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摘要： 目的
观察川崎病急性血清和丙种球蛋白对血管内皮细胞白三烯B4受体1(BLT1,leukotriene B4 receptor 1)基因的表达及内皮细胞产生白三烯B4(LTB4,leukotriene B4)的影响,并观察不同刺激后的内皮细胞条件培养基对小鼠腹腔巨噬细胞表达白三烯B4受体2(BLT2,leukotriene B4 receptor 2)的影响,以了解LTB4-BLT通路在川崎病血管损伤过程中的作用以及丙种球蛋白治疗川崎病可能的作用机制。
方法
1.内皮细胞培养和实验分组:人脐静脉内皮细胞(ECV304)按以下设计分组,A正常血清组:RPMI1640培养基+10%健康儿童血清;B川崎病血清组:RPMI1640培养基+10%川崎病急性期血清;C丙种球蛋白组:RPMI1640培养基+10%川崎病急性期血清+丙种球蛋白(20mg/ml)。留各组细胞刺激液,将细胞分别培养24,48小时后,用TRIzol溶解细胞,-70℃冻存,并收集细胞培养上清液作为条件培养基备用。
2.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法对内皮细胞BLT1mRNA进行扩增,产物琼脂糖凝胶中电泳后,用凝胶成像分析系统测定电泳条带密度值,以β-actin为内参照,计算BLT1基因mRNA的相对含量,结果以BLT1与β-actin条带密度的比值表示。
3.各组内皮细胞培养48小时后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液培养前后的LTB4浓度。
4.分离健康Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞,将细胞分为正常血清条件培养组,川崎病血清条件培养组和丙种球蛋白条件培养组。在各组细胞培养瓶中加入上述各组内皮细胞条件培养基,继续培养24小时后,用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞备检。
5.采用流式细胞技术将消化下来的各组巨噬细胞用间接免疫荧光标记法检测细胞BLT2的表达。
结果
1.川崎病血清组内皮细胞BLT1的表达水平在培养的第24、48小时分别为(54.23±6.25)%、(67.17±3.49)%,显著高于正常血清组(25.63±3.62)%和丙种球蛋白组(32.30±6.89)%(p<0.05)。正常血清组和丙种球蛋白组BLT1的表达水平无显著性差异(p>0.05)。
2. LTB4的浓度在川崎病血清刺激48小时后为(595.6±46.4)pg/ml显著高于刺激前的浓度(106.3±45.3)pg/ml(p<0.05);而在用含治疗量丙种球蛋白培养液培养的上清中LTB4浓度上调不明显。
3.川崎病血清刺激后的内皮细胞条件培养基能够使巨噬细胞BLT2表达上调[(33.16±4.08)% VS(12.43±3.71)%](p<0.05);而加入丙种球蛋白后可抑制上述BLT2的改变。
结论
LTB4-BLT通路参与川崎病血管内皮损伤过程并在川崎病的血管损伤中发挥着重要作用,丙种球蛋白可能通过阻断LTB4-BLT通路而起到治疗川崎病的作用。
关键词: LTB4-BLT通路 ；丙种球蛋白 ；川崎病
被引量
1
摘要： 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是常见的心血管疾病,能引起严重的并发症,是导致病人死亡最常见的病因之一。炎症反应是动脉粥样硬化的发病机制之一,而白三烯(leukotrienes,LTs)是重要的炎症介质,在炎症信号通路中具有免疫调节和促炎作用。白三烯与动脉粥样硬化密切相关。白三烯的产生主要通过5-脂氧合酶和环氧合酶产生。白三烯B4(leukotrienes B4,LTB4)、半胱氨酸-白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTs)等通过诱导中性粒细胞聚集,增强内皮细胞通透性,介导血管平滑肌细胞核钙信号转导,促进动脉粥样硬化的形成。一些与动脉粥样硬化有关的疾病,如阻塞性睡眠呼吸暂停的夜间间歇性低氧显著增加了白三烯B4的产生及5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)的表达;糖尿病患者基质金属蛋白酶明显增加,可促进5-脂氧合酶和白三烯B4表达。本文论述了白三烯及其代谢途径中相关物质、产生白三烯相关疾病与动脉粥样硬化的关系,提出了抑制白三烯受体、5-脂氧合酶途径和白三烯A4水解酶等新的治疗动脉粥样硬化的策略。
关键词: 白三烯 ；炎症 ；动脉粥样硬化 ；5-脂氧合酶 ；白三烯受体拮抗剂
被引量
4
摘要： 支气管哮喘是一种慢性呼吸系统疾病,其特征是气道高反应性、炎症引起的气道阻塞及气道重塑[1]。免疫细胞和其他炎性介质参与了哮喘的病理生理进程[2]。哮喘患者中大部分为儿童及青少年[3]。因此,通过各种临床和生物标志物预测儿童哮喘的发病及其严重程度是小儿呼吸学科的重要课题。在特应性体质人群中,过敏原暴露可促进辅助性T细胞2(T helper cell 2,Th2)细胞因子的激活,特别是白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-5和IL-13等2型免疫相关因子,这提示2型免疫应答有可能是哮喘的发病机制之一[4]。另外,有研究结果显示,白三烯B4受体(leukotriene B4 receptor,LTB4R)在过敏性疾病,包括哮喘中发挥了重要作用[5]。为此,本研究拟探讨LTB4R及2型免疫相关标志物在支气管哮喘患儿中的表达及其临床意义。
关键词: 白三烯B4受体 ；白细胞介素 ；支气管哮喘 ；喘息性支气管炎
被引量
17
摘要： 目的观察白三烯B4(LTB4,leukotriene B4)在川崎病患者血清中的表达及阻断白三烯B4/白三烯B4受体1(LTB4-BLT1)途径对内皮细胞游走的影响,以探讨阻断LTB4-BLT1途径在川崎病治疗中的意义。方法用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测川崎病急性期及丙种球蛋白治疗后患儿的LTB4血清含量;用改良Boyden法检测加入BLT1拮抗剂U-75302后的血清对内皮细胞游走的影响。结果在川崎病急性期,血清LTB4含量明显增高,用丙种球蛋白治疗后下降;在加入BLT1拮抗剂后使得上述血清对内皮细胞的游走作用明显降低。结论 LTB4-BLT1途径参与川崎病血管炎性损伤过程,阻断LTB4-BLT1途径可能成为治疗川崎病血管内皮损伤的新靶点。
关键词: 川崎病 ；白三烯B4 ；LTB4-BLT1途径
【会议论文】 • 吕娇燕
+3位作者
会议时间： 2014-10-18
摘要： 研究背景:肺纤维化是一类致死率极高的肺部疾病,其发病机制复杂,尚无有效治疗方法。白三烯B4（LTB4）是一类被熟知的急性炎性介质,通过结合其主要受体BLT 1参与急性炎症发生发展及转归,但其在慢性炎症及组织纤维化中的作用研究尚处空白。鉴于早期临床研究发现,问质性肺纤维化病人的肺泡灌洗液（BALF）中LTB4水平明显上调,提示LTB4-BLT 1通路可能参与肺纤维化的发生和发展。目的:探究LTB4 BLT 1通路对肺纤维化发生发展的影响及具体作用机制。方法:分别利用野生型（WT）小鼠和BLT1基因敲除(BLT1)小鼠,建立博来霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型。采用EIA方法检测肺泡灌洗液中LTB4水平;利用Masson染色和Sircol胶原定量方法,确定肺部胶原沉积情况;吉姆萨染色及FACS检测肺泡灌洗液中炎症细胞浸润程度及类型;采用ELISA检测肺泡灌洗液中纤维化相关蛋白水平;利用Realtime RT-PCR方法检测肺组织局部炎症及纤维化相关基因表达水平。结果:LTB4水平在BLM小鼠虽未发现上调,但BLT1小鼠肺纤维化水平显著低于WT小鼠,表现为:肺组织病理评分,原位胶原沉积,胶原合成相关基因COL 1A2,COL3A1,TIMP-1表达水平及肺泡灌洗液中纤维化相关因子TGF-β蛋白水平较WT小鼠显著下调。BLT1小鼠肺纤维化减轻的同时伴随着气道炎症细胞浸润的明显减轻,尤其是CD4和CD8 T cells比例及总数均显著下调;胞内因子染色发现,IL-13+CD4+T及IL-17A+CD4+T细胞数量及一类IL-13+CD4-细胞数量在BLT1小鼠中显著下降;肺组织中IL-13及IL-17A蛋白水平同样显著下调。结论:LTB4-BLT1通路参与BLM诱导的肺纤维化的进程。该通路可能一方面参与调控IL-13+/IL-17+CD4T细胞向肺组织局部浸润或影响IL-13和Il-17A的表达水平,同时其对CD4-IL-13+浸润及IL-13表达也发挥调控功能,共同参与BLM诱导的肺纤维化的发生发展。因此,LTB4-BLT1通路通路可能作为肺纤维化疾病的治疗靶点。
关键词: LTB4-BLT1通路 ；肺纤维化 ；CD4细胞浸润及分化 ；CD4-IL-13+细胞
被引量
1
摘要： 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是被公认的危及生命的呼吸系病,随着老龄化社会的临近,该病对人类健康的影响程度将日益加重。目前,我国40岁以上人群患病人数已经超过1亿。COPD主要表现为持续的气流受限和与气道重塑、气道炎症相关的肺气肿。COPD气道重塑涉及气道平滑肌与淋巴滤泡增生,气道外壁胶原沉积增多等一系列气道结构的改变。同时COPD也是一种复杂的炎症性疾病,多种不同类型的炎症细胞和介质被涉及其中。在该病发生、发展过程中,复杂的先天因素如宿主因素与外在因素如吸烟、环境空气污染等共同加重疾病进程。虽然现代医学认为COPD可防可治,但是到目前为止仍然没有精准的治疗方法可以有效控制疾病的进展。总而言之,在COPD发病机制方面,还需要更深入的研究来回答和解决一些关键问题。卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like protein 1,FSTL1)也被称为卵泡抑素相关蛋白(Follistatin related protein,FRP)。它参与包括细胞凋亡、新陈代谢、免疫反应及内分泌等生理过程。同样,FSTL1也被证明在不同信号通路的调节中发挥作用。目前已知FSTL1与多系统疾病相关,包括循环系统疾病、恶性肿瘤以及免疫相关性疾病等。FSTL1参与调节肺脏的发育与成熟。有研究表明FSTL1缺失会导致小鼠出生后死亡,主要是由于肺发育的多种缺陷导致呼吸衰竭。在呼吸相关疾病方面,FSTL1被证实介入特发性肺纤维化、肺部感染、哮喘等疾病过程。同时FSTL1还是一种新型的炎症介质,在炎症细胞的调节中表现出关键作用。而炎症是多种慢性呼吸系统疾病的特征性改变,尤其是COPD的主要特征。有研究发现合并肺动脉高压的COPD患者血清FSTL1 水平较高。机体需要定期对自身物质进行降解,以此更新自我,保护自我。这种机制依赖溶酶体完成,这一过程被称为自噬。因此,自噬调节功能障碍可以引发多种疾病。有研究表明自噬相关蛋白ATG 8/微管相关蛋白-1LC3是COPD的候选分子靶点。进一步研究证实自噬相关蛋白可能与COPD肺气肿的形成相关。临床研究发现COPD患者自噬水平升高,与预测的肺通气功能指标第一秒用力呼气容积(Forced Expiratory Volume in 1 second,FEV1)呈负相关,与循环中的促炎细胞因子白介素-8(Interleukin 8,IL-8)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)呈正相关。因此,自噬是评估COPD发病及严重程度的重要指标。综合分析以上研究结果,我们认为FSTL1与自噬应该与COPD的气道炎症与气道重塑密切相关。然而FSTL1与自噬的相互关联如何?二者如何在介导COPD气道炎症与气道重塑中发挥作用,均未见报道。针对以上问题,本课题主要针对FSTL1和自噬进行研究,对它们如何在香烟诱导的COPD气道炎症与气道重塑中发挥作用进行探索,进一步拓展对COPD发病机制的认识,并积极寻找可能对COPD疾病进程进行有效干预的治疗措施。研究目的探究FSTL1介导COPD气道炎症和气道重塑的机制,发现在COPD疾病进程中可能减轻气道炎症与气道重塑的有效靶点。研究方法1.COPD患者FSTL1水平与自噬的表达。1.1病例选取选取2017年1月至2018年1月就诊于山东大学齐鲁医院的稳定期COPD患者(n=25),取患者静脉血。对照组(n=28)血液标本来源于就诊的非COPD患者。COPD组肺组织标本(n=7)来自于因疑似或确诊肺癌而行肺切除的COPD患者。对照组的肺组织标本(n=6)来源于齐鲁医院遗体捐赠中心,取材尸体生前无COPD病史,死因排除呼吸系统疾病。所有受试者均无其他呼吸相关疾病,如哮喘、间质性肺病、矽肺以及感染性肺部疾病。本课题经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准,并已取得书面知情同意。1.1.1 COPD组纳入标准:(1)诊断依据GOLD2016相关标准,明确诊断为COPD,并对其进行肺功能分级。1.1.2排除标准:(1)近1月内发作心绞痛(稳定型/不稳定型)、诊断冠心病心肌梗死、肺栓塞、脑梗死。(2)存在重度高血压病,收缩压>180mmHg,或舒张压>120 mmHg。(3)伴有恶性心律失常。(4)身体极度虚弱。(5)有精神疾病和类风湿关节炎者。1.2 HE(hematoxylin&eosin)染色观察受试者肺组织病理表现。1.3免疫组化染色检测受试者肺组织标本中FSTL1、自噬标记物LC3B的表达。1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测评价COPD患者与对照组血清FSTL1 水平。2.FSTL1和自噬对CS诱导COPD气道炎症与气道重塑的影响。2.1动物分组:①实验小鼠为C57BL/6雌性野生型小鼠(Wild type,WT),体重为20±3g,8周龄,购自山东大学动物实验中心。