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摘要： 本文利用冠脉结扎/放松方法和Langendorff灌注技术,建立在体和离体大鼠心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤模型,探讨白藜芦醇甙(polydatin)对大鼠I/R心肌损伤的保护作用及其机制。观察白藜芦醇甙对缺血和再灌注心律失常、心肌梗死面积、心脏收缩功能、心肌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、NO含量以及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性的影响。结果显示:与对照组相比,白藜芦醇甙组大鼠缺血和再灌注心律失常明显降低(P<0.05,P<0.01);心肌梗死面积显著减少(P<0.01);I/R心脏左心室发展压(left ventricular developedpressure,LVDP)、左心室压力上升和下降最大变化速率(±LVdp/dtmax)、冠脉流量(coronary flow,CF)明显改善(P<0.05,P<0.01);心肌SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05);NO含量和NOS及cNOS活性也明显升高(P<0.05);此外,NOS抑制剂L-NAME拮抗白藜芦醇甙对I/R心肌的保护作用。结果提示:白藜芦醇甙具有明显的抗心肌I/R损伤作用,此作用主要由cNOS产生的NO增加所介导。
关键词: 白藜芦醇甙 ；心脏 ；缺血/再灌注 ；保护作用 ；大鼠
被引量
82
摘要： 目的:观察Notchl信号通路在肝缺血/再灌注损伤时对心脏损伤的保护作用并探讨其相关的机制。方法:36只健康雄性SD大鼠随机分为3组,假手术组(SC组)、肝缺血/再灌注组(HIR组)、白藜芦醇预处理组(Res处理组),每组12只。各组均与肝脏缺血40 min再灌注2 h(SC组旷置相等时间)后,记录左室血流动力学变化,测定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)浓度,取心肌组织测定SOD活力及MDA含量,Western blot检测心肌组织反应Notch通路活化标志的NICD表达,以RT-PCR法从转录水平检测Notch1和TNF-α的表达水平。结果:与SC比较,HIR组左室收缩及舒张功能均显著降低(P<0.01),血清CK、LDH活力,TNF-α和Ⅱ-6浓度明显升高(P<0.01),心肌MDA含量明显升高而SOD活力明显降低(P<0.01),且Notch1表达下降,TNF-α表达增加;与I/R组相比,Res处理组左室舒缩功能明显升高,血清CK、LDH活力及TNF-α、IL-6浓度明显降低,同时心肌SOD活力明显升高而MDA含量明显降低,Notch1表达上升TNF-α表达降低。结论:白藜芦醇对肝缺血/再灌注大鼠心脏具有保护作用,其机制可能与Notch1信号通路的激活进而调节炎症反应及氧化应激有关。
关键词: 肝缺血/再灌注损伤 ；白藜芦醇 ；Notch信号通路 ；炎症反应 ；氧化应激
被引量
9
摘要： 目的探究沉默信息调节因子1(silent information regulator of transcription 1,SIRT1)在大鼠心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)中对核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related actor 2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)信号通路的影响及白藜芦醇(resveratrol,RSV)的保护作用。方法采用随机数字表法将60只健康雄性大鼠分成4组(每组15只):假手术组(S组)、缺血/再灌注组(I/R组)、白藜芦醇组(R组)、白藜芦醇+ex527组(RE组)。R组、RE组于术前7 d腹腔注射RSV 15 mg/kg,连续7 d,1次/d;S组与I/R组腹腔注射等容量生理盐水;RE组于缺血前15 min尾静脉注射SIRT1抑制剂ex5271μg/kg。采用结扎左冠状动脉前降支30 min,恢复灌注120 min制备MI/RI模型。监测并记录缺血前(T1)、再灌注120 min(T2)时大鼠的心率、MAP和心率与收缩压的乘积(rate-pressure product,RPP)。T2时采用ELISA法检测血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)水平。处死大鼠摘取心脏,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)检测大鼠心肌梗死面积百分比,分别采用硫代巴比妥酸法及黄嘌呤氧化酶法检测心肌丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,PCR法检测心肌SIRT1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA水平,Western blot法检测心肌SIRT1、Nrf2、HO-1蛋白水平。结果I/R组、R组、RE组T2时心率、MAP、RPP低于T1时(P<0.05),T2时I/R组、RE组心率、MAP、RPP低于R组(P<0.05)。与S组比较,I/R组、R组、RE组心肌梗死面积百分比、血清CK-MB、血清LDH增加,心肌MDA含量增加,SOD活性降低,心肌SIRT1、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白水平上调(P<0.05);与R组比较,I/R组和RE组心肌梗死面积百分比、血清CK-MB、血清LDH、心肌MDA含量增加,SOD活性降低,心肌SIRT1 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1mRNA及蛋白的水平下调(P<0.05)。结论RSV减轻MI/RI的机制与激活SIRT1的表达进一步激活Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激有关。
关键词: 沉默信息调节因子1 ；核因子E2相关因子2 ；心肌 ；缺血/再灌注损伤 ；白藜芦醇 ；氧化应激
被引量
14
摘要： 目的本研究主要探讨荭草苷抗心肌缺血/再灌注损伤的保护作用与细胞凋亡和细胞自噬的关系。方法采用Langendorff法,建立大鼠离体心脏缺血/再灌注模型,缺血30min,再灌注120 min;随机将Wistar大鼠分为正常对照组、模型组、不同剂量荭草苷组(1.0、2.0、4.0 mg·kg^(-1))、自噬抑制剂组(2.0 mg·kg^(-1)荭草苷+渥曼青霉素)以及阳性对照药白藜芦醇组;采用多道生理记录仪采集血流动力学指标,全自动生化仪检测灌流液中心肌酶活性,电镜观察大鼠心肌细胞超微结构改变及自噬体,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,Western blot法检测心肌细胞中自噬相关蛋白LC3和Beclin1水平。结果与模型组比较,荭草苷可明显改善大鼠血流动力学指标,降低乳酸脱氢酶和肌酸激酶水平,明显改善大鼠心肌细胞超微结构变化,同时能降低心肌细胞凋亡水平,增加细胞内自噬体数量以及自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin 1表达水平。结论荭草苷对大鼠心脏缺血/再灌注损伤具有明显保护作用,其机制可能与降低心肌细胞凋亡及增强细胞自噬有关。
关键词: 荭草苷 ；心肌缺血/再灌注损伤 ；自噬 ；凋亡 ；LC3 ；Be-clin1
被引量
25
摘要： 目的探讨白藜芦醇苷(Poly)对大鼠缺血再灌注(I-R)心肌损伤的保护作用及其机制。方法应用Langendorff室技术制备离体大鼠心脏I-R损伤模型。雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、Poly(25, 50和75μmol.L-1)组、格列本脲(Gli) +Poly组、5-羟基癸酸(5-HD) +Poly组和苍术苷(Atr) +Poly组。对照组心脏由K-H液灌流110 min;模型组由K-H液灌流20 min后,停灌30 min,复灌60min;Poly组在I-R处理前用含不同浓度Poly的K-H液灌流10 min;Gli +Poly和5-HD+Poly组在I-R前分别用含Gli (10μmol.L-1)和5-HD(100μmol.L-1)的K-H液灌流5 min,再加入Poly (50μmol.L-1)灌流10 min;Atr +Poly组用含Poly(50μmol.L-1)K-H液灌流10 min及停灌30 min后,先用含Atr(20μmol.L-1)的K-H液灌流15 min,然后改用K-H液灌流。分别记录各组停灌前、停灌30 min和复灌60 min内的左心室舒张末压(LVEDP)、左心室舒张压(LVDP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp/dtmax)和冠脉流量(CF)等心功能指标。心脏复灌60 min后,用氯化三苯基四氮唑染色法测定心肌梗死面积,透射电镜下检测心肌超微结构变化。结果缺血前各组心功能参数无明显变化。与模型组相比,Poly可浓度依赖性地促进大鼠I-R后心功能的恢复,预防I-R损伤。复灌60 min后,Poly组大鼠心脏LVDP,±dp/dtmax和CF明显高于模型组;LVEDP则低于模型组;缺血前给予Poly(50μmol.L-1)10 min可明显减小I-R后心肌梗死面积,并改善心肌超微结构。Gli, 5-HD和Atr可阻断Poly对I-R心脏心功能参数和心肌梗死面积等的保护作用。结论 Poly具有明显的抗心肌I-R损伤作用,其心脏保护作用可能与其增加细胞膜和线粒体膜ATP敏感性钾通道开放和抑制线粒体通透转换孔开放有关。
关键词: 白藜芦醇苷 ；钾通道 ；线粒体通透转换孔 ；心肌 ；再灌注损伤
被引量
11
摘要： 研究背景心肌重构(Myocardial remodeling)以心肌细胞肥大和心肌纤维化为主要表现形式。心肌肥厚代偿早期,肥大心肌细胞的细胞核及线粒体增大增多,需要能量增加。随着心肌重构发生发展,心肌细胞能量供应不足及能量利用障碍,导致心肌细胞凋亡坏死。心肌细胞坏死引起心肌细胞数量减少,心肌收缩力降低,触发炎性级联反应,清除受损细胞及坏死细胞并激活修复过程,过度炎症反应增加心脏损伤,加重纤维化进程,引起收缩功能障碍。细胞外间质纤维化程度加重,表现为心肌细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)积累,增加心肌僵硬度,降低心室顺应性,引起舒张功能障碍。心肌结构重构导致心肌细胞自律性、兴奋性、传导性等电生理特性改变,诱发多种心律失常,影响心脏泵血功能,加重血流动力学紊乱,极易合并心源性休克,甚至猝死。由于心肌结构重构和电重构(Electrical remodeling)导致心肌缺血损伤和再灌注损伤,恶性重构加重,终至不可逆转的心力衰竭。因此,探讨心肌重构机制,寻找潜在靶点预防及延缓心肌肥厚对防治心力衰竭具有重要意义。随着分子生物学技术发展,心肌重构集中在重构相关基因转录、翻译、蛋白合成与修饰等信号通路调控研究方面。例如掌握能量调控枢纽的一磷酸腺苷活化蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR),心肌间质纤维化相关转化生长因子(TGFβ),细胞有丝分裂相关促分裂原活化蛋白激酶(MAPK),信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)等信号通路。多种信号通路彼此通过上下游分子相互作用,形成复杂多变的细胞信号网络系统,精准调控心肌重构。能量代谢、炎症、自噬、凋亡、内质网应激、氧化应激等任何环节调控异常都会导致心肌重构不良。因此,早期发现心肌重构不良相关信号通路蛋白给予靶向干预,可能预防心力衰竭的发生发展。淫羊藿苷Ⅱ(acariin Ⅱ,ICA Ⅱ)又称淫羊藿次苷,是从淫羊藿中提取的黄酮类化合物之一,通过JAK2-STAT3,MAPK-ERK,和PI3k-Akt-mTOR等多种信号通路发挥细胞周期调控、细胞凋亡、血管生成和氧化应激等生物学效应。ICAⅡ通过ROS/GSK-3b线粒体信号通路发挥抗氧化活性作用,在神经PC12细胞中缓解氧化应激诱导自噬。ICAⅡ在体外和体内抑制PI3K/Akt和RAS/ERK通路,减轻EGFR刺激mTOR磷酸化,发挥抗癌作用。ICA Ⅱ通过抑制心肌细胞凋亡和氧化应激,对高血压所致心肌细胞凋亡和缺血再灌注损伤有保护作用。基于ICA Ⅱ心血管保护作用,ICA Ⅱ在心血管研究领域倍受关注。在本实验室中,我们已经研究发现ICA Ⅱ通过抑制活性氧依赖JNK/NF-κB途径,保护心肌细胞免受LPS诱导炎症损伤和凋亡。然而,ICA Ⅱ是否能减轻压力超负荷所致心肌重构,目前尚不清楚。在本研究中,我们将探讨ICA Ⅱ对压力超负荷导致小鼠心肌肥厚和PE诱导新生大鼠心肌细胞肥大的保护作用和可能机制。本文采取Real time-PCR检测肥大基因相关mRNA表达水平;Western Blot检测p-AMPKa,T-AMPKa,p-Akt,T-Akt,p-mTORC1,T-mTORC1,p-P70S6K,T-P70S6K,p-4EBP1,T-4EBP1相关信号通路蛋白质水平,进一步明确ICA Ⅱ改善心脏重塑的可能分子机制。研究目的探索ICA Ⅱ对心肌重构的作用及机制。通过动物实验和细胞实验研究:ICA Ⅱ在体内对压力超负荷诱导小鼠心肌肥大的作用及机制；ICA Ⅱ在体外对苯肾上腺素(PE)诱导新生大鼠心肌细胞肥大的作用及机制;明确ICA Ⅱ是否是治疗或辅助治疗恶性心肌重构的潜在药物。研究方法第一部分:动物实验选取8-9周龄,体重23.5-24.5g之间的健康雄性C57BL/6J小鼠。主动脉缩窄术(AB)建立压力负荷诱导的心肌肥厚模型,假手术组(sham)暴露主动脉后不予结扎。实验动物随机分配至四个实验组:Sham+vehicle(Veh)(n=16),Sham+ICA Ⅱ(ICA Ⅱ)(n=16),AB+ vehicle(AB)(n=16)和 AB+ICA Ⅱ(n=16)。ICA Ⅱ用60%乙醇溶解,然后用0.9%生理盐水稀释,ICA Ⅱ浓度1mg/ml进行灌胃。其中 Sham+ICA Ⅱ 组和 AB+ ICA Ⅱ 组给予 ICA Ⅱ(10 mg/kg/d)灌胃 6 周,而 Sham+Veh组和AB+ Veh组给予等量ICA Ⅱ溶剂灌胃6周。采用M型二维超声心动图测定各组小鼠 HR、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVDd、LVDs、FS、EF评估小鼠心功能变化。采用左心室压力一容积曲线检测LVESP、LVEDP、dp/dt max、-dp/dtmin等指标评估小鼠左心室血流动力学改变。