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摘要： [目的]为研究白木香受到胁迫的生长与防御过程,探明其结香过程的生理响应机制。[方法]以3年生白木香为对象,应用注射真菌菌剂与机械钻孔2种诱导结香方法对白木香进行制香,通过分析其调控生长与防御的激素含量、抗氧化酶活性、防御物质总酚与总萜含量以及光合与叶绿素荧光特性,研究白木香对真菌侵染与机械损伤胁迫的生理响应机制。[结果]在胁迫初期,与防御反应相关的激素茉莉酸、水杨酸、乙烯前体含量在胁迫处理组中显著升高,而与生长相关的激素赤霉素与生长素含量降低;在胁迫后期,茉莉酸、水杨酸与乙烯前体含量逐步降低,而赤霉素与生长素的含量逐渐增加。胁迫处理初期的抗氧化酶活性与总酚、总萜的含量显著高于对照组;抗氧化酶活性增幅随处理时间的延长而减小,总酚和总萜含量随处理时间的延长而增加,但增幅速率降低。胁迫处理1~3个月的光合作用与叶绿素荧光受到抑制,而胁迫处理第6个月时,光合与荧光得到恢复。[结论]当白木香受到真菌侵染与机械损伤胁迫时,激活防御反应的激素含量显著升高,抗氧化酶活性增加,同时次生代谢防御产物酚类与萜类增加,光合作用受到抑制;随着时间的延长,白木香生长获得恢复,胁迫得到缓解。说明白木香结香过程是防御反应加强,产生沉香物质,且是生长与防御的动态平衡过程。
关键词: 白木香 ；胁迫 ；激素 ；抗氧化性酶 ；次生代谢产物 ；光合特性 ；叶绿素荧光
被引量
18
摘要： 茉莉酸(jasmonic acid,JA)为植物防御反应的重要信号分子,其生物合成途径的关键酶是丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS)。本研究以白木香(Aquilaria sinensis)为材料,设计特异引物,克隆了白木香As AOS1基因的c DNA序列,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、组织特异性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析。白木香As AOS1基因的开放阅读框(ORF)长1 575 bp,编码524个氨基酸,其蛋白分子质量是58.70 k Da。As AOS1蛋白包含细胞色素P450的保守区域。系统进化树显示As AOS1蛋白与甜橙(Citrus sinensis)AOS蛋白同源性较高。构建原核表达载体p ET28a-As AOS1并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达As AOS1重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性As AOS1重组蛋白。荧光定量PCR结果显示As AOS1基因在茎中表达最高,根次之,叶中表达最低。盐、低温和重金属胁迫能够诱导白木香愈伤组织中As AOS1基因表达,诱导12 h表达量达到最高;激素茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸诱导后,愈伤组织中As AOS1基因的表达量明显上升,而干旱胁迫和赤霉素处理对本As AOS1基因的表达量影响不大。本研究为进一步研究茉莉酸途径在白木香结香机制和植物防御反应中作用奠定基础。
关键词: 白木香 ；丙二烯氧化物合酶 ；茉莉酸 ；原核表达 ；表达分析
被引量
14
摘要： 琼府[2013]88号各市、县、自治县人民政府,省政府直属各单位:为深入贯彻落实党的十八大、十八届三中全会精神和全国科技创新大会精神,激发广大科技工作者的创新积极性,加快推进我省科技进步和科技创新,省政府决定,对为我省科学技术进步、经济社会发展作出突出贡献的科学技术人员和组织给予奖励。授予"白木香防御反应诱导沉香形成机制及通体结香技术研究"项目省科技进步奖特等奖,"低窄壳糖规模化生产与应用研究"等11个项目省科技进步奖一等奖,"几类微分方程的理论和数值解法研究"
关键词: 省科技进步奖 ；白木香 ；科学技术人员 ；创新大会 ；结香 ；科技成果 ；防御反应 ；科技工作者 ；热带作物 ；热带农
摘要： 沉香来源于瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)植株含树脂的木材。具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等药效作用,使用历史悠久,《名医别录》中将沉香列为上品。中国产沉香唯一法定来源树种为白木香,白木香树是典型的伤害诱导型药用植物。健康白木香树不能结香,需要经过凿洞、打钉、接菌、火烙、砍伤等不同伤害后才能产生树脂沉香。倍半萜为沉香中的主要活性化学成分之一,倍半萜合酶为沉香倍半萜合成途径中最关键的催化酶。前期我们实验室筛选到沉香中一个重要倍半萜合酶基因ASS1,并找到了调控ASS1表达的关键转录因子WRKY44,它是位于ASS1启动子上游W-box处的转录抑制子,类似一个“开关”。健康状态下抑制ASS1转录表达;当植物受到伤害后,WRKY44通过某种机制被降解,ASS1开始转录表达,合成倍半萜。但WRKY44是如何降解的,尚不清楚。阐述清楚WRKY44的降解分子机制是解析白木香受伤害诱导后形成沉香机理的关键点之一。基于此,本论文围绕转录因子WRKY44受伤害后的降解机制,以WRKY44为研究对象,采用免疫沉淀与质谱联用(IP-MS)方法鉴定与WRKY44降解相关的互作蛋白,解析了 WRKY44的降解分子机制,并对与WRKY44互作的蛋白的功能进行了研究。