小鼠生活在无病原菌的室温条件,生活具有昼夜节律,可以自由获得饮水及标准实验室喂养饲料。②FSTL1flox/+小鼠由南京大学高翔教授和中国科学院上海生物科学研究所神经研究所徐章教授慷慨赠送。③cmv-Cre小鼠于南京大学动物实验中心购进。④FSTL1+/-小鼠:通过FSTL1flox/+小鼠与cmv-Cre小鼠交配,在其子代小鼠中,需要通过基因检测以确定基因型。2.2动物分组及模型建立:2.2.1分组随机分为 3 组,每组 6 只。包括,CON-FSTL1flox/+,CS-FSTL1flox/+,CON-FSTL1+/-,CS-FSTL1+/-.CON-WT,CS-WT,CS+3MA-WT 组。2.2.2 CS 诱导CS诱导为期12周,每周6天,每天2次,每次使用4只哈德门过滤嘴香烟(焦油含量10毫克,尼古丁 1.0毫克,一氧化碳12毫克),使用自制熏笼进行CS诱导。对照组小鼠在相同条件下暴露于室内空气中。2.2.3 3-甲基腺嘌呤干预3-甲基腺嘌呤(Sigma,美国)进行腹腔内注射,为期12周,注射剂量20mg/kg/天。对照组使用同等体积生理盐水,同样给药方法与频率注射。注射于每日首次CS诱导开始前2h完成。2.3 HE(hematoxylin&eosin)染色观察实验小鼠肺组织病理表现。2.4免疫印迹分析、免疫组化染色观察实验小鼠肺组织标本中FSTL1、自噬标记物 LC3B、P62 以及 collagen 1、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actinα-SMA)的表达。2.5酶联免疫吸附试验分析评价实验小鼠肺泡灌洗液中炎症因子白细胞介素8、肿瘤坏死因子α及白三烯B4水平。2.6肺功能检测实验小鼠肺总量与肺顺应性。2.7透射电镜观察小鼠气道上皮细胞中自噬小体的表达。结果1.COPD患者与对照组患者在性别、年龄、BMI方面,其差异无统计学意义。COPD患者的肺组织标本HE染色显示气道上皮炎症细胞浸润、网状基底膜破裂、气道上皮完整性缺失以及纤毛倒伏等病理学改变。2.免疫组化染色显示COPD患者气道上皮细胞和肺间质中FSTL1与LC3B的表达明显高于对照组,COPD组与对照组存在显著差异。3.酶联免疫吸附试验检测血清FSTL1水平,结果显示COPD患者FSTL1水平明显高于对照组,COPD组与对照组存在显著差异。4.FSTL1在CS诱导COPD野生型(CS-WT)小鼠的气道上皮细胞与肺间质内高表达。免疫印迹和免疫组化染色结果显示与CON-WT小鼠相比,CS-WT小鼠气道上皮细胞和肺间质内FSTL1高表达。5.CS诱导COPD小鼠自噬水平升高,同时伴有气道炎症因子与气道重塑标记物表达增多。与CON-WT小鼠相比,CS-WT小鼠具有如下改变:免疫组化染色与免疫印迹分析结果显示气道上皮细胞内LC3B、P62、collagen Ⅰ与α-SMA表达增加。透射电镜观察到气道上皮细胞内自噬小体形成增多。酶联免疫吸附试验分析显示支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8和LTB4水平显著升高。6.实验小鼠体内使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬可以减轻CS-WT小鼠的气道炎症与气道重塑。免疫组化与免疫印迹分析结果显示,与CS-WT小鼠相比,CS+3MA-WT小鼠表现出较低水平的collagen Ⅰ、α-SMA的表达,支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8和LTB4水平也较CS-WT小鼠减低。7.条件性敲除FSTL1基因可以减轻CS诱导的自噬激活。CS诱导后FSTL1flox/+小鼠LC3BⅠ向LC3BⅡ的转换增多,同时,自噬小体的形成增加。然而,在同样的CS诱导下,CS-FSTL1+/-小鼠的上述改变弱于CS-FSTL1flox/+小鼠。8.条件性敲除FSTL1基因可以减轻CS诱导COPD小鼠的气道炎症与气道重塑。免疫组化染色和免疫印迹分析显示,与CS-FSTL1flox/+小鼠相比,CS-FSTL1+/-小鼠collagen Ⅰ和α-SMA的表达减低。同时,CS-FSTL1+/-小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-8、LTB4和TNF-α表达水平低于CS-FSTL1flox/+小鼠。9.条件性敲除FSTL1基因与使用自噬抑制剂体内干预均可减缓CS诱导COPD小鼠肺功能的下降。CS-WT小鼠、CS-FSTL1fox/+小鼠肺总量和肺顺应性增高。CS+3MA-WT小鼠的上述改变弱于CS-WT小鼠。CS-FSTL1+/-小鼠的上述改变弱于CS-FSTL1flox/+小鼠。以上实验结果表明COPD患者同时存在FSTL1及自噬高表达。条件性敲除FSTL1基因与自噬抑制剂均可减轻CS诱导COPD的气道炎症与气道重塑。FSTL1通过增强自噬水平促进COPD气道炎症与气道重塑的发生。结论1.香烟诱导的COPD细胞自噬水平增强。2.条件性敲除FSTL1基因与体内使用自噬抑制剂干预均可改善香烟诱导COPD的气道炎症与气道重塑。3.FSTL1通过增强自噬促进香烟诱导的COPD气道炎症与气道重塑。4.FSTL1与自噬均可能成为COPD治疗的潜在靶点。
关键词: 卵泡抑素样蛋白1 ；气道炎症 ；自噬 ；COPD
被引量
7
摘要： 慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病。气流受限不完全可逆,并呈进行性发展,与气管和肺对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。COPD的致残率和病死率很高,目前成为全球第3大死亡原因。在我国,COPD发病率高达8.6%,40岁以上人群患病率13.7%,给社会和患者带来了沉重负担。因此,关于COPD的疾病进展及预后的研究具有重要战略意义。 慢性阻塞性肺疾病急性加重（Acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）是COPD患者临床症状加重的表现,主要症状是气道反应增强,呼吸困难,痰液分泌增加。导致急性加重的原因复杂,主要因素与呼吸道细菌和病毒感染相关。急性加重不仅会增加患者的死亡率,也会导致急性加重的易感性,同时会延长患者的住院时间,降低患者生活质量。目前对于AECOPD的治疗主要是药物治疗和非药物干预措施,但是对于降低AECOPD的发病率作用有限,需要更加细致的对患者急性加重期间的各项表现进行综合分析,研究开发有效的预防和管理措施。 氧化应激是COPD发病机制中的重要因素。COPD患者的肺部出现氧化负荷增加,氧化应激可能参与各致病过程,如直接损伤肺泡上皮细胞、黏液分泌增多、抗蛋白酶失活以及通过激活氧化还原敏感转录因子增强肺部炎症等。COPD患者因吸入香烟烟雾（Cigarette smoke,CS）或有害物质而产生氧化应激,导致肺部炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞）积聚,产生大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,进而出现蛋白酶和抗蛋白酶表达失衡,肺微循环中各种炎症介质释放增加,加重COPD的发展。 中性粒细胞（Neutrophils,NE）是介导炎症反应的重要效应细胞,在机体非特异性免疫防御中起重要作用。NE的数量、功能及存活时间会影响炎症反应的发生、发展过程及转归。正常生理情况下NE的增殖与凋亡保持动态平衡,既有利于机体的防御反应,又有利于炎性反应的消散。但在严重创伤、脓毒血症、烧伤、缺血再灌注等情况下,NE过度激活、聚集于靶组织、释放大量毒性介质及产生大量的炎性细胞因子,持续过度的炎性反应会造成正常组织细胞的损伤。临床上应用的抗炎药物如肾上腺皮质激素类与非甾体类等,只能缓解症状,却无法完全治愈,且毒副作用大。中性粒细胞明胶酶（Neutrophil gelatinase,NGAL）相关脂质是由中性粒细胞分泌出来的,可以参与到炎症反应中是中性粒细胞活化的标志。 在众多的细胞因子和炎症介质中,花生四烯酸的代谢产物白三烯B4（Leukotriene B4,LTB4）被认为是中性粒细胞的主要趋化物质。LTB4具有趋化中性粒细胞、收缩气道、改变微循环通透性、促进气道黏液分泌等多种作用,参与多种气道炎症性疾病的发病过程。研究发现血清中LTB4浓度的升高与中性粒细胞的激活显著相关。 脂氧素（Lipoxin,LX）是近年来发现的一种重要的、在炎症后期自体产生的内源性抗炎介质,是Serhan于1984年发现的二十烷类家族中一类花生四烯酸的产物,是体内产生的一类重要的内源性脂质抗炎介质,主要在炎症等病理过程中通过跨细胞途径来合成,对多种炎症细胞和炎症相关基因有显著的负性调节作用,在炎症反应中发挥广泛的抗炎促消退作用。脂氧素主要包括LXA4与LXB4,LXA4被认为是炎症反应过程的“刹车信号”。LXA4被证实能够抑制多种炎症因子的释放,抑制中性粒细胞的聚集,促进非炎性吞噬作用,从而促使炎症反应快速进入消退阶段。近期有研究发现在重症哮喘患者存在脂氧素合成及其信号传导通路缺陷,尚不明确在不同临床严重程度的COPD稳定期患者以及急性加重期患者体内脂氧素LXA4的水平,及其与肺功能严重程度有无关系。 目的 本文主要通过meta分析,将多个独立的研究整合起来,对已有的证据进行汇总、综合和分析,系统评价慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）临床相关因素,汇总患者的圣乔治呼吸问卷（St George’s Respiratory Questionnaire,SGRQ）,慢性阻塞性肺病评估测试（COPD assessment test,CAT）评分,住院时间（Length of stay,LOS）及其病原菌感染情况,对AECOPD的原因进行分析,为临床预防和管理AECOPD提供科学依据;通收集临床样本探讨不同疾病严重程度的COPD患者血清LXA4和LTB4水平与中性粒细胞活化程度的差异及相关性。 方法 第一部分:慢性阻塞性肺疾病急性加重临床相关因素及其病原学的meta分析 以中国期刊全文数据库（CNKI）、万方数据资源系统、Pub Med、Webof Science、Embase、Cochrane Library等中英文数据库为数据源,检索2015年1月1日至2021年11月12日发表的有关慢性阻塞性肺疾病急性加重的文献,根据纳入和排除筛选文献,并进行文献质量评价。共纳入文献15篇,其中英文文献9篇、中文文献6篇;高质量文献8篇、中等质量文献7篇。16项研究均纳入慢性阻塞性肺疾病急性加重患者。利用Stata15.0软件计算AECOPD患者的CAT、SGRQ、LOS、革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌及其95%可信区间（Confidential interval,CI）,此外,对所纳入研究的发表偏倚进行分析。该部分的目的是为了了解慢性阻塞性肺疾病急性加重方面的研究现状和发现,为后续深入研究提供基础和参考。 第二部分:慢性阻塞性肺疾病患者血清LXA4、LTB4水平与中性粒细胞活化程度的差异及相关性研究 选取重庆医科大学附属第一医院呼吸科2021年12月至2022年10月间收治的120例慢性阻塞性肺疾病患者为研究对象,均经肺功能检查确诊,存在不同程度的呼吸困难、气短、咳痰、咳嗽等慢性症状,分为急性加重期、缓解期两大组,缓解期组又分为轻度、中度、重度、极重度四个亚组,其中轻度21例,中度20例,重度10例,极重度9例,缓解期组共60例,急性加重期组共60例。另选同期体检中心100名健康人作为健康对照组,其中男性59人,女性41人。 收集各组COPD患者及健康人的空腹静脉血5m L,并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测健康组、缓解期组、急性加重期组患者血清中LXA4和LTB4水平与中性粒细胞活化程度,分析各组之间的差异和相关性。 结果 第一部分:慢性阻塞性肺疾病急性加重临床相关因素及其病原学研究的meta分析 1.SGRQ共纳入3篇文献,对这3篇文献进行异质性检验,得出I2=0.00%<50%,且Q检验的P>0.1,提示本项研究选择的文献之间不存在显著异质性,因此选择固定效应来进行meta分析,得出3个研究汇总的效应量是36.751,95%置信区间为35.268～38.233,且具有统计学意义,z=48.58,p<0.05,由此可以得出COPD急性加重期SGRQ评分为36.751。 2.CAT共纳入4篇文献,对这4篇文献进行效应值合并,得出I2=0.00%<50%,且Q检验的P>0.1,提示本次研究选择的文献之间不存在显著异质性,因此选择固定效应来进行meta分析。得出4个研究汇总的效应量是25.214,95%置信区间为24.514～25.915,且具有统计学意义,z=70.56,p<0.05,提示COPD急性加重期CAT评分为25.214。 3.LOS共纳入3篇文献,经过异质性检验,得出I2=0.00%<50%,且Q检验的P>0.1,提示本次研究选择的文献之间不存在显著异质性,因此选择固定效应来进行meta分析。基于固定效应进行meta分析,得出3个研究汇总的效应量是9.233,95%置信区间为8.652～9.813,且具有统计学意义,z=31.12,p<0.05,提示COPD急性期住院时间为9.233天。 4.革兰阴性菌共纳入5篇文献,经过异质性检验,I2=35.68%<50%,且Q检验的P>0.1,提示本次研究选择的文献之间不存在显著异质性,因此选择固定效应来进行meta分析。基于固定效应进行meta分析,得出5个研究汇总的效应量是0.71,95%置信区间为0.68～0.73,且具有统计学意义,z=51.82,p<0.05,提示COPD急性加重期患者革兰阴性菌占病原菌总株数的71%。 5.真菌共纳入3篇文献,经过异质性检验,得出I2=12.25%<50%,且Q检验的P>0.1,提示本次研究选择的文献之间不存在显著异质性,因此选择固定效应来进行meta分析。