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摘要： 目的观察间断皮下注射信号选择性甲状旁腺素（PTH）模拟肽对大鼠脊柱融合的影响。方法32只雄性SD大鼠行后外侧路脊柱融合术，术后即用FFH模拟肽（Gly2，Arg^19）人甲状旁腺素（hPTH）（1—28）[“G1，R19（1～28）”]、hPTH（1—34）币口（Gly1，Arg19）hPTH（1～34）[“G1，R19（1—34）”]，经手法触诊、X线、融合节段骨矿含量（BMC）和骨密度（BMD）测定、显微CT（Micro—CT）和组织学综合评价各模拟肽对脊柱融合区骨组织生长的影响。结果手法触诊G1，R19（1～28）组、hPTH（1—34）组、G1，R19（1—34）组和空白对照组融合率分别为37．5％、50．0％、87．5％和50．0％；X线评分在G1，R19（1～28）组、hPTH（1～34）组、G1，R19（1～34）组和对照组分别为（1．88±1．36）、（2．58±1．32）、（3．88±0．75）和（2．54±1．32）分；融合节段RMC证实G1，R19（1～34）组明显高于其他3组（P〈0．01）；Micro—CT分析证实融合区骨体积在G1，R19（1～28）组、hPTH（1—34）组、G1，R19（1～34）组和对照组分别为（294．358±49．481）、（343．340±106．744）、（401．010±97．120）和（339．790±44．200）mm2。结论间断皮下注射G1，R19（1～34）能够增加大鼠后外侧路脊柱融合率及融合区的体积，且比hPTH（1～34）的效果更为显著。
关键词: 脊柱融合 ；甲状旁腺素 ；骨移植
被引量
1
摘要： 研究背景
植骨融合在脊柱疾患的手术治疗中是最常用的手术方法之一,腰椎手术的成败与融合的成败休戚相关。自体骨植骨融合是融合的金标准。
在美国,每年有将近五十万病人因为脊柱或者骨折而通过目前融合手术来缓解严重的腰痛或骨折不愈合翻修来促进愈合而接受治疗。在这些手术中脊柱手术占了1/2。在进行各种脊柱融合手术或明显骨缺损的骨折治疗时,往往在术中需要进行植骨。面对自体骨,同种异体骨,DBM等形形色色备选植骨材料,究竟为病人选择哪种植骨材料是临床脊柱外科医生一直面临的一个困惑。使用自体骨植骨融合已获广大学者的公认,尽管目前有很多种异体骨,但始终不可能完全取代自体骨,自体骨植骨有很多优点等(如费用低廉,无免疫排斥性等),但是自体骨植骨同时也带来了很多问题,如自体骨移植出现的不融合率在逐年增加,由此可导致邻近节段退变、不稳、假关节形成等。如何提高脊柱融合率已成为当前研究的热点。
甲状旁腺素(parathyroid hormone, PTH)是甲状旁腺分泌的一种激素,主要调节机体的钙磷代谢及骨代谢。大量研究证实,甲状旁腺激素及其片段和类似物具有直接和强有力的刺激骨生长作用,尤其在小梁骨丰富的脊柱、骨质疏松的患者。各年龄人群的骨折修复和宇航员失重造成的骨丢失者中均显示出理想的疗效。椎骨和非椎骨骨折的发生率均下降。
目前国外已开发的PTH类似物有两种,分别为美国Lilly公司采用大肠杆菌表达系统成功开发的rhPTH(1-34)和Allelix公司运用蛋白酶缺失的大肠杆菌表达系统,并对天然PTH的基本序列改造成功研发的rhPTH(1-84)。PTH类似物特立帕肤(teriparatide)是由美国礼来(Lilly)公司开发,已于2002年在美国、奥地利、丹麦、芬兰、德国、希腊、冰岛、爱尔兰、荷兰、挪威、葡萄牙、瑞士上市,并于2003年和2004年在英国和澳大利亚相继上市,是目前唯一治疗骨质疏松症的药物。特立帕肽为人甲状旁腺激素类似物,通过与细胞表面受体特异性地高亲和力结合来介导,增加成骨细胞的活性及数量而促进骨的形成,而应用于骨质疏松症及预防骨质疏松性骨折的治疗,它具有与天然甲状旁腺激素(PTH)N端34个氨基酸序列相同的结构,它可以与PTH-1受体结合,发挥PTH对骨骼与肾脏的生理作用；同时不存在C端肽对骨代谢的不利影响。研究表明该药可以促进骨形成,增加骨密度,降低骨折风险,并可与其他治疗骨质疏松症药物联合应用增强疗效。Anastasilakis等[1]对22例绝经后骨质疏松症妇女分别应用特立帕肽20 u g·d-1与每周利塞膦酸钠35mg,在开始治疗前、治疗后第3个月、第6个月观察骨转换指标改变,1年后停用药物。研究发现,反映骨形成相关指标如血清碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原N端前肽(PNP)在特立帕肽组明显增加(P<0.001),而在利塞膦酸钠组明显下降(P<0.001)；反映骨吸收指标血清Ⅰ型胶原C端肽(CTX)在特立帕肽组也增加,而在利塞膦酸钠组下降,提示特立帕肽独特具有促进骨形成与骨吸收的双重作用。