紧接着颈椎离断处死小鼠,快速取出心脏并称重,同时记录小鼠体重(body weight,BW)、心重(heart weight,HW)、肺重(lung weight,LW)和胫骨长度(tibial length,TL),计算LW/TL,HW/BW和LW/BW等比值。收集的心脏随机分为两组,一组取左室保存于-80℃用于蛋白印迹和RT-PCR检测;另一组心脏经10%KC1停跳在舒张期后,脱水、包埋后切片用于病理染色。其中苏木素伊红(HE)染色用于观察小鼠心肌细胞横截面积变化,心脏组织切片天狼猩红(PSR)染色评估小鼠心肌间质、血管周围纤维化情况及检测纤维化面积。RNA提取试剂盒从小鼠心脏组织中提取总RNA,RT-PCR用于检测小鼠心肌组织中心肌细胞肥大相关标志物心房钠尿肽(ANP)、B型利钠肽(BNP)、α-肌球蛋白重链/β-肌球蛋白重链(α-MHC/β-MHC)和检测纤维化相关标志物转化生长因子-β(TGF-β)、胶原蛋白Ⅰ(Coll Ⅰ)、胶原蛋白Ⅲ(Coll Ⅲ)、结缔组织生长因子(CTGF)等mRNA表达量改变。采用蛋白质免疫印迹法检测心肌组织蛋白表达量p-Akt,T-Akt,p-AMPKα,T-AMPKα,p-ACC,T-ACC p-mTORC1,T-m TORC1,p-P70S6K,T-P70S6K,p-4EBP1,T-4EBP1和 GAPDH。第二部分:细胞实验1-3日龄的Sprague-Dawley大鼠鼠婴用于制备新生大鼠心肌细胞(NRCM)。分离培养的NRCM中分别给予0μM,2.5μM,5μM,10μM和20μM的ICAII作用1h后检测p-AKT和p-AMPKα表达改变;给予ICAⅡ分别作用Oh,0.5h,1h,3h,6h后检测p-AKT和p-AMPKα表达改变;分别给予白黎芦醇(RSV,20μM),5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR,20μM)和ICAⅡ(20μM)检测p-AMPKα表达改变;NRCM细胞体外接受苯肾上腺素(PE)刺激诱导心肌细胞肥大模型,给予ICAⅡ干预后蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测p-Akt T-Akt,p-AMPKα,T-AMPKα,p-ACC,T-ACC,p-mTORC1,T-mTORC1,p-P70S6K,T-P70S6K,p-4EBP1,T-4EBP1 和 GAPDH 表达的改变。在 PE 诱导的心肌细胞肥大模型中,给予AMPK抑制剂复合物C(compoundC,CPC)后,免疫荧光检测心肌细胞横截面大小;RT-PCR用于检测心肌细胞肥大基因标志物心房钠尿肽(ANP)、B型利钠肽(BNP)、α-肌球蛋白重链/β-肌球蛋白重链(a-MHC/β-MHC)的表达。研究结果第一部分1.ICA Ⅱ减轻压力超负荷所致心肌肥厚:AB组与Veh或ICAⅡ比较,压力超负荷显著诱导小鼠心脏肥大,表现为HW,HW/BW,LW/BW显著增加(AB组vs Veh或ICAⅡ组,P<0.05),而给予ICA Ⅱ显著抑制AB诱导的HW、HW/BW和LW/BW的增加(AB+ICAⅡ组vsAB组,P<0.05);心脏HE染色进一步显示压力负荷显著加剧左室肥厚和心肌细胞肥大(AB组vsVeh或ICAⅡ组,P<0.05),ICA Ⅱ显著抑制AB诱导的心肌细胞肥大(AB+ICAⅡ组vsAB组,P<0.05);肥大相关基因ANP和BNP表达在AB组明显上调,心脏组织中成熟型a-MHC的表达显著降低,胚胎型β-MHC表达显著增加(AB组vsVeh或ICAⅡ组,P<0.05),ICAⅡ显著抑制ANP,BNP和β-MHC表达,同时抑制a-MHC表达下调(AB+ICAⅡ组 vsAB 组,P<0.05)。2.ICAⅡ减轻压力超负荷致心肌纤维化:PSR染色示压力负荷显著促进心脏间质和血管周围纤维化,左室中胶原沉积分数显著增加(AB组vs Veh或ICAⅡ组,P<0.05),ICAⅡ显著抑制心脏间质和血管周围纤维化,并抑制左室中胶原沉积分数增加(AB+ICAⅡ组vsAB组,P<0.05);RT-PCR示压力负荷显著促进纤维化相关基因TGF-β、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和结缔组织生长因子(CTGF)表达(AB组vs Veh或ICAⅡ组,P<0.05),ICAⅡ能显著下调这些纤维化相关基因表达(AB+ICAⅡ 组 vsAB 组,P<0.05)。3.ICAⅡ改善压力超负荷所致心功能不全:M型超声心动示压力负荷致小鼠心脏舒缩功能不全,表现为LVEDD和LVESD显著增加,LVEF和FS显著下降;小鼠左心室后壁显著肥厚,表现为LVPWs和LVPWd显著增加(AB组vsVEH或ICAⅡ组,P<0.05);所有这些参数都可以通过ICAⅡ治疗而得到显著改善(AB+ICAⅡvsAB组,P<0.05);不同组间HR无显着性差异(P>0.05)。此外,压力容积曲线(PV-loop)观察各组心脏血流动力学变化,AB组小鼠LVESP和LVEDP 显著升高(AB 组 vs VEH 或 ICAⅡ 组,P<0.05),而 dp/dt max 和 dp/dt min则显著降低,所有这些受损血流动力学参数都可以通过ICAⅡ治疗得到显著改善(AB+ICAⅡ 组 vsAB 组,P<0.05)。4.ICAⅡ在小鼠心脏内激活AMPKα并抑制Akt磷酸化:压力负荷作用下,心脏组织中AMPKa磷酸化水平显著下调(AB组vs Veh或ICAⅡ组,P<0.05),其下游信号通路中mTORC1,P70S6K和4EBP1磷酸化水平显著上调(AB组vs Veh或ICAⅡ组,P<0.05);给予ICAⅡ治疗后显著恢复压力负荷作用下小鼠心脏组织中AMPKa磷酸化水平并抑制下游信号通路中mTORC1,P70S6K和4EBP1磷酸化激活(AB+ICAⅡ组vsAB组,P<0.05)。此外,检测到压力负荷作用下心脏组织中Akt磷酸化显著上调(AB组vs Veh或ICAⅡ组,P<0.05),ICAⅡ处理可显著抑制Akt磷酸化(AB+ICAⅡ组vsAB组,P<0.05)。第二部分1.体外实验中,ICAⅡ激活AMPKa抑制mTORC1活性。分别给予0μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM ICAⅡ作用于 NRCM 观察到 AMPKa激活呈现浓度依赖性;不同浓度ICAII均未观察到对AKT磷酸化水平的抑制。选择20μM ICAⅡ作用于NRCM可观察到在0.5h,1h,3h,6h均显著促进AMPKa磷酸化,但不同时间点ICAⅡ对AKT的磷酸化水平均无显著影响。进一步与激活AMPKa的已知化合物对比发现,ICAⅡ促进AMPKa磷酸化的作用显著强于白藜芦醇(RSV)(ICAⅡ组vsRSV组,P<0.05),且其激活AMPKa的作用与AICAR相当(ICAⅡ组vs AICAR 组,?>0.05)。2.体外实验中,ICAⅡ通过抑制AMPK/mTORC1通路改善苯肾上腺素(PE)诱导的NRCM肥大。PE作用于NRCM导致AMPKa磷酸化水平显著下调(PE组vsVEH或ICAⅡ组,P<0.05),其下游信号通路中mTORC1,P70S6K和4EBP1的磷酸化水平显著上调(PE组vsVEH或ICAⅡ组,P<0.05);给予ICAⅡ有效促进AMPKa磷酸化(PE组vs VEH或ICAⅡ组,
关键词: ICAⅡ ；心肌重构 ；AMPK/mTORC ；心肌肥大
摘要： 背景： 近年来，随着冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉溶栓疗法、心脏体外循环、心脏移植等方法的建立和推广应用，使众多的心血管疾病得到了有效治疗，但是由此引发的心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）却严重威胁患者的预后。据统计，即使经过冠脉再通治疗，心电图ST段抬高型急性心肌梗死（STEMI）患者一年后的死亡率仍然达到7%，心衰的发病率高达22%。因此，尽早恢复缺血心肌血供的同时尽可能减小MI/RI已成为目前治疗急性心肌梗死亟需解决的一个关键问题。 线粒体是心肌细胞生成活性氧（ROS）的主要细胞器，缺血心肌细胞线粒体内ROS暴发性生成是引起MI/RI的重要原因。白藜芦醇是一个抗氧化剂，能够减少H2O2诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡，减弱大鼠离体心脏缺血再灌注引起的线粒体损伤，减小心肌梗死面积，具有明确的心脏保护作用。但是白藜芦醇难溶于水，在人体内分布无选择性，代谢迅速，半衰期只有8~14min，口服生物利用度较低。因此，构建针对缺血心肌细胞线粒体的主动靶向递药系统，将白藜芦醇直接靶向递送到缺血心肌细胞线粒体，在防治MI/RI中将发挥重要作用。 IMTP（ischemicmyocardium-targeted peptide）是一个由9个氨基酸（Ac-CSTSMLKAC）组成的缺血心肌细胞靶向环状多肽，能选择性地与缺血心肌结合，可以作为递药系统中缺血心肌组织靶向配体，使递药系统更多的聚集在缺血心肌组织。SS-31是Szeto-Schiller（SS）肽家族中的一员，水溶性好。SS-31跨膜转运没有饱和性，能够迅速通过线粒体外膜，富集于线粒体内膜，并进入线粒体基质。除此之外，SS-31等电点为10.4，在内涵体或溶酶体酸性环境中，SS-31带三个正电荷，因此SS-31对内涵体膜及溶酶体膜具有很强的穿透能力，可协助递药系统从内涵体或溶酶体逃逸。综上所述，SS-31是一个理想的线粒体靶向肽。 目的： 本研究以缺血心肌细胞靶向肽（IMTP）和线粒体靶向肽（SS-31）为靶向配基，以白藜芦醇（RES）为ROS清除剂，构建具有层级响应的线粒体靶向PLGA纳米粒（MCTD-NPs）。该纳米粒能够依次对缺血心肌组织、溶酶体以及线粒体产生敏感响应，分别在细胞及亚细胞水平上呈现主动靶向特性，提高对缺血心肌细胞线粒体的靶向性，将白藜芦醇递送至缺血心肌细胞线粒体，改变白藜芦醇在体内和亚细胞器中的分布，靶向防治MI/RI。 方法： 1.合成pH敏感的腙键连接物IMTP-PolyHis-PEG3400-hyd-PLGA，应用纳米沉淀法制备层级响应线粒体靶向白藜芦醇纳米粒MCTD-NPs。 2.通过改变材料/药物投料比和两种靶向肽修饰材料的比例筛选出MCTD-NPs的最优制备处方。 3.通过测定粒径、zeta电位、载药量和稳定性等，对MCTD-NPs进行表征。 4.采用高效液相色谱（HPLC）法测定MCTD-NPs在释药介质[PBS（pH7.4）缓冲盐∶乙醇（v/v=40∶1）混合液]中的释药特性。 5.建立体外H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型;通过MTT法和LDH释放法测定MCTD-NPs的抗H/R损伤活性;应用HPLC和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察H/R损伤H9c2心肌细胞对MCTD-NPs的摄取;通过CLSM观察MCTD-NPs在H/R损伤H9c2心肌细胞中的动态分布;通过测定细胞内ROS和线粒体内ROS，观察MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞中ROS的清除作用;通过测定mPTP的开放和线粒体膜电位，观察MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体功能的影响;通过测定caspase3活性观察MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞凋亡的影响。 6.通过western blot法测定MCTD-NPs对H/R损伤H9c2心肌细胞中STAT3、SOD2、cyt c、bax、caspase3等蛋白表达的影响。 7.建立大鼠MI/RI模型;通过监测血流动力学指标观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心功能的影响;通过伊文思蓝/2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心肌梗死面积的影响;通过自动生化分析仪分析MCTD-NPs对MI/RI大鼠血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）和天冬氨酸转氨酶（AST）的影响;通过酶联免疫吸附法观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠血清中肌钙蛋白I（cTnI）的影响;通过TUNEL染色观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心肌细胞凋亡的影响;通过光学显微镜和透射电子显微镜（TEM）观察MCTD-NPs对MI/RI大鼠心肌组织形态的影响;通过小动物活体成像仪观察MCTD-NPs在大鼠心脏中的分布。 结果： 1.通过核磁共振氢谱（1H NMR）和质谱（MS）确定所合成的化合物为目标化合物。 2.采用纳米沉淀法制备MCTD-NPs。当SS-31-PEG8-PLGA和IMTP-PolyHis-PEG3400-hyd-PLGA投料比为4∶6，材料和RES投料比为10∶4时，所制备的MCTD-NPs平均粒径为91.8nm，平均zeta电位为-11.8mV，平均载药量为11.7%。TEM观察MCTD-NPs为球形。MCTD-NPs在释药介质[PBS（pH7.4）缓冲盐∶乙醇（v/v=40∶1）混合液]中，48h内释放90%以上的药物。 3.MTT结果显示，缺氧3h/复氧4h时，H9c2心肌细胞存活率合适，适合于后续实验研究;LDH和MTT测定结果显示RES浓度为100μmol/l时，MCTD-NPs对于H/R损伤H9c2心肌细胞表现出最强的保护作用;摄取实验结果显示MCTD-NPs能够显著提高H/R损伤H9c2心肌细对RES的摄取;2-脱氧-D-葡萄糖、蔗糖、秋水仙素和IMTP能够显著抑制H/R损伤H9c2心肌细胞对MCTD-NPs的摄取，提示H/R损伤H9c2心肌细胞主要是通过网络蛋白和巨胞饮的方式摄取MCTD-NPs，IMTP介导了H/R损伤H9c2心肌细胞对MCTD-NPs的摄取;CLSM结果显示，与对照纳米粒（PLGA-NPs）相比，MCTD-NPs能够更快地从溶酶体逃逸，并且更多的分布在线粒体中;细胞内ROS和线粒体内ROS测定结果显示，MCTD-NPs能够增加RES清除ROS的能力;mPTP开放测定结果显示，MCTD-NPs能够降低mPTP的开放，与RES相比具有显著差异;JC-1染色结果显示与游离RES和PLGA-NPs相比，MCTD-NPs维护H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体膜电位的作用最强;Caspase3活性测定结果显示，与游离RES组和PLGA-NPs组相比，MCTD-NPs处理组心肌细胞caspase3活性最低，说明MCTD-NPs抑制心肌细胞凋亡的作用最强。 4.Westernblot测定结果显示，MCTD-NPs能够上调H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体中p-STAT3和cyt c蛋白的表达，下调H/R损伤H9c2心肌细胞线粒体中ace-SOD2和bax蛋白的表达;MCTD-NPs能够上调H/R损伤H9c2心肌细胞胞浆中p-STAT3、bax和caspase3蛋白的表达，下调H/R损伤H9c2心肌细胞胞浆中cleaved-caspase3和cyt c蛋白的表达;MCTD-NPs能够提高H/R损伤H9c2心肌细胞中SOD2的活性。5.血流动力学测定结果显示，当RES剂量为10mg/kg时，与RES给药组和PLGA-NPs给药组相比，MCTD-NPs改善±dp/dtmax、心率（HR）和左心室收缩末期压（LVESP）的作用更强;血清酶学测定结果显示，与RES给药组和PLGA-NPs给药组相比，MCTD-NPs给药组大鼠血清中CK-MB、LDH、AST和cTnI的浓度最低;心梗面积测定结果显示，MCTD-NPs能够显著降低MI/RI大鼠的心梗面积;形态学观察结果显示，与MI/RI模型组相比，MCTD-NPs给药组心肌组织坏死面积明显减少，心肌组织纹理清晰，少见心肌细胞肿胀及细胞间质水肿，胞浆染色均匀，出现少量炎性细胞浸润，大鼠心肌细胞线粒体数量明显增多，肿胀线粒体体积缩小，嵴排列基本有序，未见明显肿胀、溶解或空泡化的线粒体;TUNEL测定结果显示，与RES和PLGA-NPs相比，MCTD-NPs显著降低了MI/RI大鼠心肌细胞凋亡率;体内分布实验结果显示MCTD-NPs主要分布在大鼠缺血心肌组织中，并且能够渗透进入深层缺血心肌组织。 结论： MCTD-NPs具有明显的缺血心肌细胞线粒体靶向性，能够增加RES在缺血心肌组织及缺血心肌细胞线粒体中的分布，增强了RES对H/R损伤H9c2心肌细胞以及MI/RI大鼠心肌的保护作用，减少了MI/RI大鼠的心肌梗死面积，提高了MI/RI大鼠的心脏功能，这种保护作用与线粒体STAT3蛋白磷酸化、提高SOD2活性、增强心肌细胞的抗氧化能力有关。本课题为研究和探讨缺血心肌靶向给药系统提供了实验依据，为MI/RI的防治探索了新思路和新方法。
