摘要: 鸡大肠杆菌病是由大肠埃希杆菌(Escherichia coli,简称E.coli)的某些血清型引起的细菌性传染病的总称,目前已成为鸡群中最严重的细菌病之一,主要防治手段是抗生素治疗。但随着耐药菌株的产生使抗菌药物预防和治疗效果日益减弱。近年来,多重耐药革兰氏阴性菌感染的发生率不断上升,黏菌素被作为临床治疗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线。因此关于E.coli对黏菌素耐药性表现的流行病学监测至关重要。抗菌药物敏感性判定标准(折点)是开展病原菌耐药性监测及确定其耐药率、耐药水平的重要技术标准,它包括野生型折点(epidemiological cut-off value,ECV)、临床折点(clinical cut-off value,COCL)和药代动力学/药效学折点(pharmacokinetices-pharmacodynamics,COPD)。ECV是对病原菌耐药性表现的流行病学的监测,在最终折点建立之前,对细菌耐药性的发现和发展起到预警作用。本试验参照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)折点建立流程,建立了黏菌素对鸡大肠杆菌的ECV,并且通过药敏实验研究鸡大肠杆菌的多重耐药性,从分子角度研究了质粒介导的黏菌素耐药基因(the transfer of polymyxin resistance genes,mcr)的流行情况,通过黏菌素联合用药筛选,为临床合理联合用药提供参考。本研究从2016年9月至2018年1月从我国十大省份各大规模化养鸡场,用无菌棉签采集鸡的新鲜粪便,共采集1563份样品。通过MH琼脂、麦康凯(MAC)琼脂和伊红美蓝(EMB)琼脂培养基进行初步分离,经革兰氏染色、16S rRNA PCR扩增和生化鉴定方法成功分离和鉴定了1250(79.97%)株E.coli。采用微量肉汤稀释法测定了黏菌素对临床分离E.coli的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitorv Concentration,MIC),MIC50和MIC90分别为2μg/mL和4μg/mL。MIC值转化为log2 MIC带入Ecoffinder分析软件进行非线性回归模拟,得到黏菌素对鸡源大肠杆菌的ECV为8μg/mL。依据折点筛选出黏菌素耐药菌株,通过药敏纸片扩散法(Kirby-Bauer,K-B)检测耐药菌株对7类17种抗生素药物敏感性。药敏试验结果显示,E.coli对14种抗生素的耐药率高于50%,其中对阿莫西林、磺胺异噁唑、氧苄氨嘧啶100%耐药;对阿米卡星(5.88%)、大观霉素(17.65%)和磷霉素(41.18%)的耐药率较低。同时此次检测的E.coli均为多重耐药大肠杆菌,主要表现为8~16耐,多重耐药现象严重,耐药谱宽。为了了解黏菌素对不同敏感性菌株中耐药基因mcr(1~5)的流行情况,依据MIC值筛选了不同地区分离的E.coli共95株。经PCR扩增,mcr-3和mcr-5未扩增到。在DNA中mcr-1、mcr-2和mcr-4的检出率分别为23.2%、7.3%和2.1%。在质粒中mcr-1的携带率高达41.1%,其次mcr-2为7.3%,mcr-4仅为3.2%。挑选黏菌素耐药菌株中mcr-1阳性E.coli(8/18),PCR扩增新德里金属-β-内酰胺酶-1(New Delhi metal-lactamase-1,NDM-1)的检率为37.5%(3/8);通过多位点测序分型(Multilocus Sequence Typing,MLST),测得这8株菌株分别为ST10、ST48、ST57、ST155、ST359、ST744和ST2458,其中两株菌均是ST48。选择阿米卡星、多西环素、庆大霉素与黏菌素通过肉汤稀释棋盘法进行体外联合药敏实验。黏菌素与这三种药物的联合用药效果依次递增,分别属于无关作用、相加作用和协同作用。综上所述,本研究建立的黏菌素对鸡源大肠杆菌的野生型折点为8μg/mL,我国鸡源大肠杆菌对黏菌素敏感性偏低,对黏菌素耐药的大肠杆菌临床分离株,多重耐药性严重,耐药谱宽,耐药基因mcr(1~5)在E.coli中的流行情况研究发现,mcr-1为优势基因介导低水平耐药;mcr-4只在耐药菌株中检测到,推测它可能介导高水平耐药,黏菌素耐药菌株中携带mcr-1的E.coli中部分菌株同时产NDM-1,经多位点序列分型均为ST型,并且发现黏菌素和庆大霉素体外联合抗菌作用为协同作用,为临床合理用药提供参考。 摘要译文