目前原发性骨质疏松症常规治疗药物如双膦酸盐、降钙素、雌激素类,其作用机制均是通过抑制破骨细胞活性达到治疗骨质疏松症效果,而特立帕肽是目前唯一认为具有促进骨合成代谢的药物。单独或联合应用特立帕肽,可以增加骨密度、改善骨微结构、降低骨折风险。Lilly's公司对1637名患骨质疏松症-相关骨折的绝经后妇女的Ⅲ期临床试验结果表明,rhPTH(1-34)具有显著降低病人患中度或严重脊椎骨折危险率及非脊椎骨折危险率的明显疗效。PTH对于患骨质疏松症的大鼠和人不但能刺激骨形成而且还能增加骨质量和强度。因灵长类动物骨重建和结构与人骨相似,所以灵长类动物逐渐被应用到实验中,研究证实,连续6个月每天皮下注射重组人PTH(rhPTH)(1-34),能够增加卵巢切除猴的脊椎骨矿物质密度,不影响血清离子化钙水平或尿钙排泄。这是目前第一个被批准具有促骨形成的药物,因而受到各国的特别关注。hPTH(1-34)是骨形成药物,通过增加成骨细胞数及(或)其活力来促进新骨生长。
间歇性应用PTH有较强的成骨作用但作用机制尚不完全清楚。目前主要有以下观点：抑制成骨细胞凋亡；促进成骨母细胞与成骨细胞的增生与分化,此过程可能与核结合因子有关；促进骨衬里细胞向成骨细胞转化；调节成骨细胞自分泌与旁分泌。PTH具有很强的成骨作用,现在已有大量的文献报道小剂量hPTH(1-34)能够增加全身BMD,治疗骨质疏松。hPTH(1-34)对脊柱融合率的影响,也有文献报道能够提高融合率,增加融合区的骨量。
已经证实hPTH(1-34)主要是通过激活PTH1R受体,从而激活了几个信号转导通路,包括cAMP/PKA、NonPLC/PKC和PLC/PKC等。经研究证明PLC/PKC促进骨代谢转换,促进骨吸收。PTH的临床应用复杂而且本身具有促骨合成和促骨吸收作用,如何避免其促骨吸收发挥其促骨合成作用是目前来研究的热点之一。通过设计PTH信号选择性模拟肽从而单一刺激某一PTH的信号通路是一条重要的研究途径。G1,R19(1-34)和G1,R19(1-28)是基于hPTH的改建肽。YangD等证实了G1,R19(1-34)不能激活PLC/PKC信号途径,可通过PTH1R受体激活cAMP/PKA信号和NonPLC/PKC信号通路,可增加全身BMD和促进骨松质形成,改善其微结构；并证实间断小剂量G1,R19(1-34)在对成骨细胞的促分化和松质骨的促合成作用上优于hPTH(1-34),理论上因不刺激PLC通路(研究证明PLC促进骨代谢转换,促进骨吸收)更加合理。
研究目的
1、通过建立大鼠脊柱融合模型,研究三种信号选择性PTH模拟肽全身使用对大鼠脊柱融合以及骨量的影响。分析研究PTH通过非PLC信号通路影响移植骨愈合的机制。
2、阐明PTH通过不同信号转导通路对自体骨脊柱融合的影响,为PTH(1-34)及其信号选择模拟肽在脊柱外科的临床应用提供理论依据。为临床促进脊柱融合提供实验依据,并为下一步临床实验和PTH相关药物设计奠定基础。
研究方法
32只纯种健康雄性SD大鼠(动物,麻醉及抗菌素用药均由南方医科大学动物中心提供),平均重220g,周龄8周,3%戊巴比妥腹腔注射麻醉,所有动物均行后外侧路脊柱融合术,术后随机分成四组,每组8只。G1,R19(1-28)组——皮下注射G1,R19(1-28)(200μg/kg), hPTH(1-34)组——皮下注射hPTH(1-34)组(15μg/kg),G1,R19(1-34)组——皮下注射G1,R19(1-34)组(30μg/kg),对照组——皮下注射适量生理盐水。分笼饲养,采用颗粒营养饲料喂养,自由饮水,同等采光通风条件。术后第四天各组采用上述方法分别开始肩胛下区皮下注射,每天1次,每周5天,共6周。术后6周分别行手法触诊检查融合节段的活动度、融合节段X线进行评分、融合节段BMD和BMC、Micro-CT和组织学观察。
结果
手法触诊：G1,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组融合率分别达到37.5%、50%、87.5%和50%；X线评分系统(“0”=无骨形成,“5”=完全融合)在G1,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组分别为(1.8750±1.3562)分、(2.8333±1.3101)分、(3.8750±0.7546)分和(2.5417±1.3206)分,四组之间统计学差异显著(x2=8.850,P=0.031),平均秩次分别为10.69、16.56、24.13和14.63；离体融合节段BMD四组之间统计学差异显著(F=9.136,P=0.000),从均值上看,G1,R19(1-34)组高于其他三组,和G1,R19(1-28)组间统计学差异显著(P=0.001),和hPTH(1-34)组(P=0.524)及对照组(P=1.000)的差异没有统计学意义,hPTH(1-34)组和G1,R19(1-28)组统计学差异不显著(P=0.056),hPTH(1-34)组和对照组差异不显著(P=0.600),G1,R19(1-28)组明显低于对照组统计学差异显著(P=0.001)。