基于固定效应进行meta分析,得出3个研究汇总的效应量为0.06,95%置信区间为0.05～0.08,且具有统计学意义,z=10.30,p<0.05,提示COPD急性加重期患者真菌占病原菌总株数的6%。 6.革兰阳性菌共纳入4篇文献,经过异质性检验,I2=59.65%,P=0.06,基于固定效应进行meta分析,得出3个研究汇总的效应量0.28,95%置信区间为0.26～0.31,且具有统计学意义,z=22.13,p<0.05,提示COPD急性加重期患者革兰阳性菌占病原菌总株数的28%。 第二部分:慢性阻塞性肺疾病患者血清LXA4、LTB4水平与中性粒细胞活化程度的差异及相关性研究 1.健康组LTB4和中性粒细胞活化水平低于缓解期组和急性加重期组,健康组LXA4水平高于缓解期组和急性加重期组。缓解期组LTB4和中性粒细胞的活化水平均低于急性加重期组,缓解期组LXA4高于急性加重期组（P<0.05）。 2.COPD缓解期组不同亚组间LTB4、LXA4水平和中性粒细胞活化程度有显著差异。中度组LXA4、LTB4水平和中性粒细胞活化程度高于轻度组（p<0.05）,重度组LXA4水平低于中度组,LTB4和中性粒细胞活化水平高于中度组（p<0.05）,极重度组LXA4水平在亚组中最低,LTB4和中性粒细胞活化水平在亚组中最高（p<0.05）。 3.Spearman相关分析显示LTB4和中性粒细胞活化程度与COPD的严重程度呈正相关,即LTB4和中性粒细胞活化程度越高,疾病程度越重。其中,LTB4的水平与COPD严重程度呈强正相关,中性粒细胞活化程度与COPD严重程度呈中等正相关（r=0.735,P<0.001;r=0.685,P<0.001）;LXA4水平与疾病严重程度呈中等负相关（r=-0.641,P<0.01）,即LXA4水平越高,COPD严重程度越低,反之,COPD严重程度越高。 4.COPD患者LXA4、LTB4和中性粒细胞活化的曲线下面积分别为0.756、0.758和0.896,表示COPD患者LXA4、LTB4和中性粒细胞活化水平对疾病严重程度诊断准确性高。其中,中性粒细胞活化水平的曲线下面积最大说明该指标预测准确率最高,LXA4的预测敏感性高于LTB4和中性粒细胞,LTB4的特异性高于LXA4和中性粒细胞活化水平。 结论 1.AECOPD患者的CAT,SGRQ评分均高,LOS延长,且与病原菌感染有关,关注并管理患者的CAT,SGRQ,LOS病原菌感染可以预防慢性阻塞性疾病急性加重的发生。 2.在临床上,COPD患者血清中LXA4、LTB4和中性粒细胞活化水平均高于健康人,LTB4和中性粒细胞活化水平与疾病严重程度呈正相关,而LXA4与疾病严重程度呈负相关,且均具有较高的特异性和敏感性。检测血清炎症因子有助于评估患者病情,指导治疗,值得临床推广应用。
关键词: COPD ；LXA4 ；LTB4 ；中性粒细胞激活 ；不同严重程度
摘要： 第一部分短暂性脑缺血发作患者代谢组学研究背景和目的 短暂性脑缺血发作(Transient ischemic attacks,TIA)被认为是发生缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,CIS)的先兆。约50%TIA患者在发病后48h内可继发CIS。也有临床研究证实:TIA可诱导缺血耐受,对继发的CIS具有神经保护作用,但TIA如何诱导缺血耐受,进而产生神经保护作用的机制目前尚不明确。 血液中代谢物与脑血管疾病的发生发展有关,但TIA后外周血代谢谱的变化规律及其在继发CIS患者神经功能恢复中的作用目前尚不清楚。本研究拟利用代谢组学研究观察TIA患者发病后不同时间点的外周血代谢谱变化,旨在筛查出与脑缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)相关的代谢物,并为后续探索其在CIS中的作用奠定基础。 方法 收集20例TIA患者发病后1d和7d外周静脉血,经离心后分离出血浆,利用液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography with Mass Spectrometry,LC-MC/MS)检测代谢谱的表达情况。采用偏最小二乘判别分析法(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)分析TIA患者发病后7d和1d的代谢模式差异,并通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、人类代谢组数据库(Human metabolome database,HMDB)和脂质代谢途径研究(Lipid metabolites and pathways strategy,LIPID MAPS)等数据库进行代谢物通路及分类注释以解释代谢物相关的生物学意义并筛选出差异代谢物,采用KEGG富集通路分析找出差异高表达代谢物富集的代谢途径,利用标准分数(Z-score)衡量同一水平代谢物的相对含量的高低。 结果 1.TIA患者血浆代谢物LC-MC/MS结果:总共检测到1543种代谢物质,其中正离子模式966种,负离子模式577种。 2.PLS-DA分析结果:正离子和负离子模式下2个时间点差异代谢物的Q2值>0.8,且R2Y>Q2Y,R2值>Q2值且Q2回归线与Y轴的截距<0,提示纳入的TIA病例样本具有代表性,并可作为模型生物标记物寻找的前提。 3.KEGG通路注释结果:TIA患者检出的血浆代谢物主要参与脂类新陈代谢信号通路,其中与神经系统疾病有关的有14种,而与免疫系统相关的有4种。 4.HMDB分类注释结果:TIA患者发病后血浆代谢物最主要参与脂质和类脂分子的代谢途径。 5.LIPID MAPS分类注释结果:TIA患者发病后血浆代谢物最主要注释到脂肪酸类。 6.与TIA发病后1d相比,发病后7d的血浆中有151种差异表达的代谢物,其中85种差异高表达,另66种为差异低表达(P<0.05)。 7.KEGG通路富集分析显示:85种差异高表达代谢物主要富集于视黄醇(全反式13,14二氢视黄醇)和花生四烯酸(20-羧基白三烯B4和前列腺素B2)代谢通路及神经组织激活配体-受体相互作用通路(皮质醇);而66种差异低表达的代谢物主要富集在磷酸盐和苯丙氨酸代谢通路(丙酮酸、苯丙氨酸、水杨酸、苯乙醛)。 8.Z-score分析显示:TIA发病后7d,在同一水平9-氧代-10(E),12(Z)-十八碳二烯酸(9-Oxo-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid,9-KODE)的含量是明显增高的(P<0.05)。 9.综合TIA患者发病后血浆代谢物的分类注释和KEGG通路富集分析结果发现差异高表达的代谢物中属于内源性的代谢物,其中前列腺素B2和20羧基-白三烯B4参与脂肪酸类物质代谢且又富集于KEGG最显著富集通路上。 结论 1.TIA患者发病后血浆代谢谱有明显变化,发病后7d与1d相比差异表达代谢物主要参与脂类和和类脂分子的代谢途径。 2.TIA患者血浆中皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4和前列腺素B2含量显著增加,主要富集于视黄醇和花生四烯酸代谢通路。 第二部分短暂性脑缺血诱导的差异代谢物对缺血性脑卒中的作用背景和目的 急性CIS目前最为有效的治疗方法是早期血管再通治疗,但受严格时间窗等条件限制,以及继发性出血等并发症影响,真正能从早期血管再通治疗中获益的CIS患者目前国内不到10%。造成此现象的主要原因之一是对CIS的发病机制缺乏深入了解。因此,通过探索CIS发病机制寻求更多有效治疗方案是很有必要的。 TIA可能对继发CIS患者产生IPC作用。IPC是一种内源性保护机制,具有显著的神经保护作用。既往IPC神经保护作用的研究主要集中在体液和神经因子相互作用过程。最新研究提示IPC诱导代谢谱的变化在缺血耐受中具有重要作用,但TIA诱导的血浆代谢物变化在CIS中的作用目前尚不清楚。本研究在第一部分的研究基础上,我们进一步观察TIA患者差异高表达代谢物在实验性CIS模型中是否具有神经保护作用。 方法 1.观察药物预处理对神经功能的影响 线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,动物随机分为Sham组、Vehicle+MCAO组和药物预处理+MCAO组,每组8只。造模前第5d开始药物预处理组分别给予腹腔注射皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2,每天一次,连续5d。术后2d采用mNSS评分,滚筒、粘贴物去除和悬挂试验进行神经功能评分;利用Nissl染色计算脑梗死体积;原位末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)法观察脑梗死周边区细胞凋亡情况;免疫印迹法(Western blot,WB)检测脑梗死周边区凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。 2.观察药物后处理对神经功能的影响 线栓法制备小鼠MCAO模型,动物随机分为Sham组、MCAO+Vehicle组和MCAO+药物后处理组,每组8只。药物后处理组术后2h分别给予腹腔注射皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2,每天一次,共3次。术后2d采用mNSS评分,滚筒、粘贴物去除和悬挂试验进行神经功能评分;利用Nissl染色计算脑梗死体积;TUNEL法观察脑梗死周边区细胞凋亡情况;WB检测脑梗死周边区凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。 结果 1.与Vehicle+MCAO组相比,药物预处理组(包括皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2)小鼠MCAO后2d的神经功能显著改善;Nissl染色结果显示全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE预处理组小鼠MCAO后2d的脑梗死体积显著减小;TUNEL染色显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE预处理组小鼠脑梗死周边区的凋亡细胞显著减少;WB结果显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE预处理组脑梗死周边区Bcl-2的表达显著增高,Bcl-2/Bax的比值亦显著增加(P均<0.05)。 2.与MCAO+Vehicle组相比,药物后处理组(包括全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2)小鼠MCAO后2d的神经功能显著改善;Nissl染色结果显示全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE后处理组小鼠MCAO后2d的脑梗死体积显著减小;TUNEL染色显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE后处理组小鼠脑梗死周边区的凋亡细胞显著减少;WB结果显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE后处理组脑梗死周边区Bcl-2的表达显著增高,Bcl-2/Bax的比值亦显著增加(P<均0.05)。 结论 TIA诱导的血浆差异高表达代谢物皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4和前列腺素B2均能显著改善MCAO小鼠神经功能缺损,其中全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE有更明显的神经保护作用,可缩小脑梗死体积,减少脑细胞凋亡。 第三部分 全反式13,14二氢视黄醇通过中性粒细胞FoxO信号通路介导神经保护的作用与机制研究 背景和目的 脑缺血损伤后中性粒细胞是最先产生反应的免疫细胞。中性粒细胞在缺血性脑血管疾病中具有“双刃剑”作用。有些代谢物可抑制中性粒细胞迁移、脱粒以及白三烯的合成,从而通过抗炎发挥神经保护作用。本研究我们拟观察TIA患者发病后不同时间点外周血中性粒细胞数和中性粒性粒细胞基因表达变化,并将血浆中差异高表达全反式13,14二氢视黄醇的相对定量结果与其进行相关分析,旨在探索中性粒细胞在全反式13,14二氢视黄醇介导的神经保护中的作用。 方法 1.收集17例TIA患者发病后1d和7d的外周静脉血进行血常规检测,对比分析白细胞数、中性粒细胞数以及单个核细胞数变化;对中性粒细胞进行mRNA二代测序,并进行KEGG通路富集分析。 2.分别将TIA患者血浆差异高表达代谢物(全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE)的相对定量结果与白细胞数、中性粒细胞数和单个核细胞数或二代测序结果进行皮尔逊相关分析。 3.为了验证中性粒细胞在全反式13,14二氢视黄醇介导的神经保护中的作用,利用抗Ly6G抗体腹腔注射消耗中性粒细胞。将动物随机分为3组:Vehicle+MCAO组,Anti-Ly6G+MCAO 组,全反式 13,14 二氢视黄醇+Anti-Ly6G+MCAO 组,每组8只。术后2d进行神经功能评分(同第二部分)并采用Nissl染色计算脑梗死体积。 结果 1.17例TIA患者发病后7d和1d的血常规对比分析结果:10例TIA患者白细胞计数和中性粒细胞计数是轻度增高的,9例TIA患者单个核细胞计数轻度增高。中性粒细胞mRNA二代测序结果:与TIA发病后1d相比,7d外周血中性粒细胞中有300种差异表达基因,其中121种表达下调,179种表达上调(P均<0.05);KEGG通路富集分析显示FoxO信号通路是TIA发病后差异表达基因最显著富集通路之一。 2.皮尔逊相关分析显示TIA患者血浆全反式13,14二氢视黄醇高表达水平与外周血白细胞和中性粒细胞计数增加均呈显著正相关(P均<0.05);且与中性粒细胞多个差异表达呈显著正相关(P均<0.05),包括鸟氨酸脱羧酶抗酶3蛋白(OAZ3),转膜蛋白67(TMEM67)、长基因间非蛋白编码RNA 1560(LINC01560)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(AC034105.3)等。3.与Anti-Ly6G+MCAO组相比,全反式13,14二氢视黄醇预处理组小鼠MCAO后2d的神经功能未见显著改善,脑梗死体积未见明显减小(P>0.05)。结论TIA患者血浆全反式13,14二氢视黄醇水平的增加与外周血中性粒细胞增多明显相关;中性粒细胞在全反式13,14二氢视黄醇对MCAO小鼠神经保护功能中起重要作用,并可能通过参与FoxO信号通路发挥作用。
