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摘要： 将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合建立一种快速检测草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的LAMP-LFD检测方法,并与实时荧光定量PCR(qPCR)技术进行对比。以GCRV S8片段为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),其中上游引物FIP以生物素(Biotin,BIO)标记,进行LAMP反应条件优化,同时设计1条羟基荧光素(Fluorescein amidite,FAM)标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间40min。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50min,比qPCR检测缩短近1h。LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出GCRV,针对同一重组质粒的检测,LAMP-LFD的检测限为970fg,qPCR的检测限为97fg,虽然LAMP-LFD的检测灵敏度低于qPCR 10倍,但该方法操作简单,仪器设备依赖性低,可快速、特异地检测出GCRV,有望成为GCRV现场快速检测的常规技术手段。
关键词: 横向流动试纸条 ；环介导等温扩增技术 ；草鱼呼肠孤病毒 ；实时荧光定量PCR
被引量
11
摘要： 草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是一种双链分节段RNA病毒,是引起草鱼出血病的(hemorrhage of grass carp)的病原,目前临床上较为流行的为基因I型和II型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法(lateral flow dipstick,LFD)进行可视化检测,分别建立了可应用于基因I型和II型GCRV快速检测的RT-LAMP-LFD技术。该技术以基因I型和II型GCRV第六基因为检测靶标,分别设计了2对特异性引物(其中,上游内引物由生物素biotin标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针。结果表明,RT-LAMP最适反应温度为63oC,扩增时间为40min,从核酸扩增到LFD结果判读仅需50min。利用RT-LAMP-LFD可特异性检出基因I型和II型GCRV,而对鲤疱疹病毒II型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、嗜水气单胞菌等鱼类常见病原的核酸检测结果为阴性,而且两种基因型RT-LAMP-LFD方法只能检测本基因型GCRV,特异性良好。该方法最低可检测到1.19pg的基因I型GCRV的RNA,1.88pg基因II型GCRV的RNA,其灵敏度分别比相应的RT-PCR方法高2个数量级和1个数量级。对实际样品的检测结果表明,两种基因型RT-LAMP-LFD方法检测GCRV与普通RT-PCR扩增并测序的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出GCRV,而且操作简单,费用低且耗时短,不需特殊仪器设备,有望成为GCRV现场检测的常规技术手段。
关键词: 草鱼呼肠孤病毒 ；逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP) ；横向流动试纸条(LFD) ；特异性 ；灵敏度
被引量
5
摘要： 本研究针对鱼类病毒检测中目前亟待解决的问题以及产业发展需求,以鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp virus,GCRV）及鲤疱疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpesvirus-Ⅲ,CyHV-Ⅲ）为研究对象,基于其保守基因序列,设计引物,优化LAMP反应体系,探讨了LAMP反应产物在不同终端检测方法下的灵敏度及特异性;将优选的检测方法与实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）进行对比评价;另以2套引物进行LAMP反应,通过优化反应体系,对反应时间、特异性、灵敏度等方面与单套引物LAMP联合横向流动试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）检测技术（LAMP-LFD）进行对比,以期为鱼类病毒快速检测提供一定的理论基础和技术指导。主要研究结果分述如下:1.鲤春病毒血症病毒LAMP扩增产物三种终端检测方法的对比研究鲤春病毒血症病毒（SVCV）是一种重要的鲤科鱼类致病病毒,属弹状病毒科（Rhabdoviridae）,水疱疹病毒属（Vesiculovirus）,其可导致鲤鱼（Cyprinus carpio）出血性症状且具有高度传染性。