离体融合节段BMC四组之间统计学差异显著(F=22.353,P=0.000),经统计检验,G1,R19(1-34)组高于hPTH(1-34)组(P=0.008)、G1,R19(1-28)组(P=0.000)和对照组(P=0.000),hPTH(1-34)组高于对照组(P=0.001),hPTH(1-34)组和G1,R19(1-28)组差异没有统计学意义(P=0.430),G1,R19(1-28)组和对照组差异没有统计学意义(P=0.112)；Micro-CT扫描后分析融合区体积,结果显示四组间统计学差异显著(x2=8.031,P=0.045)。G’,R19(1-28)组、hPTH(1-34)组、G1,R19(1-34)组和对照组组分别为290.233±49.201mm3、343.356±106.742mm3、401.008±97.116mm3和339.789±44.198mmm3,平均秩次分别为9.13、16.75、22.13和18.00；6周后对所有样本进行组织学观察。G’,R19(1-34)组和hPTH(1-34)组可见骨小梁分布规则,髓腔完全再通,而对照组骨小梁较厚排列紊乱,髓腔未完全再通,G’,R19(1-28)组大部分髓腔未相通,同时还可见大量的未吸收的移植骨碎片。G1,R19(1-34)组和hPTH(1-34)组还可见大量的软骨细胞；对照组和G1,R19(1-28)组较少见到软骨细胞,虽然可以看到一些新骨形成,但生长较慢,在一些骨不连区域,大量胶原纤维样组织出现。
结论
1、间断皮下注射G1,R19(1-34)能够增加大鼠后外侧路脊柱融合率及融合区的体积,且比hPTH(1-34)更为显著；再次证实了G1,R19(1-34)不能激活PLC/PKC信号途径,可通过PTH1R受体激活cAMP/PKA信号和NonPLC/PKC信号通路,增加全身BMD和促进骨松质形成,改善其微结构。并证实间断小剂量G1,R19(1-34)在对成骨细胞的促分化和松质骨的促合成作用上优于hPTH(1-34),理论上因不刺激PLC通路(研究证明PLC促进骨代谢转换,促进骨吸收)更加合理。为临床上选用G1,R19(1-34)片段提供了实验依据。
2、从手法触诊、X线评价、融合节段BMD和BMC、MicroCT、组织学观察来看,G1,R19(1-28)抑制了大鼠的脊柱融合；这说明抑制了NONPLC/PKC信号通路,则抑制了骨的再生及重建,从而抑制了脊柱融合。
关键词: G1，R19(1-34) ；大鼠模型 ；脊柱融合 ；骨移植 ；腰椎
被引量
1
摘要： 骨质疏松症(OSTEOPOROSIS,OP)是一种以骨量低下、骨微结构损坏而导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。骨质疏松症所致的骨折严重影响患者的健康和生活质量,并对社会经济造成沉重的负担。目前骨质疏松症的治疗手段主要是以双膦酸盐类为主的抗骨吸收类药物。这类药物抑制骨吸收,但无法新生成骨组织。以重组人甲状旁腺素(1-34)[PTH(1-34)]为代表的促骨形成类药物作用于成骨细胞,通过刺激骨形成发挥作用,为治疗骨质疏松症提供了新的选择。多项临床研究证明PTH(1-34)可增加骨密度并改善骨结构,长期应用可降低骨质疏松症患者椎体和非椎体骨折发生率。PTH(1-34)已在中国获批用于治疗有骨折高发风险的绝经后妇女骨质疏松症。骨质疏松症不仅增加了患者发生骨折的风险,也使得骨折愈合更加困难。由于PTH(1-34)特殊的成骨作用机制,近年来其在治疗骨折不愈合和脊柱融合等骨科领域的应用也日益受到重视,并且已经有一些成功的个案报道。本文回顾了近年来国内外关于PTH(1-34)在骨质疏松症和骨科领域的临床研究的进展,以期为临床实践提供参考。
关键词: 甲状旁腺素 ；骨质疏松症 ；骨折 ；骨密度 ；骨强度
被引量
8
会议名称： 2014成人脊柱畸形研讨会
会议时间： 2014-04-18