关键词: 短暂性脑缺血发作 ；代谢谱 ；血浆 ；缺血预处理 ；大脑中动脉闭塞 ；9-KODE ；全反式13,14二氢视黄醇 ；缺血耐受 ；小鼠 ；短暂性脑缺血发作 ；中性粒细胞 ；二代测序 ；神经保护 ；FoxO信号通路
摘要： 目的探讨川崎病血管损伤过程是否与白三烯B4-白三烯B4受体1(LTB4-BLT1)通路有关,了解丙种球蛋白治疗川崎病的作用机制。方法分别用正常血清、川崎病急性期血清、川崎病急性期血清加丙种球蛋白作用于人脐静脉内皮细胞(ECV304)48 h后,检测BLT1在细胞内mRNA水平上表达的情况,以及不同作用下内皮细胞条件培养基中LTB4的浓度。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测内皮细胞BLT1基因的表达,酶联免疫吸附试验(enzym e-linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测内皮细胞条件培养基中LTB4的浓度以观察内皮细胞分泌LTB4的情况。结果内皮细胞BLT1表达水平和培养上清液中LTB4浓度在川崎病血清刺激48 h后明显上调(P<0.01),而在用含治疗量丙种球蛋白培养液培养的内皮细胞中BLT1表达水平和培养上清液中LTB4浓度上调不明显。结论LTB4-BLT1通路参与川崎病血管内皮损伤过程,丙种球蛋白可能通过阻断LTB4-BLT1通路而起到治疗川崎病的作用。
关键词: 丙种球蛋白 ；川崎病 ；血管内皮损伤 ；LTB4-BLT1通路
被引量
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摘要： 本文综述了川崎病(KD)分子生物学研究进展,包括可以为预后和疗效提供重要信息的可溶性血管细胞黏附分子1和肿瘤坏死因子α;与KD免疫发病机制有关,并可望为KD或其他Toll样受体(TLR)传导途径异常活化的疾病提供新的治疗线索的TLR途径负性调节因子A20、IRF-4和TRAF4;在KD的血管损伤过程中发挥重要作用的白三烯B4和白三烯B4受体2通路;有助于KD病情评价的降钙素原和白细胞介素6质量浓度;与KD高凝状态和血栓形成有关,并能预测是否合并冠状动脉损伤的D-二聚体;在KD急性期加重血管壁破坏,而在恢复期参与血管重构的血管内皮生长因子;KD及其冠状动脉损害发生机制的重要参与者,在不同阶段被不同细胞显著表达的一氧化氮和一氧化氮酶;与KD血管炎性损伤的发生和发展有密切关系,并已成为治疗新靶点的NF-κB等免疫因子。多方位重新探讨KD的病因、诊断、治疗和预后等问题,以期为广大KD患儿的早日康复带来福音。
关键词: 分子生物学 ；免疫因子 ；川崎病
被引量
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摘要： 目的观察川崎病（KD）急性期血清和丙种球蛋白对血管内皮细胞产生白三烯B4（LTB4）的影响，以及不同刺激后的内皮细胞条件培养基对单核巨噬细胞表达LTB4受体2（BLIT2）的影响，以了解LTB4-BLT2通路在KD血管损伤过程中的作用以及丙种球蛋白治疗KD可能的作用机制。方法分别用KD急性期血清和KD急性期血清加丙种球蛋白作用于人脐静脉内皮细胞（ECV304）后，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测内皮细胞条件培养基中LTB4浓度的改变；用流式细胞术检测不同内皮细胞条件培养基作用于单核巨噬细胞后，巨噬细胞表达BLT2的情况。结果KD血清能够诱导内皮细胞产生LTB4，KD血清刺激后的内皮细胞条件培养基能够使巨噬细胞BLT2表达上调；而加入丙种球蛋白后可显著抑制上述LTB4和BLT2的改变。结论LTB4-BLIT2通路参与KD血管炎性损伤过程，丙种球蛋白阻断LTB4-BLT2通路可能是其抗KD冠状动脉损伤的机制之一。
关键词: 白三烯B4 ；黏膜皮肤淋巴结综合征 ；丙种球蛋白
被引量
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摘要： 一、研究背景与目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括两种类型:克罗恩病(Crohn's disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。其病因及发病机制尚未明确。IBD的病程迁延反复,不仅影响患者的生活质量,还加重了公共卫生事业的负担,因此,积极探索对IBD的发病机制显得尤为重要,将为IBD防治提供新的策略。研究发现,核苷酸寡聚区域2(nucleotide oligomerization domain 2,NOD2)、细胞因子23(IL23)型辅助T细胞17(Th17)通路都已被证明在IBD的发病机制中起重要的作用。肠道炎症的发生发展中涉及多种炎症因子如白细胞介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等。使用抗生素或其他手段改变肠道菌群均能有效控制IBD的病情。最近研究报道n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)能降低白三烯B4、血栓素A2(thromboxane A2)、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF-α)等强力的促炎因子的生成,从而发挥显著的抗炎作用。在大鼠的DSS诱导肠炎模型中,给予含丰富DHA及EPA的饮食可以有效缓解大鼠肠炎的症状。但n-3PUFAs影响IBD发生的机制目前仍然未阐明。哺乳动物雷帕霉素靶受体(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可整合细胞内外的各种刺激信号,调节蛋白质翻译、脂质合成、细胞生长、增殖、自噬、衰老等多种生命活动。近年来报道其在炎症的发生、发展中扮演重要角色。很大一部分的炎症反应都依赖于抗原特异性T细胞的增殖与克隆,而T细胞的增殖则与mTOR的活性密切相关,通过作为调节性T细胞和效应T细胞相互转化过程的桥梁,mTOR在机体的免疫平衡体系中充当着支点这一角色。而有研究指出,给予雷帕霉素可以抑制mTORC1活性,抑制实验性肠炎的淋巴细胞迁移,从而缓解肠炎的症状。此外,本课题组成员前期的一些研究发现,n-3PUFAs与mTOR的活性有密切的联系。这些结果表明,n-3PUFAs可能通过调节mTORCI的活性影响IBD的发生发展,深入研究n-3PUFAs调控mTOR活性的机制将为IBD防治提供新的思路。我们在预实验中发现,利用DSS诱导C57小鼠发生结肠炎时,同时给予小鼠富含DHA的鱼油灌胃会缓解小鼠肠炎的发展。小鼠的体重下降幅度、结肠炎症短缩的程度及直肠出血的症状都得到了改善。同时,我们利用小鼠结肠组织进行组织切片的免疫组化,发现DSS诱导结肠炎的小鼠肠上皮细胞的mTORC1活性上升,但在DHA灌胃的小鼠中,肠上皮细胞mTORC的活化被抑制。这些结果提示,结肠上皮细胞对结肠炎的发生发展也有重要的影响,而n-3 PUFAs可能通过抑制mTOR信号通路影响结肠炎的发生发展。为证实这一假设,本研究拟通过动物与细胞模型探讨n-3 PUFAs是否通过调节mTORC1活性抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎,以及寻找mTOR影响IBD发生发展的机制,为使用n-3 PUFAs、靶向mTORC1信号防治IBD提供实验依据。二、研究方法1、转基因小鼠和基因敲除小鼠与结肠炎小鼠模型构建。将fat-1小鼠与C57小鼠交配繁殖出fat-1阳性小鼠,同窝的fa加-1阴性小鼠作为对照;此外运用Cre-loxP系统繁殖CAC;Tsc1-/-小鼠,同窝Tsc1-/-小鼠作为对照;将fat-1小鼠与CAC;,Tsc1-/-小鼠交配繁殖出fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠,同窝CAC;Tsc1-/-小鼠作为对照。然后进行利用DSS诱导小鼠发生结肠炎。2、通过检测小鼠造模期间的体重变化及隐血试验结果的变化,来计算疾病活动评分。造模结束后,取小鼠结肠进行长度测量及组织切片。运用HE染色观察结肠组织结构的改变并根据预先设定的评分标准进行病理评分。综合上述的几个指标,对小鼠结肠炎的病变程度进行分析与判定。3、利用组织切片免疫组化及免疫荧光来了解小鼠结肠上皮pS6的表达,用以判定mTORC1的活化程度。除此以外,我们利用EDTA法提取了小鼠结肠上皮细胞,通过免疫印迹来确定与mTORC1活性相关的蛋白的表达水平;同时利用Trizol试剂提取结肠上皮细胞的组织mRNA来进行IL-1β及IL-6等因子的转录水平测定,了解小鼠的炎症相关因子的转录水平改变。三、研究结果1、n-3PUFAs可以缓解DSS诱导的C57小鼠的结肠炎。造模后,(1)对照组造模周期的后两天的体重较实验组明显下降,经统计差异显著(p<0.05)。n-3PUFAs的摄入能够对肠炎造成的体重下降起一定的保护作用。(2)实验组小鼠结肠的实际长度较对照组长;(3)实验组小鼠的体重肠长比也较对照组更接近正常小鼠。(4)在造模周期的后两天,实验组的直肠出血评分显著低于对照组(p<0.05)。(5)实验组的疾病活动评分(DAI)也比对照组低(p<0.05)。(6)实验组的结肠组织切片病理评分较对照组低,差异有统计学意义(p<0.05)。2、转入fat-1基因能缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。我们利用转入了fat-1基因的小鼠进行DSS肠炎诱导,发现(1)fat-1小鼠能够缓解肠炎引起的体重下降,特别是造模周期的后两天,与对照组对比有统计学差异(p<0.05)。(2)fat-1小鼠的结肠长度也比对照组要长。fat-1小鼠的体重肠长比较对照组更接近正常小鼠。(3)fat-1小鼠的结肠组织切片的病理评分也显著低于对照组(p<0.05),结肠损伤更少。3、摄入外源及内源产生的n-3 PUFAs均能下调DSS诱导的肠炎模型结肠上皮细胞的mTORC1活性。我们利用小鼠结肠的组织切片免疫组化检测mTORC1活性即pS6(s235/236)表达水平。结果显示:DSS诱导肠炎模型中,小鼠结肠上皮细胞的pS6(s235/236)表达增加,mTORC1活性提高。而外源摄入(C57小鼠以DHA灌胃)及内源产生n-3PUFAs(fat-1小鼠)在DSS诱导肠炎时结肠上皮细胞的mTORC1活性被抑制。此外,我们还提取了小鼠的结肠上皮细胞进行western blotting,结果显示pS6(s235/236)在肠炎发生时表达上升,在给予了DHA灌胃的小鼠和fat-1小鼠中表达基本恢复到正常水平。4、小鼠结肠上皮特异性敲除TSC1能加重DSS诱导的结肠炎。通过应用Cre-loxp系统我们获得了结肠上皮细胞特异性敲除Tsc1的小鼠,CAC;Tsc1-/-小鼠。对这种小鼠及其同窝对照进行DSS诱导肠炎后,我们发现,(1)CAC,Tsc1-/-小鼠因肠炎引起的体重下降较对照组更重(p<0.05)。(2)CAC;sc1-/-小鼠的结肠较对照组短。(3)疾病活动评分显示CAC;Tsc1-/-小鼠的疾病活动程度较高(p<0.05)。(4)CAC;Tsc1-/-小鼠的结肠组织病理切片的病理评分较对照组要高(p<0.05)。(5)利用肠上皮细胞的组织RNA进行荧光定量PCR显示促炎因子IL-1β和IL-6的转录水平都比对照组明显上升(p<0.05)。5、fat-1缓解DSS诱导的结肠上皮特异性敲除TSC1的小鼠的肠炎。在CAC,Tsc1-/-小鼠中再转入fat-1基因而繁殖出fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠后,我们同样进行了 DSS诱导肠炎模型。结果显示,(1)肠炎造模中fat1-CAC;Tsc1-/-如小鼠的体重下降幅度比对照的CAC;Tsc1-/-小鼠小(p<0.05);(2)fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠的结肠长度较对照组长。(3)fa11-CAC;Tsc1-/-小鼠的体重肠长比也较CAC;Tsc1-/-小鼠有显著改善(p<0.05)。(4)DAI评分也显示fat-1的加入能缓解CAC;Ts,Tsc-/-小鼠的肠炎进展。(5)fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠的结肠组织切片的病理评分也较对照低。(6)利用RT-PCR进行检测则发现fat1-CAC;Tsc-/-小鼠结肠上皮细胞的IL-1 β及IL-6的mRNA转录水平下调。6、CA4C;Tsc1-/-小鼠的结肠上皮细胞在肠炎时Fpr2表达上调,而fat-1转基因可以抑制mTORC1活性同时下调Fpr2表达。通过对小鼠结肠组织切片进行免疫组化我们发现,(1)fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠的肠上皮细胞的pS6(s235/236)表达较对照组下调,mTORC1活性下降。(2)利用结肠上皮细胞蛋白进行westernblotting也显示pS6(s235/236)表达下调,mTORC1活性下降。我们同时还检测了结肠上皮细胞Fpr2的mRNA转录水平。结果显示(3)CACTsc1-/-小鼠结肠上皮细胞Fpr2的转录水平上升;(4)fat1-CAC;T,Tsc1-/-小鼠结肠上皮细胞的Fpr2转录水平下降。四、结论1、外源摄入和内源产生的n-3 PUFAs都能缓解DSS诱导的结肠炎并抑制小鼠肠上皮mTORC1活性。2、结肠上皮特异敲除Tsc1引起mTORC1活化,会加重DSS诱导的肠炎。3、内源产生的n-3 PUFAs(fat-1)能够缓解结肠上皮细胞mTORC1活化所致的小鼠肠炎进展,同时抑制结肠上皮细胞mTORC1活性。4、n-3 PUFAs可能通过抑制肠上皮细胞mTORC1活性、下调Fpr2转录水平从而缓解DSS诱导的肠炎。
