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摘要： 目的观察坐骨神经慢性压榨损伤(CCI)致神经病理性痛后,大鼠背根神经节(DR G)神经元γ-氨基丁酸A受体(GABAA受体)激活电流的改变及其细胞内第二信使系统的变化。方法将SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组和CCI模型组。用穿孔膜片钳全细胞记录模式观察该3组大鼠DRG神经元GABAA受体特异性激动剂蝇蕈醇(muscimol)的激活电流,比较各组激活电流的特点;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该3组大鼠DR G神经元内IP3、cAMP和cGMP的浓度变化。结果正常对照组、假手术组和CCI模型组大鼠DR G神经元在不同浓度muscimol时激活电流均为内向电流且幅值均呈浓度依赖性,各组的EC50值差异无统计学意义。CCI模型组在不同浓度muscimol时激活电流幅值与正常对照组、假手术组相比均显著减小,正常对照组和假手术组在不同浓度muscimol时激活电流幅值差异无统计学意义。CCI模型组DRG神经元中cAMP和cGMP的浓度与正常对照组和假手术组相比均显著升高,假手术组和正常对照组之间差异无统计学意义。正常对照组、假手术组和CCI模型组大鼠DRG神经元中IP3的浓度差异无统计学意义。结论在坐骨神经慢性压榨损伤的过程中,受损伤侧DRG神经元GABAA受体激活电流显著减小,受损伤侧DRG神经元内cAMP和cGMP的浓度显著升高。GABAA受体功能的减弱导致的突触前抑制作用减弱可能是神经病理性疼痛产生的重要原因之一,并且这种功能的减弱是细胞内cAMP和cGMP浓度的改变共同参与调节的结果。
关键词: 神经病理性痛 ；背根神经节 ；γ-氨基丁酸A受体 ；穿孔膜片钳 ；第二信使
被引量
9
摘要： 阿片类药物（Opioids）主要被用于临床麻醉、急慢性痛和癌性痛的治疗。其引发的痛敏效应因与其镇痛初衷相悖,很大程度上制约了Opioids的临床使用。瑞芬太尼（Remifentanil）常用于临床复合麻醉,但多篇文献报道其镇痛作用消除快使瑞芬太尼诱发痛觉过敏（RIH）的发生率显著高于其他Opioids。因此明确RIH发生的关键性分子机理并寻找确切的治疗靶点具有重要意义。蛋白激酶Mζ（PKMζ）是非典型PKC家族成员,具有固有活性,其处于持续活化状态是保持突触效能的重要机制。有研究证实,PKMζ调节突触结构重塑和AMPA受体功能诱导并维持突触功能重塑是神经病理性痛和炎性痛中枢敏化的关键环节。Kalirin是一类兴奋性突触神经元胞质内的蛋白分子,在协调树突棘数量、突触发育、学习记忆等过程中发挥重要作用。其中,Kalirin-7与AMPA受体信号传导系统关系最为密切。最新研究发现,Kalirin-7也参与了疼痛相关的兴奋性神经突触重塑,介导痛觉信息的储存,形成并巩固痛觉敏化。故我们推测PKMζ通过Kalirin-7介导树突棘结构重塑和AMPA受体功能可能是RIH的发生机制。本研究拟建立大鼠在体切口痛—RIH模型和体外孵育瑞芬太尼模型,探讨PKMζ和Kalirin-7对RIH大鼠脊髓背角兴奋性神经突触结构和功能重塑的分子机理,从而为临床合理有效地防治瑞芬太尼引发痛觉过敏提供新的靶点。目的通过评价切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角PKMζ活性、Kalirin-7表达和AMPA受体转运水平的变化,探讨其在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的可能机制;通过鞘内注射PKMζ选择性抑制剂ZIP,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角Kalirin-7表达和AMPA受体转运的影响;通过鞘内注射kalirin-7-shRNA基因沉默kalirin-7,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛阈和AMPA受体转运的影响;通过鞘内注射GluA1选择性拮抗剂NASPM,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛阈的影响;通过鞘内注射ZIP和kalirin-7-shRNA抑制PKMζ和Kalirin-7,探讨其对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角树突棘形态学的影响;探讨PKMζ和Kalirin-7在瑞芬太尼诱发大鼠脊髓背角神经元AMPA受体微小兴奋性突触后膜电流（mEPSCs）中的作用。