摘要： 脊柱Gorham病极其少见，目前为止，文献报道仅30例左右。其发病年龄为2-72岁。本组2例患儿均在1岁内即出现脊柱区后凸，早期x线片提示胸椎Gorham病，是目前为止文献报道中年龄最小的脊柱Gorham病患者。脊柱Gorham病通常是因骨溶解而引起的脊柱畸形、脊髓受压或因伴发的乳糜胸而就诊，在对本疾病认识不深的情况下极易发生漏诊、误诊。本组2例患儿均以脊柱畸形就诊，辗转多家医院，摄片数年后才确诊为脊柱Gorham病。脊柱Gorham病的影像学具有高度特异性，主要表现为多个椎体的溶骨性破坏，周围无硬化骨，椎间盘不受影响，MRI表现为高T1、高T2信号改变。可以通过MR、CT等检查与以下几种疾病鉴别：单发或多发的脊柱血管瘤、感染、多发性骨髓瘤以及转移性溶骨性肿瘤等。与脊柱血管瘤的鉴别主要根据影像学上的骨破坏程度。Gorham病的常见治疗方法为药物疗法、放疗以及手术治疗。维生素D、甲状旁腺素、二膦酸盐、降钙素以及干扰素等均曾被用于Gorham病的治疗，但缺乏影像学研究证明其疗效。有作者认为放疗可以预防疾病进展，甚至可以促进新骨形成，但更多的作者认为其对脊柱Gorham病无效。手术治疗脊柱Gorham病效果亦不令人满意，Liversley等曾对1例脊柱Gorham病并发脊柱侧凸的患者进行融合手术治疗，但术后患者病情仍进展，在侵犯邻近椎体的同时将植骨块吸收。其他报道中的首次脊柱手术亦均告失败。即使联合使用上述治疗方法，脊柱区Gorham病也无法获得满意的疗效。本组例2早期行脊柱融合手术，在复查x线片及CT上均未见融合块形成，疾病仍继续进展。Mawk等采用放疗及Halo背心治疗脊柱Gorham病取得了良好的效果，但仅为个案报道。侵犯其他骨骼的Gorhaml病在不合并乳糜胸时通常预后较好，但脊柱Gorham病预后通常较差。因为脊柱Gorham病常导致脊柱脱位和乳糜胸等并发症。本组2例患者家属在了解治疗方案及预后后均放弃治疗。到目前为止，脊柱Gorham病的诊断尚无公认的确定标准。通常根据其症状、影像学资料。组织学改变甚至疾病的进程来进行诊断。而如何治疗脊柱Gorham病也是一个难题，因常常累计多个椎体，同时伴有严重的后凸畸形，放疗、药物以及手术等均不能获得满意疗效。因此加强对脊柱Gorh锄病的认识，早期诊断并控制脊柱后凸畸形或脱位，对改善患者的预后起着重要作用。
关键词: 婴幼儿 ；Gorham病 ；脊柱侧后凸畸形 ；临床治疗 ；病理诊断
摘要： 目的能够替代自体髂骨促进成功脊柱融合的骨组织工程材料是目前脊柱外科领及组织工程域研究的热点。甲状旁腺素(PTH)是人体钙磷平衡及骨代谢过程中扮演重要作用的分子,该分子在对于骨代谢的作用中表现出两面性,既可促进成骨活动又可促进破骨活动。其相关活性肽段PTH(1-34)是已被FDA批准的治疗骨质疏松的合成代谢药物,目前以全身用药方式为主。利用骨组织工程支架材料作为载体将PTH(1-34)进行局部应用有希望成为具有高效成骨效果的骨组织工程材料。本次研究我们利用3D介孔生物活性玻璃(MBG)作为支架,复合PTH(1-34)制成骨组织工程材料,对其诱导成骨的能力及相关作用机理进行探索。并观察该复合支架材料植入大鼠体内后促进脊柱融合的情况,为其进一步临床应用的研究提供相关理论依据。研究内容(1)3D生物活性玻璃(MBG)支架的制备、PTH相关肽的复合及材料的表征测定。通过使用改良溶胶-凝胶聚氨酯泡沫法制备与人体松质骨具有相似空间结构、孔隙率和孔径的3D MBG支架材料;用浸润冻干法将PTH(1-34)复合于支架中。利用透射电镜观察制备成的支架材料;使用BET和BJH法对材料的比表面积,孔容及孔径分布情况进行测定;使用压力测试器测定其抗压强度;根据阿基米德定律测定材料的孔隙率。测定PTH(1-34)/3D MBG支架材料在PBS液中PTH(1-34)的释放速率。(2)观察不同浓度PTH(1-34)/3D MBG支架对BMSCs增殖、黏附及分化的影响。将BMSCs分别与含有高浓度和低浓度PTH(1-34)的3D MBG支架材料以及不含PTH(1-34)的MBG支架材料共同培养后通过激光共聚焦显微镜(CLSM)及扫描电镜(SEM)观察BMSCs在其表面的形态及黏附情况;通过使用CCK-8试剂盒检测BMSCs的增殖情况;利用ALP试剂盒测定其ALP生成情况;通过使用q RT-PCR检测成骨相关基因ALP、BMP-2、BMP-4、COL-1、Runx-2及OCN,成血管相关基因VEGFa的表达情况。利用western blot检测经典(smad依赖)和非经典(非smad依赖)BMP通路相关基因的表达情况,以及wnt通路相关基因的表达情况,以阐明其促进成骨生物活性的内在分子机制。(3)观察将PTH(1-34)/3D MBG作为骨移植替代材料促进SD大鼠脊柱融合的作用。将含有高浓度和低浓度PTH(1-34)的3D MBG支架材料以及不含PTH(1-34)的MBG支架材料分别植入SD大鼠的L4-5横突之间,利用荧光标记物在术后观察术后各时间段新骨生成的情况。利用Micro CT检查、手触动检查以及组织学观察检测其促进脊柱融合的能力。