关键词: 心肌缺血再灌注损伤 ；白藜芦醇 ；实验药理 ；线粒体 ；活性氧
摘要： 目的:
从DJ-1与线粒体热休克蛋白70(mtHsp70)相互作用的角度,探讨白藜芦醇(RSV)预处理通过促进DJ-1在线粒体的亚定位,产生减轻大鼠心肌缺血再灌注(I/R)所诱发的氧化应激损伤的保护机制。
方法:
1、首先通过在大鼠心肌内注射sh-mtHsp70低表达慢病毒,7天后,大鼠接受RSV灌胃(30 mg/kg)7天,每日一次。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支(LAD)使心脏缺血30 min,再解扎行恢复血流灌注2 h的方法,构建大鼠心肌I/R模型。大鼠心脏再灌注结束后,分离心脏组织胞浆与线粒体蛋白或取心肌组织做冰冻切片,通过免疫共沉淀(Co-IP)评估RSV预处理对DJ-1与mtHsp70相互作用的影响,结合Western Blot或免疫荧光(IF)技术检测RSV是否促进DJ-1蛋白在线粒体的转位,同时观察沉默mtHsp70的表达是否会抑制DJ-1在线粒体的转位表达情况。
2、其次大鼠心肌内注射sh-DJ-1低表达慢病毒,7天后,大鼠接受RSV灌胃,采用Co-IP实验观察RSV预处理是否促进DJ-1与线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4相互作用的影响,并明确该作用是否被DJ-1下调所取消。
3、大鼠接受RSV灌胃后,结合腹腔注射线粒体复合体Ⅰ抑制剂(IACS-010759)进行干预,通过沉默mtHsp70的表达进而抑制DJ-1在线粒体的转位后,观察是否会影响RSV预处理保护再灌注后心肌组织的线粒体复合体Ⅰ的活性,同时明确沉默mtHsp70的表达是否会进一步影响RSV缓解再灌注后心脏线粒体ROS的生成。
4、通过测定以下指标的变化,观察沉默DJ-1的表达,是否会影响RSV预处理对抗心肌I/R诱导的氧化应激损伤,产生心肌保护作用:DHE染色检测心肌组织总ROS;TTC染色检测心肌梗死面积大小;HE染色观察心肌组织的细胞形态;超声心动图评估左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS);检测血清中LDH、SOD的活性、MDA的含量。
结果:
1、Co-IP结果显示,与Sham组相比,I/R组DJ-1与mtHsp70的相互作用增强,RSV预处理进一步增加了I/R心肌中DJ-1与mtHsp70的相互作用。Western Blot与IF检测心肌组织内DJ-1在线粒体的转位结果显示,与I/R组相比,RSV可显著促进DJ-1从胞浆到线粒体的转位,但是心肌内注射sh-mtHsp70慢病毒致下调mtHsp70蛋白表达后,RSV产生的上述效应被抑制。
2、Co-IP结果显示,与I/R组相比,RSV预处理促进DJ-1与线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4相互作用,然而,当mtHsp70的表达被沉默进而抑制DJ-1在线粒体亚定位后,RSV促进DJ-1与ND1/NDUFA4的相互作用被取消。类似地,当心肌内DJ-1的表达被sh-DJ-1慢病毒敲低后,会显著取消RSV预处理促进DJ-1与ND1/NDUFA4的相互作用。
3、RSV预处理进一步增加I/R后心脏中DJ-1的表达,同时抑制心肌I/R所导致的线粒体复合体Ⅰ的活性下降、线粒体ROS释放增多,有趣的是,当心肌组织中的DJ-1或mtHsp70的表达被慢病毒所下调后,RSV产生的上述现象被显著抑制,表现为线粒体复合体线粒体复合体Ⅰ的活性抑制增加、ROS进一步增多。有趣的是,线粒体复合体Ⅰ抑制剂(IACS-010759)会直接取消RSV保护线粒体复合体线粒体复合体Ⅰ活性的效应,造成线粒体ROS的大量生成。
4、DHE染色结果显示,RSV可显著抑制心肌I/R导致的ROS产生;TTC结果表明,与I/R组相比,RSV缩小心肌梗死面积;HE染色结果显示,RSV+I/R组相比于I/R组心肌细胞肿胀程度与变形情况明显减轻,炎症细胞浸润现象得到改善;与I/R组相比,超声心动图结果显示,RSV可显著恢复I/R后的心功能,表现为左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)值增加;与I/R组相比,RSV明显下降血清中的LDH活性、MDA含量,升高SOD活性;重要的是,当心肌组织中的DJ-1或mtHsp70的表达被抑制后,RSV产生的上述心肌保护效应全部被逆转。
结论:
在伴侣蛋白mtHsp70的协助下,RSV预处理可促DJ-1在线粒体的亚定位,促进DJ-1与线粒体复合体线粒体复合体Ⅰ的两个亚基ND1和NDUFA4相互作用增强,从而保护线粒体复合体Ⅰ的活性,降低线粒体ROS的生成,对抗心肌I/R导致的氧化应激损伤,产生心肌保护作用。
关键词: 白藜芦醇 ；DJ-1 ；氧化应激 ；心肌缺血再灌注 ；线粒体复合体I
摘要： 目的:本研究利用UHPLC/Q-TOF-MS及HPLC技术对二仙汤水煎液化学成分进行定性与定量检测分析。通过去卵巢（Ovx）结合左冠状动脉前降支结扎再灌注（I/R）方法,复制去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型,灌胃给予二仙汤（EXD）,探讨二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及机制。利用H2O2作用心肌细胞复制心肌细胞氧化应激模型,给予芒果苷作用,考察芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用及机制。方法:1、通过UHPLC/Q-TOF-MS及HPLC技术对二仙汤水煎液中有效成分进行定性定量检测分析,利用电喷雾（ESI）离子源正负离子模式检测采集数据,Peakview质谱分析软件提供的化学成分保留时间、精准相对分子量和二级质谱碎片离子信息结合chemicalbook、chemspider化学信息检索建立化学成分数据库进行数据分析。2、将SPF级雌性SD大鼠根据体重随机分组,除假手术组（Sham）外,其余各组均进行卵巢摘除,通过阴道涂片筛选造模成功大鼠分为去卵巢组（Ovx）、去卵巢+缺血再灌注组（Ovx+I/R）、戊酸雌二醇组(Estradiol Valerate,E2 V,0.8mg·kg-1)、二仙汤低剂量组(Er-xian Decoction Low,EXD/L,4g·kg-1)、二仙汤中剂量组(Er-xian Decoction Middle,EXD/M,8g·kg-1)、二仙汤高剂量组(Er-xian Decoction High,EXD/H,12g·kg-1),灌胃给药80天;除Sham组、Ovx组外,其余各组均进行左冠状动脉前降支（LAD）结扎再灌注。以结扎后心电图ST段上抬,左心室壁发绀、苍白,再灌注ST段回落,心室壁恢复红润为缺血再灌注损伤模型成功。3、二仙汤对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用:Ⅱ导联采集正常去卵巢大鼠及缺血再灌注损伤后大鼠心电图,比较二仙汤对各阶段大鼠心电图的影响;Evans Blue和TTC染色法检测大鼠心肌缺血区及梗死区面积;试剂盒和酶联免疫吸附法（Elisa）检测大鼠血清中谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）、雌二醇（E2）及大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量;对大鼠心肌组织及子宫进行病理切片HE染色;蛋白质免疫印迹法（Western Blot）法检测大鼠心肌组织中Bcl2、Bax及雌激素α受体（ERα）蛋白的表达。4、芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用:利用酶解法和差速贴壁法分离纯化心肌细胞,分为空白组（Control）,模型组（Model）,白藜芦醇组（Resveratrol,Res,1μM）,芒果苷（Mangiferin）低剂量组（75μM）、中剂量组（150μM）、高剂量组（300μM）,药物作用24h后,除空白组外,均加H2O2 400μM作用1h,复制心肌细胞氧化应激损伤模型。MTT法检测芒果苷对心肌细胞活性的影响,试剂盒检测心肌细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）和心肌细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量;Fluo-3AM和DCFH-DA荧光探针检测心肌细胞内Ca2+和ROS的含量;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Western Blot检测心肌细胞的凋亡相关蛋白Bax和PTEN/AKT/Foxo1信号通路相关蛋白的表达。结果:1、通过数据分析,二仙汤水煎液中分析出72个化合物,包括黄酮类28个、皂苷类4个、蒽醌类6个、酚苷类11个、生物碱类3个、有机酸类5个和其他15个。2、大鼠心电图结果显示,与Sham组相比,Ovx组和Ovx+I/R组大鼠心电图P波、R波、T波幅度明显减小（P<0.01）,PR间期、QRS时程、QT间期不同程度的缩短;与Ovx+I/R组相比,EXD组和E2 V组大鼠心脏ECG的病理变化显著改善。缺血再灌注后大鼠心电图比较,Ovx组与Sham组各阶段的心率、ST段幅度均无明显变化;与Ovx组相比,Ovx+I/R组在LAD结扎与再灌注阶段大鼠心电图ST段显著上抬（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD组与E2 V组结扎与再灌注ST段上抬幅度不同程度减小（P<0.05）。Evans Blue和TTC染色结果显示,大鼠心肌缺血区与梗死区面积,Sham组与Ovx组无明显变化;与Ovx组相比,Ovx+I/R组大鼠心肌缺血区与梗死区面积明显增加（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD组、E2 V组心肌缺血区和梗死区面积显著减小（P<0.05,P<0.01）。试剂盒检测结果显示,大鼠血清中AST、LDH、CK-MB及大鼠心肌组织中SOD的含量,Sham组与Ovx组相比无明显变化;与Ovx组相比,Ovx+I/R组大鼠血清中AST、LDH、CK-MB明显升高（P<0.05,P<0.01）,大鼠心肌组织中MDA含量升高,SOD的含量降低（P<0.05）;与Ovx+I/R组相比,EXD组、E2 V组大鼠血清中AST、LDH、CK-MB及心肌组织中MDA不同程度的降低,SOD的含量明显升高（P<0.05,P<0.01）。Elisa检测结果显示,与Sham组相比,Ovx组与Ovx+I/R组大鼠血清E2水平明显下降（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD/M和EXD/H组E2水平显著上调（P<0.01）。大鼠心肌组织病理切片显示,EXD组大鼠心肌组织病理变化改善明显,可使心肌纤维、心肌细胞排列规整,肌间隙明显减小,心肌纤维断裂少,但有部分呈波浪状。大鼠子宫图片、病理切片和Western Blot结果显示,与Sham组相比,Ovx组与Ovx+I/R组大鼠子宫明显干瘪,皱缩,HE染色子宫内膜层变薄,腺体数量明显减少且心肌组织中ERα蛋白表达明显下调（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,各剂量组的EXD和E2 V组能够显著逆转上述子宫的病理变化,上调大鼠心肌组织ERα蛋白表达。Western Blot结果显示,Sham组与Ovx组大鼠心肌组织Bcl2、Bax的蛋白表达无明显差异;与Ovx组相比,Ovx+I/R组大鼠心肌组织Bcl2蛋白表达明显上调（P<0.01）,Bax蛋白表达明显下调（P<0.01）;与Ovx+I/R组相比,EXD组、E2 V组Bcl2的蛋白表达显著上调（P<0.01）,Bax的蛋白表达显著下调（P<0.01）。3、芒果苷对心肌细胞氧化应激损伤的作用:MTT结果显示,与空白组相比,模型组心肌细胞活力显著降低（P<0.01）;与模型组相比,不同剂量组的芒果苷均能够不同程度改善H2O2对心肌细胞活性的抑制作用（P<0.05）。试剂盒检测结果显示,与空白组相比,模型组心肌细胞培养基上清液中AST、LDH及心肌细胞内MDA的含量明显增加（P<0.05,P<0.01）,细胞内SOD含量明显减少（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷药物组心肌细胞培养基上清液中AST、LDH和心肌细胞内MDA含量不同程度减少（P<0.05,P<0.01）,心肌细胞内SOD（P<0.05,P<0.01）含量显著增加。Fluo-3AM和DCFH-DA荧光探针检测结果显示,与空白组相比,模型组细胞内钙离子和ROS的含量明显增加（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷组心肌细胞内钙离子和ROS的含量不同程度减少（P<0.05,P<0.01）。流式细胞术检测结果显示,与空白组相比,模型组心肌细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷给药组心肌细胞的凋亡显著减少（P<0.01）。Western Blot检测结果显示,与空白组相比,模型组大鼠心肌细胞中Bax、AKT、p-PTEN的蛋白表达明显上调（P<0.01）,p-AKT、p-Foxo1的蛋白表达不同程度的下调（P<0.01）;与模型组相比,芒果苷组Bax、AKT、p-PTEN的蛋白表达显著下调（P<0.05,P<0.01）,芒果苷组p-AKT、p-Foxo1的蛋白表达不同程度上调（P<0.05,P<0.01）,各组之间的PTEN、Foxo1总蛋白表达无明显差异。结论:1、二仙汤水煎液中化学成分含量较多,共72个化合物,主要分为黄酮类、皂苷类、蒽醌类、生物碱等,其中芒果苷、淫羊藿苷、阿魏酸和盐酸小檗碱的含量较高。2、二仙汤通过调节大鼠体内雌激素水平,逆转由雌激素水平降低引起的大鼠ECG病理变化,维持雌激素对心脏的保护作用。二仙汤具有抗氧化作用,通过增加抗氧化酶活性,减轻缺血再灌注引起的心肌损伤。3、芒果苷通过改善氧化应激产生的心肌细胞不良状态,减少心肌细胞损伤、凋亡,减少心肌细胞内氧自由基,增强心肌细胞内抗氧化酶活性,减轻钙超载,从而减轻心肌细胞氧化应激损伤。