研究旨在解析白木香伤害诱导发生防御反应形成沉香的关键调控机制,并筛选出调控沉香结香的关键蛋白。主要研究成果如下:(1)筛选到3类与WRKY44降解相关的蛋白。通过IP-MS实验筛选与WRKY44的互作蛋白,基于蛋白降解性质,主要关注于筛选结果中3类与WRKY44降解相关蛋白:泛素化修饰相关类蛋白、蛋白激酶、伴侣蛋白。成功克隆其中7个关键基因(AsSnRK1y,AsCDPK,AsHECT,AsRING1,AsRING2,AsRING3,AsHSP70),为后续蛋白生物功能研究奠定基础。(2)明确WRKY44通过泛素-蛋白酶体途径降解,并筛选到能直接调控WRKY44泛素化修饰的RING型E3泛素连接酶RING3。WRKY44体内降解实验表明,MeJA处理愈伤组织后,WRKY44和泛素化修饰的WRKY44蛋白迅速降解,26S蛋白酶抑制剂MG132可以有效延缓WRKY44蛋白的降解速度。随后的IP实验结果与WRKY44体内降解实验结果一致。结合酵母双杂交、pull-down和BIFC实验,证实C3HC4型E3连接酶RING3与WRKY44在体内外直接互作。随后体外泛素化实验表明RING3具有E3泛素连接酶活性,且能够对WRKY44进行体外泛素化修饰。获得RING3-RNAi白木香转基因愈伤,体外降解实验表明WRKY44蛋白在转基因愈伤中降解速度相比于对照组明显减慢,表明RING3直接调控WRKY44蛋白通过泛素-蛋白酶体途径被降解。(3)GC-MS检测表明RING3能够调控白木香中倍半萜含量。GC-MS检测RING3-RNAi转基因愈伤中倍半萜含量,结果表明转基因愈伤中检测到4种倍半萜成分(α-guaiene,humulene,aromadendrene 和 δ-guaiene),且倍半萜合酶ASS1的主要催化产物α-guaiene,humulene和δ-guaiene在转基因愈伤中含量显著高于对照组,说明RING3/WRKY44/ASS1模块在调控白木香受伤害后倍半萜含量的产生过程中发挥了重要作用。(4)筛选到WRKY44互作蛋白AsSnRK1γ,明确AsSnRK1γ能调控白木香淀粉合成途径,调控白木香倍半萜含量。通过IP-MS实验,结合酵母双杂交、pull-down和BIFC实验证实WRKY44与AsSnRK1γ在体内外直接互作。转基因实验表明,过表达AsSnRK1γ转基因愈伤中淀粉和葡萄糖含量均高于对照组,且淀粉合成途径中关键酶基因:AGPase,GBSS,NI,SBE1,SBEII,SPP,SSP I,SSI和SS基因表达量在转基因愈伤中均比对照组中高。GC-MS检测结果表明转基因愈伤中共检测到的4种倍半萜(α-guaiene,humulene,aromadendrene,δ-guaiene)中的两种倍半萜成分(α-guaiene,δ-guaiene)含量显著高于对照组。(5)对IP-MS筛选到的AsHSP70基因进行基因家族鉴定,生信分析,表达分析和亚细胞定位,为后续深入研究其生物功能奠定基础。共筛选到15条AsHSP70基因,分成6个亚族。15条AsHSP70基因在热胁迫处理后表达水平均升高。各基因在沉香层、枝、根、茎、老叶、嫩叶、芽和花中均有表达,其中AsHSP70-1,AsHSP70-11,AsHSP70-3,AsHSP70-5和AsHSP70-15在沉香层中表达量高。通体结香技术处理植株后,15条基因在沉香形成过程中的不同时间或不同形成层中能够显著表达,部分基因主要在沉香层中表达,表明他们可能在沉香形成过程中起关键作用。综合以上结果,本研究不仅揭示了 MeJA处理下RING型E3泛素连接酶RING3介导转录因子WRKY4降解的分子机制,解析了倍半萜合酶ASS1健康条件下不表达,受伤害后启动表达的关键分子调控网络,且首次克隆了在WRKY44降解过程中活跃蛋白AsSnRK1γ,AsHSP70基因,初步探究其在促进倍半萜合成及沉香形成中的生物功能,为揭开沉香形成机理提供了一个新的视角。本研究解析清楚了伤害诱导白木香形成沉香分子机制的关键节点,为深刻认识结香机制及高效结香技术的创新发明提供了关键数据。
关键词: 白木香 ；倍半萜 ；沉香 ；WRKY44 ；RING3 ；泛素-蛋白酶体途径 ；AsSnRK1γ ；AsHSP70
被引量
2
摘要： 白木香（Aquilariasinensis）为瑞香科沉香属植物,白木香树在受到外界损伤刺激后能于伤口附近逐渐形成含有特殊香味的树脂,称之为沉香。沉香是传统名贵中药,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效,同时沉香也是名贵的香料。目前,关于白木香受刺激后形成沉香（结香）的分子机制亟待阐明,进而为建立针对性的结香方法,人为调控结香的进程及质量提供理论指导。2-苯乙基色酮类化合物是沉香的主要化学成分和特征性成分,也是参与白木香防御反应的重要物质,H2O2、产生H2O2的关键酶-NADPH氧化酶、MAPKs蛋白激酶在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用,但其是否能够影响白木香愈伤组织中2-苯乙基色酮的生物合成目前尚无明确报道。因此本课题旨在研究盐胁迫下白木香愈伤组织中H2O2、NADPH氧化酶、MAPKs蛋白激酶与2-苯乙基色酮生物合成的相关性,取得以下研究进展:一、盐胁迫能够使愈伤组织的细胞活性显著降低,在120 h降低到正常细胞的5%以下。因此我们在盐胁迫初期研究H2O2和NADPH氧化酶在2-苯乙基色酮生物合成中的相关性。