摘要: 在中枢神经系统疾病的发展过程中,神经元的丢失是其基本的病理变化之一。兴奋性损伤,作为神经元损伤的重要机制之一,以诱导其凋亡作为神经元退变的主要机制。研究证明,减少兴奋性氨基酸释放和抑制突触后谷氨酸受体功能能够有效对抗谷氨酸介导的神经元损伤,但由于谷氨酸受体拮抗剂诸多的不良反应限制了临床应用。中药复方及单味药也呈现出确切的中枢神经系统的保护作用,前期动物实验表明,芍药甘草汤对于痉挛性偏瘫和缺血性脑损伤疗效确切,可显著改善脑卒中大鼠的神经功能障碍,调节神经递质Glu、GABA水平及其受体的表达。本实验拟在NMDA诱导PC12细胞兴奋性损伤的基础上,采用抑制性氨基酸GABA受体激动剂和拮抗剂,加入芍药甘草3:1最佳配伍含药血清,同时以1:1原方配伍比例含药血清作为对照,探讨芍药甘草配伍干预作用,以及"Src-NR2-nNOS"信号介导的受体之间的相互作用。以期通过本研究阐明体外兴奋性细胞损伤模型中二者的协同作用机制,研究两种配比的作用差异。为芍药甘草配伍临床应用于防治中枢神经损伤疾病提供实验依据,为中药复方抗兴奋性氨基酸损伤有效成分新药的开发和利用提供实验依据。目的探讨芍药甘草配伍对PC12细胞的保护作用;探讨"Src-NR2-nNOS"信号介导的芍药甘草配伍调节GABA-Glu平衡作用。方法1.芍药甘草汤的制备和HPLC质量控制。2.检测芍药甘草配伍含药血清对NMDA诱导兴奋性损伤PC12细胞的活性、凋亡和Ca2+离子浓度的影响。3.检测"Src-NR2-nNOS"信号通路Src、NR2A、NR2B、nNOSmRNA和蛋白磷酸化表达水平,及芍药甘草配伍含药血清干预作用。结果1.指纹图谱共检测到10个特征峰,其中5个为白芍特征峰,5个为甘草特征峰;本次所用芍药甘草汤(白芍:甘草=3:1)中,芍药苷含量为19.13 mg/g、甘草苷含量为13.39mg/g、甘草酸铵含量为0.018 mg/g。2.芍药甘草配伍含药血清对PC12细胞活性的影响NMDA可显著抑制PC12的细胞活性,模型组OD值较空白组显著降低(P<0.01),给予芍药甘草汤1:1低剂量组可增加细胞活性,中剂量组和高剂量组较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01),给予芍药甘草汤3:1低剂量组减少细胞活性,中剂量组和高剂量组较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01); GABAA受体激动剂(Muscimol)组、GABAB受体激动剂(Baclofen)组细胞OD值与模型组比较升高;GABAA受体拮抗剂(Bicuculline)组与模型组相比升高、GABAB受体拮抗剂(Saclofen)组细胞OD值下降。3.芍药甘草配伍含药血清对PC12细胞凋亡的影响3.1芍药甘草配伍含药血清对凋亡率的影响NMDA可显著增加PC12的细胞凋亡,模型组凋亡率较空白组显著升高(P<0.05),给予芍药甘草汤1:1组凋亡率较模型组显著下降(P<0.05)、3:1组较模型组有所下降;GABAA受体激动剂(Muscimol)组、GABAB受体激动剂(Baclofen)组细胞凋亡率与模型组比较显著下降(P<0.05,P<0.01); GABAA受体拮抗剂(Bicuculline)组、GABAB受体拮抗剂(Saclofen)组细胞凋亡率与模型组相比显著升高(P<0.05、P<0.01)。3.2芍药甘草配伍含药血清对Caspase-3凋亡蛋白表达的影响NMDA可显著增加PC12的Caspase-3凋亡蛋白表达(P<0.01),给予芍药甘草汤1:1、3:1均抑制细胞凋亡,Caspase-3凋亡蛋白较模型组显著下降(P<0.05); GABAA受体激动剂(Muscimol)组细胞Caspase-3凋亡蛋白与模型组显著下降(P<0.05)、GABAB受体激动剂(Baclofen)有下降趋势;GABAA受体拮抗剂(Bicuculline)组Caspase-3凋亡蛋白较模型组显著下降(P<0.05),GABAB受体拮抗剂(Saclofen)组细胞Caspase-3凋亡蛋白与模型组相比有所下降。4.芍药甘草配伍含药血清对PC12细胞Ca2+浓度的影响NMDA可显著增加PC12细胞内的Ca2+浓度(P<0.01),给予芍药甘草汤1:1、3:1均可抑制细胞Ca2+浓度,较模型组显著下降(P<0.05,P<0.01);GABAA受体激动剂(Muscimol)组、GABAB受体激动剂(Baclofen)组细胞Ca2+浓度与模型组显著下降(P<0.05);GABAA受体拮抗剂(Bicuculline)组Ca2+浓度较模型组下降,GABAB受体拮抗剂(Saclofen)组细胞Ca2+浓度与模型组相比显著下降(P<0.01)。