nocardiopsis,Pseudonocardia,Marinobacter,Glycomyces,Blastococcus,Saccharomonospora,Kitasatospora,Microbispora和Stenotrophomonas,其中Streptomyces和Saccharomonospora为优势属,分别占总数的71.97%和10.61%。这项研究有助于我们了解软珊瑚共附生微生物群落结构,为次生代谢产物生物活性菌株的筛选提供大量可培养放线菌资源。2.采用平板对峙法和TLC-生物自显影法（TLC-bioautography）,对132株软珊瑚共附生放线菌进行抗真菌活性筛选,其中49株表现出抗真菌活性,菌株2-6、2-11和H-7代谢产物表现出较强抗真菌活性。根据形态特征、培养特征、生理生化特征和16s r RNA分子生物学特征,鉴定菌株2-6、2-11和H-7为链霉菌属（Streptomyces sp.）。菌株2-6和H-7分别命名为:Streptomyces sp.2-6和Streptomyces sp.H-7。菌株2-11与最近同源标准株Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491（T）(EF408733)显示出较低相似率,利用全基因组数据进行多相分类鉴定,鉴定菌株2-11为链霉菌属新种,命名为Streptomyces xishaensis 2-11 sp.nov.。为了获得链霉菌2-6、2-11和H-7的高活性代谢产物,从5种发酵培养基中筛选到代谢产物活性最大的M1培养基,采用响应面优化法对发酵条件进行优化。优化后链霉菌2-6的抑菌活性为20.35 mm,较优化前（13.06 mm）提高19.35%;链霉菌2-11的抑菌活性为22.56 mm,较优化前（14.35mm）提高21.56%;菌株H-7的抑菌活性为24.73 mm,较优化前（15.82）提高23.73%。3.运用正、反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及制备高效液相等多种色谱分离手段,从链霉菌2-6、2-11和H-7中分离得到3个抗真菌活性化合物。采用核磁共振、高分辨质谱、红外等多种现代结构鉴定技术,结合文献检索,3个化合物被鉴定为Terrein（A7）、Niphimycin C（M1）和Tetramycins A（H1）,对Foc TR4的抑菌活性分别为33.67 mm、30.33 mm和26.33 mm。其中化合物A7是首次从放线菌中分离得到,对植物真菌性病害的抑菌活性属首次报道;化合物M1对植物真菌性病害活性也是首次报道;化合物H1对多种植物病原真菌抑菌活性有相关报道,但对香蕉枯萎病等土传性病害的抑菌活性为首次报道。4.基于香蕉枯萎病（Foc TR4）的肆虐蔓延,以Foc TR4为靶标病原菌,探究化合物A7、M1和H1的抑菌机理。结果表明:3种单体化合物对Foc TR4的EC50分别为25.76μg/m L、21.35μg/m L和17.60μg/m L。3种化合物可引起Foc TR4菌丝表面粗糙、不平整,出现萎缩、变细,发生断裂和破裂,且抑制分生孢子的产生;可造成Foc TR4孢子变形、皱缩、塌陷、弯曲和头部肿胀,发生断裂与破裂;可导致Foc TR4细胞细胞壁变薄,细胞器溶解消失,细胞组织崩解,细胞内形成空泡,囊泡出现,细胞质电子密度增加,线粒体数量明显增多,线粒体表面畸形凹陷、缺乏基质、内外膜清晰可见,嵴肿胀和结构无序;能够诱导激活几丁质酶,水解几丁质生成N-乙酰葡萄糖胺,引起Foc TR4细胞壁损伤。3种活性化合物还能抑制Foc TR4的生物合成,诱导其产生氧化应激与细胞凋亡。经活性化合物处理后,Foc TR4细胞内总糖、总蛋白和脂肪含量均随化合物浓度的增大而逐渐降低;且抑制Foc TR4线粒体ETC复合体酶和TCA关键酶的活性,促使活性氧累积,造成靶标菌氧化应激,导致线粒体结构和功能损伤,细胞代谢紊乱,进而导致细胞坏死。5.基于化合物A7和M1对植物真菌性病害的抑菌活性属首次报道。本章通过盆栽实验,进一步验证了链霉菌2-6和2-11对Foc TR4的防控效果,结果显示,接种Foc TR4的香蕉幼苗经链霉菌2-6和2-11处理后,有效抑制了Foc TR4进入香蕉根部和维管束,也降低了土壤中Foc TR4的数量,病原菌的生长繁殖得到有效防控。高通量测序结果表明,土壤中芽孢杆菌属（Bacillus）、乳酸菌属（Lactobacillus）、柄孢壳菌属（Podospora）、Plectosphaerella、Subulicystidium和线虫草属（Ophiocordyceps）相对丰度显著升高,且随着时间的推移,呈倍数增长;而镰刀菌属（Fusarium）相对丰度在持续降低,在处理后期,分别降低了49.03%和46.66%（P<0.05）。此外,链霉菌2-6和2-11对香蕉植株有促生长作用,与对照相比较,叶绿素含量分别提高27.10%和51.07%,株高分别提高30.46%和12.48%,茎粗分别提高14.52%和15.21%,叶面积分别提高117.32%和111.42%,叶片厚度分别提高13.73%和17.70%,鲜重分别提高38.42%和31.07%,干重分别提高41.61%和39.05%。因此,链霉菌2-6和2-11是防治植物真菌性病害和促进香蕉生长的重要微生物资源。
关键词: 软珊瑚 ；链霉菌 ；香蕉枯萎病 ；抗真菌活性 ；次级代谢产物
被引量
4
摘要： 海洋占地球表面约71%的面积,具有非常丰富的资源,其环境具有高盐、高压、低氧、低温、寡营养等特点,特殊的生长环境、独特的代谢方式造就了海洋微生物可能产生不同于陆地的结构新颖的活性化合物。海洋放线菌是一类革兰氏阳性菌,产生具有多种生物活性的结构新颖的次生代谢产物,其次生代谢产物主要包括肽类、大环内脂类、氮杂环类、聚酮类、萜类、甾体类等结构。本论文主要包括一下是三个方面:对海洋放线菌新天然产物的文献综述、七株海洋放线菌菌株筛选和对两株海洋放线菌的次生代谢产物进行研究。对七株海洋放线菌采用TLC、HPLC、NMR、LC-MS等分析方法对其次生代谢产物进行初步筛选,选择两株海洋放线菌新凯撒链霉菌(Streptomyces novaecaesareae)和乳脂色马杜拉放线菌（Actinomadura cremea)对其次生代谢产物进行放大发酵培养、萃取分离,并对得到的单体化合物进行结构鉴定和活性测试。本论文以A1培养基对海洋放线菌乳脂色马杜拉放线菌次生代谢产物进行研究,采用Sephadex LH-20凝胶柱、ODS层析柱和半制备液相等分离手段,从中分离得20个单体化合物。