盐胁迫初期,2-苯乙基色酮的含量持续上升,而H2O2的含量在24 h达到最高,之后显著降低。盐胁迫下外源添加H2O2 120 h能够显著降低2-苯乙基色酮的含量,而盐胁迫下添加DMTU（H2O2的清除剂）120 h,2-苯乙基色酮的含量明显增加。NADPH氧化酶,又称为Rboh,是盐胁迫下产生H2O2的主要酶类。为研究NADPH氧化酶对2-苯乙基色酮生物合成的影响,根据白木香愈伤组织转录组数据,通过RT-PCR结合RACE技术从白木香愈伤组织中克隆得到3个Rboh基因:AsRbohA-C。盐胁迫下AsRbohA-C的表达量与NADPH氧化酶的活性24 h瞬时增加,之后降低,这与H2O2在盐胁迫下的变化趋势一致。盐胁迫下外源添加H2O2能够增加AsRbohA-C的表达量和NADPH氧化酶的活性,而添加DMTU后AsRbohA-C的表达量和NADPH氧化酶的活性明显降低,说明NADPH氧化酶能够参与白木香愈伤组织中2-苯乙基色酮的生物合成。为进一步确定NADPH氧化酶与2-苯乙基色酮生物合成的相关性,盐胁迫下利用NADPH氧化酶的抑制剂—DPI处理愈伤组织120 h,发现DPI能够明显降低盐胁迫下AsRbohA-C的表达量和NADPH氧化酶的活性,显著提高2-苯乙基色酮的产量。因此,盐胁迫初期H2O2和NADPH氧化酶影响2-苯乙基色酮的生物合成。二、盐胁迫初期,白木香愈伤组织产生的主要2-苯乙基色酮是AH6和AH8。为研究MAPKs蛋白激酶与2-苯乙基色酮生物合成的相关性,利用MAPKK的抑制剂PD98059处理盐胁迫下的白木香愈伤组织,LC-MS-IT-TOF与Qtrap检测发现愈伤组织中含有的2-苯乙基色酮AH6和AH8的含量明显降低,预测MAPKs蛋白激酶家族可能影响2-苯乙基色酮的生物合成。台盼蓝与DAB染色的方法表明盐胁迫诱导愈伤组织细胞凋亡,预示2-苯乙基色酮生物合成可能与细胞凋亡相关。利用RT-PCR技术首次在白木香愈伤组织中克隆得到AsMAPKK5基因,农杆菌注射瞬时表达证明,AsMAPKK5定位于细胞壁和细胞核中,并且瞬时表达的本生烟叶片呈现明显的凋亡现象,同时利用台盼蓝和DAB染色证明瞬时表达AsMAPKK5使叶片细胞产生凋亡和大量的H2O2。实时荧光定量PCR结果表明AsMAPKK5在盐胁迫下其表达量上升,同时PD98059能够抑制AsM4PKK5的表达量。在白木香悬浮细胞中过表达AsMAPKK5,实时荧光定量PCR检测发现其能够显著提高生物合成2-苯乙基色酮关键酶AsPKS3的表达量。三、MAPKs蛋白进行信号传递都是通过MAPKKK-MAPKK-MAPK级联途径进行传递的,利用酵母双杂筛选结果表明AsMAPKK5与AsMAPK11互作。农杆菌注射实验表明AsMAPK11定位于细胞壁上,DAB和台盼蓝染色结果表明AsMAPK11不能够诱导细胞凋亡。利用双分子荧光实验、GST Pull down和Far Western Blotting结果表明AsMAPKK5和AsMAPK11能够在体内体外互作。实时荧光定量PCR分析发现,AsMAPK11在NaCl和PD98059处理下表达量的变化趋势与AsMAPKK5相似。在白木香悬浮细胞中过表达AsMAPK11,实时荧光定量PCR检测发现其能够显著提高生物合成2-苯乙基色酮关键酶AsPKS3的表达量,以上结果证明AsMAPKK5-AsMAPK11级联途径能够影响2-苯乙基色酮的生物合成。综上,H2O2、NADPH氧化酶以及AsMAPKK5-AsMAPK11能够参与盐胁迫下沉香中2-苯乙基色酮生物合成,这为阐明白木香树在胁迫条件下生成沉香的分子生物学机制提供理论依据,为改善、建立高效的白木香结香技术提供指导。
关键词: 白木香 ；H2O2 ；NADPH氧化酶 ；MAPKs ；2-苯乙基色酮
被引量
1
摘要： 沉香是我国传统名贵药材,瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng是药材沉香的唯一植物来源,是我国特有的珍稀濒危植物。沉香倍半萜是沉香的主要药效成分,健康的白木香木材不能产生沉香倍半萜,白木香树体只有受到物理、化学伤害及真菌侵染后才能够在伤口附近产生沉香倍半萜,最终形成沉香药材。然而伤害如何通过信号途径参与调控沉香沉香倍半萜合成的机制仍不清晰,因此本课题通过以下三个方面研究沉香倍半萜类成分的合成及调控机制,主要研究内容如下:1.沉香倍半萜合酶基因筛选与功能验证基于已发表的白木香基因组数据,对沉香萜类合酶基因家族成员进行了系统发育关系、染色体定位和基因启动子元件分析。共筛选获得了 46个编码萜类合酶的模型,其中氨基酸长度为350-860个的基因22个,结合前人发布的数据,共发现萜类合酶基因32个,其中新发现6个基因,被认定为倍半萜合酶的基因16个。对不同激素和过氧化氢处理24h的沉香悬浮细胞进行转录组数据分析,结果表明,AsTPS2、AsTPS3、AsTPS29、AsTPS10、AsTPS12基因在激素处理后表达量显著上调。本研究利用实时荧光定量PCR方法,检测不同激素处理24小时后AsTPS在悬浮细胞中的基因表达模式和48小时后该基因的表达模式,结果显示,AsTPS29、AsTPS3、ASS1在不同激素处理下均有高水平表达,AsTPS2在ABA、ET和MeSA处理上调,在MeJA处理下表达量无明显变化。从五年生白木香枝条伤害的过渡层中分离获得AsTPS2基因,并使其在大肠杆菌中异源表达,结果显示,AsTPS2蛋白可催化底物(FPP)生成α-葎草烯,并将该基因重新命名为AsHS1。2.