方法一雄性SD大鼠44只（240～260g）,随机分为4组（n=11）:C组（假手术+生理盐水组）:假手术,生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;I组（切口痛组）:建立Brennan切口痛模型;R组（Remifentanil组）:瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;IR组（Remifentanil+切口痛组）:建立Brennan切口痛模型,瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定热刺激缩足潜伏期（PWL）和机械刺激缩足阈值（PWT）;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L4-6节段,采用免疫组化和Western Blot法测定PKMζ活性、Kalirin-7表达和AMPA受体转运水平。二雄性SD大鼠66只（240～260g）,随机分为6组（n=11）:C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;C+Z3组:鞘内注射ZIP 100nmol后即刻开始静脉输注生理盐水;Z1,Z2,Z3组:分别鞘内注射ZIP 1nmol,10nmol,100nmol后即刻开始输注瑞芬太尼。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定PWL和PWT;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L4-6节段,采用Western Blot法测定Kalirin-7表达和AMPA受体转运水平。三雄性SD大鼠44只（240～260g）,随机分为4组（n=11）:C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;C+kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA（10μL;3×10～8 transducing units[TU]/mL）,2周后待转染成功,生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;IR+kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA（10μL;3×10～8 transducing units[TU]/mL）,2周后待转染成功,瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定PWL和PWT;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L4-6节段,采用Western Blot法测定PKMζ活性和AMPA受体转运水平。四雄性SD大鼠66只（240～260g）,随机分为6组（n=11）:C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;C+N3组:鞘内注射NASPM 100μg后即刻开始静脉输注生理盐水;N1,N2,N3组:分别鞘内注射NASPM 1μg,10μg,100μg后即刻开始输注瑞芬太尼。于输注前1 d、输注后2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d,每组取7只大鼠分别测定PWL和PWT;于输注后2 d,每组取4只大鼠处死并取脊髓背角L4-6节段,采用Western Blot法测定AMPA受体转运水平。