其中,通过波谱学方法、物理常数及文献对照鉴定结构出17个化合物,分别为:9β,11β-环氧-17α-羟基-16α-甲基孕-4-烯-3,20-二酮(1)、9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16α-甲基孕-4-烯-3,20-二酮(2)、9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16α-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(3)、4,9(11)-孕甾-17α-羟基-16α-甲基-3，20-二酮-21-醋酸酯(4)、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(5)、N-乙酰基色胺(6)、N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)Propionamide(7)、环(L-苯丙-L-撷)二肽(8)、环(L-脯-L-撷)二肽(9)、环(L-亮-L-撷)二肽(10)、环(L-丙-L-撷)二肽(11)、环(L-亮-L-异亮)二肽(12)、环(L-丙-L-异亮)二肽(13)、N-(4-羟基苯乙基)丙酰胺(14)、N-乙酰酪胺(15)、N-苯乙基乙酰胺(16)、戊内酰胺(17)。以上化合物1～8、10～17均首次从Actinomadura该属中分离得到,且所有化合物均首次从乳脂色马杜拉放线菌(Actinomadura cremea)该种中分离得到。化合物1～4为孕甾酮类化合物,此类化合物可作为合成甾体激素类药物的关键中间体,同时微生物发酵方法制备甾体激素关键中间体具有反应步骤少、收率高、环境污染小等优点,对甾体激素药物的发展具有重大意义。化合物1～4从海洋放线菌中报道较少,因此乳脂色马杜拉放线菌(Actinomadura cremea)可以考虑作为制备甾体激素药物中间体的一个新的菌种。本论文以A1培养基对海洋放线菌新凯撒链霉菌次生代谢产物进行研究,采用Sephadex LH-20凝胶柱、ODS层析柱和半制备液相等分离手段,从中分离得到12个化合物,通过波谱学方法、物理常数及文献对照鉴定结构分别为:环(4-羟基-L-脯-D-苯丙)二肽(18)、环(4-羟基-L-脯-L-苯丙)二肽(19)、环(4-羟基-L-脯-D-脯)二肽(20)、环(4-羟基-L-脯-L-亮)二肽(21)、环(L-脯-L-苯丙)二肽(22)、环(L-亮-L-脯)二肽(23)、环(D-脯-L-亮)二肽(24)、环(8-羟基-L-脯-D-异亮)二肽(25)、N-(4-氧代戊基)-乙酰胺(26)、邻苯二甲酸二丁酯(27)、环(丙-苯丙)二肽(28)和环(L-脯-甘)二肽(29)。化合物18～26、28～29为叶立德类化合物,且18、20、24和25含有自然界中不常见的D构型氨基酸。所有化合物均首次从Streptomyces novaecaesareae中分离得。
关键词: 海洋放线菌 ；次生代谢产物 ；结构鉴定 ；Streptomyces novaecaesareae ；Actinomadura cremea
摘要： 海洋放线菌因独特的生态环境，及其次生代谢产物而具有独特的生物活性和丰富的结构，是陆生放线菌被过度发掘后的可替代性药源微生物。海绵是最古老的动物，体内富集了高密度的菌群，海绵宿主与共附生菌群经过数亿年漫长的进化和互相选择，含有大量特有、新颖或未知的放线菌类群，是海洋放线菌的重要来源，蕴藏着丰富的遗传多样性和巨大的次生代谢潜力，是新奇放线菌和新天然活性分子发现的重要来源。 为进一步探明我国南海地区海绵共附生放线菌的多样性，积累新奇的海洋放线菌资源，从中发现新颖结构的活性天然产物分子。本课题对采自南海海绵Leucetta chagosensi中的共附生微生物进行菌种分离鉴定，根据观察菌落形态，结合16SrRNA测序鉴定菌株种属排重，发现菌株隶属19个属的102个菌种，其中马杜拉属(Actinomadura)有1个菌种，壤霉菌属(Agromyce)有2个菌种，拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)有11个菌种，芽孢杆菌(Bacillus)有1个菌种，乳酪短杆菌属(Brevibacterium)有1个菌种，短波单胞菌属(Brevundimonas)有2个菌种，迪茨氏菌属(Dietzia)有2个菌种，戈登氏杆菌属(Gordonia)有4个菌种，两面神菌属(Janibacter)有1个菌种，Krasilnikoviella有1个菌种，小单孢菌属(Micromonospora)有6个菌种，诺卡氏菌属(Nocardiopsis)有18个菌种，野野村氏菌属(Nonomuraea)有1个菌种，云南原小单孢菌属(Promicromonospora)有6个菌种，假单胞菌属(Pseudomonas)有8个菌种，假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)有8个菌种，链霉菌属(Streptomyces)有26个菌种，Qipengyuania 有 1个菌种，根瘤菌属(Rhizobium）有2个菌种。其中发现11个新种，1个新属。基于Neighbor-Joining(NJ),Maximum-Parsimony(MP)和 Maximum-Likelihood(ML)算法，采用MEGA7.0对其中分离得到的一个菌株Actinomadura进行系统发育进化分析，确定分离自Leucetta chagosensis海绵的菌株LHW52907为马杜拉菌属的新种，并命名为Actinomadura spongiicola,对其展开多相分类鉴定研究。 此外对分离得到的102个菌种进行六种水产病原菌的活性筛选，所选水产病原菌分别是溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)，筛选结果显示链霉菌属中的一株Streptomyces somaliensis菌对溶藻弧菌、杀香鱼假单胞菌、沙门氏菌均具有较为显著的抗菌活性。选定该菌株(Streptomyces somaliensis sp. nov.编号为Y2)进行后续次生代谢产物研究。实验通过运用凝胶柱色谱，薄层色谱，硅胶柱色谱，反相柱色谱等等色谱手段，从大发酵所得浸膏中分离纯化得到15个已知化合物，其中11个环二肽，3个脂肪酸，1个酰胺类化合物。运用核磁共振等波谱技术确定单体化合物的结构。 以上研究结果表明，南海海绵Leucetta chagosensis中的共附生微生物种类丰富，存在新的分类单元，并且具有较强的微生物次生代谢产物开发和应用的潜力。本文对海绵放线菌资源的收集和分类具有重要的海洋生物资源战略意义。
关键词: 海绵来源放线菌 ；菌落形态 ；分类鉴定 ；次生代谢产物