沉香JAZ和WRKY家族成员的鉴定与互作机制茉莉酸(JAs)信号通路途径参与调控沉香沉香倍半萜合成。基于已发布的高质量沉香基因组,我们对白木香基因组中JA信号通路的TIFY和WRKY家族成员进行了研究。对白木香TIFY家族成员的研究包括系统发育关系、基因结构、基因染色体位置和基因启动子元件。基因结构和序列基序分析表明,AsTIFY基因也具有保守的TIFY内含子和Jas内含子。对以往发布的五年生白木香注射甲酸12个月后木材的转录组进行数据分析,结果表明,AsJAZ1、AsJAZ2、AsJAZ7/8、AsJAZ9、AsJAZ10和AsJAZ12在沉香中表达。采用实时荧光定量PCR方法检测不同激素处理1小时后AsJAZ在悬浮细胞中的基因表达模式和2小时后该基因的表达模式。AsJAZ4、AsJAZ9、AsJAZ10在不同激素处理下均有高水平表达,而AsJAZ1的表达水平则相反。AsJAZ12在MeJA和ET处理后上调,ABA和MeSA处理后下调。基于高质量的白木香基因组数据,我们研究分析了As WRKY基因的染色体位置和AsWRKY蛋白的系统发育关系。一些与拟南芥WRKY蛋白同源的AsWRKYs被发现并重新命名。初步的转录组数据分析显示,一些AsWRKY基因在沉香中特异性表达,或在悬浮细胞中受激素诱导上调。异源表达及纯化获得AsJAZ4和AsWRKY75n蛋白,为下一步研究JAZ与WRKY的互作机制奠定了基础。综上,本研究对白木香基因组中的萜类合酶基因、TIFY基因和WRKY基因进行了筛选鉴定,并分离验证了一种沉香倍半萜合酶基因的功能,发现了茉莉酸信号通路途径中JAZ蛋白通过与WRKY蛋白的相互作用调控下游基因的表达。本研究对沉香的基因组注释做出了重要贡献,为进一步研究茉莉酸介导的防御反应、沉香的形成机制和研发更高效通体结香技术奠定了理论基础。
关键词: 沉香 ；倍半萜合酶 ；生物合成 ；调控机制
被引量
2
摘要： 白木香(Aquilariasinensis)为瑞香科沉香属植物,白木香树木受到伤害或真菌侵染时形成的含有特殊香味的树脂,称为沉香。沉香是我国传统名贵中药材,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效,同时也是名贵的香料。目前,关于白木香受到刺激形成沉香的机制尚不清楚。2-(2-苯乙基)色酮是沉香的主要化学成分和特征性成分,也是白木香特殊的防御物质。因此揭示2-(2-苯乙基)色酮生物合成过程和调控机制有利于进一步阐明白木香结香机制。Ⅲ型聚酮合成酶在植物次生代谢产物的生物合成和植物防御反应中起到重要作用,课题组前期实验结果证明AsPKS3是2-(2-苯乙基)色酮生物合成关键酶,但是关于AsPKS3的生物学功能尚未揭示。MAPKs蛋白激酶能够调控植物防御反应物质和次生代谢产物的生物合成,并在植物生长发育、激素信号转导和植物防御反应中起到重要的作用。因此本课题主要研究AsPKS3的生物学功能、AsMAPK1与2-(2-苯乙基)色酮生物合成的相关性和AsMAPK1的生物学功能。 亚细胞定位结果表明AsPKS3定位于细胞质和细胞壁中。在本生烟中过表达AsPKS3,将3个过表达株系和野生型株系进行转录组测序,测序结果表明3个过表达株系与野生型株系相比共同差异表达基因数目为295个,其中92个基因上调,203个基因下调。具体分析结果表明过表达AsPKS3能够使聚酮和聚糖合成途径的基因发生变化,也能够使转录因子、热激蛋白、叶绿素脂钙蛋白、MAPKs等家族基因发生变化,说明AsPKS3可能参与植物在生物和非生物胁迫的响应及激素信号转导。将白木香愈伤组织分别进行非生物胁迫和外源激素处理,发现盐、干旱和ABA能够诱导愈伤组织中AsPKS3的表达。过表达AsPKS3能够提高植株抗盐、抗旱能力和外源ABA的耐受性。根据转录组数据选取可能参与盐、干旱胁迫的3个上调基因及与ABA相关的bZIP基因,实时荧光定量PCR结果表明,盐和干旱胁迫下,过表达AsPKS3植株中3个基因的表达量远高于野生型;ABA处理下过表达AsPKS3植株的bZIP的表达量显著低于野生型。因此AsPKS3在植物防御反应和ABA信号转导方面起到重要的作用。 利用MAPK级联信号通路抑制剂PD98059处理盐胁迫的白木香愈伤组织,实验结果表明PD98059显著降低盐诱导的2-(2-苯乙基)色酮的积累,说明MAPKs参与调控2-(2-苯乙基)的生物合成。利用RT-PCR结合RACE技术,首次从白木香愈伤组织中克隆得到一条全长1053 bp的AsMAPK1基因。实时荧光定量PCR结果表明AsMAPK1在盐胁迫下表达量上升,同时PD98059抑制AsMAPK1的表达,在白木香悬浮细胞中过表达AsMAPK1能够显著提高2-(2-苯乙基)色酮生物合成关键酶AsPKS3基因的表达量,因此AsMAPK1参与调控2-(2-苯乙基)色酮的生物合成。农杆菌注射瞬时表达实验表明,AsMAPK1定位于细胞核和细胞壁。在本生烟中过表达AsMAPK1能够使植株矮小,叶和花过早凋亡,不能结种。将过表达AsMAPK1植株和野生型本生烟相同位置叶片进行转录组测序分析,实验结果表明,过表达植株中的基因与野生型植株中的基因表达量相比,共有326个基因表达量上调,1388个基因下调。对差异基因分析表明,过表达AsMAPK1能够调控37条乙烯反应转录因子、21条WRKY转录因子、10个热激蛋白家族基因及16个生长素途径相关基因的表达,因此AsMAPK1可能主要通过调控这些基因从而调控植株生长发育,叶片和花的过早凋亡。
关键词: 白木香 ；沉香 ；促丝裂原活化蛋白激酶 ；生物学功能 ；2-(2-苯乙基)色酮 ；Ⅲ型聚酮合成酶