关键词: 炎症性肠病 ；溃疡性结肠炎 ；葡聚糖硫酸钠 ；mTORC1 ；n-3多不饱和脂肪酸 ；fat-1 ；甲酰肽受体2
摘要： 目的: 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常见的慢性肺部炎症性疾病，有着较高的发病率。慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)常合并炎症并发症，患者肺功能恶化，是COPD的首要死亡原因。本研究旨在探讨COPD及AECOPD患者脂氧素A4体内合成的关键酶5-LO、15-LO以及其灭活关键酶15-PDGR、LTB4DH的表达情况与脂氧素A4受体ALX、白三烯B4受体BLT1的表达水平，通过从蛋白及基因水平检测其相关酶及受体的表达，从炎症消退的角度，来探究COPD的发病机制，从而寻找治疗COPD的新靶点，为临床提供有效的治疗新策略。 方法: 参照中华医学会呼吸病学分会2013年修订的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》，并结合患者的病情、症状及影像学检查，将符合诊断COPD及AECOPD的患者纳入研究当中，并且选取健康体检者为对照，分为健康对照组、COPD组、AECOPD组三个试验组，外周静脉采血，提取外周血的RNA，利用荧光定量PCR技术检测各组外周血中5-LO mRNA、15-LO-1 mRNA、15-PGDH mRNA、LTB4DH mRNA、ALX mRNA、BLT1mRNA的表达水平，同时利用流式细胞技术检测各组外周血中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞的ALX受体、BLT1受体的表达水平。 结果: 1.荧光定量PCR技术检测各组外周血中5 LO mRNA、15 LO-1 mRNA、15-PGDH mRNA、LTB4DH mRNA的表达情况: 5-LO在AECOPD组中表达较高，与COPD组相比，具有统计学差异（P＜0.01）。其余各组间并没有统计学差异，其中COPD组的表达量较低。各试验组之间，15-LO-1在表达量上并没有明显的统计学差异，COPD组的表达量较低。15-PGDH与LTB4DH的表达各组内差异较大，各组间无明显差异。 2.流式细胞术检测各试验组外周血白细胞的ALX受体表达情况: 在健康对照组、COPD组及AECOPD组中，外周血单核细胞的ALX受体表达较高。比较单核细胞上ALX受体表达各组间的差异，与健康对照组相比，AECOPD组的表达水平较高，有统计学意义（P＜0.01）。与COPD组相比，AECOPD组的表达水平也是较高的，有统计学意义（P＜0.05）。在三组当中，COPD组单核细胞的ALX受体表达处于较低的水平，但与健康对照组相比，差异无统计学意义。 ALX受体在中性粒细胞上的表达各组间没有明显差异，其在淋巴细胞上表达量很小，与健康对照组相比，AECOPD组ALX受体在淋巴细胞上的表达较高，差异有统计学意义（P＜0.01）。 3.流式细胞术检测各试验组外周血白细胞的BLT1受体表达情况: 与健康对照组及COPD组相比，AECOPD组BLT1受体在单核细胞上的表达水平较高，有统计学意义（P＜0.05）。其余各组间比较，无统计学意义。BLT1受体在中性粒细胞上的表达各组间无明显差异，其在淋巴细胞上几乎不表达。 4.荧光定量PCR检测各试验组外周血中ALX mRNA、BLT1 mRNA表达情况: AECOPD组外周血ALX mRNA表达水平较COPD组明显增高，并且其差异具有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间无明显差异，COPD组的ALX mRNA处于较低的水平。各试验组外周血样本BLT1 mRNA的表达水平没有统计学差异，其中AECOPD组的BLT1表达水平较高。 结论: COPD组患者脂氧素A4相关的合成酶5-LO表达较低，且ALX受体表达较低，可能提示COPD患者存在炎症消退障碍，从而导致COPD的炎症转为慢性，持续存在。而AECOPD患者炎症程度较强，脂氧素A4相关的合成酶5-LO及ALX受体表达均较高，是慢性炎症的急性表现，可能与触发促炎症消退程序有关。
关键词: 慢性阻塞性肺疾病 ；病理机制 ；脂氧素A4 ；酶活性 ；脂氧素A4受体 ；白三烯B4受体
摘要： 脓毒症(Sepsis)是以多器官功能衰竭和心血管抑制为特征的全身炎症反应综合征,其死亡率高,预后差且治疗费用高,目前已成为非心血管重症病房中最常见的死亡原因。目前对脓毒症的研究大都聚焦于促炎与抗炎、氧化与抗氧化以及凝血与纤溶等诸多系统的启动、放大与调控。虽然已有许多新药上市,可以调节免疫功能、阻断脂质过氧化、恢复凝血/纤溶平衡等,但是其临床效果欠佳。而且,脓毒性休克是一种临床急症。心血管系统是重要的循环系统,心血管功能异常在脓毒症早期即已存在,尤其在严重脓毒症和脓毒症休克患者中较为显著,有较大比例患者存在左室收缩/舒张功能异常。临床研究证明心脏功能抑制显著增加脓毒血症病人的死亡率。脓毒性心功能障碍已经广泛被关注,但其潜在的机制没有很好的解释。白三烯B4(LTB4)是一种强有力的炎性介质和趋化因子,通过与其相应受体结合而发挥生物学效应,其潜在的炎性脂调节可被涉及在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征、类风湿关节炎和缺血性心脏病等多种疾病的病理生理过程。另外,LTB4通过白三烯B4受体1(BLT1)介导白细胞聚集从而在脓毒症中发挥重要的作用。目前国外已有研究表明LTB4/BLT1通路参与天然免疫和获得性免疫系统免疫细胞功能的调控。LTB4介导的炎症已经证明在1型糖尿病患者中发生脓毒症的敏感性提高。研究发现在脓毒症中血清LTB4浓度提高促进血管内皮功能紊乱,脓毒症中血清LTB4浓度提高,使用BLT1受体拮抗剂后可使脓毒症诱导的各种器官损伤程度减轻,表明LTB4和BLT1对脂多糖诱导的急性心功能障碍可能起作用。腺苷5-单磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是丝、苏氨酸蛋白激酶,主要协调能量和代谢的需要,是细胞能量稳态的重要调节因子。AMPK存在于细胞核和细胞质中允许快速变化(细胞质中蛋白质的磷酸化)和代谢过程的逐渐调整(基因转录的变化)以维持能量的稳态,可启动分解代谢途径,增加ATP的产生,同时关闭合成代谢途径,减少ATP的消耗。研究发现AMPK信号通路与脂多糖诱导的急性心功能障碍有关。值得注意的是,AMPK与能量代谢相关疾病如2型糖尿病、肥胖症、癌症、脑缺血损害、心脏缺血再灌注等相关。研究发现,AMPK信号通路在心脏面临缺血性损伤对能量需求增加时具有重要作用,活化的AMPK有助于增加葡萄糖摄取和糖酵解,加速脂肪酸氧化,增加心肌组织的能量供应,并可以抑制心肌细胞凋亡保护心肌组织,而且对血管平滑肌细胞、内皮细胞的增殖及能量代谢均有影响,在心血管重构过程中起重要作用。然而AMPK和BLT1两者在脂多糖致脓毒性心功能障碍中的关系尚不清楚。综上所述,我们提出:抑制LTB4/BLT1受体可能通过激活AMPK信号通路发挥抗脓毒性心功能障碍的作用,并最终通过减轻线粒体功能障碍和抗凋亡途径发挥心肌保护作用。本课题将采用一系列研究模型和实验方法,阐明AMPK和BLT1在脂多糖致脓毒性心功能障碍中的关系及具体作用机制。本研究中,我们探究LTB4/BLT1在脂多糖诱导的小鼠急性心肌损伤模型中的作用和阐明其潜在的机制。通过研究其作用机制和了解治疗靶点才能更好的用于指导临床,进一步改善脓毒症患者的病死率。第一部分:建立LPS诱导的脓毒性心功能障碍小鼠模型,研究抑制LTB4/BLT1受体后对脓毒性心功能障碍的影响目的:建立脓毒性心功能障碍小鼠模型,观察LTB4对脓毒症小鼠心功能的影响及抑制LTB4/BLT1受体后对小鼠心功能的影响,明确抑制LTB4/BLT1受体对脓毒症小鼠心功能的作用。方法:C57小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)建立脓毒症模型,观察LTB4对脓毒症小鼠心功能的影响。实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)LTB4;(4)LTB4+LPS;(5)U753021μM+LTB4。观察不同浓度LTB4/BLT1受体抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠的影响。实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U753020.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LTB4(10mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,小鼠麻醉接受超声心动图检测。记录超声心动图指标,包括:左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF%)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,FS%),和舒张早期到晚期二尖瓣充盈峰值流速比(the peak velocity ratios of early to late mitral inflow filling,E/A ratio)。结果:1)LTB4是否对脓毒症小鼠心功能造成影响。超声心动图分析表明,LTB4组FS%和EF%显著减低(与Control组相比,P<0.01);LPS+LTB4组FS%和EF%显著减低(与LPS组相比,P<0.05);U75302+LTB4组中小鼠的EF轻度减低(与Control组相比,P>0.05)。表明LTB4可导致脓毒症小鼠心功能的损伤。2)不同浓度LTB4/BLT1抑制剂U75302对脓毒症小鼠的心功能是否有保护作用。超声心动图分析表明,LPS处理组可导致FS%和LVEF%有意义的减低,E/A比显著增加(与Control组相比,P<0.05)。U75302预处理组逆转了FS%和LVEF%的减低和E/A比增加,还呈浓度依赖性(与LPS组相比,P<0.05)。结果表明不同浓度U75302(0.25,0.5,1μM)对脓毒症小鼠的心功能均有明确的保护作用。结论:(1)LPS可以诱导脓毒症小鼠心功能损伤,LTB4可加剧脓毒症小鼠心功能损伤;(2)LBT4/BLT1抑制剂U75302可能有保护脓毒症小鼠心功能损伤的作用。第二部分:研究抑制LTB4/BLT1受体对脓毒症小鼠心肌炎症、凋亡、线粒体功能、生存率的影响及可能的作用机制目的:观察LTB4/BLT1受体抑制剂U75302对脓毒症小鼠心肌炎症、凋亡、线粒体功能的各项指标、小鼠生存率的影响及可能的作用机制。方法:实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U75302 0.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,测血浆LTB4的水平。BLT1另一种抑制剂CP105,696也用于评估其对脓毒性心功能障碍心肌炎症、凋亡和线粒体功能的影响。1)通过Real-time PCR法检测TNF-α和IL-6m RNA水平,Western blot法检测p NF-k B和Ik B-α蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌炎症的影响;2)通过Westernblot法检测BCL-2、BAX和cleaved caspase-3的蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌凋亡的影响;3)分离提取心肌细胞线粒体,评估complex I(Nd)and complex IV(Co)亚单位密码m RNA表达通过通过Real-time PCR法检测核DNA(Cox4i and Cox5a)or mt DNA(mt-Nd1,mt-Nd2,mt-Co1,and mt-Co2),Western blot法检测ComplexⅠ、ComplexⅡ和OPA1蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌线粒体生物学和功能学的影响;4)通过Westernblot法检测p AMPK、AMPK、p ACC、ACC和PGC1α的蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对保护脓毒症小鼠心功能障碍可能的作用通路;5)基于之前的研究,我们选择U75302 1mg/kg作为最佳浓度。实验分为3组:(1)PBS;(2)LPS;(3)LPS+U75302,LPS(30mg/kg),LPS(30mg/kg)+U75302(1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,观察6h到3d内小鼠生存率并绘制Kaplan-Meier生存曲线。结果:1)LPS预处理后显著增加TNF-α和IL-6m RNA水平及p NF-k B表达(与Control组相比,P<0.05),但是Ik B-α表达减少(与Control组相比,P<0.05),然而U75302可以显著降低TNF-α,IL-6和p NF-κB表达水平及增加Ik B-α表达(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696可以逆转p NF-k B增加和Ik B-α减少(与LPS组相比,P<0.05)。