摘要： 海绵共附生放线菌是海洋微生物的重要组成部分,其产生的次级代谢产物结构出新率高,是新药先导化合物发现的重要资源。海南岛四面环海,海绵种类繁多,为研究海绵共附生放线菌提供了丰富的材料。本论文从海南文昌海域采集海绵样品,分离其共附生放线菌、分析其菌株多样性,发现抗菌活性菌株,并探讨了活性菌株的目标次生代谢产物。其主要研究结果如下:采用四种培养基从4种海绵样品中共分离出50株海洋放线菌。依据菌落形态差异,选取22株代表性特征菌株,通过16S r RNA序列分析将所分离菌株归属于5个亚目、6个科和7个属,包括链霉菌属、小单孢菌属、红球菌属、糖多孢菌、栖白蚁菌属、分枝杆菌属和Krasilnikoviella属,其中Krasilnikoviella为首次从海绵中分离得到。抗菌活性测试显示48%的分离菌株呈现抗细菌活性,24%的分离菌株呈现抗植物丝状病原真菌活性。采用多相分类技术对5株海洋放线菌HNM0563、HNM0569、HNM0574、HNM0575、HNM0581进行了新种鉴定。菌株HNM0563和HNM0569鉴定为红球菌属的新种,分别命名为Rhodococcu spongiae sp.nov.和Rhodococcus wenchangensis sp.nov.;菌株HNM0574和HNM0575鉴定为链霉菌属的新种,分别命名为Streptomyces aquaticus sp.nov.和Streptomyces wenchangensis sp.nov.;HNM0581鉴定为小单孢菌属的新种,命名为Micromonospora marinus sp.nov.。选取新种菌株HNM0575进行大量发酵,选用八种培养基进行最佳发酵条件筛选,并对其发酵产物产物进行分析。采用硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱和HPLC等色谱技术从其发酵产物分离到11个化合物,通过质谱、核磁共振分析确定了三个化合物的结构,其中化合物5为Formononetin(芒柄花素);化合物6为Daidzein(黄豆苷元),化合物11为Oxopropaline G(β-咔啉生物碱)。抗菌活性测定显示,化合物4对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有抗菌活性。化合物6表现出对大肠杆菌的抑菌活性。
关键词: 海绵 ；放线菌 ；抗菌活性 ；放线菌分类鉴定
摘要： 海洋放线菌因其独特的生存环境和丰富多彩的次生代谢产物而备受关注，从中发现的抗生活性化合物也日渐增加，成为海洋药物开发的一个重要资源。独特的生存环境孕育了独特的代谢机制，海洋放线菌来源的天然产物多具有新颖的化学结构；同时，这些代谢产物也表现出很多如抗肿瘤、抗菌等的抗生活性。正是这些新奇的结构和良好的活性激发了众多海洋天然产物工作者的研究热情。
为了从海洋放线菌中发现新的具有抗生活性的化合物，本论文对多株分离自海洋沉积物、珊瑚等不同海洋环境样品的放线菌进行了筛选，采用了化学筛选与生物活性筛选相结合的筛选模式。化学筛选主要关注次生代谢产物的多样性、新颖性和化合物种类，所用到的方法包括TLC-特征显色以及HPLC-UV-MS；生物活性筛选主要关注代谢产物是否具有抗肿瘤或者抗菌活性，以K562和MCF-7等肿瘤细胞株来测定代谢产物的细胞毒活性，以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及白色念珠菌等致病菌模型来考察发酵产物的抑菌活性。综合化学与生物活性，筛选出四株天才菌株进行进一步的研究。
通过改变发酵培养基及发酵时间等方式优化天才菌株的发酵条件，兼顾化学与生物活性，并以最佳条件进行发酵，获得发酵提取物。利用硅胶、凝胶柱色谱以及HPLC等分离手段对提取物进行化合物的分离纯化，共获得56个单体化合物，从异壁放线菌（Actinoalloteichus cyanogriseus）WH1-2216-6中分离得到27个化合物（1–27），从达松维尔类诺卡菌（Nocardiopsis dassonvillei）HR10-5中分离得到8个化合物（32–39），从达松维尔类诺卡菌（Nocardiopsis dassonvillei）XG-8-1中分离得到12个化合物（40–51），从链霉菌（Streptomyces sp.）OUCMDZ-1703中分离得到9个化合物（52–60）。
综合利用质谱（MS）、核磁（NMR）、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、圆二色谱（CD）、比旋光（OR）、X-ray单晶衍射、量子化学计算以及化学沟通反应等方法确定了化合物的结构，其中30个为新结构。新化合物类型包括联吡啶类生物碱（1–7，9–14），噻吩类（19），2-吡喃酮类（32–34，40–46），恶唑类（39），二酮哌嗪类（35–37），多氯取代的聚酮类（52，53）。
对所得化合物进行了细胞毒活性和抑菌活性测试，结果表明：化合物1对K562、KB和MCF-7细胞株具有中等的抑制活性，IC50分别为1.2，4.7和9.8μM。化合物3对K562和KB细胞株具有中等的抑制活性，IC50分别为0.73和4.7μM。化合物12对K562细胞株具有强的抑制活性，IC50为0.37μM。浅蓝霉素A（化合物8）对HL-60和A549细胞株具有强的细胞毒活性，IC50分别为0.71和0.26μM。化合物15对K562和KB细胞株具有中等的抑制活性，IC50分别为1.8和3.1μM。化合物17对A549细胞株有弱的抑制活性，IC50为15.0μM。化合物52和53对MCF-7具有弱的细胞毒活性，IC50分别为9.9和20.2μM。化合物8对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌具有弱的抑制活性，MIC为10.9，21.8和21.8μM。化合物15对大肠杆菌、产气杆菌、铜绿假单胞菌以及白色念珠菌具有弱的抑制活性，MIC分别为9.7，19.3，38.6和19.3μM。化合物32–34对枯草芽孢杆菌表现出弱的抑制活性，MIC分别为26，14和12μM。另外，化合物40–46对多种致病菌表现出中等的抑制活性。苯基取代的噻唑类化合物（54–56）对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌具有中等的抑菌活性。
对联吡啶类化合物的生物合成途径进行了探讨，通过在发酵培养基中添加不同的芳香甲酸作为生物合成的前体，证实了联吡啶类化合物第一个吡啶环的来源，在此过程中得到了两个新的氟代联吡啶类化合物（8F和15F）。对菌株WH1-2216-6的三株突变株（CRM001，CRM004，CRM005）的次生代谢产物进行了系统的研究，从中分离得到了一个新的联吡啶生物碱（28）、一个结构全新的联吡啶与氨基酸结合的衍生物（29）以及两个结构新颖的联吡啶糖苷（30–31）。这些化合物的发现证实了联吡啶类化合物第二个吡啶环的生物合成机制。
关键词: 海洋放线菌 ；天才菌株 ；次生代谢产物 ；抗生活性 ；生物碱
被引量
11
摘要： 聚酮化合物是细菌、真菌或植物来源的、由低级羧酸通过连续缩合生成的一大类次级代谢产物,多种在临床和农牧业上有着重要用途的抗生素属于聚酮类化合物。FK506是一种具有免疫抑制活性的聚酮类化合物,因其高效低毒的特性被学者认为是临床上最具潜力的免疫抑制剂。由于FK506的原产菌产量比较低,使得通过发酵培养来提取次级代谢物的过程变得复杂而困难。因此利用生长速度较快,可实现规模发酵培养的大肠杆菌或遗传背景清晰、易于分子生物学操作的链霉菌进行FK506的异源合成是一条新的解决途径。