关键词: 二仙汤 ；缺血再灌注损伤 ；芒果苷 ；心肌细胞 ；氧化应激
被引量
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摘要： 研究背景:周围神经损伤是临床常见病、多发病,也是疑难病。一旦周围神经损伤,其临床修复效果不尽人意,常常导致患者遗有运动或感觉功能障碍甚至残疾,给患者带来生活健康难题,同时也造成了巨大的社会压力与经济负担。周围神经与中枢神经系统不同的是,周围神经具有损伤后再生的能力。周围神经损伤后,远端发生华勒式变性,这种变性被认为是受损神经再生的关键步骤。近年来,有研究人员指出细胞自噬现象在华勒式变性过程中起着关键作用。细胞自噬现象广泛存在于多种细胞中,它通过降解细胞内蛋白质和受损细胞器来维持体内平衡。在自噬过程中,这些细胞器或蛋白质被包裹在双层膜结构中,并在溶酶体内降解。在神经系统中,自噬广泛发生在正常生理过程中,周围神经髓鞘的发育过程也需要自噬过程参与。而在病理条件下,自噬水平的降低可以导致多种神经退行性疾病;在神经创伤类损伤后,自噬溶酶体系统的抑制也会导致神经元坏死变性。在周围神经系统中,对自噬的研究也越来越广泛。施旺细胞在神经损伤修复过程中起着至关重要的作用,它不仅可以分泌多种神经营养因子,而又有证据表明它可以发生细胞自噬现象。外周神经损伤后,随着组织碎片的断裂,损伤神经远端髓鞘发生降解。髓鞘的降解不仅依赖于巨噬细胞的吞噬作用,而且施旺细胞的自噬在髓鞘降解过程中也起着至关重要的作用。白藜芦醇是从某些食品中提取的具有抗氧化性、减少炎症和减缓细胞衰老的天然产物。近年来,白藜芦醇对细胞自噬的促进作用越来越受到人们关注。白藜芦醇对神经系统具有保护作用,这种保护作用已经在脊髓损伤与脑缺血再灌注损伤动物模型中被证实。在周围神经系统中,白藜芦醇能够通过血管内皮生长因子信号通路加速神经修复再生过程,但白藜芦醇是否能够通过自噬机制促进周围神经再生有待进一步研究。研究目的:研究自噬现象在周围神经损伤修复中的作用及机制,探讨白藜芦醇促进周围神经损伤修复的机制;研究白藜芦醇对氧化应激刺激下的施旺细胞的保护作用,明确白藜芦醇在临床应用的可行性。研究方法:1.建立SD大鼠坐骨神经挤压伤模型。2.用步态分析的方法检测给药后运动神经功能恢复情况。3.对大鼠坐骨神经进行半薄切片,用电镜及甲苯胺蓝染色分析神经纤维再生数量与再生后髓鞘厚度,形态学评估药物作用下损伤的周围神经再生状况。4.用Western blot以及免疫荧光染色方法鉴定自噬相关蛋白与髓鞘蛋白的表达情况,用甲苯胺蓝染色形态学观察早期髓鞘降解过程,判断药物对损伤后周围神经早期华勒式变性过程的影响。5.用免疫组化方法判断自噬与白藜芦醇对周围神经损伤后施旺细胞增殖的影响。6.通过细胞与动物实验研究白藜芦醇的药物毒性。7.通过建立RSC96细胞氧化应激损伤模型,应用CCK-8方法检测白藜芦醇对细胞的保护作用。8.通过流式细胞仪检测细胞活性氧生成,探究白藜芦醇对活性氧生成的影响。9.通过Western blot与免疫荧光染色研究白藜芦醇对细胞保护作用及其机制。研究结果:1.自噬激动剂与白藜芦醇能够促进损伤后运动神经功能恢复;自噬抑制剂早期影响神经再生,但是在第二周,其恢复速度与对照组没有统计学差异。2.形态学证实在损伤后第14天,自噬激动剂与白藜芦醇均促进了神经再生数量,髓鞘厚度也有明显升高。3.与对照组相比,自噬激动剂与白藜芦醇均加速了早期髓鞘降解过程,MPZ水平降低,甲苯胺蓝染色提示髓鞘结构降解更完全。自噬抑制剂抑制了早期髓鞘降解过程,MPZ水平高于对照组;同时甲苯胺蓝染色提示完整髓鞘结构数量多于对照组。白藜芦醇促进了损伤早期施旺细胞自噬现象,免疫荧光染色结果表示LC3表达明显升高,western blot结果表示自噬相关蛋白LC3B-II/LC3B-I明显升高;电镜切片提示代表自噬的双层膜结构在施旺细胞中广泛存在,多于对照组。4.免疫组化表明自噬激动剂与白藜芦醇均能够明显促进施旺细胞Ki67的表达水平,说明自噬激动剂与白藜芦醇促进了损伤早期施旺细胞的增殖过程。5.25μM浓度的白藜芦醇作用下,RSC96细胞活性与对照组无显著差异;在最高200mg/kg的给药浓度下连续腹腔给药一周后,大鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏与肺组织HE染色均未出现明显损伤,说明白藜芦醇具毒性低,提示我们白藜芦醇可能被应用于未来临床研究。6.白藜芦醇增加了H2O2刺激下细胞的存活率,这种作用能够被自噬抑制剂阻断。7.白藜芦醇降低了细胞在H2O2刺激下活性氧的生成。8.在白藜芦醇作用下,细胞自噬相关蛋白水平升高,p62明显降低,mTOR磷酸化水平降低;白藜芦醇降低了焦亡相关蛋白的表达,NLRP3、Caspase-1与IL-1β表达水平明显降低;随着白藜芦醇给药浓度升高,施旺细胞TXNIP表达水平逐渐降低,mTOR磷酸化水平同样逐渐降低。研究结论:1.白藜芦醇具有促进神经挤压伤后神经运动功能的恢复。2.白藜芦醇是通过促进损伤后施旺细胞自噬,促进了损伤早期髓鞘降解过程,从而加速了神经再生速度;同时白藜芦醇还具有促进新生施旺细胞增殖的作用。3.白藜芦醇细胞毒性低,具有良好的临床应用前景。4.白藜芦醇通过抑制mTOR磷酸化促进了细胞自噬作用,降低了细胞氧化应激水平,减少了细胞焦亡;同时白藜芦醇直接通过减低细胞TXNIP表达水平降低细胞焦亡。创新点:1.首次证实白藜芦醇是通过促进自噬进而加速了早期髓鞘降解这一过程,并有促进新生施旺细胞增殖作用,促进了挤压伤后神经功能恢复。2.氧化应激条件下,白藜芦醇通过降低施旺细胞焦亡从而保护细胞,这种作用直接通过降低施旺细胞TXNIP表达水平来实现;同时也通过增加细胞自噬间接减少细胞焦亡。
关键词: 白藜芦醇 ；自噬 ；周围神经损伤修复 ；髓鞘降解 ；焦亡
被引量
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摘要： 目的:通过对糖尿病大鼠进行白藜芦醇(Res)缺血预处理,评价其在心肌缺血再灌注损伤中的作用。探讨缝隙连接蛋白43(Cx43)在糖尿病心肌缺血再灌注损伤中扮演的角色和起到的作用。方法:选择4-5月龄,体重为200～220 g的清洁级健康成年雄性SD大鼠高脂饲料喂养4周后一次性按体重腹腔注射30 mg/kg 1%链脲佐菌素柠檬酸缓冲液并继续高脂饲料喂养8周制作糖尿病模型。随机将30只糖尿病大鼠分为3组(n=10):糖尿病假手术组(Sham组),糖尿病心肌缺血再灌注组(MIR组)和糖尿病心肌缺血再灌注+白藜芦醇组(MIR+Res组)。取10只非糖尿病大鼠作为非糖尿病心肌缺血再灌注+白藜芦醇组(N+Res组)。采用结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支30 min,恢复血流灌注120 min的方法制作心肌缺血再灌注损伤模型。MIR+Res、N+Res组于缺血再灌注模型建立前7天每日一次按体重腹腔注射15 mg/kg二甲基亚砜(DMSO)与磷酸缓冲液(PBS)混合液稀释的白藜芦醇。Sham、MIR组不注射白藜芦醇,注射等量DMSO与PBS混合液。于再灌注120 min时腹主动脉取血,取心脏组织。采用全自动血生化仪测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)浓度;采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的浓度;采用硫代巴比妥酸法(TCA)测定心肌丙二醛(MDA)含量;采用ELISA法测定心肌活性氧(ROS)含量;采用黄嘌呤氧化酶法(XOD)测定心肌超氧化物歧化酶(SOD)含量;HE染色后观察心肌组织病理学改变;采用免疫组织化学法(IHC)检测心肌Cx43含量;采用Western blot法测定心肌Cx43表达。结果:Sham组心肌组织结构完整,肌原纤维排列整齐,几乎无炎症细胞浸润,胞浆内线粒体丰富。MIR组心肌组织结构紊乱,肌原纤维溶解,大量炎症细胞浸润,胞浆内线粒体少见。MIR+Res、N+Res组细胞水肿及心肌结构紊乱程度较MIR组明显减轻,可见少量炎性细胞浸润。其中,N+Res组病理学损伤较MIR+Res组轻。与MIR组比较,MIR+Res组的CK-MB、LDH、TNF-α、IL-6等心肌损伤标志物及炎性因子浓度降低,MDA和ROS含量降低,SOD含量增高、Cx43表达上升(均P<0.05)。结论:白藜芦醇缺血预处理能减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤,其保护机制可能与Cx43有关。
关键词: 白藜芦醇 ；缝隙连接蛋白43 ；缺血预处理 ；糖尿病 ；心肌缺血再灌注
被引量
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摘要： 目的:心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)是由冠状动脉完全或局部闭塞后,在一定时间内恢复再灌注致使心肌损伤加重的病理过程,其主要成分为心肌的缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤。心脏是一个对氧供敏感的器官,H/R可对心肌代谢、形态结构和生理功能造成严重损害。虎杖苷(Polydatin)是蓼科蓼属草本植物虎杖等的主要活性成分,它是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物,属于羟基二苯乙烯类化合物,化学名称为3,4′,5-三羟基芪-3-B-单-D-葡萄糖苷,在植物中分布广泛,目前至少在70余种植物中发现了虎杖苷。研究表明,虎杖苷具有明显的心血管保护作用,可改善离体心脏I/R损伤,减少心肌梗死面积。此外,虎杖苷还具有抗动脉硬化、抗急性缺血缺氧性肺动脉高压、抑制颈动脉窦压力感受性反射等作用,但是虎杖苷对心血管保护作用的机制远未阐明。内质网作为维持细胞内环境稳态的主要细胞器之一,在蛋白质合成、折叠、成熟,以及脂质合成及钙稳态等方面发挥重要的生物学作用。持续的缺氧可导致内环境稳态失衡,引发细胞内质网应激。越来越多的研究表明,内质网应激与急性心肌H/R损伤密切相关。但虎杖苷是否可通过减轻内质网应激改善心肌H/R损伤,未见报道。本课题通过构建在体大鼠急性H/R心肌损伤模型,以及离体心肌组织水平二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)诱导的内质网应激模型,应用心功能检测导管法和分子生物学等技术,观察虎杖苷对大鼠H/R心脏损伤的保护作用,并进一步探讨虎杖苷对大鼠心脏的保护作用是否通过改善心肌内质网应激所产生。方法:1.选用30只雄性Wistar大鼠,12周龄,体重320-360g,随机分为对照组(CON)、急性缺氧组(Hypoxia)和虎杖苷+急性缺氧组(Poly+Hypoxia)。每组10只大鼠,自由饮水和饮食,适应性喂养1周。大鼠麻醉状态下采用小动物呼吸机行人工呼吸,经右侧颈总动脉逆行左心室插管,描记在体左心室功能参数。Hypoxia和Poly+Hypoxia组通过小动物呼吸机给予90%氮气和10%氧气的混合气体进行30 min急性缺氧和1h复氧处理。Poly+Hypoxia组动物在急性缺氧处理前腹腔注射Polydatin(60mg/kg)。通过Labchart记录系统分别描记各组动物在缺氧前、缺氧过程中和复氧过程中动脉血压和左心室功能的变化。记录的功能参数包括:左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒张末期压(Left Ventricular End Diastolic Pressure,LVEDP)、左心室内压最大上升速率(Maximum rate of the increase of left ventricular pressure,+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(Maximum rate of the decrease of left ventricular pressure,-dp/dtmax)、心率(Heart rate,HR)和平均动脉压(Mean blood pressure,MBP)。2.功能学实验结束后,立即进行开胸取出心脏,留取左心室标本,迅速置于液氮并转存入-80度冰箱保存。采用Western Blot技术检测三组大鼠心肌内质网应激相关蛋白GRP 78,CHOP和Caspase-12的表达。3.虎杖苷对DTT诱导的心肌内质网应激的作用实验分三组:Control组(CON)心肌组织片用K-H液孵育,二硫苏糖醇组(DTT)心肌组织片用2mmol/L DTT孵育,Polydatin+DTT组(Poly+DTT)心肌组织片用Polydatin(100μmol/L)和DTT(2 mmol/L)孵育,置于37℃下的水浴箱中,孵育处理3小时后收集心肌组织-80度冻存。用Western Blot技术检测三组大鼠心肌细胞中内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP和Caspase-12的表达。结果:1.功能学数据显示:急性缺氧过程中,Hypoxia和Poly+Hypoxia组大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、MBP较CON组大鼠明显降低,且Poly+Hypoxia组大鼠功能学指标的降低程度明显小于Hypoxia组大鼠(P<0.05)。Hypoxia组较CON组大鼠LVEDP升高,Poly+Hypoxia组大鼠LVEDP的升高程度与Hypoxia组大鼠差异不大。复氧后各功能学指标均有一定程度的恢复,复氧60分钟时,Poly+Hypoxia组大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和MBP的恢复明显好于Hypoixa组大鼠(P<0.05),Poly+Hypoxia组大鼠LVEDP变化率低于Hypoixa组大鼠(P<0.01)。2.Western Blot技术数据显示:与CON组大鼠相比较,Hypoxia组大鼠心肌GRP 78,CHOP和Caspase-12蛋白表达明显上调(P<0.05);与Hypoxia组大鼠相比较,Poly+Hypoxia组大鼠心肌GRP 78,CHOP和Caspase-12蛋白表达明显下调(P<0.05)。与CON组相比,DTT组大鼠心肌细胞中GRP 78,CHOP和Caspase-12的表达明显上调(P<0.01);与DTT组相比,Poly+DTT组大鼠心肌细胞中GRP 78,CHOP和Caspase-12的表达明显下调(P<0.05)。结论:虎杖苷可明显改善急性缺氧/复氧对大鼠左心功能的损伤和恢复血压的降低。虎杖苷抗急性缺氧/复氧损伤心脏保护作用可能与降低内质网应激有关。