5.芍药甘草配伍含药血清对Src、NR2A、NR2B、nNOS mRNA表达的影响与空白组相比,NMDA组NR2A、nNOS mRNA的表达显著升高(P<0.01,P<0.05),上调NR2B mRNA的表达,Src mRNA的表达有所下降。与模型组相比,给予芍药甘草汤1:1组可下调Src、NR2BmRNA的表达,显著下调NR2A、nNOS mRNA的表达(P<0.01,P<0.05);给予芍药甘草汤3:1组可下调Src、NR2B、nNOS mRNA的表达。显著下调NR2AmRNA的表达(P<0.01)。与模型组相比,GABAA受体激动剂(Muscimol)组细胞NR2A、NR2B、nNOS mRNA表达与模型组比较显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05),且Src mRNA的表达也呈下降趋势;GABAB受体激动剂(Baclofen)组NR2A、nNOSmRNA的表达显著下降(P<0.01,P<0.05),Src、NR2BmRNA的表达有所下降。与模型组相比,GABAA受体拮抗剂(Bicuculline)组、细胞NR2A、NR2B、nNOS mRNA的表达与模型组比较显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05),且Src mRNA的表达也呈下降趋势;GABAB受体拮抗剂(Saclofen)组细胞NR2A.nNOS mRNA的表达显著下降(P<0.01,P<0.05),Src、NR2BmRNA的表达有所下降。6.芍药甘草配伍含药血清对p-Src(Tyr418)、p-NR2A(Tyr1325)、p-NR2B(Tyr1472)、 p-nNOS(Ser1417)蛋白表达的影响与空白组相比,NMDA组p-NR2A、p-NR2B、p-nNOS的蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),p-Src的蛋白表达有所升高。与模型组相比,给予芍药甘草汤1:1组可下调p-NR2A、p-NR2B、p-nNOS蛋白的表达,显著下调p-Src的蛋白表达(P<0.05);给予芍药甘草汤3:1组可下调p-Src的蛋白表达,显著下调p-NR2A、p-NR2B、 p-nNOS的蛋白表达(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。与模型组相比,GABAA受体激动剂(Muscimol)组细胞p-Src、p-NR2A、p-nNOS的蛋白表达与模型组比较显著降低(P<0.05,P<0.05, P<0.001),p-NR2B的蛋白表达有所上升;GABAB受体激动剂(Baclofen)组p-Src、p-NR2A、p-NR2B、p-nNOS的蛋白表达显著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,GABAA受体拮抗剂(Bicuculline)组p-NR2B的蛋白表达显著降低(P<0.01),p-Src的蛋白表达呈下降趋势,p-NR2A的蛋白显著升高(P<0.01),p-nNOS的蛋白表达有所升高;GABAB受体拮抗剂(Saclofen)组细胞p-Src、p-nNOS的蛋白表达显著下降(P<0.01),p-NR2B的蛋白的表达有所下降,p-NR2A的蛋白表达有上升趋势。结论1.NMDA诱导PC12兴奋性损伤模型成立,造模浓度为200μmol/L。芍药甘草配伍含药血清可以升高细胞活性,降低凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3蛋白表达,降低胞内钙离子浓度,从而减轻NMDA兴奋性神经损伤。2. GABA激动剂均显示良好的拮抗NMDA兴奋性损伤的作用,但不排除可能存在的GABA与NMDA胞外的负反馈调节,在GABA受体过度兴奋的同时,可能会激动NMDA受体,加剧兴奋性毒性;GABA拮抗剂则不能明显增加兴奋性神经毒作用。3.芍药甘草配伍发挥Src抑制剂样作用,显著影响NR2A受体磷酸化,通过结合蛋白进一步影响nNOS合成减弱NO释放。4.本实验探讨了芍药甘草汤滋阴制阳,调节大脑中枢抑制性和兴奋性神经递质系统的功能特色,为中药复方NMDA抑制剂的开发提供有效思路。而且本实验中白芍在“酸甘化阴”的配伍中所体现出来的“酸”贡献度更大,为探讨五味和合的科学内涵提供了一定的实验基础。 摘要译文