FK506生物合成过程中较为特殊的一个延伸单位为甲氧基丙二酰ACP(MM-ACP),其生物合成基因簇包含fkbG,fkbH, fkbl, fkbJ和fkbK五个基因。本课题通过基因工程的方法将合成MM-ACP的五个基因进行单独克隆,构建了含有单个基因的表达载体pETG,pETH,pETI,pETJ和pETK,以及五个基因的串联表达载体pETGK,同时还构建了基于核糖体DNA同源整合的表达载体pZHGK。将构建好的重组载体转化进入大肠杆菌BAP1中进行蛋白的诱导表达,得到了大小正确的目标蛋白产物,并研究了提高蛋白可溶性表达的策略,利用带有链霉菌伴侣蛋白的表达载体pL1SL2获得了可溶目的蛋白。
海洋放线菌是进行新颖活性物质生产的重要来源。本实验室前期分离鉴定了一株海洋链霉菌新种星海链霉菌,对其基因组测序结果分析表明,该菌种具有生产聚酮类化合物、氨基糖苷类化合物、非核糖体多肽类化合物等多种次生代谢物的潜力,可作为生产聚酮化合物的异源表达宿主。本课题对该菌株进行了遗传转化体系的建立研究,首先研究了合适的培养基,发现高氏一号培养基为合适的生孢子培养基；其次,对可以使用的遗传转化标记进行了研究,结果表明,安普霉素、硫链丝菌素等抗生素可以作为星海链霉菌的筛选标记。利用pSET152整合载体,成功进行了结合转移操作,获得了较高的结合转移效率。
本论文的研究结果为实现MM-ACP在大肠杆菌中的异源表达奠定了基础,也为研究MM-ACP的拷贝数对FK506异源生产的影响提供了前提。同时,星海链霉菌遗传转化体系的建立,为进一步开发其作为异源表达宿主,进行FK506等重要的次生代谢产物的生产提供了良好的理论依据。
关键词: 聚酮化合物 ；FK506 ；甲氧基丙二酰ACP(MM-ACP) ；E. coli ；星海链霉菌 ；异源表达
被引量
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摘要： 微生物天然产物(Microbial natural products)是发掘新抗生素的的重要源泉,对人类的健康和生活起着至关重要的作用。然而,随着耐药性病原菌在临床治疗中的不断扩散,寻找具有抗菌活性的新结构微生物天然产物变的更为迫切。微生物所产的活性代谢产物中,有很大一部分是放线菌次生代谢产物。如从灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中发现的链霉素(1952年获诺贝尔生理学奖),是继青霉素之后第二种应用于临床的抗生素,结束了肺结核病人无药可医的悲惨历史。本论文的研究内容主要是对放线菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085(台勾霉素生产菌)卤化酶基因tiaM缺失突变株次生代谢产物进行研究,从其发酵产物中发现了一系列不含卤素的台勾霉素结构类似物并进行了抗菌活性评价,同时对19株中国南海来源的放线菌进行了抗菌活性筛选并选取一株具有良好抗菌活性的放线菌Micromonospora sp.SCSIO 07395进行了初步的化学成分研究,以期从中发现新的活性化合物。第一章主要是对台勾霉素基因簇中Tia M卤化酶基因缺失突变株次生代谢产物进行研究。本研究组肖毅博士后对台勾霉素的生物合成途径进行了深入研究,对台勾霉素生产菌指孢囊菌NRRL18085进行了一系列的基因敲除实验,共获得了23个基因缺失突变株。本章选取台勾霉素基因簇中TiaM卤化酶基因缺失突变株TCM50进行研究,采用YMS培养基对突变株进行放大培养,通过硅胶柱层析、pTLC、semi-HPLC等色谱分离技术对其发酵产物进行分离纯化,采集所得化合物的红外、紫外光谱、质谱、NMR等数据并分析后鉴定其结构。共分离鉴定16个化合物,其中12个为新化合物。分别为11个新的tiacumicins类化合物(2-12),1个新的大环内酯类化合物(13),3个已知tiacumicins类化合物(1、14和15)和1个吲哚-3-甲醛(16)。分离到的tiacumicins类化合物在末端Orsellinic acid和Homo-orsellinic acid部分均没有氯原子取代,再一次证实了TiaM卤化酶在台勾霉素生物合成途径中的功能。测定Tiacumicin B以及化合物1和12个新化合物的抗菌活性并进行比较。其结果明确的显示化合物1、2、3、5、6、7、8、9和10依然保留了不同程度的抗菌活性。构效关系分析表明,台勾霉素B苯环上氯原子不是活性必需基团;苯环上取代的脂肪链长度影响活性,为活性必需基团;18元内酯环上碳18位羟基为活性必需基团,丢失或者氧化为酮都会造成活性降低;化合物左侧糖(6-甲基-D-鼠李糖)C-5位羟基酯化后活性提升,参与酯化的酰基链长影响活性;化合物右侧糖(2-氧甲基-D-鼠李糖)C-4位羟基与Orsellinic acid和Homo-orsellinic acid酯化后活性提升。第二章主要是对19株海洋来源放线菌进行抗菌活性筛选。海洋来源的放线菌在长期的演变过程中,为了适应高压、黑暗、高盐、高(低)温和寡营养等严酷的海洋环境,进化出独特的代谢途径及生理功能,研究海洋来源放线菌次生代谢产物提高了发现新颖抗菌活性化合物的可能性。本章实验主要是对海洋来源放线菌进行生物活性和化学筛选,采用三种不同培养基对其发酵产物丁酮萃取物进行检测分析,并对其粗提物进行抗菌活性及卤虫致死性评价。通过对比,选择代谢产物相对丰富且具有生物活性的菌株进行研究。第三章主要是对筛选出的海洋来源放线菌SCSIO 07395的次生代谢产物进行研究。对该菌株使用1号培养基进行放大发酵培养,通过硅胶柱层析、凝胶柱层析、semi-HPLC等色谱分离技术对其发酵产物进行分离纯化,从中分离得到三个化合物,包括次黄嘌呤(17)、丁二酸(18)和尿苷(19),其中丁二酸和尿苷是混合物,其比例约为3.5:1。进一步利用活性追踪法发现该菌株所产的抗菌活性成分可能为Avilamicin类化合物,需要进一步研究。最后,对从近几年来海洋放线菌中分离得到的化合物进行综述。
关键词: 放线菌 ；台勾霉素 ；突变株 ；次生代谢产物 ；抗菌活性
被引量
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摘要： 海洋微生物生存环境复杂特殊,其次生代谢产物结构新颖、种类繁多,是新结构活性化合物的重要来源。为了寻找结构新颖的活性化合物,本论文采用活性追踪的方法开展了对海洋放线菌和海洋细菌次生代谢产物的研究工作。内容主要包括：活性菌株的筛选及初步评价,抗肿瘤活性成分的追踪分离,单体化合物的结构解析,化合物抗肿瘤及抑菌活性的初步评价。
经研究发现,多种海洋生物包括海绵、被囊动物、红藻以及海洋共附生微生物等都可以产生结构新颖的吲哚生物碱类化合物,该类化合物是海洋来源生物碱最重要的组成部分。这些海洋来源的吲哚类生物碱与陆生来源的相比不仅具有结构骨架的复杂性,而且存在卤素取代的现象。目前为止,海洋来源吲哚类生物碱具有细胞毒活性、抗病毒、抗微生物、抗炎、抑制拓扑异构酶Ⅰ等多种生物活性,因此该类化合物构效关系的研究广泛受到科学家们的关注。