通过动物实验研究检验其作为具有促进骨生成作用的骨移植替代物应用于生物体内时的实际效果,为其进一步的实际临床应用奠定实验基础。结果(1)改良溶胶-凝胶聚氨酯泡沫法可成功制备出具有分层介孔结构的3D MBG。通过透射电镜对其观察可见高度有序的孔道结构。通过对其比表面积、孔径、孔容以及孔隙率和抗压强度等表征的测定发现其具有与人体松质骨相似的物理特性和空间结构,且PTH(1-34)的复合对其物理特性和空间结构无明显影响。3D MBG可作为有效的药物载体对其搭载的PTH(1-34)进行释放,并在48小时内达到最大释放量,高浓度PTH(1-34)的支架较低浓度能释放出更高比率的药物。(2)含PTH(1-34)的材料组的细胞黏附情况均优于不含PTH(1-34)的MBG材料组,且高浓度PTH(1-34)组优于低浓度组,在高浓度组中的细胞相较于其他组,材料表面细胞数量明显更多,胞质伸展的更为明显,细胞中心扁平化及细胞质网状舒展也更为明显。CCK-8结果显示PTH(1-34)/3D MBG组比不含肽的3D MBG组可显著促进BMSCs的增殖,且高浓度组优于低浓度组。在未复合PTH(1-34)的3D MBG材料组,BMSCs几乎无成骨分化,而在PTH(1-34)/3D MBG材料组ALP生成及成骨相关基因ALP、BMP-2、BMP-4、COL-1、Runx-2和OCN等均显著升高,且高浓度组优于低浓度组。BMSCs在与PTH(1-34)/3D MBG材料共同培养后,多条成骨相关信号通路均明显激活,包括经典与非经典的BMP通路和wnt通路,P-smad 1/5/8,P-smad 2/3,P-GSK3β,P38以及β-catenin均高表达于两组PTH(1-34)/3D MBG组,且高浓度组较低浓度组更为显著。在不含PTH(1-34)的3D MBG材料组,各基因皆未出现表达量的明显提高。(3)将PTH(1-34)/3D MBG材料与不含PTH(1-34)的3D MBG材料植入SD大鼠L4-5横突后,利用荧光显微镜对术后2、4、6周新骨生成情况的观察结果显示含有PTH(1-34)的材料组可显著提高新生骨组织的数量并加快新骨生成的速度。术后12周时,Micro CT结果显示不含PTH(1-34)的3D MBG材料组未能获得成功的融合,两组PTH(1-34)/3D MBG材料组皆获得了成功的融合,且高浓度组在融合部位显示出形成了更大的骨块且骨密度更高。组织学检查显示高浓度组有更大融合面。手动触摸检查所有高浓度皆获得了牢固的融合,低浓度组获得了83.3%(5/6)的牢固融合,未复合PTH(1-34)的3D MBG材料组中皆无牢固融合。结论使用改良溶胶-凝胶聚氨酯泡沫法可成功制备具有分层介孔结构的3D MBG支架材料,其具较大的比表面积和与正常人体松质骨相似的孔隙率、孔径、空间结构及抗压强度。用浸润冻干法复合PTH(1-34)后其相关物理特性无明显变化。PTH(1-34)/3D MBG支架材料作物骨移植替代物,既可在局部提供足够的物理支撑能力,其在局部释放出的PTH相关肽又能促进局部新骨生成的生物学活动。在将材料与BMSCs共同培养后,相比于不含PTH(1-34)的3D MBG材料,PTH(1-34)/3D MBG材料能显促进BMSCs黏附、增殖及向成骨方向分化的能力,其中含有高浓度PTH(1-34)的材料对BMSCs的相关生物学活性的影响最为积极。通过对成骨相关基因及信号通路的表达与激活情况的检测发现,经典与非经典的BMP通路及wnt通路在BMSCs成骨分化的过程中皆被激活,说明复合于材料中的PTH(1-34)是一个强大的具有刺激骨生长能力的生长因子,可通过多条成骨信号通路激活BMSCs的成骨分化作用。将材料植入SD大鼠L4-5横突之间3个月后,高浓度PTH(1-34)组几乎全部获得了牢固融合,而不含PTH(1-34)的材料组几乎未获得融合。因此PTH(1-34)/3D MBG支架材料拥有良好的生物相容性和成骨的生物学活性,其能明显促进BMSCs的黏附、增殖及成骨方向分化。其提供的局部物理支撑配合PTH(1-34)带来的成骨生物活性,可为能够成功促进脊柱融合的骨移植替代物的研究带来新的希望。
关键词: 骨组织工程 ；脊柱融合 ；骨髓间充质干细胞 ；甲状旁腺激素 ；支架材料