2)LPS预处理可导致心肌凋亡,相关凋亡蛋白Bcl-2表达减少,Bax和cleavedcaspase-3表达增加(与Control组相比,P<0.05)。然而U75302可以降低凋亡呈浓度依赖的方式(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696可以减少凋亡,Bax表达减少,Bcl-2表达增加。(与LPS组相比,P<0.05)。3)LPS预处理可致complexⅠ,complexⅡ和OPA1表达减少(与Control组相比,P<0.05),核DNA和mt DNA缺失(P<0.05);U75302可以减弱这些改变和保持complex I,complex II and OPA1表达(P<0.05);U75302轻度的逆转m RNA在线粒体的改变(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696通过保持complex I,complex II and OPA1表达可以减轻线粒体损伤。4)LPS预处理后可致p AMPK,p ACC和PGC1α显著增加(与Control组相比,P<0.05)。U75302抑制BLT1受体后导致p AMPK,p ACC和PGC1α表达的增加(与LPS组相比,P<0.05),这表明AMPK信号传导途径的进一步被活化。5)Kaplan-Meier生存曲线结果显示,LPS+U75302组小鼠在LPS注射后72h死亡率显著减低(与LPS组相比,P<0.01)。结论:抑制LTB4/BLT1受体,可以保护脓毒症小鼠心肌细胞炎症、凋亡及线粒体损伤且该保护可能是通过AMPK信号通路介导,从而明确LTB4/BLT1抑制剂U75302对脓毒症小鼠心功能损伤的保护作用。第三部分:研究AMPK信号通路是否参与BLT1抑制剂对毒性心功能障碍的保护作用并探讨其作用机制目的:进一步探讨AMPK信号通路在LPS诱导的小鼠脓毒性心功能障碍过程中可能的作用并阐明其作用机制。方法:1)实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U753020.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。 LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行,腹腔注射。通过Western blot方法检测p AMPK/AMPK,p ACC/ACC,PGC1α表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍是否有影响。2)实验分为4组:(1)LPS;(2)LPS+Compound C;(3)LPS+U75302;(4)LPS+U75302 + Compound C。
关键词: 白三烯B4受体1 ；脂多糖 ；心功能障碍 ；线粒体功能 ；腺苷5-单磷酸活化蛋白激酶
摘要： 皮肤瘙痒(pruritus)是一种迫切搔抓愿望的皮肤感觉,瘙痒是皮肤病最常见的临床表现,瘙痒的神经生理学机制一直未被阐明,反复搔抓会释放各种炎性因子加重皮肤损害,产生更为强烈的瘙痒-搔抓循环。皮肤瘙痒的临床治疗困难,目前仍无特效方法,组胺可以引起皮肤瘙痒,但是组胺受体拮抗剂治疗特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)皮肤瘙痒的效果并不明显,表明组胺不是特应性皮炎等慢性皮肤瘙痒症的主要致痒物质。
蛋白酶活化受体2 (proteinase activated receptor-2, PAR-2)属于G蛋白偶联受体家族(G protein coupled receptor, GPCR)成员,介导跨膜信号转导,可以被丝氨酸蛋白酶激活,PAR-2在包括皮肤在内的不同组织细胞均有表达,具有广泛的生物学活性。最新临床研究发现蛋白酶活化受体-2与瘙痒的发生密切相关,和健康人体皮肤组织相比,特应性皮炎患者的类胰蛋白酶分泌明显增多,皮损处传入神经纤维PAR-2的表达增多,皮下注射PAR-2激动剂可引起患者皮肤持续性瘙痒,提示类胰蛋白酶是一种强效内源性致痒物质,PAR-2是治疗皮肤瘙痒的有益靶点,PAR-2调控皮肤瘙痒的确切分子机制尚未阐明。本课题通过构建被动皮肤过敏反应(passive cutaneous anaphylaxis, PC A)与特应性皮炎样(atopic-like dermatitis)小鼠皮肤瘙痒模型,深入研究PAR-2调控皮肤瘙痒的分子机制。
第一部分过敏性皮肤瘙痒PAR-2作用机制研究
PAR-2是肥大细胞参与皮肤炎症和超敏反应的重要分子,我们通过小鼠尾静脉注射DNP-OVA,构建小鼠PCA模型,对PAR-2在过敏性皮肤瘙痒中的作用机制进行研究。结果发现小鼠尾静脉注射DNP-OVA后搔抓次数明显增加,与空白对照组小鼠相比,差异有统计学意义。盐酸西替利嗪与酮舍林可以明显抑制PCA小鼠的搔抓行为,盐酸西替利嗪与酮舍林合用,PCA小鼠的搔抓次数明显减少,与PCA小鼠相比,差异有统计学意义。亮肽素与PAR-2单克隆抗体可以明显抑制PCA小鼠的搔抓行为,与PCA小鼠相比,差异有统计学意义；非特异性IgG抗体组小鼠的搔抓次数未见明显减少,与PCA小鼠相比,差异无统计学意义。他克莫司可以明显抑制PCA小鼠的搔抓行为,他克莫司与盐酸西替利嗪合用PCA小鼠的搔抓次数明显减少,与PCA小鼠相比,差异有统计学意义。小鼠皮内注射类胰蛋白酶搔抓次数明显增加,他克莫司可以明显抑制类胰蛋白酶诱导的瘙痒反应。结果表明PAR-2是小鼠过敏性皮肤瘙痒的重要信号分子,他克莫司对于小鼠过敏性皮肤瘙痒具有明显的抑制作用。
第二部分PAR-2调控皮肤瘙痒分子机制研究
PAR-2是治疗皮肤瘙痒的有益靶点,我们通过研究药物对PAR-2活性肽(SLIGRL-NH2)诱导小鼠搔抓行为的影响,探讨PAR-2调控皮肤瘙痒的分子机制。结果发现皮内注射SLIGRL-NH2,小鼠搔抓次数明显增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义；与SLIGRL-NH2对照组相比,盐酸西替利嗪组小鼠的搔抓次数未见明显改变,齐留通组小鼠的搔抓次数明显减少,吲哚美辛组小鼠的搔抓次数未见明显改变；与SLIGRL-NH2对照组相比,他克莫司组小鼠的搔抓次数明显减少,差异有统计学意义；与空白对照组相比,皮内注射PAR-2反义肽(LRGILS-NH2)小鼠的搔抓次数未见明显改变,差异无统计学意义。小鼠皮内注射SLIGRL-NH2后,花生四烯酸类代谢产物白三烯B4 (LTB4)和前列腺素E2(PGE2)水平明显增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义；与SLIGRL-NH2对照组相比,齐留通与他克莫司组小鼠皮肤LTB4水平明显减少,盐酸西替利嗪与吲哚美辛组小鼠皮肤LTB4水平未见明显改变；与SLIGRL-NH2对照组相比，吲哚美辛与他克莫司组小鼠皮肤PGE2水平明显减少,盐酸西替利嗪与齐留通组小鼠皮肤PGE2水平未见明显改变；与空白对照组相比,小鼠皮内注射LRGILS-NH2,皮肤LTB4与PGE2水平未见明显改变。SLIGRL-NH2刺激后,小鼠皮肤角质形成细胞LTB4分泌量明显增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义；与SLIGRL-NH2对照组相比,齐留通与他克莫司组角质形成细胞LTB4分泌量明显减少,盐酸西替利嗪与吲哚美辛组角质形成细胞LTB4分泌量未见明显改变；与空白对照组相比,SLIGRL-NH2刺激后,角质形成细胞PGE2分泌量明显增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义；与SLIGRL-NH2对照组相比,吲哚美辛与他克莫司组角质形成细胞PGE2分泌量明显减少,盐酸西替利嗪与齐留通组角质形成细胞PGE2分泌量未见明显改变；与空白对照组相比,LRGILS-NH2刺激后,小鼠角质形成细胞LTB4与PGE2分泌量未见明显改变,差异无统计学意义。结果表明PAR-2活性肽可以刺激角质形成细胞分泌LTB4与PGE2,其中LTB4与PAR-2活性肽诱发的皮肤瘙痒密切相关。
第三部分慢性皮肤瘙痒PAR-2作用机制研究
特应性皮炎(AD)是一种慢性、复发性、难治性炎症性皮肤病,患者血清lgE水平明显升高,AD患者慢性皮肤瘙痒的发病机制尚未阐明。我们依据文献采用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏小鼠,建立符合临床AD病理学特征的动物模型,从整体水平比较研究AD发病前后PAR-2表达水平的变化,探讨PAR-2在慢性皮肤瘙痒中的作用机制。与空白对照组相比,小鼠OVA致敏后,致敏部位表皮、真皮层均显著增厚,伴有明显炎性细胞浸润；正常皮肤组织可见PAR-2阳性表达,小鼠OVA致敏后,致敏部位皮肤PAR-2阳性表达显著增加。与空白对照组相比,小鼠OVA致敏后,致敏部位皮肤PAR-2 mRNA表达与PAR-2蛋白水平明显增加,血清IgE与类胰蛋白酶水平明显增加。小鼠OVA致敏后,搔抓次数明显增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义；与OVA致敏小鼠相比,盐酸西替利嗪(10 mg/kg)组、亮肽素组、PAR-2单克隆抗体组与他克莫司(1.0%、3.0%)组小鼠的搔抓次数明显减少,差异有统计学意义。结果表明PAR-2是OVA致敏小鼠皮肤瘙痒的重要信号分子,他克莫司对于OVA致敏小鼠特应性皮炎样慢性皮肤瘙痒具有明显的抑制作用。
关键词: 皮肤瘙痒 ；特应性皮炎 ；蛋白酶活化受体-2 ；肥大细胞 ；角质形成细胞 ；他克莫司
被引量
7
摘要： 第一部分薯蓣皂苷经5-LO/LTB4途径对TNF-α诱导FLS损伤的保护作用及机制研究背景和目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜异常增生为主要特征的自身免疫疾病。滑膜异常增生与滑膜细胞的凋亡和增殖失衡有关,其中成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)作为血管翳形成的主要细胞,由于凋亡不足积极参与RA的进程。RA患者FLS的特征是呈肿瘤样扩张,在血管翳形成、软骨和骨侵蚀中具有中心作用。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)产生于RA免疫反应的早期,能够诱导体内很多细胞产生炎性细胞因子白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白细胞介素-8(Interleukin 8,IL-8)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase 2,COX-2)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)等,促进滑膜增生,参与RA等炎症免疫反应。薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种药理作用,表明了其广阔的应用前景。本实验我们采取TNF-α体外诱导FLS作为RA的离体模型,探索Dio对TNF-α诱导Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型(CollagenⅡinduced arthritis,CIA)大鼠FLS(RAFLS)的治疗作用及其机制。方法:1.将0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml TNF-α与RAFLS共同孵育24h、48h、72h,MTT法检测细胞存活率,确定TNF-α诱导RAFLS的最佳浓度和时间。2.将0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml Dio与TNF-α诱导的RAFLS共同孵育24h、48h、72h检测细胞存活率,确定Dio对TNF-α诱导RAFLS作用的合适浓度和时间。3.ELISA检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞培养上清中白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4)含量的变化。4.实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative transcription polymerase chain reaction,Q-PCR)检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio 3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞中5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)、白三烯A4水解酶(Leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)、白三烯B4受体1(Leukotriene B4 receptor 1,BLT1)、白三烯B4受体2(Leukotriene B4 receptor 1,BLT2)m RNA的表达变化。5.蛋白印迹检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞中5-LO、LTA4H蛋白的表达变化。6.免疫荧光检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞中LTA4H蛋白的表达变化。结果:1.与对照组相比,2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量组TNF-α与RAFLS共同孵育24h、48h、72h均能显著提高细胞的存活率,且10ng/ml剂量组TNF-α处理组RAFLS增殖促进作用最为明显(p<0.05)。