将分离自青岛沿海及南海红树林样品的126株放线菌和细菌进行集成筛选。首先采用SRB法,以小鼠白血病P388肿瘤细胞为筛选模型进行体外抗肿瘤活性的筛选,然后结合HPLC指纹图谱及薄层色谱进行化学筛选,得到具有较强细胞毒活性的菌株4株,最终确定了1株主产吲哚咔唑生物碱、细胞毒活性较强的链霉菌Streptomyces sp. FMA作为进一步研究的目标菌株。同时,为了开发病原菌资源,选择了以吲哚生物碱为主要次生代谢产物并可产生多种高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子的致病菌迟缓爱德华氏菌(E. tarda) LTB-4作为另一目标菌株。
以迟缓爱德华氏菌(E. tarda)和海洋链霉菌Streptomyces sp. FMA为研究对象,对发酵产物运用萃取,薄层层析,正相、反相硅胶柱层析,LH-20凝胶柱层析,反相高压液相等多种化学的分离纯化手段,进行活性次生代谢产物的追踪分离。从E. tarda LTB-4的次生代谢产物中分离得到15个单体化合物(1-15),从Streptomyces sp. FMA的次生代谢产物中分离得到13个单体化合物(16-28)。继而,利用理化性质和波谱学方法(IR,UV,MS,NMR等)结合化学反应的方法阐述了28个化合物的化学结构(化合物结构及名称参见Table 1),其中新天然产物2个(1,2),新化合物2个(16,17)。所得化合物的结构类型包括：吲哚咔唑类化合物(16-22)、简单吲哚类生物碱(1-10,23)、黄酮类(11)、苯类衍生物(12-13,24-26)、核苷碱基(14-15)、呋喃类(27)和不饱和内酯类(28)。由此可见,吲哚类生物碱是Streptomyces sp. FMA和E. tarda次生代谢产物的主要结构类型。
通过气相色谱和质谱连用(GC-MS)的测试手段,对迟缓爱德华氏菌(E. tarda)胞外的5种酰化高丝氨酸内酯(AHLs)信号分子进行了结构鉴定,分别为C4-HSL、C6-oxo-HSL、C8-HSL、C8-oxo-HSL和C10-HSL,为该类细菌信号传导的研究提供了依据。
利用SRB法、MTT法及药敏纸片法对分离获得的单体化合物的抗肿瘤、抗菌活性分别进行了初步评价。筛选出了3个抗肿瘤化合物(2、16、18)；1个抗菌活性化合物(12)。其中,化合物2对A549的IC50为6.24μM,化合物16对HL60和A549细胞的IC50分别为4.97μM和2.01μM化合物18对P388和Hela细胞的IC50分别为1.37μM和5.06μM；化合物12对产气杆菌(Clostridium perfringens)和大肠杆菌(E. coli)均有抑制作用,其最小抑菌浓度(MIC)分别为31.25μg/mL和37.5μg/mL。
综上,本文对两株海洋微生物的次生代谢产物进行了系统研究,共分离鉴定了28个化合物,包括天然来源的新吲哚生物碱2个,新吲哚咔唑类生物碱2个,较高抗肿瘤活性化合物3个；并且提供了1株能特征产生吲哚咔唑类生物碱的海洋链霉菌和1株可高产吲哚类生物碱的海洋细菌。这一研究丰富了海洋天然产物的结构类型,同时也为抗肿瘤药物的筛选提供了活性化合物及活性菌株。
关键词: 海洋微生物 ；次生代谢产物 ；吲哚类生物碱 ；细胞毒活性 ；抗菌活性
被引量
5
摘要： 海洋是高度复杂的环境，并拥有多样化组合的环境与压力，盐度和温度的极端变化的微生物。海洋放线菌作为药物先导化合物的重要来源已引起高度重视，因为他们有独特的生理和代谢功能，不仅能生存在极端的栖息地，而且还提供了产生具有抗肿瘤和其他重要药理活性的化合物，多柔比星，柔红霉素和阿霉素等都是放线菌产生的抗肿瘤类化合物。
采用HPLC和活性相结合的方法，以MCF-7肿瘤细胞为筛选模型，对菌株的次级代谢产物测定细胞毒活性，获得了较好细胞毒活性的菌株2株，其中放线菌Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554产生一株微生物主产单一化合物，其次生代谢产物主要为放线菌素D。我们对海洋来源放线菌Streptomyces parvulusOUCMDZ-2554产放线菌素D的发酵条件进行优化，提高放线菌素D的产量。对培养基的组成、种龄、装液量、pH、盐度和发酵时间等条件的研究，通过单因素和正交试验，选择最优发酵条件；并通过波谱分析及其理化性质确定放线菌素D结构。最后确定最佳培养基为：K2HPO41.5g、MgSO40.5g、酵母浸膏5g、可溶性淀粉22.5g、陈海水1000mL；最佳发酵条件：装液量150/500mL（体积分数）、种龄4d、盐度3%、起始pH=7.5、摇床（180rpm）发酵12d。结论是以最佳发酵条件发酵，优化后放线菌素D的产量为优化前的3.6倍，达到364mg/L。
对来源于中国海南三亚红树林保护区的土壤样品中的链霉菌Streptomycessanyensis FMA进行其次级代谢产物的研究。我们通过添加前体来获得结构新颖的化合物，我们向培养基中加入前体5-OH-L色氨酸，乙酸乙酯萃取其代谢产物。采用硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析和半制备高效液相色谱等分离手段，利用理化性质和波谱学方法（IR, UV, MS, NMR等）结合化学反应的方法阐述了12个化合物（生物碱类）的化学结构（化合物结构及名称参见Table1），其中有三个新的吲哚咔唑类化合物（1-3）。其结构类型包括吲哚咔唑类生物碱（1-9）、简单吲哚衍生物（10-12）；其中，吲哚咔唑类生物碱仍是是此菌株代谢产物的主要结构类型。通过气-质连用确定了一个新化合物的绝对构型。
综上所述，本文对两株海洋来源的两株放线菌的次生代谢产物进行了系统研究，共分离鉴定了13个化合物。Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554菌株主产单一化合物，对Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554菌株以最佳发酵条件发酵，优化后放线菌素D的产量为优化前的3.6倍，进一步可为放线菌素D的工业生产提供了新的生产菌株。从Streptomyces sanyensis FMA菌株分离出12个生物碱化合物、3个为新化合物，结构类型为吲哚咔唑类化合物。说明通过添加前体可以诱导Streptomyces sanyensis FMA菌株产生新的结构类型的化合物。总之，海洋是最有前途的抗肿瘤药物的来源地，本研究为抗肿瘤药物的筛选提供了新的结构类型和候选化合物，为海洋药物提供了重要的微生物资源。
关键词: 海洋放线菌 ；Streptomyces parvulus ；Streptomyces sanyensis FMA ；发酵优化 ；次级代谢产物
被引量
4
摘要： 嗜碱菌是极端微生物中的一类，长期应对恶劣的生存环境，其必定会拥有独特的生理功能和代谢途径，产生普通微生物所不能产生的活性物质。但是目前对嗜碱菌和耐碱菌次生代谢产物的研究却鲜有报道。为了寻找结构新颖的活性化合物，本论文采用化学和活性相结合的集成筛选法，开展了对耐碱放线菌次生代谢产物的研究工作。内容包括：海洋放线菌和真菌的分离，耐碱放线菌的筛选及初步评价，天才菌株的获得及碱调节对其次生代谢产物的影响，活性成分的分离纯化，单体化合物的结构解析，单体化合物活性的初步评价。