五雄性SD大鼠16只（240～260g）,随机分为4组（n=4）:C组:假手术,生理盐水0.1 ml·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注;IR组:瑞芬太尼1.0μg·kg-1·min-1,1h,尾静脉输注,建立Brennan切口痛模型;IR+ZIP组:瑞芬太尼输注前鞘内注射ZIP 100nmol;IR+kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA（10μL;3×10～8transducing units[TU]/mL）,2周后待转染成功,建立Brennan切口痛模型并输注瑞芬太尼。于输注后2 d,处死全部大鼠并取脊髓背角L4-6节段,采用高尔基染色法测定树突棘的长度和数量。六取出生5-7周的SD大鼠16只,随机分为4组（n=4）:C组:取脊髓(L4-5),制备脊髓片,人工脑脊液孵育1h;R组:使用含有瑞芬太尼（4 nM）的人工脑脊液中孵育脊髓片1h;ZIP组:制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼（4 nM）和ZIP（5μM）的人工脑脊液中孵育1h;kalirin-7-shRNA组:鞘内注射kalirin-7-shRNA（10μL;3×10～8 transducing units[TU]/mL）,2周后待转染成功,制备脊髓切片,置入含瑞芬太尼（4 nM）的人工脑脊液中孵育1h。全细胞膜片钳技术评价大鼠脊髓背角神经元AMPA受体的电生理功能。结果一与C组相比,I、R和IR组的PWT和PWL降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表达增多;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加（P<0.05）。与I组相比,IR组的PWT和PWL显著降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表达增多;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加（P<0.05）。各组GluA2表达和转运水平均无显著差异（P>0.05）。二与C组比较,IR、Z1、Z2、Z3组的PWT和PWL明显降低;PKMζ磷酸化水平升高;Kalirin-7表达增多;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加（P<0.05）。与IR组相比,Z2和Z3组的PWT和PWL明显升高,PKMζ磷酸化水平降低;Kalirin-7表达下调;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运减少,且存在剂量依赖（P<0.05）。三与C组比较,IR和IR+kalirin-7-shRNA组的PWT和PWL明显降低;PKMζ磷酸化水平升高;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加（P<0.05）。与IR组相比,IR+kalirin-7-shRNA组的PWT和PWL明显升高;膜/总蛋白中GluA1的表达减少（P<0.05）;但PKMζ磷酸化水平未见显著性改变（P>0.05）。四与C组比较,IR、N1、N2、N3组的PWT和PWL明显降低;膜/总蛋白中GluA1的表达和转运增加（P<0.05）。与IR组相比,N2和N3组的PWT和PWL明显升高,膜蛋白中GluA1的表达减少,且存在剂量依赖（P<0.05）。五与C组比较,IR、IR+ZIP和IR+kalirin-7-shRNA组的树突棘的数量和长度均显著增加（P<0.05）。与IR组相比,IR+ZIP和IR+kalirin-7-shRNA组的树突棘数量和长度明显减少（P<0.05）。六与C组比较,R、ZIP和kalirin-7-shRNA组AMPA-mEPSCs的振幅和频率升高（P<0.05）。与R组比较,ZIP和kalirin-7-shRNA组振幅和频率降低（P<0.05）。