关键词: 虎杖苷 ；急性缺氧/复氧 ；内质网应激 ；心功能
被引量
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摘要： 【研究背景】 心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）损伤，是发生于心肌缺血基础上的，血流恢复后组织损伤不轻反重，甚至出现不可逆性损伤的现象，是心血管领域的研究热点之一。目前研究认为，在心肌 IR损伤中，肾素-血管紧张素系统（rennin-angiotensin-system，RAS）和RhoA/Rho-kinase（ROCK）通路均可被激活，进而发挥重要的病理生理学作用。 有研究表明抑制ROCK活性可对冠状动脉诱导的心肌IR损伤有保护作用。心脏缺血前使用ROCK抑制剂（Y-27632），可减少心肌细胞凋亡、减少心肌梗死面积、增强IR损伤后心功能。同时，体内ROCK活性的调控对维持血压具有至关重要的作用，它主要通过对肌球蛋白轻链（myosin light chain kinase，MLC）的直接磷酸化、与肌球蛋白结合亚基1（myosin-binding subunit，MBS/MYPT1）结合磷酸化而间接使肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphase，MLCP）失活，增强了MLC的磷酸化水平和血管平滑肌收缩力。 也有研究表明RhoA/ROCK通路是血管紧张素的一个重要的下游信号通路。在血压正常的大鼠主动脉壁中发现，高表达的血管紧张转换酶（ACE）和血管紧张素 II（angiotensin-II，ANG II）可激活ROCK。此外，在体外培养的血管平滑肌细胞和心脏细胞中激活血管紧张素1型受体（angiotensin II type1 receptor，AT1R）也可检见RhoA/ROCK的激活，与体内ANG II刺激动脉收缩的机制相同。 ROCK在全身分布广泛，其抑制剂或可诱发严重的低血压，所以在明确其调控机制之前应用ROCK抑制剂治疗心肌IR损伤需慎重。迄今为止，AT1R阻滞剂（AT1R blockers，ARB）和血管紧张素转换酶抑制剂（ACE inhibitors，ACEI）是缺血再灌注损伤治疗的基础。与ROCK抑制剂一样，ARB和ACEI也有其副作用，如ARB可引起ANG II浓度失控，ACEI的最常见的副作用是咳嗽。因此，通过对IR损伤治疗相关药物及其机制进行深入、系统的探索，或许可以为心肌 IR损伤、心肌梗死提供更好的保护作用，为相关靶点的新药开发及精准化医疗的发展提供积极有效的参考价值。 虎杖苷（Polydatin，PD）也称白藜芦醇苷，为传统中药蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc的干燥根和根茎中的提取物，具有调节心肌细胞及血管平滑肌细胞收缩，改善微循环和保护缺血缺氧器官/组织，抗休克，抗血小板聚集、降血脂、抗脂质过氧化等功效，临床上主要用于心肌缺血、脑缺血、休克等多种疾病的治疗。有研究指出 PD对体内和体外的心肌细胞缺血和 IR损伤均具有保护作用。前期研究证实，在肥大的心肌细胞中，PD治疗可通过抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）进而抑制RhoA/ROCK通路，最终使异常升高的ROCK活性降低。但是，目前PD对心肌IR损伤的具体保护作用机制仍不清楚。 综上所述，本研究假设PD可通过抑制RhoA/ROCK通路而对心肌IR损伤发挥保护作用，肾素-血管紧张素（rennin-angiotensin-system，RAS）可能为其上游调控信号通路。但PD是否可经RAS、RhoA/ROCK信号通路调控而实现对心肌IR损伤的保护机制，目前未见相关研究。本研究拟通过建立乳鼠体外心肌细胞和体内小鼠心脏冠状动脉左前降支阻滞IR模型，从小鼠体内、体外两方面入手，对PD在是否可经RAS、ROCK信号通路实现对心肌IR损伤中的保护，如果存在则对其可能的机制进行研究。分如下两部分进行： 第一部分体外实验：PD在小鼠心肌细胞SIR中对RAS、RhoA/ROCK活性的调控及心肌细胞凋亡的影响;第二部分体内试验：PD在小鼠心脏IR损伤中对RAS、RhoA/ROCK活性的调控及其心脏保护作用的机制研究。 【目的】 1.在小鼠体心肌细胞SIR损伤模型中，探索PD对RhoA/Rho相关激酶（ROCK）通路及该通路可能的上游调节信号通路RAS的调控作用及对心肌细胞凋亡的影响;2.在小鼠体内冠状动脉左前降支阻滞心脏IR损伤模型中，探索PD对RhoA/Rho相关激酶（ROCK）通路及该通路可能的上游调节信号通路RAS的作用及对心功能的影响;3.结合小鼠心肌细胞体外IR、体内SIR模型，探索PD是否经RAS、RhoA/Rho相关激酶（ROCK）通路的抑制而对心肌IR产生保护作用及其可能的机制。 【材料和方法】 1.实验动物和材料 1.1实验动物：出生1-3天的C57BL/6乳鼠，10周龄的C57BL/6雄性小鼠（重约20-22g，深圳大学医学院动物中心）。所有动物动物护理和实验程序均符合美国 NIH制定的《实验动物管理与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，U.S. NIH Publication85-23, revised1996））伦理标准，均符合动物伦理委员会的指导方针。 1.2主要药品和试剂：虎杖苷纯度为98.87％（Haiwang Co.，深圳，广东，中国）。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）（依那普利）购自深圳南山医院。Western blot和免疫染色的主要抗体： MYPT-1，Anti-Phospho-MYPT1（Thr853），Anti-phospho-RhoA（ser-188）和血管紧张素1/2（angiotensin1/2 receptor，AT1/2R）均购自Santa Cruz Biotechnology, Inc.。Vybrant MTT细胞活力和增殖检测试剂盒（Invitrogen），JC-1检测试剂（25μmol/L，碧云天Beyotime，北京），二喹啉甲酸试验检测试剂盒（Pierce，Thermo Scientific.，USA），Pierce ECL Western Blotting试剂盒（Thermo Scientific，USA），Z-phenyl-L-histidyl-Lleucine（Bachem Bioscience Inc），Masson’s三色染色试剂盒HT15-1KT（Sigma, USA），细胞死亡检测试剂盒（Roche，Germany）。 2.第一部分主要实验方法 2.1体外小鼠心肌细胞培养及心肌细胞模拟缺血再灌注（SIR）损伤模型建立：常规方法分离、培养心肌细胞;取生长72小时的单层心肌细胞，1%O2和不含葡萄糖的培养基处理2小时，正常状态放置4小时，建立体外培养心肌细胞缺血/再灌注损伤模型。SIR损伤前分别采用不同浓度的PD（30μM和50μM）对其进行处理。 2.2心肌细胞活力的MTT分析：采用 Vybrant MTT细胞活力和增殖检测试剂盒（Invitrogen，USA）、流式细胞仪（心肌细胞在570nm处的吸光度）检测分析，对不同组别心肌细胞的增殖、细胞活力和生存能力进行评估。 2.3心肌细胞凋亡的线粒体膜电位（Δψm）检测：采用将JC-1检测试剂盒（Bi云天，北京）处理及Axiovert200荧光倒置显微镜（Zeise，Germany）观察各组细胞的凋亡。 2.4 Western blot检测 (1) Western blot检测方法：对体内缺血再灌注心脏的心肌细胞和体外培养的心肌细胞进行声波处理后，使用二喹啉甲酸试验检测试剂盒（Pierce，Thermo Scientific.，USA）对总蛋白进行测定;在7.5%聚丙烯酰胺凝胶中使各种蛋白质成分解离，并转移到硝化纤维纸上，分别使用一抗和二抗进行染色;用 Pierce ECL Western Blotting试剂盒（Thermo Scientific，USA）显影，使用Image J图像分析系统（美国国立卫生研究院，USA）测量光密度。 (2) ROCK活性检测：由于 ROCK可通过特定的磷酸化肌球蛋白磷酸酶目标单元1（myosin phosphatase target subunit1，MBS/MYPT1）而抑制肌球蛋白磷酸酶，肌球蛋白磷酸酶的作用可使磷酸化的20-kDa肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC20）含量增加，所以我们采用广泛使用的pMBS/MBS（或称phosphor-MYPT1/MYPT-1）的比值来表示ROCK活性。 (3) RAS活性检测：p-RhoA（ser188-RhoA）/RhoA，AT1/2R，AT1/2R表达水平表达。 (4)血管紧张素原、ANG I和ACE表达水平检测。 2.5心肌细胞（局部）ACE和肾素表达检测：通过酶联免疫吸附测定（Elisa）、放射免疫检定法（radioimmunoassay，RIA）对生成的ANG I、ACE进行定量分析，评估新生小鼠体外心肌细胞中的肾素活性（ANG I）和ACE含量。 3.第二部分主要实验方法 3.1建立小鼠IR模型：手术线扎阻滞小鼠冠状动脉左前降支后给予持续的24h复灌注+7天PD处理，冠脉阻塞和再灌注成功的标志通过局部心肌组织缺血和典型心电图（ECG）来证实。 3.2心功能检测（超声心动图）：冠状动脉左前降支阻断8天后的小鼠麻醉后，采用，取得成年小鼠心脏胸骨旁短轴切面的M-型二维超声心动图图像，Vevo2100 Protocol-Based Measurements软件进行图像分析 3.3依文思蓝/2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）双重染色：实验最后过量戊巴比妥钠处死所有的小鼠提取心脏，采用依文思蓝/2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色显示心肌梗死风险面积（the area at risk，AAR）、梗死面积及存活区域。依文思蓝染色蓝色表示非缺血区，TTC染色后显示红色，表示心肌缺血存活区域，心肌组织中白色为心肌梗死区域。白色+红色部分=AAR区域。使用Videoplanimetry（Adobe Photo-shop, version5.5）分析心肌梗死区域、缺血和非缺血心肌，以面积为基础对数据进行标准化，以“心肌梗死区域的面积/左心肌切片总面积（%）”和/或“心肌梗死面积/AAR（%）作为统计参数。 3.4 Mason’s三色染色：提取冠状动脉阻断后8天后的成年小鼠的左心室心肌组织切片，采用Sigma HT15-1KT进行Masson’s三色染色，以每只小鼠的左心室心肌纤维化的总面积与左心室心肌的比值（%）为计算参数，在显微镜下评估心肌纤维化的面积及病理胶原沉积的面积，用于统计分析。 3.5心肌细胞凋亡的TUNEL染色：采用细胞死亡检测试剂盒（Roche），以脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL法）检测凋亡的心肌细胞，用于统计分析。 3.6血清肌钙蛋白-T（Tn-T）含量检测。 3.7 Western blot检测 (1) Western blot检测方法：对体内缺血再灌注心脏的心肌细胞和体外培养的心肌细胞进行声波处理后，使用二喹啉甲酸试验检测试剂盒（Pierce，Thermo Scientific.，USA）对总蛋白进行测定;在7.5%聚丙烯酰胺凝胶中使各种蛋白质成分解离，并转移到硝化纤维纸上，分别使用一抗和二抗进行染色;用 Pierce ECL Western Blotting试剂盒（Thermo Scientific，USA）显影，使用Image J图像分析系统（美国国立卫生研究院，USA）测量光密度。 (2) ROCK活性检测：由于 ROCK可通过特定的磷酸化肌球蛋白磷酸酶目标单元1（myosin phosphatase target subunit1，
关键词: 心脏缺血再灌注损伤 ；虎杖苷 ；ROCK活性 ；肾素-血管紧张素系统 ；保护机制