从青岛深层土壤样品和海南植物样品中分离得到了42株微生物。采用SRB和MTT法，以小鼠白血病细胞P388、宫颈癌细胞Hela、人白血病细胞HL-60为筛选模型对分离得到的菌株和沙漠菌株进行细胞毒活性的筛选，然后用平板打孔法，进行抑菌活性的筛选，再结合HPLC指纹图谱及薄层色谱进行化学筛选，得到2株“天才菌株”—YIM80379和MBRL-204，并对其进行深入研究。YIM80379进鉴定为拟诺卡氏菌Nocardiopisis alkaliphila sp. nov.，MBRL-204为链霉菌Streptomyces sindenensis。
在考察了不同条件碱胁迫对这两株菌的次生代谢的影响后，对其分别进行了大规模发酵，对发酵产物运用了萃取，薄层层析，正相、反相硅胶柱层析，LH-20凝胶柱层析，反相高压液相等多种化学的分离纯化手段，从Nocardiopisisalkaliphila sp. nov. YIM80379的次生代谢产物中分离得到6个单体化合物（1-6），从Streptomyces sindenensis MBRL-204的次生代谢产物中分离得到17个单体化合物（7-23）。继而，利用理化性质和波谱学方法（IR, UV, MS, NMR等）结合化学反应阐述了23个化合物的化学结构（化合物结构及名称参见Table1），其中3个为新化合物。所得化合物的结构类型包括：2-吡喃酮类（1，2）、吩嗪类（7，8）、二酮哌嗪类（17-21）、喹啉酮类（9-16）、其他类（3-6，22，23）。
利用SRB法、MTT法对化合物进行了细胞毒活性测试，化合物7和8对A549细胞有中等程度抑制活性。用Kirby-Bauer纸片扩散法对部分单体化合物的抗菌活性进行了初步评价，结果表明：化合物1、2、7─16和23分别对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、铜绿假单孢菌、产气杆菌以及白色念珠菌表现出不同程度的抑制作用。
综上，本文对两株耐碱放线菌的次生代谢产物进行了系统研究，共分离鉴定了23个化合物，包括2个新的2-吡喃酮和1个新的含硫化合物；并且筛选获得了一株高产吩嗪生物碱的放线菌。这些研究表明，放线菌有很大的研究潜力。而且pH值对次生代谢产物的影响明显，说明通过碱调节可以诱导微生物产生不同的活性次生代谢产物。
关键词: 耐碱放线菌 ；次生代谢产物 ；抗菌活性 ；细胞毒活性
被引量
4
摘要： 近年来，生物活性化合物对人体和植物的健康有较多益处，在医药领域中有着很高的需求。微生物可以单独或与植物结合合成这些化合物和一些酶。植物组织中的微生物，也被称为内生微生物，其产生了一系列的化合物。内生放线菌能够产生具有生物活性的次级代谢产物，它是一种具有广泛应用前景的生物技术资源。内生链霉菌产生了一些对多重耐药菌有效的新型抗生素，由内生菌产生的抗菌剂是环保的，其对人体不具有毒性，但对病原体具有较高的毒性。多样性高的内生放线菌以及其对各种环境胁迫的强适应能力似乎是新次生代谢产物尚未开发的来源。寄生在宿主植物内部的内生放线菌由于其产生大量次生代谢物的能力而受到人们的广泛重视。 本次实验选取黑豆的根部作为研究对象，用三种分离培养基通过多次分离，纯化，从植物根内共分离出221株放线菌，合并后为60种放线菌。将菌株用ISP3培养基进行培养，逐一观察菌落的形态特征，发现菌株NEAU-BB2C19T具有较为特殊的形态，于是将其进行16SrRNA基因序列对比，发现其为一株潜在的新种放线菌，于是对该菌株进行了系统性的分类学鉴定。本实验使用实验室提供的10种供试真菌和3种供试病原细菌作为靶标菌株，秀丽隐杆线虫作为供试线虫，将60株放线菌分别进行菌株单点及液体发酵后，进行抗菌活性及杀线虫活性实验，筛选出了一些具有良好抗菌或杀线虫的菌株，其中菌株2C24的生物活性在抗真菌、细菌和线虫方面均作用效果显著，遂将其进行大量发酵以分离鉴定生物活性物质。具体结果如下: (1)野野村氏菌属是放线菌属中的稀有放线菌，在16S rRNA对比分析后，将其通过Mega6.06软件构建系统发育树，发现了该菌的最高相似性菌为N.guangzhouensis NEAU-ZJ3T(98.75％)，将菌株进行生理生化特征，化学分类学特征，以及分子学特征等实验分析后，表明NEAU-BB2C19T属于野野村氏放线菌属并与此菌属内其他菌株的各项特征都具有明显差异，由此认为菌株NEAU-BB2C19T是野野村氏放线菌属的一个新种，命名为Nonomuraeaglycinis，其典型菌株为NEAU-BB2C19T(=CGMCC4.7430T=DSM104838T)。 (2)将60株放线菌进行抗10种病原真菌生长的单点实验后，发现有13株放线菌对一种以上病原真菌具有活性;将放线菌进行发酵后，有8株菌的发酵液对秀丽隐杆线虫有10％以上的杀伤作用;放线菌发酵液的上清及菌体浸提液中有17株菌对一种以上的病原细菌有抑制作用。 (3)通过抗菌活性以及杀线虫活性检测后发现，菌株2C24具有较好的生物学活性，将菌株用发酵罐进行大量发酵，利用化学相关方法对其进行分离和纯化，现代光谱学对其结构进行分析鉴定后，得到的化合物为安沙霉素大环内酯类Hygrocins D，麦芽酚和维生素K3。
关键词: 植物内生放线菌 ；多相分类学鉴定 ；次级代谢产物
摘要： 根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类危害大、分布广、难以防治的植物寄生线虫,严重危害农作物生产,同时也是诱发其它植物根部病害的重要因素之一。目前,根结线虫的生物防治已受到国内外的高度重视。红树林底泥中含有丰富的放线菌资源,是次生代谢产物的重要来源。本研究从海南省东寨港红树林采集底泥样品,分离放线菌,对放线菌的发酵液进行抗线虫活性测定,并对活性菌株进行分类鉴定。具体研究结果如下：
采集红树林底泥样品11份,采用稀释平板涂布法,分离得到206株放线菌,包含7个属,其中链霉菌属的数量最多,占总数量的63%,稀有放线菌占总数量的37%,其中小单孢菌属占18%,糖多孢菌属占8%,假诺卡氏菌属、束村氏菌属、拟诺卡氏菌属三者分别占3%,白蚁菌属占2%。
对206株放线菌发酵液进行了抗根结线虫活性测定,初筛获得28株具有较好活性的菌株,经复筛最终确定菌株HA11055、HA11090、HA11166抗线虫活性高且遗传稳定,其校正击倒率分别54.2%、65.0%和56.6%。
对3株杀线虫活性放线菌进行形态与培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列测定及系统发育分析,将菌株HA11090鉴定为Saccharopolyspora jiangxiensis,菌株HA11055鉴定为Streptomyces sp.HA11055,菌株HA11166鉴定为Nocardiopsis sp.HA11166。其中后两株放线菌有可能是新种,有待于DNA-DNA杂交进一步验证。
关键词: 放线菌 ；根结线虫 ；红树林 ；分类鉴定
被引量
5