综合考虑,以后的实验我们选用终浓度为10ng/ml TNF-α处理24h制作细胞模型。2.与TNF-α模型组相比,1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml剂量组Dio能够时间剂量依赖性的抑制TNF-α诱导的RAFLS的增殖(p<0.05)。3μg/ml剂量组Dio作用于RAFLS 24h后,细胞存活率达到49.46±1.33,接近50%。综合考虑,后续实验我们选用1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml剂量组Dio处理TNF-α诱导的RAFLS,作用24h。3.与对照组相比,RAFLS经TNF-α诱导后,培养上清中LTB4含量明显升高,Dio能剂量依赖的降低TNF-α引起的LTB4含量的升高(p<0.05)。4.与对照组相比,RAFLS经TNF-α诱导后,细胞中5-LO和LTA4H m RNA和蛋白表达明显升高(p<0.05)。与TNF-α模型组相比,1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml Dio剂量组细胞5-LO和LTA4H m RNA和蛋白表达明显降低(p<0.05)。5.与对照组相比,RAFLS经TNF-α诱导后,细胞中BLT1和BLT2 m RNA表达明显升高,1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml剂量组Dio能显著降低TNF-α模型细胞中BLT1和BLT2 m RNA表达,4μg/ml剂量组Dio能显著降低FLS中BLT2 m RNA表达(p<0.05)。结论:1.10ng/ml TNF-α与RAFLS共同孵育24h,可以显著促进RAFLS的增殖,故选择此浓度作用24小时制作离体RA疾病模型。2.1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml的Dio与TNF-α诱导的RAFLS共同孵育24h,能显著抑制RAFLS细胞的增殖,提示其对TNF-α引起的RAFLS损伤具有保护作用。3.Dio可以降低TNF-α诱导的RAFLS培养上清中LTB4的含量,这可能与其对FLS损伤的保护作用有关。4.Dio可能通过下调TNF-α诱导的RAFLS中LTB4合成酶系5-LO和LTA4H表达,降低上清中LTB4的含量。5.Dio可以降低TNF-α诱导的RAFLS LTB4受体BLT1和BLT2的表达,阻碍LTB4下游通路,发挥对TNF-α诱导的RAFLS损伤的治疗作用。第二部分薯蓣皂苷经5-LO/LTB4途径治疗CIA小鼠的作用及机制研究背景和目的:RA是一种以关节滑膜炎为主要特征的常见的自身免疫病。临床患者表现为关节晨僵、肿胀、畸形,甚至功能丧失、残疾等,严重影响患者的生活质量。CIA模型是与RA临床发病最为相似的动物模型,是RA实验研究的常用动物模型。中医学认为薯蓣皂苷具有“消食利水,舒筋活血,祛痰,截疟”的功效,现代研究证实薯蓣皂苷具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤、改善心血管功等多种药理作用,是一种潜在的治疗RA的中药。本实验拟应用牛Ⅱ型胶原诱导的CIA小鼠模型,从整体动物水平研究薯蓣皂苷片(Dioscornin tablets,DT)对RA的治疗作用,并探讨其分子机制。方法:1.雄性昆明系小鼠(6-8周龄),体重25±2g,随机分为对照组、CIA小鼠模型组和DT 5个剂量组:15.6 mg/(kg·d)、31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)、249.6 mg/(kg·d),每组12只。于初次免疫d21,对照组和模型组给予生理盐水灌胃,用药组给予不同剂量的DT灌胃,观察DT对CIA模型小鼠体重、关节指数、足爪肿胀程度、胸腺和脾脏指数、脾脏和滑膜病理损伤的影响。2.ELISA检测对照组,CIA模型组,低、中、高DT组小鼠血清中LTB4含量变化。3.反转录PCR(RT-PCR)检测对照组,CIA模型组,低、中、高DT组小鼠脾脏中5-LO、LTA4H、BLT1、BLT2 m RNA表达的变化。4.蛋白印迹和免疫组化检测对照组,CIA模型组,低、中、高DT组小鼠脾脏中5-LO、LTA4H蛋白的表达变化。结果:1.与对照组相比,CIA模型组小鼠体重、关节指数、关节肿胀度以及胸腺指数和脾脏指数明显高于对照组(p<0.05)。与CIA模型组相比,灌胃治疗12天后31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)DT剂量组小鼠体重、关节指数和关节肿胀度有不同程度的降低,灌胃治疗21天后小鼠的脾脏指数均不同程度的降低(p<0.05)。灌胃治疗21天后62.4 mg/(kg·d)各DT剂量组小鼠胸腺指数显著降低(p<0.05),脾脏病理损伤和踝关节病理损伤明显改善。2.与对照组相比,CIA模型组小鼠血清中LTB4的含量明显升高,而不同剂量组DT均能显著的降低CIA小鼠血清中LTB4含量(p<0.05)。3.与对照组相比,CIA模型组小鼠脾脏中LTA4H和5-LO m RNA和蛋白的表达明显升高(p<0.05),而DT低、中、高组剂量均能显著的降低CIA小鼠脾脏中5-LO和LTA4H蛋白的表达,DT低、中组剂量能显著的降低CIA小鼠脾脏中5-LO m RNA的表达(p<0.05)。4.与对照组相比,CIA模型组小鼠脾脏中BLT1和BLT2 m RNA表达明显升高,DT低、中组剂量能显著的降低CIA小鼠脾脏中BLT1 m RNA表达,低、中、高剂量DT均能显著降低CIA小鼠脾脏中BLT2 m RNA表达(p<0.05)。结论:1.31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)剂量组DT可明显降低CIA小鼠体重、关节指数、关节肿胀度以及胸腺指数、脾脏指数,并且可明显改善小鼠胸腺和脾脏病理损伤,因此对CIA小鼠有治疗作用。2.CIA模型组小鼠血清中LTB4的含量明显升高,不同剂量组DT均可显著降低CIA小鼠血清中LTB4的含量,表明LTB4异常增加可能与RA发病有关,而DT对CIA小鼠的治疗作用可能涉及其对LTB4含量的降低。3.DT通过降低CIA小鼠LTB4合成酶系5-LO和LTA4H的表达降低CIA小鼠血清中LTB4的含量。4.DT可以通过降低CIA小鼠脾脏中LTB4受体BLT1和BLT2的表达,阻碍LTB4发挥作用。
关键词: 类风湿关节炎 ；CIA小鼠 ；薯蓣皂苷片 ；TNF-α ；FLS
被引量
5
摘要： 目的
过敏性紫癜(henoch-Sehonlein purpura, HSP)是一种常见的全身性小血管炎,可以累及全身多个系统,涉及皮肤。关节、胃肠道、和肾脏病变。其主要病理变化是白细胞破碎性小血管炎。大约67%患者可能反复发作且容易发生肾脏的损害。研究过敏性紫癜HSP和过敏性紫癜性肾炎(henoch-sehonleinpurpura nephritis HSPN)病因及机制,才能够有效地预防HSPN的发生是近来研究的热点。众多研究资料表明,HSP或HSPN是一系列复杂的免疫反应和炎症反应导致的。细胞因子和炎性介质在过敏性紫癜的发病机制中的作用越来越被重视。大量证据均证实了组胺影响体内多数免疫及炎症过程中的生理、病理反应从而起到对炎症的促进作用。白三烯B4(LTB4)是花生四烯酸代谢产物,有趋化、活化白细胞,参与血管的炎症和损伤,和具有调节免疫反应的作用,正常时体内合成很低,在血管内皮细胞受损伤时合成增多。过敏性紫癜治疗的主要目标是抑制炎症细胞的活化和递质释放以及阻断其相应的受体。本实验通过对过敏性紫癜患者的血清组胺和LTB4含量进行检测,目的在于发现探讨组胺和LTB4在过敏性紫癜的发病机制中是否起有重要作用,随着炎性因子和HSP的深入研究,期望在过敏性紫癜治疗方面提供一些新的理论依据和治疗方法。
方法
采集27例过敏性紫癜患者急性期血清以及13例健康查体者(正常组)血清,用酶联免疫吸附试验检测血清中组胺、LTB4含量。
结果
血清组胺病例组含量为44.09±2.469(pg/ml),健康对照组组胺含量为1.811±0.427(pg/ml)；血清LTB4病例组含量为66.855±17.55(pg/ml),健康对照组LTB4含量为42.89±18.04(pg/ml)。HSP患者血清组胺和LTB4水平均显著高于正常对照组,且p<0.05。由此,组胺和白三烯B4差异均有统计学意义。
结论：1组胺在过敏性紫癜的发病和病理生理起到很重要的作用;
2LTB4参与过敏性紫癜的发病及病理生理。
关键词: 紫癜 ；过敏性 ；组胺 ；白三烯B4
被引量
1
摘要： 背景 溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)的一种。该病病程长、易复发,与直结肠癌的发生密切相关。近年来,因本病就诊人数呈现逐步增加的趋势。尽管UC的发病机制尚没有明确,但其针对自身抗原的免疫反应在疾病的发展过程中起到重要作用。有越来越多的证据从不同侧面支持了本病自身免疫损伤学说。大量研究表明,Thl7/Treg、Thl/Th2转化失衡可能是IBD发病的重要因素之一。 作为机体重要的免疫细胞,B细胞不仅可以介导体液免疫和细胞免疫发挥正性免疫调节作用,近年来的研究显示B细胞中存在具有负性调节作用的细胞亚群——调节性B淋巴细胞(Regulatory B Cell, Breg)。其主要功能是调节炎症过程,抑制过度炎症反应,是移植排斥、自身免疫病以及免疫功能紊乱等状态下的一种重要的保护性细胞,其作为一种新的炎症调节细胞有着广阔的应用前景。目前Breg的研究多集中在动物模型中,关于人类和非人灵长类动物体内Breg的研究仍较少见。而UC发病过程中是否存在效应性B细胞与调节性B细胞的转化失衡因素仍未知。有学者初步研究了小鼠体内的IL-10+Breg细胞对多种原因诱发的肠道炎症有良好的缓解作用。也有学者研究发现自身免疫病患者(如系统性红斑狼疮等)体内Breg调节功能的缺失。综合目前对Breg的研究可以发现,Breg具有多种表型。可谓是,疾病不同,表型不同；同一表型,不同疾病中的作用不同；刺激不同,Breg作用对象不同。其中与肠道及其炎症相关的是CD19+CD5+CD1d+B细胞群,本研究针对CD19+CD5+CD1d+B细胞,探讨其与UC发病的关系。 Breg主要通过分泌IL-10发挥调节作用,而IL-10的分泌依赖TLRs/MyD88信号通路的作用。动物研究表明,LPS刺激小鼠脾细胞,能有效促进IL-10的分泌。作为LPS的配体,TLR4及其下游的MyD88信号与IL-10的表达有着密切关系。而LRs/MyD88介导的信号具有细胞特异性,如树突状细胞能通过该路径促进T细胞活化,而B细胞则通过提供一个富含IL-10的周围环境而抑制T细胞增殖和分化。同时,TLRs/MyD88/NF-KB信号通路是出发炎性反应的途径之一,黄芩苷能否特异性活化Breg的TLRs/MyD88通路,进而促进IL-10的表达有待探讨。 目前,临床上治疗UC患者的一线药物不良反应明显,而顽固性、重症患者则要依赖毒副作用更严重的药物。因此,耐受性好的新的治疗途径亟待开发。UC属中医“痢疾”“肠癖”“肠风”“泄泻”“脏毒”等范畴。中药复方黄芩汤是传统医学治疗“泄泻”等病证的经典名方,中药黄芩的有效成分黄芩苷具有抗炎、镇痛、抗感染、抗过敏、抗氧化、肝纤维化、抗高血糖、抗肿瘤、抗细胞损伤、抗焦虑样效应等多重功效,临床应用广泛。现代药理学方法研究表明,黄芩苷的抗炎作用在于有效降低促炎因子IL-1β和TNF-α,并降低LPS活化的巨噬细胞内NF-κB的活性等。同时能抑制白细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成,抑制fMLP激发的白细胞内Ca2+升高,并促进细胞内cAMP水平提高,从而影响白细胞的多种功能。黄芩苷会否通过对Breg的调节发挥抗炎作用的问题有待探讨。 本研究以UC患者和肠炎小鼠模型为研究对象,以健康人为对照,以肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome, IBS)患者为疾病对照,探讨CD19+CD5+CD1d+B细胞的表达与UC的关系,探讨黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B细胞以及TLR/MyD88信号通路的调控作用。 目的 1.探讨CD19+CD5+CDld+B细胞在UC患者外周血及结肠组织中的表达情况,以及血清相关细胞因子的表达水平； 2.通过体外培养实验,探讨黄芩苷对UC患者外周血CD19+CD5+CDld+B细胞及其胞内IL-10的调控作用,探讨黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B细胞内TLR4/MyD88信号通路的影响； 3.借助UC动物模型,探讨黄芩苷体内给药对UC模型动物CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及IL-10表达相关信号通路蛋白TLR4/MyD88的调控作用,同时探讨黄芩苷对小鼠DSS肠炎的治疗效果以及TLR4-MyD88-NFκB信号通路的调控。 方法 一、CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞与UC的相关性研究 1.临床患者入选及分组： 入选标准：UC患者入选标准参考《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》；IBS患者入选标准参考《肠易激综合征中西医结合诊疗共识意见(2011年)》。 患者分组：结合入选标准,将患者分为3组：健康对照组(Control组,n=36)；溃疡性结肠炎组(UC组,n=36)；肠易激综合征组(IBS组,n=27)。 2.流式细胞术(FCM)检测外周血CD19、CD5+CDld+B细胞比例； 3.激光共聚焦显微镜(LSCM)观察CD19+CD5+CDld+B细胞在人结肠组织中的表达情况； 4.