摘要： 研究背景缺血性心脏病,又称为冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病),已经成为全世界人口死亡的第一病因。已有证据表明,冠状动脉硬化斑块堵塞血管造成的心肌缺血会导致心肌组织损伤,血管堵塞解除后,心肌组织重新获得血液供应的过程,也会进一步造成心肌组织损伤,这种过程与现象被称之为缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)。目前用于防治心肌IRI的药物很多,但是鉴于这些药物的副作用、安全性、伦理方面等问题,至今仍然未能获得理想的心肌保护药物。补骨脂酚(Bakuchiol,BAK)是一种从豆科植物补骨脂的种子中分离出来的单萜酚,对肝脏、皮肤等多个脏器具有保护功能。近来的研究表明,补骨脂酚具有广泛的药理学作用,包括抗氧化、抗炎性反应、抗衰老和抗糖尿病等效应。由于氧化应激、炎症反应和糖尿病状态都是心肌缺血再灌注损伤发生机制的重要组成部分,提示补骨脂酚可能具有抗心肌缺血再灌注损伤的效果。沉默信息调制因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)是一种组蛋白脱乙酰化酶,依赖于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)发挥其生物学效应,在热量摄入限制(calorie restriction)介导的长寿机制中发挥重要作用,大量研究证实其具有显著的心肌保护效应。白藜芦醇(一种酚类天然抗毒素)被认为是SIRT1的天然激动剂。有研究表明,白藜芦醇的心肌保护效应是由SIRT1信号通路介导,通过抗氧化应激和改善线粒体功能实现的。此外,SIRT1可以激活过氧化物酶体增生物激活受体-γ的共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γco-activator-1α,PGC-1α)抑制氧化损伤的。PGC-1α活性的上调依赖于SIRT1途径的激活,对缺血/再灌注的大脑和肾脏组织具有保护作用。组织缺血再灌注后SIRT1/PGC-1α通路的激活会加速线粒体的生物生成动力学平衡,促进线粒体蛋白质的表达和功能恢复,从而缓解线粒体损伤。补骨脂酚是白藜芦醇的类似物,分子结构类似于白藜芦醇,本课题的科学假设是补骨脂酚的抗心肌缺血再灌注损伤效应也有可能是通过SIRT1途径实现的,本课题研究目的明确补骨脂酚的心肌保护效应,同时明确SIRT1/PGC-1α信号途径在补骨脂酚心肌保护机制中的作用。研究目的1.研究补骨脂酚是否具有抗心肌IRI作用与机制。2.明确补骨脂酚是否通过调控SIRT1通路发挥抗心肌IRI的保护作用。材料和方法实验材料:成年SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供,雄性,体重220-250g。实验方法:1.离体心脏IRI模型建立及血流动力学检测;2.乳鼠心肌细胞原代培养方法及SIRI模型建立;3.TUNEL法凋亡检测细胞凋亡率;4.离体心脏冠脉流出液和细胞培养液中LDH和CK-MB检测;5.心肌线粒体氧化应激各项指标;6.Western blot检测相关分子蛋白表达。结果1.补骨脂酚剂量依赖性上调大鼠正常离体灌注心脏SIRT1蛋白表达(P<0.05)。2.补骨脂酚(0.25、0.5或1μM)预处理显著改善大鼠模拟缺血后心脏的血流动力学参数,剂量依赖性地降低心肌组织的凋亡细胞指数和心脏冠脉流出液中LDH和CK-MB含量(P<0.05)。3.补骨脂酚预处理减轻IRI诱发的线粒体氧化应激损伤(P<0.05)。4.补骨脂酚(0.25、0.5或1μM)在缺血前灌注5min,剂量依赖性地提高大鼠心脏组织中SIRT1、PGC-1α和Bcl2蛋白的表达,降低Bax蛋白的表达,其中以1μM补骨脂酚处理作用最明显(P<0.05)。5.SIRT1抑制剂sirtinol抑制补骨脂酚对大鼠离体心脏血流动力学指标和心肌损伤的保护效应(P<0.05)。6.SIRT1抑制剂sirtinol抑制补骨脂酚对大鼠离体心脏线粒体氧化应激损伤指标的保护效应(P<0.05)。7.补骨脂酚(1μM)处理显著提高大鼠缺血再灌注离体心脏组织中SIRT1、PGC-1α和Bcl2蛋白表达,降低Bax蛋白表达。SIRT1特异性抑制剂Sirtinol逆转补骨脂酚对这些蛋白表达的影响(P<0.05)。8.大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型得到了一致的结果。补骨脂酚处理可显著提高大鼠心肌细胞SIRI后细胞活力、减少心肌细胞凋亡率、减少培养液中LDH水平,SIRT1 si RNA可以逆转补骨脂酚的保护作用。氧化应激相关指标检测发现,SIRT1 si RNA具有能够逆转补骨脂酚抗线粒体氧化应激损伤的作用(P<0.05)。9.相关分子检测显示,补骨脂酚可以显著提高大鼠心肌细胞SIRI后SIRT1、PGC-1α和Bcl2蛋白表达,降低Bax蛋白表达,SIRT1 si RNA可以逆转补骨脂酚的保护作用(P<0.05)。结论1.补骨脂酚(0.25～1μM)处理5min对正常大鼠离体灌注心脏功能无显著影响,也不造成心肌损伤,但是能促进心肌组织SIRT1蛋白的表达。2.补骨脂酚(0.25～1μM)缺血前处理5min可以有效对抗大鼠离体灌注心脏缺血再灌注模型的心肌损伤。3.补骨脂酚的心肌保护效应是通过激活SIRT1/PGC-1α信号转导途径,缓解线粒体氧化应激水平,抑制凋亡信号通路实现的。
关键词: 补骨脂酚 ；沉默信息转录调控因子1 ；心肌缺血再灌注损伤 ；氧化应激损伤 ；线粒体功能
被引量
8
摘要： 背景心脏移植手术是终末期心力衰竭和严重冠脉疾病患者首选的治疗手段。而如何减轻供体心脏低温保存后再灌注损伤是心脏移植成功的前提和关键。许多研究者对各种心脏低温保存液的成分进行了相应的调整,比如添加了氧自由基清除剂、钙离子拮抗剂等,虽然这些措施也确实不同程度地提高了供体心脏低温保存后再灌注期心功能的恢复,但当供体心脏的保存时间大于6h时,这些改进措施的效果明显下降。因此,如何通过改进心脏低温保存液的成分,延长心脏保存的时间,提高保存效果,减轻再灌注损伤,是我们现今迫切需要解决的问题。白藜芦醇(Resveratrol)是一种非类黄酮的多酚物质,1939年由日本科学家从植物白藜芦的根茎中提取并将其命名之。天然的白藜芦醇在葡萄、桑葚等多种植物中含量丰富。目前,大量的研究发现,白藜芦醇在哺乳动物的体内外均具有广泛的生物学效应,包括预防肿瘤、延长寿命、对抗代谢性疾病、保护心血管系统和神经系统等作用。白藜芦醇的这些作用被认为与其强大的抗氧化、抗炎特性有关。因此,我们推测,白藜芦醇可能具有延长心脏低温保存时间,提高供心低温保存效果的作用,从而使远距获取供心,扩大供心来源成为可能。目的利用大鼠心脏低温保存和Langendorff再灌注模型,观察在心脏低温保存液中添加白藜芦醇后,是否可延长心脏保存时间,减轻心脏低温保存后再灌注损伤；并初步探讨其可能的作用机制。方法(1)大鼠心脏低温保存模型的构建和心功能的测定 离体SD大鼠心脏在Langendorff心脏灌注装置上平衡30min后,经主动脉根部逆行灌注心脏低温保存液(Celsior液),灌注温度为4℃,时间3min以内。待心脏停搏后分别置于4℃含不同浓度白藜芦醇(0、10、20、40μM)的Celsior液中保存9h,随后心脏重新置于Langendorff装置上,于37℃,用Krebs-Henseleit液体(KH液)再灌注60min。通过MedLab生物信号采集处理系统观察心脏血流动力学的改变,包括：左心室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左心室发展压力(1eftventricular developed pressure, LVDP)、心室最大收缩速率(Maximal systolic velocity of left ventricular pressure,+dP/dtmax)、心室最大舒张速率(Maximal diastolic velocity of left ventricular pressure,-dP/dtmax)、心率(heart rate, HR)及冠脉流量(coronary flow, CF)等。(2) Western blot测定心脏解偶联蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)表达实验结束后取左心室肌,匀浆、离心后提取全细胞蛋白。每组取20μ g蛋白于10%SDS-PAGE后,转膜,封闭。硝酸纤维素膜用UCP2抗体(1：1000)于4℃孵育过夜,洗脱后用辣根过氧化物酶结合的二抗室温孵育2h。用增强化学发光法探测目标蛋白。结果(1)与空白对照组(即未于Celsior液中进行冷保存组)相比,大鼠离体心脏低温缺血保存9h后,在再灌注60 min时LVEDP明显抬高,LVDP、+dP/dtmax和-dP/dtmax恢复率均明显下降,心率和冠脉流量也显著下降。在Celsior心脏保存液中添加了不同浓度的白藜芦醇后,可浓度依赖性地对抗低温保存诱导的LVDP抬高,LVDP、+dP/dtmax和-dP/dtmax的下降,以及心率和冠脉流量的下降。(2)与空白对照组相比,大鼠离体心脏低温缺血保存9h后,心室肌组织中UCP2的表达明显增高,约为空白对照组的3.2倍。在Celsior心脏保存液中添加了中、高浓度白藜芦醇(20、40μM)后,对低温保存诱导的UCP2过表达有明显的抑制作用。(3)与单纯低温保存组(Celsior组)相比,在Celsior心脏保存液中添加了SIRT1 (Sirtuin type 1)抑制剂6-氯-2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-甲酰胺((6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-lH-Carbazole-l-carboxamide, EX-257)对心肌UCP2的表达,以及心功能指标均无明显影响。但EX-257可对抗高浓度白藜芦醇(40 μM)对低温保存诱导UCP2过表达的抑制作用,并取消白藜芦醇对低温保存心脏心功能的保护作用。结论在心脏低温保存液中添加了白藜芦醇后,可促进低温保存的大鼠心脏在再灌注期心功能的恢复。其机制可能与激活了SIRT1蛋白,并抑制低温保存诱导的UCP2过表达有关。该研究结果还有待于进一步在大鼠心脏同种移植模型上加以验证。
关键词: 心脏 ；低温保存 ；白藜芦醇 ；解偶联蛋白2
摘要： PDE5对白藜芦醇诱导心肌保护中的影响
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)严重危害人类健康,在治疗AMI过程中发生的缺血／再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, IRI)目前还没有理想的治疗方法。最近的研究发现,白藜芦醇能够通过诱导药物性预处理机制而保护再灌注心脏,其中一氧化氮(nitric oxide, NO)、腺苷受体、磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)等细胞信号转导途径介导白藜芦醇诱导的药物性预处理心肌的保护机制。目前对心肌缺血／再灌注的研究中,糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase3β，GSK-3β)和线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)受到广泛关注。在前期研究中发现,白藜芦醇通过激活环磷酸乌苷／蛋白激酶G(cyclic GMP/protein kinase G, cGMP/PKG)信号通路,使GSK-3β失活并诱导其向线粒体转移,并与线粒体亲和素D结合而抑制mPTP的开放,从而保护再灌注心脏。然而,白藜芦醇激活cGMP/PKG信号途径的具体机制尚不清楚。cGMP是一种重要的具有细胞内信息转导作用的第二信使,而PKG被认为是其最重要的下游信号。细胞内cGMP含量的调控是由鸟苷酸环化酶(GC)介导的其合成作用及磷酸二酯酶(phosphodiesterases, PDEs)催化的其水解作用来实现的。如果能增加NO或抑制’PDE5活性,从理论上能够增加细胞内cGMP水平而激活cGMP/PKG信号通路。
本实验利用Langendorff装置建立大鼠离体心脏缺血／再灌注损伤模型,采用心肌梗死面积测定、Ca2+诱导的线粒体肿胀实验(mPTP开放实验)、Western blotting蛋白分析、共聚焦显微镜观察等方法,对白藜芦醇的再灌注心肌保护作用进行相关实验研究,详细探讨PDE5在白藜芦醇心肌保护中的作用及其机制。
实验结果显示,白藜芦醇未能增加离体大鼠心肌细胞NO的水平,但明显降低再灌注时PDE5的活性,并显著增加再灌注时cGMP含量,表明白藜芦醇的心肌保护作用并非通过乌苷酸环化酶介导的cGMP生成,而是通过抑制PDE5活性而增加cGMP含量的途径。而且白藜芦醇明显增加血管扩张刺激磷蛋白(Vasodilator-Stimulated Phosphoporotein, VASP)及GSK-3p的磷酸化,此作用可被PKG抑制剂KT5823所逆转。另外,PDE的非选择性抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嗓呤(3-isobutyl-l-methylxanthine, IBMX)能够模拟白藜芦醇,明显减少心肌梗死面积,并抑制mPTP的开放,此作用被mPTP开放剂Atractyloside所逆转。这些结果证实,白藜芦醇通过抑制PDE活性激活cGMP/PKG信号转导通路,使GSK-3β失活,抑制mPTP的开放进而保护再灌注心脏。
结论：
1.白藜芦醇明显抑制大鼠离体再灌注心脏的PDE5活性而增加cGMP含量,并显著增加VASP、 GSK-3p的磷酸化。
2.非选择性PDE抑制剂IBMX能够模拟白藜芦醇的心肌保护作用而减少心肌梗死面积,抑制mPTP开放。
3.白藜芦醇通过抑制PDE5的活性而激活cGMP-PKG信号转导通路,对缺血／再灌注心脏发挥保护作用。
线粒体Src酪氨酸激酶及锌在一氧化氮诱导的心肌缺血/再灌注损伤保护中的作用
一氧化氮(nitric oxide, NO)诱导心肌保护作用的关键点在于其能够抑制线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)的开放。但是,参与NO作用的线粒体信号转导机制尚未明确。本研究的目的在于探讨NO是否通过线粒体Src酪氨酸激酶及锌而抑制氧化应激,进而发挥心肌缺血／再灌注损伤的保护作用。
缺血前给予NO供体(S-nitroso-N-acetyl penicillamine, SNAP),能够明显增加模拟缺血／再灌注大鼠心肌细胞的生存率,此作用被锌离子螫合剂N,N,N',N'-tetrakis-(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN)和Src酪氨酸激酶抑制剂PP2所阻断。SNAP能够抑制再灌注时线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△ψm)的减少,此作用同样被TPEN和PP2所阻断。SNAP能够增加再灌注时线粒体内游离锌,并以锌依赖性的方式增加线粒体Src的磷酸化。SNAP通过Src酪氨酸激酶及锌抑制再灌注时线粒体复合体Ⅰ的活性及线粒体活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生。此外,TPEN和PP2可明显抑制SNAP在离体大鼠心脏中的抗梗死作用。
结论：
1.NO通过抑制复合体Ⅰ阻止线粒体氧化应激,发挥再灌注心肌保护作用。
2.复合体Ⅰ的抑制作用可能是通过锌激活线粒体Src酪氨酸激酶而引起。
关键词: 白藜芦醇 ；心肌再灌注损伤 ；磷酸二酯酶5 ；环磷酸鸟苷/蛋白激酶G信号转导通路 ；再灌注 ；梗死 ；复合体Ⅰ ；活性氧
被引量
3
摘要： 目的：白藜芦醇甙（polydatin），即3,4’，5-三羟基芪-3-β-葡萄糖苷（3,4’,5-trihydroxystibene-3-β-mono-D-glucoside）,也被称作虎杖甙，是从中药虎杖中提取的单晶体物质。研究表明，白藜芦醇甙具有多种生物学活性。近年研究结果已证实polydatin对机体的多种有益效应以及polydatin对机体多种器官均具有保护作用。对于脑，polydatin可对抗缺血和再灌注脑损伤及脑出血所致的脑损伤。对于肺，polydatin对内毒素及缺血再灌所致的肺损伤有预防和治疗作用。对于肠，polydatin可以对抗肠缺血再灌注所致损伤，并改善由DSS诱导的小鼠大肠炎。对心脏，polydatin可对抗缺血再灌注及脂多糖介导的心肌损伤。此外，polydatin已被证实具有抗炎，抗休克，抗氧化的作用，并可抑制血小板聚集，减少由血管内皮损伤所致的动脉血栓的形成，从而改善微循环。