摘要： 松树萎蔫病是松属植物的一种毁灭性疾病,松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松树萎蔫病的重要病原物,该疾病在全球范围内造成了巨大的经济损失和环境破坏。从自然界中寻找对松材线虫具有高致死性的微生物及其代谢产物已成为研发新型杀线虫剂的一个研究热点。本文对从青岛麦岛近海海域采集的样品采用稀释涂布平板法分离共得到21株海洋放线菌,使用浸渍法对放线菌培养滤液进行杀松材线虫活性测定,从中筛选出了1株具有较高杀线活性的放线菌HT-8。该菌株分离自海泥,其培养滤液处理松材线虫72 h,松材线虫的校正死亡率高达88.30%。通过形态学观察,生理生化特性和16S rDNA序列测定及其系统发育分析,将菌株HT-8鉴定为白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)。采用单因素法分析菌株HT-8的最佳培养条件,结果表明,产杀线活性物质的最适培养基海水浓度、起始pH、培养温度、培养时间分别为1000 mL/L、pH7.5、25℃、7 d;最适接种体菌龄和接种量分别为48 h和6%。对培养基海水浓度、起始pH、培养温度、培养时间进行正交试验,结果表明,菌株HT-8的培养滤液杀线虫活性达到最大的组合为海水浓度1000 mL/L,培养温度25℃,pH7.5,培养时间5 d。对菌株HT-8杀线活性物质的稳定性进行了测定,确定其活性物质具有热稳定性以及在弱碱性条件下杀线活性稳定的特点。对菌株发酵液进行杀线活性组分分析,结果表明菌株发酵液的乙酸乙酯萃取相具有很强的杀线活性,72 h的杀线活性可以达到98.2%。对乙酸乙酯相进行硅胶柱层析、凝胶色谱柱层析和制备高效液相色谱进行分离和纯化,获得两种化合物,通过质谱及核磁共振波谱将该化合物确定为Hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione和4-Methyl-5-ethylthiazole,这两种化合物在浓度为1 mg/mL时,处理松材线虫72 h线虫校正死亡率分别为77.30%和72.62%。该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。
关键词: 海洋放线菌 ；鉴定 ；松材线虫 ；杀线活性 ；杀线化合物
被引量
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摘要： 长期以来，恶性肿瘤对人类的健康构成了严重威胁。药物治疗作为肿瘤治疗的主要手段，一直受到人们的重视。微生物是重要的天然产物资源。微生物品种极其多样，其代谢物的化学复杂性和多样性是研制新药取之不尽的宝库。近年来，随着研究热点的转移，新药的研究开发已突破了陆生资源的束缚，拓展到了生态和物种更为复杂多样的海洋。海洋微生物生存环境特殊，它们具有一些独特的代谢途径和遗传背景，可能产生特殊的次生代谢产物，其化学结构类型多样、活性显著，是新活性先导化合物的重要来源。近年从海洋来源的微生物代谢产物中发现了许多结构新颖的活性物质，引起广泛的关注。本实验小组从连云港海域分离所得的96株海洋微生物菌株中筛选出了具有抗肿瘤活性的放线菌ACMA006，并对其进行了分类鉴定，确定海洋放线菌ACMA006属于链霉菌属，是卡伍尔链霉菌华盛顿亚种（S．cavourensis subsp．Washingtonensis）的一个新的分离菌株。其发酵液对多种肿瘤细胞株都具有很强的细胞毒性，能诱导肿瘤细胞凋亡;有良好的抗肿瘤活性。本研究以海洋放线菌ACMA006为实验材料，对其发酵产物中的抗肿瘤活性成分进行分离纯化，从中获得活性单体化合物，并利用核磁共振等波谱分析技术鉴定其结构。在此基础上，以肝癌HepG2细胞为受试细胞株，考察单体化合物体外抗肝癌活性，并进一步探讨其对肝癌HepG2细胞的作用机制，为活性化合物的临床提供基础。
目的：
1、对海洋放线菌ACMA006的发酵产物进行分离纯化，获得抗肿瘤活性成分，并进一步鉴定其结构。
2、对分离得到的单体化合物进行体外抗肝癌活性研究，并探讨其抗肝癌作用机制，为活性化合物的进一步临床应用提供基础。
方法：
1、建立发酵提取工艺：海洋放线菌ACMA006经大规模发酵后，发酵液采用溶剂萃取法提取其中的抗肿瘤活性成分，并利用硅胶柱层析、制备薄层及HPLC等方法对萃取物进行分离得到单体化合物。
2、利用红外光谱、质谱、核磁共振1H-HMR谱和13C-NMR谱等波谱数据对单体化合物的结构进行解析和鉴定。
3、采用MTT法检测不同浓度的单体化合物作用不同时间后对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测不同浓度的单体化合物作用不同时间后对HepG2细胞周期及细胞凋亡率的影响;并在荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态变化。
4、采用Western blot方法检测单体化合物作用不同时间后，对肿瘤相关蛋白Survivin及凋亡相关蛋白酶caspase-3表达的调控作用。
结果：
1、建立发酵提取工艺，获得单体化合物。海洋放线菌ACMA006的发酵液以不同极性的溶剂萃取后，经体外细胞毒活性检测，发现乙酸乙酯相的活性和得率较高，因此采用乙酸乙酯作为萃取溶剂，在后续实验中对乙酸乙酯相进行分离和纯化。萃取后的粗提物经硅胶柱层析、薄层层析和高效液相色谱（HPLC）分离，最终得到化合物A和化合物B。HPLC分析检测其纯度分别为93．1％和94．0％。
2、对分离纯化获得的单体化合物进行结构解析。化合物B在13C NMR谱中共显示62个碳信号，其中16个组成actinocin生色团，还有23个组成每两个相同的cyclopentapeptides。根据1H-HMR谱和13C NMR谱推测该化合物结构分为两部分：一为肽类结构，另一部分为共轭双键体系，肽类结构可能与共轭双键体系相连。由1H-HMR谱和13C NMR谱可看到该化合物肽类部分的化学位移有两组数据接近，推测可能为两个对称的肽结构，连接在不对称的基团上，化学位移接近但不完全一致。化合物B的13C NMR谱信号与文献报道的放线菌素D的信号相同，从而确定化合物B即为放线菌素D，其分子式为C62H86N12O16。化合物A的结构与化合物B相似，可能为放线菌素D的衍生物，具体结构还需进一步鉴定。
3、纯化获得的活性成分——放线菌素D对于肝癌细胞HepG2具有明显的增殖抑制作用，且呈明显的时间依赖性及剂量依赖性。流式细胞仪分析显示，同一作用时间下，随着药物浓度的增加，S期细胞的比例明显增多，G1期细胞的比例明显下降，呈浓度依赖性。同一作用浓度下，48h组细胞S期的比例较24h组均有所升高，但仅当放线菌素D的作用浓度为50ng/mL时，24h组和48h组之间存在差异，而1ng/mL和10ng/mL浓度下24h组和48h组之间的差异无显著性。此外，10和50ng/mL的放线菌素D处理HepG2细胞48小时后，在G0/G1期前出现一个凋亡峰，表明放线菌素D可通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞。用50ng/mL的放线菌素D处理后，荧光显微镜下可见典型的凋亡细胞的形态学特征，部分细胞的核收缩、碎裂，形成凋亡小体：并且，48h组HepG2细胞凋亡的程度和凋亡细胞比例较24h组更明显。