结论瑞芬太尼麻醉可加重切口痛导致的术后痛觉过敏现象;切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角PKMζ活性升高、Kalirin-7合成增多及GluA1靶向突触后膜转运增加;抑制脊髓水平PKMζ对大鼠瑞芬太尼机械痛敏和热痛敏具有预防作用,其机制可能是下调脊髓背角Kalirin-7表达和AMPA受体转运;抑制脊髓水平kalirin-7对大鼠瑞芬太尼机械痛敏和热痛敏具有预防作用,其机制可能是下调脊髓背角AMPA受体靶向突触后膜转运;抑制脊髓水平GluA1靶向突触后膜转运对大鼠瑞芬太尼机械痛敏和热痛敏具有预防作用;瑞芬太尼麻醉后可引起脊髓背角PKMζ和Kalirin-7活化,从而调控树突棘结构重塑,可能是RIH发生的关键;瑞芬太尼孵育后可上调PKMζ和Kalirin-7活性,进而介导兴奋性谷氨酸能神经突触功能重塑,这可能是瑞芬太尼痛觉过敏的核心机制。
关键词: AMPA受体 ；蛋白激酶Mζ ；Kalirin-7 ；痛觉过敏 ；突触重塑 ；瑞芬太尼
被引量
1
摘要： 随着全球癌症发病率的不断增高和癌症的慢性化趋势,治疗癌性疼痛的医疗需求及相关经济负担也日益增加。骨癌痛是由原发性骨肿瘤或肿瘤继发骨转移引起的临床最为常见的癌性疼痛类型。骨癌痛及其伴随的高钙血症、病理性骨折、易感染等情况不但严重影响患者的生活质量,而且给家庭和社会带来沉重的心理、经济和财政负担。目前临床上用于治疗癌性疼痛的药物包括世界卫生组织推荐的阿片类药物等对中、重度疼痛的治疗效果欠佳,无法达到充分缓解疼痛的目的,且大都存在安全性、成瘾性和药物耐受等方面的问题及严重的不良反应和其他副作用。因此,阐明癌性疼痛的发生发展机制,探索有效的防治措施是非常紧迫的科研和医疗任务。解决这一难题具有重要的学术和医疗价值,在挽救生命、维护人类健康等方面有着重大而深远的社会意义。癌性疼痛发生发展的主要原因包括如下四个方面:1)肿瘤源性的分泌物介导的伤害性感受;2)骨质溶解导致的疼痛;3)肿瘤导致的神经损伤;4)神经系统的敏化与重构。这些改变使得外周神经末梢、初级感觉神经元的胞体和中枢突的兴奋性异常增高,脊髓以及更高级中枢信息传递的突触可塑性长期增强,从而导致外周痛觉感受器敏化和痛觉中枢敏化。但是,癌性疼痛发生发展的具体细胞和分子机制仍然很不清楚。本文聚焦于研究骨癌痛发生和发展的外周神经机制,研究内容主要包括以下三个方面:1)通过转录组测序技术阐明骨癌痛发生发展不同阶段背根节中转录组学改变的特点,并比较不同慢性痛模型(炎性痛、神经病理性痛和骨癌痛)之间转录组差异改变的异同;2)初步阐明Wnt信号家族β-catenin非依赖性信号通路在疼痛的初级传入感觉神经元(背根神经节)和外周神经末梢中的活动状况,及其和骨癌痛发生发展的相互关系;3)探索Wnt5a/Ryk信号在外周水平调控初级感觉神经元胞内钙活动及外周伤害性感受的离子通道机制。本文采用RAN-seq技术研究了骨癌痛发生发展过程中背根节的转录组改变,并探讨了以离子通道和细胞因子改变为代表的神经病理性和炎症性特征在骨癌痛发生发展不同阶段的动态变化。研究结果显示骨癌引起背根节中数千个基因的表达发生改变,这些基因主要涉及免疫过程、炎症反应和细胞因子的胞内信号转导,且这些改变与骨癌痛的发展高度同步。其中,离子通道基因的改变有助于骨癌痛早期发生,而细胞因子信号通路相关基因的改变则有助于骨癌痛的维持。本文还比较了不同疼痛模型(炎性痛、神经病理性痛和骨癌痛)之间背根节中的转录组改变的差异。研究结果显示不同模型之间共享的基因很少,表明不同形式的疼痛发病机理有所不同。这部分的研究结论强调了细胞因子相关通路及免疫与炎症因素在骨癌痛发展中扮演的重要角色,以及不同疼痛模型之间发病机制的特殊性。此外,本文进一步研究了以Wnt5a/Ryk信号为代表的Wnt非经典通路在骨癌痛发展和维持中的作用和细胞及分子机制。结果显示外周Wnt5a/Ryk信号在骨癌痛的发展中被激活;其对大鼠背根节神经元的胞内钙活动和疼痛行为有显著的调控作用;抑制Wnt5a/Ryk信号可以显著缓解骨癌引起的疼痛行为。这部分的研究结论强调了外周Wnt5a/Ryk信号在热痛觉过敏和骨癌痛的发展中的重要作用。在机制研究中,结果显示外周Wnt5a/Ryk信号调控背根节中TRPV1的表达水平和JNK2/3的磷酸化水平;Wnt5a/Ryk/JNK信号通路调控TRPV1依赖的背根节神经元胞内钙活动和外周伤害性感受。本文提出了Wnt5a/Ryk信号通过调控外周神经系统中TRPV1离子通道的表达和活性从而调控背根节神经元中的中、小细胞胞内钙活动和大鼠热痛敏行为的观点,并初步探讨了背根节中JNK的磷酸化在介导Wnt5a/Ryk信号和调节TRPV1依赖的背根节神经元胞内钙活动中的作用。这些成果为后续研究骨癌痛的外周机制提供了理论和实验基础,也为临床治疗骨癌痛提供了新的潜在分子靶标。