我们以往的研究表明，polydatin具有明显的抗心肌缺血再灌注损伤和抗心律失常作用。电生理学研究显示，polydatin可以缩短正常心室乳头肌动作电位的复极化过程，并可降低部分去极化乳头肌动作电位的超射值、动作电位幅度以及0期最大去极化速率。此作用可能是polydatin抗心律失常作用的电生理学机制之一。众所周知，动作电位是不同离子通过细胞膜离子通道转运的结果。而有关polydatin抗心律失常的离子机制至今尚未明了。本研究旨在应用全细胞膜片钳技术，观察polydatin对大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流(ICa-L)，ATP敏感钾通道电流(IKATP)，内向整流钾通道电流(IK1)，瞬时外向钾通道电流(Ito)，稳态外向钾通道电流(Iss)的影响，从而探讨polydatin抗心律失常作用的离子机制。
方法：实验采用成年雄性SD大鼠，通过离体心脏灌流及酶分离方法获得单个的心室肌细胞。细胞置于倒置显微镜上标本小浴槽中，给予恒温和恒速细胞外液灌流，通过微操作器，使玻璃微电极和细胞接触，并达到高阻封接，通过一定负压，形成全细胞模式。在电压钳方式下,通过运行pclamp的各种记录程序完成电流的诱发和采集。通过累计给药法给予不同浓度的polydatin，观察polydatin对ICa-L, Ito, IK1, Iss,和IKATP的影响。
结果：（1）polydatin对大鼠心室肌细胞ICa-L具有抑制作用：polydatin浓度依赖性地降低心室肌细胞ICa-L。在polydatin25μM,50μM,75μM和100μM浓度下,峰值ICa-L的降低分别为17.5%、32.1%、40.5%和52.6%（P<0.01）。ICa-L的I-V关系曲线逐渐上移，但其电流-电压关系无明显变化。Polydatin对ICa-L的激活曲线及失活后的恢复过程无影响，但可使ICa-L的失活曲线向负电位方向移位（-7.4mV）。（2）polydatin对心室肌细胞内向整流钾通道电流(IK1)和ATP敏感钾通道具有激活作用：在-120mV测试脉冲电压下，与基础IK1相比较，（10,50,100μM）可以显著增加峰值IK1，峰值IK1的增加可分别达35.0%、18.4%和20.8%（P<0.05）。然而，当进一步降低polydatin浓度（1μM）和进一步增高polydatin浓度（>500μM）时，反而对峰值IK1无影响（P>0.05）。polydatin可增强DNP诱发的IKATP，在60mV和-120mV测试脉冲电压下，50μM polydatin分别使IKATP的外向电流增加达66.2%，内向电流增加144.6%（P<0.05）。（3）polydatin对心室肌细胞瞬时外向钾通道电流(Ito)和稳态失活钾通道电流(Iss)无影响。不同浓度的polydatin对Ito的峰值电流、I-V关系、激活曲线、失活曲线和失活后恢复均无明显影响（P>0.05）。同样，polydatin对Iss亦无明显影响（P>0.05）。
结论：polydatin可通过加快大鼠心室肌细胞L-型Ca2+通道的失活过程而浓度依赖性地抑制L-型Ca2+通道、降低ICa-L电流；激活ATP敏感钾通道和内向整流钾通道、增加IK1和IKATP电流。此作用可能是polydatin心脏保护和抗心律失常作用的离子机制之一。
关键词: 白藜芦醇甙（polydatin） ；L-型Ca2+电流 ；ATP敏感钾电流 ；瞬时外向钾电流 ；稳态外向钾电流 ；内向整流钾电流 ；心肌细胞 ；大鼠
被引量
2
摘要： 社会的飞速发展带给人们饮食和生活方式巨大改善的同时，心脑血管疾病的发生率也越来越高。缺血性心脏病是严重危害人类健康的常见病与多发病，心力衰竭是其主要死因。及时恢复冠脉血流是挽救急性缺血心肌的根本措施，但心肌在恢复血流的同时也会导致再灌注损伤，即心肌缺血/再灌注损伤，如何有效减轻这种损伤，使再灌注治疗最大获益，成为了缺血性心脏病治疗的最大挑战。
肺动脉高压是以肺血管阻力和肺动脉压力升高为特点的一组病理生理综合征，也是临床上一种严重且难治的疾病。其病理特征包括肺小动脉的血管痉挛、内膜增生和重构以及由此导致的肺动脉阻力进行性升高，最终伴发右心室肥厚和终末期心脏衰竭。目前，肺动脉高压的治疗缺乏高效特性的治疗方法，预后差，致死致残率高，尚无特效药物。
基础和临床研究证明：心肌缺血/再灌注和肺动脉高压的病理过程都存在氧自由基损伤和内源性NO合成量减少的问题。单硝酸异山梨醇酯是对心肌缺血/再灌注损伤与缺氧性肺动脉高压有效的NO供体药物，但自身没有抗氧化作用，且长期使用会产生耐药性。天然产物阿魏酸和白藜芦醇都是自由基清除剂，对心肌缺血/再灌注损伤与肺动脉高压有一定疗效。
近年来，人们为了增加药物的活性，已经开始趋向于把NO供体结构引入到已知药物分子中去，因此，本课题基于前药设计策略，将具有清除自由基作用的阿魏酸和白藜芦醇（或与其母核结构类似的衍生物）作为先导化合物，与NO供体单硝酸异山梨醇酯通过桥连基偶合，合成具有双功能的治疗缺血/再灌注损伤和防治肺动脉高压的NO供体型衍生物AcFA-201和BZ-1，并对其药效学进行了初步研究。
本课题主要进行了两部分实验的研究：
第一部分：
1.化合物AcFA-201的合成
采用官能团改构的方法将单硝酸异山梨醇酯的羟基转变为氨基，再将其与乙酰阿魏酸相连，经纯化后得到了结构稳定的化合物AcFA-201。对AcFA-201的合成方法进行了优化，确定混合酸酐法为最优方法。通过质谱、红外、核磁氢谱等方法对化合物AcFA-201进行了结构表征，并对其理化性质进行了研究。
2. AcFA-201抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的初步药效学研究
建立大鼠心肌缺血/再灌注模型，缺血0.5h，再灌注3h。将48只SD大鼠随机分为6组：①假手术（SHAM）组；②心肌缺血/再灌注（MI/R）组；③MI/R+阿魏酸钠（SF）治疗组；④MI/R+单硝酸异山梨醇酯（IM）治疗组；⑤MI/R+AFI治疗组；⑥MI/R+AcFA-201治疗组。SF、IM治疗组于大鼠手术前15min，腹腔注射对应药物40mg/kg， AFI及AcFA-201治疗组于大鼠手术前2h，腹腔注射对应药物10mg/kg。实验结束后，对三方面的指标进行检测：1)大鼠心功能检测（包括左室发展压LVDP、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率±dp/dtmax）；2)使用NO试剂盒进行血清NO水平检测；3)采用比色法进行血清中CK、LDH、 SOD活性和H2O2、MDA含量的检测。
检测结果表明，与假手术组相比，MI/R组的LVDP、±dp/dtmax、血清中NO含量、SOD活性均显著降低（P<0.05），血清中CK、LDH活性和H2O2、MDA含量均显著升高（P<0.05）。与MI/R组相比，四组治疗组的各项指标均有了显著改善（P<0.05或P<0.01）。与阿魏酸钠组、单硝酸异山梨醇酯组相比，AcFA-201治疗组左室发展压、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率（±dp/dtmax）明显提高（P<0.05），血清中CK、LDH的活性和H2O2、MDA的含量降低而SOD活性和NO含量显著升高（P<0.05或P<0.01）；与AFI组相比，AcFA-201组各项指标均无显著性差异（P0.05）。
3. AcFA-201与AFI在模拟胃肠液中的稳定性比较
采用体外孵育的方法，将具有酰胺键结构的AcFA-201与具有酯键结构的AFI在模拟胃肠液中的稳定性进行比较。结果显示，酰胺键结构比酯键结构在模拟胃肠液中更为稳定，表明AcFA-201更适合开发为口服药物。
第二部分：
1.化合物BZ-1的合成
采用柏琴反应合成甲基化异白藜芦醇中间体，再与单硝酸异山梨醇酯相连，得到了新的目标化合物BZ-1。对BZ-1的合成方法进行了优化，研究了3种合成方法，结果证实缩合法反应条件最为适宜，产率较高。并对BZ-1进行了理化性质研究和质谱、红外、核磁氢谱等结构表征。
2. BZ-1的小鼠体内NO释放实验
以单硝酸异山梨醇酯为对照，对BZ-1的小鼠体内NO释放进行了研究，结果表明，BZ-1可在小鼠体内稳定地释放NO，其释放量随时间延长而增加，但总体上弱于单硝酸异山梨醇酯。
3. BZ-1的耐缺氧实验
以单硝酸异山梨醇酯为对照，进行了小鼠耐缺氧实验研究，结果表明，BZ-1高剂量组可显著延长小鼠缺氧下的存活时间，而单硝酸异山梨醇酯不具有此作用。
4. BZ-1对肺动脉高压模型大鼠的初步药效学研究
采用一次性注射MCT法建立大鼠肺动脉高压模型，将50只SD大鼠随机分为5组：正常对照组；模型组；BZ-1低剂量组；BZ-1中剂量组；BZ-1高剂量组。注射MCT次日低、中、高剂量组分别腹腔注射BZ-15、15、25mg/kg，正常对照组及模型组腹腔注射等体积溶剂（吐温80：生理盐水=1:40，体积比），每天一次，持续4周。实验完成后，进行以下指标的检测：1)平均肺动脉压及右心肥大指数检测；2)全血粘度值及红细胞聚集指数检测；3)使用试剂盒进行血清和肺组织匀浆NO含量及NOS活力检测；4) HE染色法制作肺组织病理切片，观察肺部病理改变并测定肺部小动脉血管壁厚度与血管外径的百分比（WT%）以及血管壁面积与血管总面积的百分比（WA%）。
结果表明，与正常对照组相比，模型组大鼠的平均肺动脉压、右心肥大指数、全血粘度值、红细胞聚集指数、肺部病理切片中的WT%以及WA%值均显著升高（P<0.05），血清和肺组织匀浆NO含量及NOS活力均显著降低（P<0.05）。与模型组相比，BZ-1中、高剂量组的平均肺动脉压、右心肥大指数、全血粘度值、红细胞聚集指数、WT%以及WA%值均显著降低（P<0.05或P<0.01），血清及肺组织匀浆的NO含量和NOS活力显著升高（P<0.05或P<0.01）。低剂量组与模型组比较无显著性差异（P0.05）。
本课题基于前药设计策略，设计合成了两种新的双功能NO供体型衍生物AcFA-201与BZ-1，通过对这两种化合物的合成方法进行优化，确定了各自的最佳合成路线并分别对目标化合物进行了结构表征。同时对这两种化合物进行了初步药效评价，其中AcFA-201抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的初步药效学研究表明，AcFA-201可有效改善缺血/再灌注心脏功能，减轻心肌损伤，其作用机制可能是通过上调心肌组织NO含量，扩张血管，并减轻缺血/再灌注大鼠心肌的氧化应激损伤，从而起到保护心肌的作用。该化合物所具有的酰胺键结构在模拟胃肠液中代谢稳定，提示其具有开发为口服药物的优势。BZ-1对野百合碱所致大鼠肺动脉高压模型的初步药效学研究表明，BZ-1可有效改善肺动脉高压模型大鼠的肺血管收缩性，增加肺组织中NO含量和NOS的活性，改善血液流变，从而降低肺动脉高压，并显著减轻肺小血管管壁增厚及管腔狭窄程度，从而改善了肺组织的病理性重构，BZ-1还可在小鼠体内稳定释放NO并延长小鼠缺氧下的存活时间，其作用机制可能与其增加NO含量，改善血液流变性和抗缺氧有关，因此，BZ-1有望开发为防治肺动脉高压的新型药物。
关键词: NO供体药物 ；抗自由基损伤 ；单硝酸异山梨醇酯 ；心肌缺血/再灌注 ；肺动脉高压
摘要： 实验背景及目的： 近几年来，随着心血系统疾病治疗策略的进步以及溶栓术、血管成形术、冠脉搭桥术和器官移植等方法在临床的应用，使缺血的心脏组织重新得到血流灌注后，可使心脏结构、功能得到恢复和改善；但有时心脏缺血后再灌注不仅使心脏功能不能恢复，而且造成心肌组织结构和功能障碍进一步加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血/再灌注损伤(Myocardium ischemia/reperfusion injury，MI/RI)。心肌缺血/再灌注损伤可引起心肌细胞膜结构改变、基质中致密物增多，大量的钙沉积、线粒体水肿、膜通透性改变和细胞器断裂溶解等超微结构的改变，这些是缺血心肌可逆性损伤向不可逆损伤的病理生理转变过程。再灌后不但使心肌细胞发生上述的病理变化，同时导致心肌微血管内皮细胞（Cardiac microvascular endothelial cell,CMEC）在形态、结构和功能发生异常的病理生理性改变，血管内皮舒张因子（EDRF）减少和内皮素（ET-1）增多，微血管内皮的水肿和破坏，致使血小板与白细胞黏附、聚集、栓塞，造成心肌微血管内皮细胞凋亡(Apoptosis)或坏死。文献报道，心肌缺血/再灌注损伤时，心肌微血管内皮细胞功能和结构形态异常改变发生的时间早于心肌细胞[1]，心肌微血管内皮细胞受损引起活性氧物质的生成，释放细胞因子、生长因子、炎性组织因子、发生脂质过氧化反应，从而加重内皮细胞损伤、心肌组织结构和功能障碍。 白藜芦醇（Resveratrol）是广泛存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的一种多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板黏附、聚集，调节能量代谢等生物学保护作用[2]。研究发现，白藜芦醇可抑制缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡、增强心肌组织抵抗损伤的能力，维持氧供需平衡，促进缺血心肌细胞的活力，改善心功能。近期研究证实，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路可参与缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞病理生理性损伤的发生、发展过程，并调节细胞存活、增殖分化、细胞迁移和能量代谢等生物学作用[3]；缺氧诱导因子-1α(Hypoxia induciblefactor-1α, HIF-1α)是缺氧环境下，广泛存在于人体组织和哺乳动物体内的一种生存转录调节因子，通过调控一系列与适应缺氧有关的基因的表达，促进氧转运、血管新生、抑制细胞凋亡、生存应激和能量代谢等在保持机体内氧稳态中发挥着重要的生理学作用。 我们前期研究发现，白藜芦醇可抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡[4]，但是缺氧复氧前给予白藜芦醇干预是否对心肌微血管内皮细胞具有保护作用及其作用机制否是与激活PI3K/Akt/HIF-1α信号通路有关尚未见文献报道。 研究目的： 1.观察不同浓度的白藜芦醇对缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞活性和细胞凋亡的影响。 2.探讨白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡是否通过激活PI3K/Akt/HIF-1α信号通路而实现的。 实验方法：第一部分：白藜芦醇预处理对缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞的影响 1．取SD雄性大鼠心脏的左心室心肌，利用酶消化法成功分离心肌微血管内皮细胞（CMEC），Dil-Ac-LDL与DAPI免疫荧光双染法鉴定细胞。 2．建立心肌微血管内皮细胞缺氧复氧模型，设立对照组、缺氧复氧组、不同浓度白藜芦醇组（5、10、20、30、40μmol/L）。