4、Western blot实验结果表明，用放线菌素D处理HepG2细胞24、48、72h后发现：高浓度（50ng/mL）和低浓度（1μg/mL）的放线菌素D均能下调Survivin蛋白的表达水平，且存在一定的时间和剂量依赖性;用同样浓度的放线菌素D处理后pro-caspase-3蛋白的表达也均有所下降，随着放线菌素D作用时间的延长，pro-caspase-3蛋白呈时间依赖性下调趋势，且高浓度组对pro-caspase-3蛋白的下调作用较低浓度组更明显。说明放线菌素D能通过促进pro-caspase-3的裂解，激活caspase-3蛋白的表达水平来诱导肿瘤细胞凋亡。上述研究结果表明，放线菌素D诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡可能是通过下调Survivin的表达，解除原先对caspase-3活性的抑制，进而激活细胞凋亡程序诱导癌细胞凋亡。
结论：
1、从海洋放线菌ACMA006的发酵液中分离得到2种抗肿瘤活性化合物，HPLC分析检测化合物A和化合物B的纯度分别为93．1％和94．0％。
2、化合物B为放线菌素D，化合物A可能为放线菌素D的衍生物。
3、放线菌素D可显著抑制肝癌HepG2细胞增殖，并诱导HepG2细胞凋亡。其作用机制可能是通过下调Survivin蛋白的表达水平，并激活caspase-3，将HepG2细胞阻滞在S期来诱导肝癌细胞凋亡。
关键词: 海洋放线菌 ；分离纯化 ；结构鉴定 ；抗肿瘤活性 ；细胞凋亡 ；药物治疗
摘要： 微生物次级代谢产物是现代药物发现的重要来源，从各种微生物中获取天然的先导化合物是微生物药物筛选的重点。随着普通环境放线菌，尤其是链霉菌中发现新化合物的几率越来越低，极端环境微生物代谢物的研究已经成为药物筛选的又一热点。本文选取一株采自新疆盐湖的嗜盐放线菌新属种YIM90002<'T>作为材料，对其次级代谢产物进行了初步研究。
利用实验室前期工作中对该菌培养基成分的研究，我们选择甘油和酵母膏作为主要因素进行了中心组合实验设计，以发酵液乙醇提取物干重为指标进行响应面分析，得到两个因素的最优水平为：甘油1.7258％、酵母膏0.8112％，使培养基成分得到进一步的优化。利用优化的培养基配方，采用冷轧大豆粉为原料进行了30L摇瓶发酵;又采用生大豆粉为原料进行了30L发酵罐的液体发酵，为化合物的分离纯化提供了初始材料。
通过对两批发酵获得的发酵产物进行预处理，共获得了4个粗提物，分别为：F90002-SE(9.56g)、F90002-SM(7.15g)、F90002-OE(10.14g)、F90002-OM(17.28)。对粗提物的量、TLC情况进行考察，发现采用生大豆粉罐发酵菌丝体提取物量比采用冷轧大豆粉摇瓶发酵更大，且采用生大豆粉获得的代谢产物更加丰富。然后在TLC的指导下，对粗提物中的各个组分进行了分离纯化，通过凝胶柱层析、硅胶柱层析、HPLC制备等方法共得到10个化合物。经过结构解析，确定了其中9个化合物的结构。
最后，选用6种病原菌模型对所得化合物进行了抗菌活性的测定。发现YAN-03对藤黄微球菌有抑制活性以及YAN-06对藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌有抑制活性。
近年来，对极端嗜盐微生物的应用研究主要集中在嗜盐酶方面，对其次生代谢产物的研究除少数海洋放线菌外几乎为空白。本文的创新之处就在于细致研究了一株嗜盐放线菌的次生代谢产物化学多样性及生物活性，且新种所具有的独特基因也为我们发现新颖的次级代谢产物创造了条件。
关键词: 薄层层析 ；生物活性 ；放线菌 ；嗜盐微生物 ；次生代谢产物 ；化学多样性
摘要： 研究对植物寄生线虫和病原菌均具有拮抗活性的双抗生防菌对于防治植物寄生线虫与土传病原菌协同侵染同一寄主引起的复合病害有重要的科学意义和应用价值。
本研究以1000株线虫生防细菌和放线菌为资源，以全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)和烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)为靶标，筛选既毒杀线虫又拮抗病原真菌的双抗功能生防菌株;对获得的双抗菌株进行了系统亲缘关系分析;鉴定了其中一株双抗功能生防菌的杀线虫化合物;对六株杀线虫活性较好的细菌进行了多相分类鉴定;获得以下主要研究结果：
1.以全齿复活线虫和烟草黑胫病菌为靶标，从分离自全国26个省(市)187份农业土壤样品中的1000株杀线虫细菌和放线菌中筛选出29株双抗功能生防菌，其对线虫48h的致死率在50-100％之间;对烟草黑胫病菌的抑制率在40-76%之间。
2.通过16SrRNA基因系统发育分析，这29株双抗功能生防菌分属10属、15种。芽孢杆菌属5种12株：Bacillus anthracis GD1，GD17，GD58，GD72，JS41,JL97,NX4，NX28,B.aryabhattai GD23，B.drentensis GD25，B.stratosphericus GD65，B.tequilensisC;假单胞菌属1种1株：PseudomonasgeniculataJS19;葡萄球菌属1种1株：Staphylococcus warneriD;北里孢菌属1种1株：Kitasatospora nipponensisH2-4;节杆菌属1种1株：Arthrobacter humicolaJL9;短波单胞菌属1种4株：Brevundimonas diminutaGD66，GD69，GD75，JL105;埃希氏菌属1种2株：Escherichia coliGD8，BJLSH4;不动杆菌属1种1株：Acinetobacter ursingiiBJSS3;无色杆菌属1种4株：Achromobacter piechaudiiSHJC27，JXXG23，JXXG39，SXMLS11;链霉菌属2种2株：Streptomycesneopeptinius JXXG24,S.flavofungini BJLSH9。
3.黄抗霉素链霉菌(S.flavofungini)BJLSH9菌株对线虫的致死率为98%，对烟草黑胫病菌的拮抗率为50%，且兼抗小麦根腐病菌、立枯丝核菌和小麦赤霉菌。从BJLSH9菌株的次生代谢产物中鉴定出一种杀线虫化合物tryptophandehydrobutyrine diketopiperazine(TDD)，化学式为C13H17N3O2，分子量为288.33。该化合物对全齿复活线虫48h的致死率为40%，该化合物的杀线虫活性为首次报道。
4.对六株48h线虫致死率为100%的细菌进行多相分类鉴定，将菌株SX103鉴定为新种，命名为“杀线虫鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium nematocida sp.nov.)”。通过16SrRNA系统发育分析生理生化特征分析，确定了其它5株线虫生防菌(SH8、FJ9、GX4、GX18、S230)的分类地位。
关键词: 复合侵染病害 ；杀线虫化合物 ；植物寄生线虫 ；生防菌株 ；生防微生物