关键词: 骨癌痛 ；外周机制 ；背根节 ；Wnt5a ；Ryk
摘要： 目的:神经病理性痛(neuropathic pain,NP)是由躯体感觉系统的损害或疾病引起的,属于一种慢性痛,有感觉异常,痛觉过敏等症状。其发病率逐年增加,严重影响患者生活质量,且发生发展机制尚不明确。目前的治疗药物主要是阿片类药物,但是其副作用大,难以在临床实践中广泛应用。以往研究表明,褪黑素(melatonin,MLT)能够作用于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)减轻NP大鼠的痛觉过敏,且选择性MLT 2型受体(melatonin receptor 1B,MT2)激动剂通过调控脑干下行痛觉通路发挥镇痛效应,但其在脊髓水平的研究鲜少报道。本课题主要研究NP状态下,MLT是否在脊髓水平参与镇痛效应的调节及其可能的受体机制,以期未来能够研制出更好的靶向镇痛药物,为更多的疼痛患者解除痛苦,提高生活质量。 方法:1.采用雄性C57BL/6小鼠,建立坐骨神经部分损伤(spared nerve injury,SNI)模型,鞘内注射MLT以及MLT受体的激动剂和/或拮抗剂,运用von Frey纤维丝测试比较SNI组和假手术(Sham)组小鼠给药前后机械刺激缩足反应阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)的变化;采用热板实验(hot plate test)比较SNI组和Sham组小鼠给药前后缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)的变化。共分为9组:(1)SNI+Saline;(2)SNI+MLT;(3)SNI+MLT 2型受体激动剂(8MP);(4)SNI+MLT 1型和2型受体激动剂(Ramelteon);(5)SNI+Ramelteon+褪黑素2型受体拮抗剂(4PP);(6)Sham+Saline;(7)Sham+MLT;(8)Sham+8MP;(9)Sham+Ramelteon。 2.以C57BL/6小鼠、GAD67-GFP转基因小鼠和vGluT2-Cre:Ai9转基因小鼠为研究对象,采用免疫荧光染色技术明确脊髓背角不同类型神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞上MT2的表达分布情况。以SNI术后7 d C57BL/6小鼠为研究对象,采用原位杂交技术明确脊髓背角MT2阳性兴奋性神经元表达FOS蛋白的情况;以SNI术后7 d GAD67-GFP转基因鼠为研究对象,采用免疫荧光染色技术明确脊髓背角MT2阳性抑制性神经元表达FOS蛋白的情况。 3.通过膜片钳技术,比较SNI、Sham造模后8MP干预前后,脊髓背角MT2兴奋性神经元兴奋性的改变。观察的主要指标有:动作电位基强度,静息电位及兴奋性突触后电流的频率和幅度等。 4.采用行为药理学的策略观察SNI小鼠鞘内注射MLT及其受体激动剂后神经病理性痛相关焦虑样行为的变化,使用的实验方法有旷场实验(open field test,OFT)及高架十字迷宫实验(elevated plus maze,EPM)。利用旷场实验观察SNI、Sham小鼠鞘内给药后旷场相关指标(活动总路程、进入旷场中央的时间)的变化以评价该药物对焦虑样负性情绪的影响。利用高架十字迷宫实验观察SNI、Sham小鼠鞘内给药后高架相关指标(在开放臂的路程、在开放臂活动的时间占总时间的百分比)的变化以评价该药物对焦虑样负性情绪是否有改善作用。 结果:1.与Sham组相比,SNI组小鼠的PWMT显著降低(P<0.05);鞘内给予MLT、8MP和Ramelteon均能显著恢复SNI组小鼠降低的PWMT(P<0.05);SNI组小鼠同时给予Ramelteon+4PP后PWMT无显著变化(P>0.05);Sham组小鼠鞘内给予MLT、8MP及Ramelteon后PWMT无显著变化(P>0.05)。与Sham组相比,SNI组小鼠在48℃、52℃及56℃下的PWTL无显著变化(P>0.05),且MLT及其受体激动剂给药前后均无明显差异(P>0.05)。 