摘要： 白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)受到外界胁迫后能产生沉香,是我国生产沉香的重要药用植物资源。沉香是名贵的传统中药材与天然的高级香料。由于普通白木香的结香质量差、产量低,使得沉香变得珍贵与稀缺。近年来,一些新的白木香优良结香单株被人们从野生白木香中筛选出来,并通过嫁接方式,无性扩繁形成白木香易结香优良品系。白木香易结香品系被认为较普通实生种子苗白木香结香起始年龄小,结香速度快、产量大、品质高,而且结香方式简便。目前还没有研究比较普通白木香与易结香白木香品系之间的结香过程,结香质量等结香特性相关文章发表。也未曾有研究报道这两种类型白木香的差异,科学证实白木香易结香特性的存在,更没有揭示易结香白木香品系结香特性优异于普通白木香的机理研究。因此,本研究开展易结香品系与普通白木香生物特性及结香特性研究、易结香品系与普通白木香的结香差异生理机制、易结香品系与普通白木香的结香差异分子机制、易结香品系与普通白木香差异鉴定研究四个试验,科学地验证易结香白木香品系的存在,探讨普通白木香与易结香品系之间的结香差异生理机制以及分子机制。同时,尝试筛选出苗期鉴别易结香品系的指标,在苗期选择与辨别易结香品系,以期为促进白木香优质品种的筛选与培育提供理论依据。主要研究结果如下:
(1)普通白木香与易结香品系之间的形态、遗传多样性与结香特性存在差异。且易结香品系比普通白木香具有更易结香的特性。三种类型白木香(普通白木香I、易结香品系II、易结香品系III)叶片形状呈现多型态,枝条与茎干颜色呈现多样性。微观解剖观察易结香品系较普通白木香导管壁厚度显著降低,射线细胞厚度增加。易结香品系Ⅱ,Ⅲ都显著大于普通白木香Ⅰ。在三个不同类型白木香中检测到了丰富的遗传变异,包括单个核苷酸变异(Single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失标记(Insertion-deletion,In Del)。通过系统进化树分析,主成分分析,聚类分析,群体遗传结构分析表明三个白木香群体基本能被分离成3个类群。结果说明三个不同类型白木香之间,具有特异性,且具有一定关联性。在机械损伤与真菌胁迫诱导结香中,易结香品系表现出更多的非结构碳水化合物消耗,较高的次生代谢产物总酚和总萜含量以及更高的沉香出香率与沉香精油含量的结香特性。钻孔处理与菌剂处理形成的沉香,在物质组成与比例中,易结香品系与普通白木香之间存在很大差异,特别是2-(2-苯乙基)色酮(2-(2-Phenylethyl)chromones,PECs)与2-[2-(4-甲氧基)苯乙基]色酮(2-[2-(4′-methoxybenzene)ethyl]chromone,MPECs)的相对含量。
(2)普通白木香与易结香品系之间的结香生理机制存在差异。研究表明沉香形成过程中存在生长和防御之间的权衡。生长相关激素和防御相关激素之间的拮抗作用共同调节沉香形成过程中的生长—防御权衡。在受到伤害胁迫后,导管被侵填体所阻塞,且随着时间的推移,在胁迫6个月后,导管内的侵填体逐渐消失。在沉香形成过程中,导管内侵填体的形成和消除可能是生长和防御之间权衡的结果之一。机械损伤后,调控防御反应的相关生理和生化参数显著增加。然而,调节生长的相关参数在两种类型的白木香中显著降低。随着时间的推移,防御反应的强度降低,生长得到了恢复。经过1个月和3个月的机械损伤胁迫处理后,与普通白木香相比,易结香品系表现出较高的水杨酸、茉莉酸和乙烯激素水平、较高的抗氧化酶活性、较高的总酚和萜类化合物含量以及较高的净光合速率和光化学效率,更多的非结构性碳水化合物消耗,沉香出香率与沉香精油含量更高。表明易结香品系较普通白木香防御能力强。正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)结果表明,沉香精油的组成和比例在普通白木香与易结香品系两种精油中存在差异,显示显著分离,特别是PECs与MPECs的相对含量差异显著。这些数据表明,普通白木香的色酮反应机制可能与易结香品系不同。
(3)普通白木香与易结香品系之间的结香分子机制存在差异。在面对机械损伤的应激反应中,防御反应激素、抗氧化酶活性、总酚和总萜含量分别较对照组提高。易结香品系伤害胁迫下生理特征变化比普通白木香大。普通白木香和易结香品系间应激反应差异基因中,防御机制、次生代谢产物生物合成等功能差异显著。白木香应对机械损伤的应激反应中,许多参与萜类物质合成的MVA和MEP通路的差异表达基因被注释鉴定。加权基因共表达网络分析中,六个关键基因在MEplum模块中被鉴定。其中,基因evm.model.Scaffold1.765.gene功能注释为防御机制。表明此基因可能是易结香品系与普通白木香之间结香特性差异的关键基因。转录家族AP2/ERF、b HLH、MYB、NAC、WRKY等家族成员,特别是B3转录家族也被鉴定为一些防御相关次生代谢产物的潜在调控因子。白木香伤害反应的代谢物在色氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、次生代谢物生物合成等代谢途径方面被主要注释。代谢组结果显示出两种白木香基因型之间存在明显的分离,表明两种白木香基因型在代谢组水平上的物质积累代谢存在显著差异。构建的萜类生物合成途径、黄酮类生物合成途径相关代谢通路图显示,在机械损伤处理中,与普通白木香相比,易结香品系中萜类和黄酮类生物合成的同源性基因AACT、MVD、PAL、CHS、CHI、F3H、DFR的表达显著升高。易结香品系诱导沉香次生代谢产物形成的容易程度可能大于普通白木香,尤其是在黄酮类物质合成方面。