本研究开发了一种LAMP体系,通过结合不同的终端检测方法,实现对SVCV的现场快速检测。以SVCV的糖蛋白（Glycoprotein,G）基因为检测靶标,设计6条特异性引物（FIP/BIP,F3/B3,LF/LB）,并对LAMP方法的反应参数进行优化,应用SYBR Green I,LFD和琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis,AGE）三种终端检测方法对LAMP产物进行检测。将上游内引物FIP以生物素（Biotin,BIO）标记,同时设计1条羟基荧光素（Fluorescein amidite,FAM）标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果显示:LAMP最佳反应体系为8 mmol/L Mg2+,320 U/mL Bst DNA聚合酶,1.4 mmol/L dNTP,1 mol/L Betaine,最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为40 min。本研究中,SVCV的LAMP-LFD体系最低检测限为860 fg,与SYBR Green I检测灵敏度相同,AGE检测最低检测限为86fg,且3种检测方法均未与其他常见鱼类病毒发生交叉反应。在三种终端检测方法中,LAMP-LFD摆脱了对实验室条件的依赖,且不易出现假阳性现象,较SYBR Green I及AGE方法更适宜于现场检测,此外,本方法为基于PCR技术的检测提供了有效替代方法。2.草鱼呼肠孤病毒LAMP-LFD检测方法的建立草鱼呼肠孤病毒（GCRV）是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株,本研究建立了一种GCRV的LAMP-LFD快速检测方法,并与qPCR技术进行了对比。以GCRV的S8片段为检测靶标,设计6条特异性引物（FIP/BIP,F3/B3,LF/LB）,其中上游引物FIP以BIO标记,进行LAMP反应条件优化,同时设计1条FAM标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间为40 min。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50 min,与qPCR检测相比时间缩短近1 h。LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出GCRV,针对GCRV同一重组质粒的检测,LAMP-LFD的检测限为970 fg,qPCR的检测限为97 fg,虽然本研究所建立的GCRV的LAMP-LFD检测体系的灵敏度低于qPCR 10倍,但LAMP-LFD操作简单,无需特殊仪器设备,可快速、特异地检测出GCRV,有望成为GCRV现场快速检测的常规技术手段。3.鲤疱疹病毒Ⅲ型LAMP-LFD技术的建立锦鲤疱疹病毒病（Koi herpes virus disease,KHVD）因具有高度传染性、致死性而被广泛关注,鲤疱疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpes virus-Ⅲ,CyHV-Ⅲ）是引发该病的主要病原。本研究将LAMP-LFD应用于快速检测CyHV-Ⅲ,并与qPCR技术进行对比。以CyHV-Ⅲ的胸苷激酶（Thymidine kinase,TK）基因为检测靶标,设计3套4条特异性引物（FIP/BIP,F3/B3）,通过对3套引物扩增效果对比,选取实验引物,并设计该套引物配套环引物（LF/LB）,其中上游引物FIP以BIO标记,并进行LAMP反应条件优化,同时设计1条FAM标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:单套引物LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间40 min,2套引物LAMP最佳反应温度为61℃,反应时间30 min,且反应进行20 min时即可检测到反应产物,比qPCR检测时间缩短近1h。LAMP、LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出CyHV-Ⅲ,针对同一重组质粒的检测,单套引物LAMP-LFD的检测限为32.6 fg,qPCR的检测限为32.6 fg,2套引物LAMP检测限为3.26 fg。在本研究中,因选取的2套引物设计位点所限,未能进行2套引物LAMP-LFD检测,而以AGE检测代替。本研究所建立的CyHV-Ⅲ的2套引物LAMP反应速度快,灵敏度高,可特异地检测出CyHV-Ⅲ,有望成为CyHV-Ⅲ现场快速检测的常规技术手段。综上所述,本研究建立了水产养殖鱼类常见病毒的LAMP-LFD检测体系,通过对反应组分及反应条件的优化,筛选了最佳反应体系,并成功应用于对SVCV,GCRV及CyHV-Ⅲ的检测。LAMP-LFD体系的建立,对水产病毒的现场快速检测,及病毒性疾病的防控具有重要意义。
关键词: 环介导等温扩增技术 ；荧光定量PCR ；鲤春病毒血症病毒 ；草鱼呼肠孤病毒 ；鲤疱疹病毒Ⅲ型 ；快速检测
被引量
3