摘要： 骨折作为高发性的创伤疾病,严重影响人们的日常生活。目前临床上采用的治疗方法主要包括骨移植、物理辅助性疗法、全身注射甲状旁腺激素以及局部注射人源重组BMP等。尽管经过治疗,绝大多数骨折患者可以愈合,但由于骨折处血液供应减弱、骨折断端活动性强、骨膜受损、受伤部位感染等,每年仍有5%-10%的患者无法愈合。BMPs是从骨基质中分离提纯的一类能高效诱导骨、软骨组织发生的酸性糖蛋白,在胚胎发生、个体形成,尤其是在骨和软骨的修复过程中具有重要作用。目前,人源重组BMP-2(rh BMP-2)是用于骨折治疗、脊柱融合和种植牙愈合的最有效的生长因子。但其提纯困难,导致使用rh BMP-2治疗成本高昂,并且局部注射易产生异位骨形成、天然骨吸收、软组织肿胀和溶骨等不良作用,因此,FDA仍未批准其在儿童、孕妇和荷瘤患者中的应用。由于在临床应用中直接使用rh BMP-2存在天然障碍,因此靶向BMP信号通路的增敏剂作为间接降低rh BMP-2治疗成本的新方法可能会在未来中占有重要的地位。泛素连接酶Smurf1作为骨的负调控因子通过拮抗BMP信号通路以降低其信号活性。前期实验室建立了基于计算机模拟对接E3拮抗剂筛选的新方法,筛选出了可以抑制Smurf1的小分子化合物A01和A17,并在细胞水平上证明了靶向Smurf1以增强BMP信号通路作为药物靶点的可行性。本研究的目的是对前期结果做更深入的研究,利用小鼠骨折模型探究Smurf1抑制剂A01、A17在动物水平上对骨形成是否有促进作用。我们创新发明了针对小鼠骨骼的骨折造模仪,优化了髓内针固定的手术方案,并确立小鼠愈后的评估标准。使用新型骨折造模仪将120g重物从200mm高处下落可以在不伤及小鼠皮肤及肌肉的情况下,对其股骨干造成横行或斜行断端,骨折造模成功率高;术后我们使用X-ray、Micro-CT等临床方法检查小鼠骨折愈合情况,并通过骨痂染色、m RNA检测软骨特异性基因表达等生物学方法分析愈合过程,结果显示小鼠愈合方式为典型的软骨内成骨,该模型可以作为模拟人类骨折愈合的标准模型。在药效评价方面,我们对术后3d的骨折小鼠进行灌胃处理,在骨折后28d采用三点弯曲的方式评估其生物力学的恢复状况,以此作为药效评价的第一标准。并在骨折后标志性时间点(14d、28d)对实验小鼠进行Micro-CT、骨密度扫描等分析,以此来评估骨折小鼠的恢复状况,分析Smurf1抑制剂A01、A17在骨折愈合不同时期中的作用。结果显示:在骨折后28d用药组(A01、A17组)小鼠骨折部位的生物力学强度以及峰值负荷更高;在骨折后14d和28d时,用药组小鼠的骨矿物质密度(BMD)要明显高于对照组;Micro-CT结果也显示用药组在骨折后14d时骨痂要小于对照组,且其形成新骨的比例高于对照组;骨折后28d时用药组的骨痂大小与对照组无显著差异,但其矿化骨的比例要明显高于对照组。因此,以上结果表明Smurf1抑制剂A01和A17对于骨折小鼠的生物力学恢复有促进作用,其原因可能是由于促进了愈合过程中新骨的形成以及矿化骨的沉积。虽然目前促进骨折愈合的疗法不胜枚举,但靶向泛素-蛋白酶体的药物和通过靶向拮抗细胞内效应蛋白的药物还未曾应用到这骨折的治疗之中,我们的实验结果为这一方案提供了有力的数据,证明靶向泛素连接酶Smurf1以促进骨折愈合的可行性。
关键词: 股骨骨折 ；骨折愈合 ；软骨内成骨 ；BMP信号通路 ；小鼠 ；Smurf1抑制剂
被引量
1
摘要： 背景：甲状旁腺素(PTH)是目前应用于临床的唯一促骨形成药物,它可以有效增加骨量,治疗骨质疏松及骨质疏松性骨折、关节假体松动及长期使用二磷酸盐引起的非典型骨折等。2002年美国FDA批准低剂量PTH间断性皮下注射用以治疗骨质疏松,2010年PTH被批准进入中国,治疗绝经后的重度骨质疏松。随着中国人口老龄化问题的日益严重,以及人们对于预防骨质疏松的意识尚浅薄等原因,骨质疏松症愈来愈成为困扰中老年人的疾病之一。骨质疏松症是一种以骨量减少及骨组织显微结构退化为特征,导致骨脆性增加及骨折危险性增加的一种全身代谢性骨病,目前骨质疏松症的治疗药物种类很多,其适用范围和作用机制也各不相同。国内的治疗主要以抗骨质吸收类药物为主,包括二膦酸盐类、降钙素、雌激素及选择性雌激素受体调节剂等,辅以促进骨矿化的钙剂、维生素D及其活性代谢物等,其对于骨质疏松症的治疗效果有限。PTH作为一种骨形成促进剂,研究证明其对骨密度提高的程度优于既往抗骨吸收类药物,对减少骨质疏松性骨折的作用也更为突出。但是,PTH在临床上的应用也受到诸多限制,如价格高,疗程长(2年),高剂量、持续应用会促进骨吸收(不能复合到内植入物以促进骨融合),可能存在致癌的风险,长期使用还存在疗效降低的可能性等,因此优化PTH,促进疗效,缩短使用时间,避免其副作用,是目前PTH领域研究的重要方向之一。人体中天然的PTH由84个氨基酸构成[PTH(1-84)],与Ⅰ型PTH受体(PTHR1)结合后激活PTHR1及其下游的多个信号途径,参与骨组织代谢的过程。主要的信号通路有：(1) Gs/cAMP/PKA信号转导通路,目前认为是PTH作用于骨组织的主要机制。(2) PLC/PKC通路。(3)非PLC依赖PKC激活途径(PTH/nonPLC/PKC)。(4) β-arrestin通路等。