(4)普通白木香与易结香品系之间的应激反应与组成成分之间存在差异,易结香品系苗期筛选鉴别是可行性的。5个优良易结香品系与普通白木香之间的应激反应指标与储藏营养物质参数,如全氮含量,碳氮比,茉莉酸含量,过氧化物酶活性,总酚含量,总萜含量存在显著差异。易结香品系之间茎干处全氮含量显著高于普通白木香,而碳氮比显著低于普通白木香。机械损伤对易结香品系激素茉莉酸含量与过氧化物酶活性的变化显著大于普通白木香。在受到伤害胁迫后,普通白木香与易结香品系总酚和总萜含量都显著增加,且易结香品系显著大于普通白木香。机械损伤诱导结香一年后,测定沉香含油率与沉香成分PECs与MPECs相对含量。表明易结香品系的沉香含油率,PECs与MPECs相对含量都显著高于普通白木香的沉香。鉴于易结香品系与普通白木香之间差异显著的参数。通过将这些指标与诱导形成的沉香精油含量与沉香质量分级依据的关键色酮成分(PECs与MPECs相对含量)做回归分析,建立线性回归方程。结果表明,全氮含量,碳氮比,茉莉酸含量和总萜含量与沉香含油率和沉香精油含量以及PECs与MPECs相对含量之间存在显著的线性相关性。与沉香含油率以及沉香精油含量和PECs与MPECs相对含量都保持显著相关性的指标,全氮含量,碳氮比以及茉莉酸的含量,在普通白木香与易结香品系的一年生幼苗中,测定验证,同样保持显著的差异。结果表明在白木香幼龄期与成熟期之间的生理生化指标存在一致性。
关键词: 白木香品系 ；生长防御平衡 ；转录组 ；代谢组 ；苗期鉴定
摘要： 茉莉酸(JA)及其衍生物统称为茉莉素(JAs),广泛存在于植物中的一类植物内源激素,对植物生长和发育具有广泛的生理效应；同时可作为内源信号分子参与植物的抗逆反应。长期以来,对JA信号途径的机制及功能的研究一直是生命科学研究的热点之一。白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg)为瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)常绿乔木,是我国生产传统名贵中药材沉香的基原植物,同时也是中药沉香的正品来源。作为传统中药,沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效。白木香只有在受到伤害时才能形成沉香,我们已证明了沉香是白木香防御反应的产物。沉香主要由倍半萜类和苯乙基色酮类衍生物两种类型的化合物组成。其中,倍半萜类化合物的生物合成途径研究相对比较清晰,但对于它的调控途径不清楚。前期研究中发现,外源茉莉酸甲酯(MeJA)能显著诱导白木香树和愈伤组织中沉香倍半萜物质的合成与积累。这些结果表明,JA与沉香倍半萜的形成有关；但它是否直接参与调控以及如何调控沉香倍半萜的生物合成还不清楚。本文从分子层面上研究JA信号途径与沉香倍半萜形成的关系,为揭示白木香结香机理提供基础数据。本研究获得了以下主要结果：1、JA信号分子能调控沉香倍半萜的合成。结合白木香转录组基因表达谱数据与荧光定量PCR (qRT-PCR)检测分析,发现JA信号途径中的关键基因显著响应外界胁迫,且均属于响应早期伤害的基因。热激处理能诱导白木香悬浮细胞中内源激素JA和沉香倍半萜(a-愈创木烯,α-蛇麻烯和δ-愈创木烯)的快速大量合成；JA合成抑制剂能抑制JA和倍半萜的合成,在热处理后12h以内未检测到沉香倍半萜成分,24 h后才检测到少量倍半萜生成。2、首次从白木香中,也是沉香属植物中分离并克隆了JA信号途径中的5个关键基因(LOX、CPI1、NINJA、JAZ和MYC2) 的 cDNA全长序列。分别命名为,AsLOX1、AsCOI1、AsNINJA1、AsJAZ1和AsMYC2,为倍半萜合成过程中JA信号途径的研究奠定基础。3、基本明确了白木香AsJAZ1基因功能,过表达AsJAZ1基因能抑制拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPSll的表达,该基因极有可能是调控沉香倍半萜合酶基因表达的负调控因子之一。通过亚细胞定位分析,AsJAZ1基因编码的蛋白定位于细胞核中,属于核蛋白；基因组织表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶和枝中均有表达,但以叶中的表达量最高。将白木香AsJAZ1基因转入野生型拟南芥中,该基因过表达抑制了拟南芥中TPS21和TPS11基因的表达。4、基本明确了白木香AsMYC2基因功能,AsMYC2基因过表达能正调控拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表达,该基因极有可能是调控沉香倍半萜合酶基因表达的正调控转录因子。亚细胞定位分析表明,AsMYC2基因编码的蛋白定位于细胞核中,属于核蛋白；基因组织表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶和枝中均有表达,但以茎和根中的表达量最高；AsMYC2基因过表达能正调控野生型拟南芥倍半萜合酶基因：VPS21和TPS11的表达；在拟南芥myc2-2突变体中,AsMYC2基因过表达能一定程度上恢复对TPS21和TPS11基因表达的调控作用。5.明确了白木香AsJAZ1与AsMYC2白间存在体外相互作用。通过基因重组技术,成功的构建了AsJAZl基因和AsMYC2基因的原核表达载体,在大肠杆菌中成功的诱导了His-AsJAZ1(?)GST-AsMYC2融合蛋白的表达,并进行了蛋白纯化,高质量蛋白的获得为今后蛋白多克隆抗体的制备提供材料基础。利用pull-down技术验证了两蛋白间相互作用,为研究JA信号途径参与调控沉香倍半萜的生物合成机制奠定基础。通过研究基本证实了JA信号途径参与沉香倍半萜生物合成的调控过程。本研究也是首次在沉香属植物中,针对沉香倍半萜生物合成调控机制上开展的关于JA信号分子通路较系统的研究,将对其它信号分子通路的研究有参考价值,为全面解析伤害诱导白木香防御反应形成沉香的调控机制提供分子依据。