MTT比色法检测心肌微血管内皮细胞的活性，TUNE染色法检测心肌微血管内皮细胞凋亡，并确定白藜芦醇最适实验浓度。 第二部分：PI3K/Akt/HIF-1α信号通路在白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡中的作用 体外培养2-3代的心肌微血管内皮细胞（CMEC），建立缺氧复氧细胞损伤模型，并随机分为1）对照组2）缺氧复氧(H/R)组3）缺氧复氧(H/R)+20μmol/L白藜芦醇组4）缺氧复氧(H/R)+20μmol/L白藜芦醇+LY294002组。MTT比色法检测心肌微血管内皮细胞的活性；Transwell检测心肌微血管内皮细胞的迁移能力；分别以PI-AnnexinV、TUNEL染色法检测心肌微血管内皮细胞凋亡；Western-blot法检测心肌微血管内皮细胞的P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平。 实验结果： 1.心肌微血管内皮细胞鉴定：细胞质Dil-Ac-LDL染色阳性（呈红色荧光），细胞核DAPI染色阳性（呈蓝色荧光），证实体外所培养的细胞为心肌微血管内皮细胞（CMEC）。 2. MTT、TUNEL法检测结果表明：不同浓度（5、10、20、30、40μmol/L）白藜芦醇均可提高细胞活性，抑制细胞凋亡，中浓度的白藜芦醇（20μmol/L）保护作用明显(P<0.05)，差异有统计学意义；故选定20μmol/L白藜芦醇作为最适实验浓度。 3.与对照组相比，缺氧复氧组P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05)；与缺氧复氧组相比，白藜芦醇组P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与白藜芦醇组相比，缺氧复氧(H/R)+20μmol/L白藜芦醇+LY294002组CMEC的活性、迁移能力均明显降低(P<0.05)，细胞凋亡明显增加(P<0.05)，P-Akt、HIF-1α蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡可能与Ak磷酸化和上调HIF-1α蛋白表达水平有关。 结论： 1.不同浓度的白藜芦醇可增强缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞的活性、抑制细胞凋亡，而且在一定浓度范围内具有剂量依赖性。 2.白藜芦醇可抑制心肌微血管内皮细胞凋亡，并增强细胞的活性和迁移能力，其生物学保护作用可能是通过激活PI3K/Akt信号转导通路并上调细胞HIF-1α蛋白表达水平而实现。
关键词: 白藜芦醇 ；心肌微血管内皮细胞 ；缺氧复氧 ；凋亡 ；PI3K/Akt ；HIF-1α
被引量
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摘要： 急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是住院病人常见的并发症之一。一旦发生AKI,患者死亡率和病死率均明显增加,缺血是引起急性肾功能损伤常见原因。有报道称AKI之后,尽管部分患者当时成功存活下来但是肾脏功能出现了不可逆的损伤甚至慢性肾功能不全,后续生存率降低。据统计,急性肾脏衰竭后患者病死率高达40-60%。AKI的特征是肾小球滤过率急剧下降。人们逐渐清楚地认识到,慢性肾脏疾病基础之上的AKI是推动终末期肾病进程的一个重要因素。以往的研究表明,细胞凋亡、氧化剂和铁离子介导的细胞损伤,内皮细胞的变化、再生和修复,炎症反应等在AKI的发病机制中扮演中关键的作用。然而,越来越多的研究结果表明,线粒体功能障碍是AKI的主要原因。失血性休克作为一种病理状态的显著的特点之一是全身和局部组织灌注减少,液体复苏是重症失血性休克患者的重要治疗措施。多器官功能衰竭作为失血性休克复苏后的常见不良预后,肾脏是主要的受累的器官之一。然而,重症失血性休克再灌注(hemorrhagic shock/reperfusion,HS/R)后肾脏细胞是否也存在线粒体功能障碍尚不清楚。已经查明,AKI线粒体功能障碍发生机制主要和缺血缺氧、氧化应激、微循环障碍、线粒体动力学破坏和线粒体介导的细胞凋亡有关。p53作为肿瘤抑制因子它具有强大的调节细胞凋亡的作用。正常情况下,p53蛋白通过MDM2介导的泛素化和降解途径维持在较低水平。然而,当细胞暴露于包括基因毒性应激在内的应激环境时,p53蛋白可迅速蓄积并作用于下游靶点发挥生物学效应。主要表现为p53通过转录依赖性和转录非依赖性方式调控凋亡途径。p53转录依赖性的细胞凋亡和凋亡相关靶基因包括Bax、NOXA和PUMA的表达有关。p53转录非依赖性的细胞凋亡通过p53在线粒体和抗凋亡Bcl-2等之间的直接相互作用后促进Bax释放和线粒体外膜通透性增加,细胞色素C从线粒体膜间隙释放启动凋亡。p53的数量、稳定性和活性部分受到翻译后的多种修饰调节,包括磷酸化、泛素化和乙酰化等。已有大量文献报道,限制热量摄入可以延缓衰老、延年益寿,但由于应用中存在很多不足,临床危重病人难以在短时间治疗起效。而促进染色质沉默和转录抑制的sirtuin家族是一种模拟热量限制的替代选择,它在肾脏疾病的发病中起着重要的作用。该家族中已知沉默信息调节因子2相关酶1(Sirtuin 1,SIRT1)是一种烟酰胺腺嗓呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的蛋白去乙酰化酶,它是哺乳动物Sir2的7种同源染色体之一,总序列最长,被研究得最为广泛。SIRT1最初被发现能够调节长寿、凋亡和DNA修复。SIRT1不仅去乙酰组蛋白H1、H3和H4,而且也对其他许多非组蛋白包括p53、FOXO、Ku70、P300、Rb、E2F1、NF-κB、p73和PGC-1α等产生去乙酰化作用。由于作用于上述重要的蛋白,SIRT1参与调控正常和异常细胞的多种生命进程,如应激反应、肿瘤代谢、衰老等。p53基因是第一个被发现的SIRT1去乙酰化非组蛋白靶点。即使是在组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetyltransferase,HDAC)抑制剂曲古抑菌素 A(trichostatin A,TSA)作用的条件下,细胞裂解液中的乙酰化p53也极不稳定。而蛋白去乙酰化酶的存在可能是p53乙酰化不稳定的原因,SIRT1可能是通过去乙酰化方式降低p53乙酰化水平,影响p53的线粒体移位和线粒体凋亡途径。后续有研究证实尽管在常用的HDAC抑制剂TSA存在的条件下,SIRT1的去乙酰化酶活性仍不能被有效抑制。进一步的研究证实p53的确是SIRT1的作用靶点,即SIRT1通过去乙酰化负性调节p53活性,该现象也被Vaziri和Langley等分别加以验证。近年来,白藜芦醇作为SIRT1的激活剂受到了广泛的报道,它广泛存在于红葡萄皮和红葡萄酒,改善线粒体功能和脂质水平、促进和维持PGC-1α表达,最终维持了足细胞的完整性。有趣的是,白藜芦醇被首先证实是SIRT1的激动剂且已经被证实能够减轻肾脏缺血再灌注损伤。此外,白藜芦醇还被证实能够通过SIRT1的去乙酰化p53途径减少顺铂诱发的小鼠近端小管上皮细胞损伤和多柔比星诱发的心肌细胞凋亡。除了白藜芦醇,其他新的SIRT1激动剂也有报道。由于辅酶因子NAD+是SIRT1关键信号分子。食物中添加NAD+前体烟酰胺单核苷酸或核苷能够增强氧化代谢。因此,sirtuin家族成员和他们的活化剂可能是有前途的治疗靶点。虎杖苷(Polydatin,PD),又名白藜芦醇,虎杖晶4号。它是从中国传统中药虎杖的根茎中提取的有效活性成分,化学结构已确定为3,4,5-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷,是单晶体药物。PD经过南方医科大学(原第一军医大学)病理生理教研室赵克森教授等经过30年的研究,已证实在多个疾病模型中有确切效果,多年来应用无明显毒副作用。通过赵克森教授和海王药业有限责任公司的合作开发,PD已取得了临床试验的正式批件(批件号2006L00301),成为国家为数不多的I类新药,目前正在开展临床失血性休克和烧伤Ⅱb试验,进展顺利。多项研究表明,PD对多种原因引起的实验动物休克有显著的疗效。我们实验组既往工作通过大鼠失血性和烧伤休克等模型证实PD能够扩张微血管,改善微循环,提高心输出,降低全身外周阻力,增强心功能及脉压,改变血液流变学特征,抑制白细胞粘附等。其次,PD能改善缺血再灌注模型多脏器的损伤。我室宋瑞、王兴民等均证实PD有保护重症休克血管平滑肌和脑神经元线粒体损伤的效应。张利萍等通过大鼠实验证实PD治疗心肌缺血/再灌注损伤的作用。总结其机制与下列原因有关:1、PD通过抑制线粒体KATP以及线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition,mPTP)开放,保护线粒体,发挥心脏保护作用;2、增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达,减少缺血/再灌注诱导的大鼠心肌细胞凋亡;3、使钙离子内流减少和开放KATP增加钾离子外流,产生明显的抗心肌缺血/再灌注心律失常作用;4、抑制血小板聚集,降低白细胞对血管内皮的粘附性,改善微循环,抑制脂质过氧化。也有学者证实PD通过直接抗氧化应激等作用保护缺血再灌注后的心肌受损。在孕兔失血性休克模型中,PD可能通过诱导肺组织HSP-70表达,抑制肺组织NF-κB的激活,减少了血清炎症因子TNF-α等的释放以及肺组织ICAM-1粘附分子的生成,最终减轻了产兔失血性复休克后的肺损伤。最新文献报导PD还能预防脓毒症后肺损伤。既往报道显示,PD能够减少线粒体第三复合物(complex Ⅲ)氧自由基形成,具有直接保护线粒体的作用。基于上述文献回顾,本研究拟解决如下几个问题:1、HS/R后大鼠肾脏细胞是否存在线粒体损伤;2、HS/R后大鼠肾脏细胞线粒体损伤是否和SIRT1-p53有关;3、PD作用能否上调SIRT1的表达和(或者)活性,它是否是PD线粒体保护的分子机制。根据上述问题,我们将实验分为如下三个部分:1.建立HS/R的动物模型,检测肾脏细胞是否发生了线粒体损伤,哪一种细胞尤为明显;分离靶细胞,集中对受损的细胞线粒体功能进行评估;探讨SIRT1水平和活性,乙酰化p53水平和线粒体损伤之间的关系。2.探讨PD是否具有SIRT1的激动作用,PD对于SIRT1-p53信号通路的影响和保护细胞线粒体的机制;3.构建人肾细胞株(human kidney2,HK-2)缺氧复氧模型,进一步验证SIRT1-p53信号通路在缺氧复氧模型中的作用以及PD对于SIRT1-p53信号通路的激动作用。第一部分失血性休克再灌注后大鼠肾小管上皮线粒体损伤1、HS/R后大鼠肾小管上皮细胞存在线粒体损伤首先我们评估了重症失血性休克再灌注后是否存在线粒体损伤,通过透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检查休克再灌注后肾脏细胞的线粒体超微结构。我们发现肾小管上皮细胞线粒体损伤尤为显著,表现为正常对照组(Control)大鼠的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)线粒体形态正常,线粒体膜和嵴完整。休克后(vehicle组)RTECs线粒体形态不规则,肿胀明显,嵴部分破坏或难以辨认。因此,我们确定了肾小管上皮细胞的线粒体作为后续研究的对象。通过分离RTECs并采用我们既往报道的方法测定了 RTECs线粒体通透性转变孔(mPTP),线粒体跨膜电位(ΔΨm),细胞内ATP水平和溶酶体稳定性。共聚焦显微镜下Control组中可见明亮黄绿色的钙黄绿素荧光,而在HS/R组(vehicle组)荧光被部分淬灭。为进一度对通透性转变孔的开放程度进行定量,我们采用了流式细胞技术对calcein-AM荧光进行了分析。和control组比较,calcein-AM荧光强度在重症休克再灌注后(vehicle组)下降至34.1±2.1%(t=15.654,P=0.000)。采用荧光探针JC-1的单体JC-1/聚合体比率这一指标反映线粒体膜电位(ΔΨm)。结果发现重症休克后,单体JC-1/聚合体比率显著增加(t=-10.495,P=0.002)。采用荧光素荧光素酶法检测细胞内ATP水平,结果发现vehicle组ATP水平较正常对照组下降了 34±7.3%(t=10.939,P=0.000)。我们既往研究证实线粒体和溶酶体是密切相关,线粒体的受损可能加重溶酶体的损伤,反过来溶酶体的破坏可能会进一步恶化线粒体损伤。也可以认为,亚细胞器溶酶体损伤是线粒体损伤的一个间接的指标。介于溶酶体和线粒体的关系,我们也探讨了失血性休克RTECs溶酶体的影响。我们发现HS/R后,vehicle组出现了红色显著减弱,甚至典型的"苍白细胞"(t=7.155,P=0.000)。2、HS/R后大鼠肾小管上皮细胞线粒体促凋亡蛋白表达增加为了探讨HS/R后RTECs线粒体损伤的机制,我们采用免疫组化技术对线粒体凋亡相关蛋白的测定。结果发现HS/R之后肾脏组织较control促凋亡蛋白Bax表达显著增加而抑凋亡蛋白Bcl-2减少。为了进一步定量凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2,我们采用了免疫印迹技术测定这肾脏皮质的两种蛋白的相对含量并提取了其胞质和线粒体蛋白测定细胞色素C含量。和免疫组化结果的趋势一致,HS/R后vehicle组的Bax含量较control组增加了30±14%(t=-3.682,P=0.006)。与之对应的是Bcl-2的含量,HS/R后vehicle组Bcl-2较control组减少了29±9.8%(t=4.692,P=0.002)。细胞色素C的测定HS/R后胞质/线粒体比率较control组增加了 115±32.2%(t=-6.817,P=0.000)。上述结果表明线粒体损伤后,线粒体的凋亡相关蛋白发生了显著的变化。3、HS/R后大鼠肾皮质p53的乙酰化水平增加免疫印记结果发现,HS/R后vehicle组大鼠肾脏组织的p53蛋白较control组显著增加;不仅如此,HS/R后vehicle组Acetyl-p53也较control组增加(t=-3.063,P=0.039),这些结果提示p53可能参与了 HS/R线粒体凋亡调节。4、HS/R后大鼠肾脏皮质的SIRT1蛋白和活性减少同正常对照组(control组)相比,休克大鼠肾脏皮质中SIRT1的蛋白表达和活性分别下降了48.6±5.3%(t=8.859,P=0.002)和58.2±8.9%(t=8.329,P=0.001)。第二部分虎杖苷通过激活SIRT1减少失血性休克再灌注诱导的大鼠肾小管上皮细胞线粒体损伤1、PD和Ex527对于正常大鼠肾脏组织的SIRT1活性的影响正常大鼠7天给药后,各组大鼠肾脏组织SIRT1蛋白表达和活性的差异均有统计学意义(SIRT1 蛋白:F=30.233,P=0.000;SIRT1 活性:F=56.636,P=0.000)。
关键词: 去乙酰化 ；虎杖苷 ；p53 ；肾损伤 ；休克 ；SIRT1
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