目前认为,PTHR1受体至少通过两种途径激活PKC,其一为激活质膜上的PLC,进而激活PKC；另一途径为不依赖PLC的PKC激活途径(nonPLC/PKC),即不激活PLC而通过其他分子介导机制激活PKC,具体信号特征并不清楚,其信号转导机制及调节骨代谢功能的研究是时下PTH研究领域的热点之一。PTH激活不同的信号通路与其自身的多肽结构密不可分,任何氨基酸的突变及构象的改变都有可能导致某些信号通路激活能力的缺失。研究证实,改变PTH的氨基酸序列能改变PTH的信号转导特征,如PTH(1-34)片段中,1-3位的氨基酸决定PTH的cAMP/PKA和PLC信号通路的激活功能；Ser1变成Gly1可使得PTH(1-34)失去激活PLC的能力；第19位氨基酸Glu19变成Arg19能够补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力减弱；Leu24,Leu28,va131突变成Glu后,PTH(5-34)不与受体结合Aib1,3,Nle8,21,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Arg19构成的组合突变亦称M突变,M突变可使PTH(1-34)的cAMP合成能力提高约40倍,PLC的激活能力提高66倍,与PTHR的结合力提高约10倍；在PTH(1-34)中,Ile5,Glul9,Val21等位点的突变严重干扰PTH(1-34)与受体的结合力：PTH(1-34)第1、3位氨基酸突变成氨基异丁酸(Aib)后促进与PTHR的结合和cAMP的形成。根据以上模拟肽结构的研究基础,我们拟通过氨基酸突变的方法来达到基本不影响PTH肽与受体结合能力,屏蔽cAMP/PKA和PLC激活能力的目的,设计nonPLC/PKC通路特异性PTH模拟肽的序列。我们的前期研究也表明,Gly1Arg19hPTH(1-28) (GR(1-28)和Gly1Arg19hPTH(1-34) (GR(1-34))均失去了激活PLC的能力,但GR(1-34)仍可激活PKC,而GR(1-28)却没有这样的作用,即PTH可以通过nonPLC/PKC通路激活PKC,且功能区域是PTH(29-34)片段。通过C57BL小鼠皮下注射观察发现,GR(1-34)显著增加骨量,尤其是受力的松质骨区域,显著强于GR(1-28)的作用,尽管后者具有与前者相同的cAMP激活特性,提示PTH作用下nonPLC/PKC通路的激活能够促进受力区松质骨合成,改善骨小梁微结构,促进新骨的形成。近期我们发现GR(1-34)具有比PTH(1-34)和GR(1-28)更强的促进脊柱融合的作用,具有一定通路选择性的PTH模拟肽具有较PTH更好的促骨形成作用和改善骨微结构的功能。但是nonPLC/PKC通路的具体信号介导分子仍不清楚,其对于骨代谢的作用机制仍需要深入研究。因此我们拟设计和筛选nonPLC/PKC信号通路选择性PTH模拟肽,并分析该通路特有的下游效应分子,进一步探讨PTH通过nonPLC/PKC信号通路促进骨形成的作用机理。目的：利用原代成骨细胞,通过相关信号通路屏蔽和基因表达分析,筛选与核实甲状旁腺激素29-34位蛋白结构域(PTH(29-34))的效应基因,分析其对骨代谢的影响。以PTH结构为模板,通过改变其氨基酸序列,构建nonPLC/PKC信号通路选择性PTH模拟肽,并在相关通路阻滞剂与激活剂的干扰下利用FRET技术和ELISA法对其信号特征进行验证核实。并研究新肽对成骨相关基因的影响,探究PTH/nonPLC/PKC通路的骨代谢功能。方法：2-3日龄C57BL乳鼠10只,取颅盖骨分离培养成骨细胞,经成骨诱导液培养14d和28d时分别进行ALP染色和茜素红染色,鉴定原代成骨细胞。取贴壁生长的第1代细胞,分别接受100 nmol/L GR(1-28),10 nmol/L GR(1-34),10 nmol/L PTH(1-34)及空白对照作用4h,提取总RNA,行小鼠全基因组表达谱芯片分析,进行相关通路分析,并筛选出可能与nonPLC/PKC信号转导通路相关的差异表达基因。RT-PCR筛选及验证上述差异表达基因。培养MC3T3-E1细胞,使用cAMP通路抑制剂(RP-cAMP)阻断PTH诱发的cAMP/PKA信号通路,比较GR(1-28)和GR(1-34)引起的基因变化情况。构建PTHR稳定转染的HEK293细胞,转染CKAR报告分子后,利用PKC激活的荧光能量共振转移(FRET)技术,检测PTHR稳转细胞在cAMP通路抑制剂(RP-cAMP)干扰下分别接受GR(1-28)和GR(1-34)刺激下PKC的激活情况,确定PTH的nonPLC/PKC通路相关区域。以PTH氨基酸为基础,用氨基酸突变的方法增强nonPLC/PKC通路相关区域作用,合成PKA"PLCPKC+肽(MY1肽)。