关键词: 白木香 ；沉香 ；倍半萜 ；JA信号途径 ；调控机制
被引量
22
摘要： 国产沉香是我国传统名贵药材，而白木香是其唯一植物资源，健康的白木香不产沉香，为满足对沉香的消费需求，人们对人工结香技术进行了研究，发现任何对白木香树干的伤害均能诱导产生沉香物质，而这些伤害是怎样诱导结香的，其中的结香机理是怎样的，相关的研究报道却很少。本项目对白木香木材组织总RNA的提取方法进行了研究，利用第二代高通量测序技术对国产沉香的转录组进行测序，并对国产沉香各组织进行了数字基因表达谱分析，筛选各组织表达有差异的基因，从倍半萜合成代谢途径和伤害防御反应两方面研究白木香产沉香的机理。获得结果如下：
（1）确定白木香木材组织总RNA的最佳提取方法为改良异硫氰酸胍-CTAB法，并用该方法成功提取白木香各组织总RNA用于转录组测序。
（2）本研究进行的转录组测序结果理想，测序质量较高，Q20值高达97.45%，组装后获得平均长度为702nt，N50值为1120的83,467条Unigenes序列，丰富了白木香产沉香的转录组信息。经过blast比对，共50,565条Unigenes序列得到基因功能注释，占所有Unigenes总量的60.58%，其中各有171、33、1352条Unigenes序列分别被Terpenoid backbone biosynthesis（ko00900）、Sesquiterpenoid and triterpenoidbiosynthesis（ko00909）和Plant-pathogen interaction（ko03040）Pathway注释，为研究白木香倍半萜代谢途径和白木香伤害防御反应机制提供序列信息。
（3）利用RNA-Seq技术对国产沉香各组织进行数字基因表达谱分析，各样品均获得超过7M的clean reads，约80%以上的序列能比对上参考转录组数据。经过差异表达基因筛选，结香样品相对于白木样品有4784个基因上调表达，3603个基因下调表达，说明结香组织与白木组织基因表达差异明显，而这些表达有差异的基因可能在白木香产沉香的过程中承担重要的任务。
（4）得到倍半萜合成代谢途径中各种酶在国产沉香各组织中的表达情况，发现HMGS和HMGR的表达量要明显高于其他酶类，且这两种酶的表达量在结香样品中要明显高于其他样品，说明这两种酶，尤其HMGR，可能是白木香倍半萜类合成代谢中极为重要的酶类；得到防御相关的WRKY、MYC2和JAZ转录因子在国产沉香各组织中的表达差异，发现WRKY转录因子的表达模式可分为三类。而MYC2转录因子也可能参与了白木香的应激反应或次级代谢过程。
（5）成功从国产沉香cDNA中扩增得到倍半萜合成酶基因As-SesTPS，对该序列进行了相似性比较和同源性分析，确定其编码的蛋白与Vitis vinifera的大根香叶烯-D合成酶相似性最高，达68%，一致性达50%。应用生物信息学的方法对该编码蛋白进行各种理化性质分析，确定分子量为62.80kD，等电点为5.26，为酸性蛋白，总平均疏水指数为-0.303，预测其为亲水性蛋白。
综上所述，本研究对国产沉香转录组进行测序，获得了大量的国产沉香转录组信息，为国产沉香的转录组研究提供了基础数据。对国产沉香各组织进行的数字基因表达谱分析，得到了各组织基因的差异表达情况，对差异表达基因进行研究，推测出在白木香结香过程中的关键基因，并成功克隆在结香组织中高表达的倍半萜合成酶基因As-SesTPS，为白木香产沉香机理的研究提供参考。
关键词: 国产沉香 ；RNA-Seq ；差异表达基因 ；倍半萜代谢 ；伤害防御
被引量
43
摘要： 国产沉香为瑞香科白木香Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg含树脂的木材,为著名的芳香南药,同时在香料、化工、宗教、工艺品等有广泛应用。白木香野生资源主要分布于海南、广东、广西、云南、福建等地。因伐树结香,目前白木香的野生资源几乎破坏殆尽,1999年被列为国家二级保护植物,2000年被列入《世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》,2004年已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ。目前中国已种植的白木香林超过3000万株,迫切需要高效的结香技术。近年来,魏建和团队发明的“通体结香”技术已开始在国内外广泛应用,并获得了较好的结香效果。伤害诱导白木香防御反应形成沉香的机制已得到初步揭示,但沉香形成的机制,特别是初始伤害后沉香持续形成的分子机制尚未清晰阐明,制约了通体结香技术的改进及更优方法的发明。本论文首次较系统地研究了程序性细胞死亡（PCD, programmed cell death）与沉香倍半萜形成的关系,以探索PCD与沉香形成,特别是持续结香的关系。1、构建了体系均二稳定、细胞活力良好的白木香悬浮细胞体系,健康体系未检测到倍半萜a-愈创木烯（α-guaiene）、α-蛇麻烯(α-humulene和δ-愈创木烯（δ-guaiene）,但MeJA可诱导其产生倍半萜,表明悬浮细胞体系可作为结香机制研究的离体材料。