免疫组织化学法(IHC)检测TLR2、TLR4、TLR9在结肠组织的表达； 5.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α和TGF-β的水平；二、黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞的体外干预作用研究 6.体外干预实验细胞入选和分组： 入选标准：已入选实验的中度病情UC患者外周血单核细胞； 细胞分组：空白对照组、LPS刺激组、LPS+黄芩苷刺激组(LPS+BCLN组)。 7.UC患者外周血单核细胞分离； 8.UC患者外周血单核细胞分别与不同刺激物共培养48小时,三组刺激物分别为PBS(对照组)、LPS (LPS组)、LPS和黄芩苷(LPS+BCLN组); 9.流式细胞术检测CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及胞内IL-10、TLR4和MyD88的表达； 10.比较不同刺激物对CD19+CD5+CDld+B细胞比例的影响； 11.比较不同刺激物对CD19+CD5+CDld+B细胞IL-10、TLR4和MyD88表达的影响; 三、黄芩苷对DSS肠炎小鼠CD19+CD5+CDld+B细胞及相关信号蛋白调控作用研究 12.实验动物肠炎模型造模及分组： 分组方法：C57BL/6小鼠32只,随机分为4组：对照组(n=8)、DSS组(n=8)、DSS+黄芩苷组(n=8)、DSS+美沙拉嗪组(n=8)。 小鼠肠炎模型造模方法：饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulfate, DSS),制成3.5%DSS溶液给DSS组、DSS+黄芩苷组、DSS+美沙拉嗪组小鼠自由饮用,连续7天； 13.分别用黄芩苷和美沙拉嗪治疗DSS肠炎小鼠,治疗方案如下： 黄芩苷、美沙拉嗪按100mg/kg剂量配制0.3ml的灌胃液,造模成功后给予DSS+黄芩苷组、DSS+美沙拉嗪组小鼠每天两次、连续7天灌胃给药。 14.评价DSS诱导的肠炎小鼠模型以及治疗效果： 每天观察大鼠的饮食、体重、粪便、毛色、活动和精神状态等情况。记录小鼠体重下降、隐血／便血情况,两者评分总和的平均值为每只小鼠的改良DAI评分(mDAI),用以评估疾病严重程度和治疗效果。 15.流式细胞术检测各组小鼠外周血CD19+CD5+CDld+B细胞比例； 16.分离结肠组织中的单核细胞,流式细胞术检测结肠组织CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及CD19+CD5+CDld+B细胞的MyD88及IL-10的表达水平； 17.Western blot法检测各组小鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NFκB-p65蛋白的表达水平。 18.RT-PCR法法检测小鼠结肠组织中IL-6、IL-10、IL-13、TNF-αmRNA的表达水平。 统计方法 实验数据用均数±标准差(x±S)表示,用统计软件SPSS19.0进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)法。分析前对数据进行方差齐性检验,方差齐时用LSD法进行多重比较；方差不齐时用Welch法进行方差分析,多重比较采用Dunnett'sT3法分析；重复测量的资料采用重复测量数据方差分析方法进行比较,如果满足球形检验,则无需矫正；如果不满足球形检验,则采用Greenhouse-Geisser系数来矫正自由度。P<0.05差异有统计学意义。 结果 一、CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞与UC的相关性研究 1.三组间CD19+CD5+CD1d+B细胞比较差异无统计学意义(F=0.402,P=0.670)。 2.UC患者血清IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α和TGF-p的水平ELISA检测结果： (1) IL-6：各组间血清IL-6水平差异有统计学意义(F=4.507,P=0.013)。UC组分别较对照组和IBS组升高,差异有统计学意义(P=0.006,P=0.029),对照组与IBS组比较无统计学差异(P=0.688)。 (2) IL-10：各组间血清IL-10水平差异有统计学意义(Welch=129.474,P=0.000)。UC组较对照组和IBS组升高,差异有统计学意义(P=0.000),IBS组血清IL-10水平较对照组降低,差异有统计学意义(P=0.002)； (3)IL-13：各组间血清IL-13水平差异有统计学意义(F=4.288,P=0.016)。UC组和IBS组血清IL-13水平较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.019,P=0.010),UC组与IBS组相比无统计学差异(P=0.696)； (4) IL-17：各组间血清IL-17水平差异有统计学意义(F=27.27,P=0.000)。UC组较IBS组和对照组升高,差异有统计学意义(P=0.000),IBS组较对照组降低,差异有统计学意义(P=0.040)； (5)TNF-a:各组间血清TNF-α水平差异有统计学意义(F=16.669,P=0.000),UC组较对照组和IBS升高,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.011),IBS组较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.000)； (6)TGF-p：各组间血清TGF-p水平差异有统计学意义(Welch=71.804,P=0.000),UC组较对照组和IBS组升高,差异有统计学意义(P=0.000)IBS组较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.021)。 3.TLR2、TLR4、TLR9在结肠组织中的表达 (1)TLR2：三组间TLR2表达水平有统计学差异(F=10.399,P=0.001)。UC组高于IBS组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001)。IBS组和对照组之间差异无统计学意义。 (2)TLR4：三组间TLR4表达水平有统计学差异(F=18.699,P=0.000)。UC组高于IBS组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。IBS组和对照组之间差异无统计学意义(P=1.000)。 (3)TLR9：三组间TLR9表达水平有统计学差异(F=41.533,P=0.000)。UC组高于IBS组和对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.019)。IBS组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。 4.CD19+CD5+CDld+B细胞在结肠组织中的分布情况：LSCM检测结果显示,CD19+CD5+CDld+B细胞均表达于三组结肠组织中。其比例三组间均无差异(F=0.728,P=0.486)。 二、黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞的体外干预作用研究 5.黄芩苷上调UC患者PBMC中CD19+CD5+CDld+B细胞的比例： 各组间CD19+CD5+CD1d+B细胞比例有统计学差异(F=16.361,P=0.000)。LPS+BCLN刺激组高于LPS刺激组和PBS对照组,差异有统计学意义(P=0.004,P=0.026)。LPS刺激组高于PBS对照组,差异有统计学意义(P=0.033)。 6.黄芩苷对UC患者CD19+CD5+CDld+B细胞TLR4、MyD88、IL-10表达的影响 (1)TLR4：三组CD19+CD5+CD1d+B细胞的TLR4表达有统计学差异(F=6.
关键词: 调节性B细胞 ；CD19+CD5+CD1d+B淋巴细胞 ；溃疡性结肠炎 ；炎症性肠病 ；黄芩苷
被引量
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摘要： 一、研究背景与目的
表皮肿瘤是常见的皮肤疾病,其主要来源细胞为表皮的角质形成细胞,恶性表皮肿瘤可发生转移,严重者甚至可危及患者生命。近年来,表皮肿瘤的发病率呈不断上升趋势。表皮肿瘤的病因及发病机制复杂,目前认为主要与环境因素、基因突变及病毒感染有关。该类疾病的治疗多以手术治疗为主,但受到病变范围、病期等诸多因素的限制。因此,深入研究此类疾病的发病机制,对于临床上寻找新的简便有效的防治方法具有重要意义。
近年来研究证实,白三烯及其受体(leukotriene receptors,LTRs)参与了人胰腺癌、恶性淋巴瘤、结肠癌等多种肿瘤的发生,是肿瘤发生的一种新机制,其主要机制可能为肿瘤细胞上白三烯受体高表达,发挥了对肿瘤细胞的促增殖作用。另外有研究发现半胱氨酰白三烯受体1(cysteinyl leukotriene receptor 1,CysLTR1)在结肠癌细胞中发生核转位是发挥促增殖作用的重要机制。研究同时表明这种促增殖效应可被相应的受体拮抗剂所阻断;并且有研究表明白三烯B4受体(leukotrienes B4 receptor,BLT)拮抗剂LY293111在治疗肿瘤Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中有抗瘤效应。以上研究均提示白三烯及其受体与肿瘤的发生发展相关。目前虽然已有研究报道LTRs在多种组织细胞中表达,但关于LTRs在表皮肿瘤组织中的表达、分布与功能,以及他们在表皮肿瘤发病中作用的研究少见报道。
我科在前期研究中已证实半胱氨酰白三烯及其受体在表皮高增殖性疾病银屑病中表达升高,并且文献报道BLT2 mRNA在人的皮肤鳞状细胞癌肿瘤组织中较正常组织相比高表达。我们推测白三烯及其受体参与表皮肿瘤的发生,其机制可能为白三烯与其受体结合后,发挥对表皮肿瘤细胞的促增殖作用,而白三烯受体的表达是否可因外界环境因素(如目光)而诱发,均需要我们进一步深入研究。
为探讨白三烯受体参与表皮肿瘤发生的机制,就必然要了解白三烯及其受体对人角质形成细胞的影响。如果能够了解白三烯受体在皮肤组织甚至角质形成细胞中的表达状况与功能,白三烯与紫外线作用于角质形成细胞所发生的生物学作用,将对于评价LTRs在表皮肿瘤发病中的作用以及寻求新的治疗靶位和方法具有积极的意义。
二、方法与结果
1.采用免疫组化法检测几种表皮肿瘤组织中LTRs的表达。结果:CysLTR1和CysLTR2、BLT1和BLT2在表皮肿瘤、寻常型银屑病、正常皮肤中均有表达。阳性染色主要分布于癌细胞巢、表皮细胞的胞膜及胞浆内,胞核未见明确表达。正常皮肤的皮脂腺及汗腺也可见BLT的表达。与正常表皮相比,鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma,SCC)、基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)、寻常型银屑病(psoriasisvulgaris,PV)中白三烯受体的表达上调(P＜0.05);而白三烯受体在Bowen's病(Bowen'sdisease,BD)、鲍温样丘疹病(Bowenoid papulosis,BP)、脂溢性角化病(seborrheic keratosis,SK)表达与正常皮肤相似(P＞0.05)。相同疾病的同一组织中,CysLTR1和CysLTR2、BLT1和BLT2表达强度无显著差异(P＜0.05)。
2.运用白三烯B4(leukotriene B4,LTB4)与中波紫外线(ultraviolet B,UVB)作用人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞),然后首先采用流式细胞术检测细胞周期的变化,运用RT-PCR检测人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在HaCaT细胞中的表达,同时采用免疫细胞化学、免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察、免疫印迹等方法检测HaCaT细胞上BLT及p53的表达。结果:①证实了HaCaT细胞上存在BLT1和BLT2的表达,分布于细胞膜和细胞浆,胞核中未见表达;②LTB4作用HaCaT细胞,hTERT表达上调、细胞增殖指数(proliferation index,PI)增高、BLT表达与空白对照相似;③HaCaT细胞上无突变型p53表达,通过LTB4、UVB及二者共同作用于HaCaT细胞均不能诱发p53的突变,但UVB照射可引起野生型p53表达升高(P＜0.05);④UVB单次急性照射HaCaT细胞,BLT的表达升高(P＜0.05),PI降低;⑤LTB4和UVB共同作用HaCaT细胞,HaCaT细胞PI下降,p53、BLT、hTERT的mRNA与空白对照无显著差异(P＞0.05)。
三、结论
1.CysLTR1和CysLTR2、BLT1和BLT2在SCC、BCC、PV组织中表达升高,提示LTRs可能参与了SCC、BCC、PV的发病过程。
2.HaCaT细胞上表达BLT1和BLT2蛋白,并且LTB4能够促进HaCaT细胞的增殖,但这种调控可能不依赖于BLT的核转位。
3.UVB照射可诱导HaCaT细胞BLT的表达升高,但同时野生型p53升高,细胞增殖减弱,可能提示UVB急性照射过程中细胞凋亡发挥了主导作用。
通过以上实验,为评价LTRs在表皮肿瘤发病中的作用和地位,寻求新的防治靶点奠定了一定的实验基础。
关键词: 表皮肿瘤 ；HaCaT细胞 ；白三烯 ；白三烯受体 ；白三烯B4 ；白三烯B4受体 ；UVB ；增殖
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