用FRET技术检测MYl肽对转染CKAR的PTHR稳转HEK293细胞中PKC的激活能力,并观察加入PKC抑制剂(Go6983)后PKC激活的变化情况,检测MY1肽作用下转染CKAR的HEK293细胞(无PTHR)中PKC的激活情况,探究其与PTHR的关系。用ELISA法检测MY1肽对MC3T3-E1细胞中cAMP、PLC激活能力。以验证核实MYl肽为PTH的nonPLC/PKC通路特异性模拟肽。MC3T3-E1细胞分别接受10umol/LMY1肽、10umol/L PTH(3-34、100nmol/LPTH(1-34)及空白对照组作用4h,提取总RNA, RT-PCR检测成骨相关基因的表达。结果：原代培养成骨细胞细胞形态较均一,呈梭形或多边形。待细胞长满后,见细胞排列紧密,呈铺路石状。成骨诱导培养14d,细胞排列紧密,呈复层生长,行ALP染色,镜下显示胞质中出现蓝色颗粒,成骨诱导培养至28d行茜素红染色,镜下显示出现红染的矿化结节。行小鼠全基因组芯片检测,通过相关通路分析,得到了最可能与PTH的nonPLC/PKC信号转导途径相关的14条信号通路。根据芯片结果,经过进一步分析,我们挑选出了与PTH的nonPLC/PKC信号通路相关性最高的56个基因,作为RT-PCR筛选验证的基因对象。筛选的56个基因中,我们发现CITED1的表达量PTH(1-34)组明显高于其他各组,且GR(1-34)组显著高于GR(1-28)组,PTH(1-34)与GR(1-34)组均显著高于空白对照组。MC3T3-E1细胞经各组模拟肽刺激后,提取总RNA,进行RT-PCR检测,CITED1的表达量GR(1-34)组仍显著高于GR(1-28)组,与原代成骨细胞实验结果一致,且在加入PKC抑制剂后,CITED1表达量明显下降,证实CITED1表达量的升高由nonPLC/PKC通道激活引起,不依赖PLC及PKA的激活。PTHR稳转细胞经PKC特异性激活剂TPA刺激后,PKC被激活,C/Y值显著增高,表明我们检测PKC激活的FRET技术检测平台构建成功,其可以作为后续试验中检测PKC激活的有效手段。PTHR稳转细胞在PTH(1-34)的作用下,C/Y值显著增高,即检测到PKC被激活,表明我们成功地构建了PTHR稳转细胞。在转染CKAR的PTHR稳转细胞细胞中,阻断cAMP通路后,GR(1-28)无法激活PKC,而GR(1-34)仍可激活PKC,nonPLC/PKC通路的激活与PTH的29至34氨基酸片段有关。在MYl肽作用下,FRET检测显示C/Y值明显升高,PKC被激活,而PTH(3-34)及空白对照中,PKC未被激活。在MYl肽刺激使C/Y值明显升高后,加入PKC阻滞剂后,C/Y值明显下降,并逐渐降至起始水平。转染CKAR的HEK293细胞(无PTHR)在PTH(3-34)或是MYl作用下,C/Y值均未发生变化,而在加入TPA (PKC特异性激活剂)后,C/Y值明显升高,PKC被激活。ELISA法检测MC3T3-E1经各模拟肽作用下cAMP、PLC的含量,实验结果显示,PTH(1-34)组中cAMP、PLC含量明显高于其它各组,而其它三组之间cAMP含量无统计学差异,即MYl肽没有激活cAMP、PLC的能力。MC3T3-E1细胞经各PTH模拟肽作用后行RT-PCR检测,结果显示MYl组CITED1的表达量明显高于空白对照组和PTH(3-34)组,在加入PKC抑制剂Go6983后,CITED1的表达量明显下降,与原代成骨细胞实验中结果相一致。在成骨基因检测中,ALP的表达量在MYl组明显高于空白对照组和PTH(3-34)组,且在加入PKC抑制剂后,其表达量明显下降。结论：1.原代成骨细胞培养成功,经基因芯片分析,发现与PTH的nonPLC/PKC信号转导途径相关的14条信号通路。经RT-PCR筛选,我们发现PTH(29-34)蛋白机构域可通过PKC信号途径促进CITED1的表达,介导PTH对成骨代谢的作用。该途径不依赖PLC和PKA信号的激活。2.经FRET分析,PTHR稳定转染细胞成功建立,我们构建的MY1肽具有通过PTHR激活PKC的特性,且不依赖PKA及PLC信号转导。表明MY1为PTH/nonPLC/PKC通路特异性模拟肽。MYl肽的建立为PTH/nonPLC/PKC的进一步研究奠定了基础,据我们所知,单纯具有nonPLC/PKC的信号特征的PTH模拟肽国内外未有报道。3.MYl肽促进转录因子CITED1和成骨基因ALP的表达,表明PTH的nonPLC/PKC通路至少通过调控转录因子CITED1或成骨基因ALP的表达量参与骨代谢调节过程。但其对骨代谢的影响和机理需要进一步的研究。
关键词: 甲状旁腺素 ；信号转导通路 ；荧光能量共振转移 ；成骨细胞 ；基因芯片 ；成骨基因