采用茎尖诱导愈伤组织,最适培养基为MS+2.0 mg-L·1 NAA+1.0 mg-L·16-BA;经12次继代培养的愈伤组织生长旺盛、质地疏松适于悬浮培养;将其置于液体培养基MS+2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 6-BA+500.0 mg·L-1 CH中震荡培养,建成悬浮细胞体系。悬浮细胞生长曲线呈S型,初期增长缓慢,4-6 d为对数增长期,7-12 d进入平台期,12d以后细胞生长速度及活力下降；GC-MS分析结果显示,培养0d、3d、6d、2d悬浮细胞未检测到倍半萜α-guaiene、α-humulene、 δ-guaiene,使用100μMMeJA处理24 h可明显检测到这三种倍半萜。PCD检测结果表明,悬浮细胞培养到24 d后发生PCD；荧光定量PCR检测倍半萜诱导结果表明,悬浮培养到24 d后倍半萜合成相关基因表达明显提高,说明生长后期的悬浮细胞不可用于结香机制研究。因此,本实验所构建的白木香悬浮细胞体系在7-12 d可作为研究伤害诱导白木香防御反应形成沉香机制的离体材料。2、首次克隆了沉香倍半萜合成途径的AsAACT、AsHMGS、AsHD及 AsDXR 4个基因全长,为检测倍半萜合成提供参考指标。本课题对沉香倍半萜合成的4个关键酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR进行全长克隆、生物信息学分析。运用荧光定量PCR对茉莉酸甲酯MeJA及水杨酸SA诱导白木香悬浮细胞的关键基因AsAACT、AsHMGS、AsHMGR、AsDXS、AsDXR、AsHDR、AsFPS、ASS1、及ASS2表达进行分析,运用基因表达谱对火烙法、接菌法与输液法处理的白木香转录组数据进行分析,最终筛选到AsAACT、AsFPS、ASS1、ASS2为特异表达基因,可作为后续实验检测诱导型倍半萜的参考指标。3、H2O2胁迫可以明显诱导白木香悬浮细胞PCD,生成少量的α-guaiene、 α-humulene、δ-guaiene。H2O2处理后3h发生PCD,6-12 h出现明显的细胞核皱缩及DNA降解,24 hMCP1、MCP2、Cyt-c表达明显调高,48 h细胞核变为核小体；采用GC-MS检测、峰面积归一化法计算,得出三种倍半萜的相对百分含量,H202处理后3h仅检测到0.058% α-humulene,6hFPS、ASS1、ASS2表达明显上调,12h可检测到0.244% α-humulene 与 0.521% δ-guaiene,24 h可检测到0.157% α-guaiene、 0.373% α-humulene、1.297%δ-guaiene。4、MeJA也可以明显诱导白木香悬浮细胞发生PCD,生成较大量的α-guaiene、 α-humulene、δ-guaiene。（1）采用2.5 μM～25 μM MeJA处理悬浮细胞,96h内细胞死亡率无明显变化,但采用TUNEL法可检测到阳性细胞,说明悬浮细胞发生了PCD但尚未死亡；MeJA处理后12 h,三种倍半萜总量最高,2.5μM和25μM MeJA处理分别达86.098%、71.825%,之后倍半萜量下降,48 h分别下降到31.993%、20.908%；（2）采用50μM～100μMMeJA处理,12h～96h细胞死亡率显著升高,TUNEL检测处理后悬浮细胞3h～6h呈弱阳性、24 h～96h呈阳性；三种倍半萜总量在12h～24 h最高,50μM和100μM MeJA处理分别达93.884%、89.037%,之后总量一直保持在71%以上；（3）采用250μM～500μM MeJA处理,在12h～96 h细胞死亡率显著升高,TUNEL检测处理后悬浮细胞3h呈弱阳性、96h呈阳性；三种倍半萜总量在24 h最高,250μM和500μM MeJA处理分别达90.197%、76.335%,之后总量一直保持在58%以上；（4）相关性分析表明,细胞死亡率与倍半萜浓度呈显著正相关,说明MeJA处理后悬浮细胞发生的PCD很可能由倍半萜诱导；（5）Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可一定程度减缓悬浮细胞发生PCD的进程,但不能阻止,对倍半萜合成关键基因有下调趋势,反向证明PCD对倍半萜具有正向促进作用。5、愈创木烯型倍半萜guaiene及α-humulene能诱导白木香悬浮细胞的PCD,说明初始伤害后诱导白木香悬浮细胞生成的倍半萜可能会产生类似二次伤害的作用,进二步推动PCD的发生。guaiene、α-humulene处理健康的白木香悬浮细胞,可检测到PCD, guaiene比α-humulene更容易诱导PCD；随着倍半萜浓度增加、处理时间延长,细胞死亡率升高,TUNEL的荧光强度增大、PCD关键基因的表达上调。本研究采用白木香悬浮细胞体系探索了程序性细胞死亡与沉香倍半萜的关系。通过研究初步阐明伤害胁迫H202及MeJA可以诱导白木香悬浮细胞PCD与沉香倍半萜合成,诱导的倍半萜类成分guaiene、α-humulene能进一步推动PCD的发生。离体研究结果为揭示白木香受到伤害后诱导形成沉香的机制,特别是沉香持续形成的机制提供了新的数据。
关键词: 白木香 ；倍半萜 ；沉香 ；程序性细胞死亡 ；结香机制
被引量
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