2.免疫荧光染色结果表明,在C57BL/6小鼠脊髓背角处,神经元标记物Neu N与MT2大量共标,占比高达94.67%±1.1%;在vGluT2-Cre:Ai9转基因小鼠脊髓背角处,MT2与表达td Tomato红色荧光蛋白的vGluT2(兴奋性神经元标记物)共标率达56.83%±1.38%;在GAD67-GFP转基因小鼠脊髓背角处,MT2和表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的GAD67(抑制性神经元标记物)也存在部分共标,共标率仅有29.17%±1.85%。而MT2和小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)尚未观察到明确的共标。原位杂交结合免疫荧光染色结果表明:SNI术后7 d C57BL/6小鼠脊髓背角处的MT2阳性兴奋性神经元和FOS蛋白有共标,共标率为31.08%±1.38%;免疫荧光染色结果表明:SNI术后7 d GAD67-GFP转基因小鼠MT2阳性抑制性神经元与FOS蛋白有少量共标的情况,共标率为6.43%±0.24%。 3.膜片钳结果表明:与Sham组相比,SNI组脊髓背角兴奋性神经元的动作电位基强度明显降低(P<0.05);静息电位绝对值减小(P<0.05);并且8MP可以逆转上述变化(P<0.05)。SNI组给予8MP后MT2阳性兴奋性神经元的兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,s EPSC)的频率也降低(P<0.05),而幅度无明显变化(P>0.05)。同时,Sham组8MP给药前后脊髓背角兴奋性神经元的基强度和静息电位绝对值无明显变化(P>0.05)。 4.旷场实验结果显示:SNI术后12 w小鼠进入旷场中央的时间减少(P<0.05);高架十字迷宫实验结果显示:SNI术后12 w小鼠在开放臂的路程、在开放臂活动的时间占总时间的百分比下降(P<0.05),表现出焦虑样行为。鞘内给予MLT、8MP或Ramelteon并不能缓解焦虑样行为:给药后小鼠的活动总路程、进入旷场中央的时间、在开放臂的路程以及在开放臂活动的时间占总时间的百分比均无明显变化(均P>0.05)。 结论:1.SNI小鼠的PWMT而不是PWTL显著降低,说明小鼠出现机械痛敏而没有热痛敏。MLT及其受体激动剂显著增加SNI小鼠降低的PWMT,表现出对于机械痛的镇痛效应,且该效应是通过MT2介导的。 2.MT2广泛分布于小鼠脊髓背角神经元的胞膜上,尤其是兴奋性神经元,在抑制性神经元也有少量分布,小胶质细胞、星形胶质细胞尚未观察到MT2的分布。在神经病理性痛状态下脊髓背角MT2阳性兴奋性神经元活化,MT2阳性抑制性神经元可能被活化。 3.SNI术后小鼠脊髓背角兴奋性神经元的兴奋性增强。8MP通过激活MT2可以逆转SNI组神经元降低的基强度和静息电位绝对值,从而降低脊髓背角神经元异常增高的兴奋性。同时,8MP也减少SNI小鼠突触前兴奋性神经递质的释放,但不改变突触后受体的表达。 4.SNI术后12 w,小鼠表现出显著焦虑样行为,但鞘内给予MLT及其受体激动剂对焦虑样行为无明显改善作用。
关键词: 神经病理性痛 ；褪黑素 ；褪黑素2型受体 ；脊髓背角神经元
摘要： 慢性痛是一种常见的临床疾病,迁延不愈的疼痛会导致包括焦虑在内的多种情绪障碍,两者交互恶化进一步加重疼痛,给患者带来巨大的身心负担。尽管人们已开始关注疼痛的情绪维度,但是对大脑内痛觉情绪相关的高级中枢仍缺乏深入了解。岛叶（IC）是边缘系统的重要组成部分,是个体实现从外界刺激到内在自我情绪认知的重要节点。近年来,岛叶在痛觉传递和调控中的作用日益受到关注。基于解剖联系特征,一般认为吻侧岛叶（aIC）与痛觉的情感方面有关,而尾侧岛叶（p IC）与痛觉的感觉方面相关,但目前仍缺乏明确的行为学证据。作为内侧痛觉系统的重要组成部分,丘脑背内侧核（MD）主要投射到与情感性痛觉调制相关的皮层脑区,如内侧前额叶皮质（m PFC）、前扣带回（ACC）和aIC。其中MD-ACC神经通路已被阐明参与了痛觉相关厌恶情绪的产生,那么MD-aIC神经通路是否也参与了情感性痛觉信息的传递和调控呢?既往关于岛叶在慢性痛领域的基础研究多基于神经病理性痛模型,神经损伤引起岛叶兴奋性增强的突触可塑性改变,这些改变促进了慢性痛的维持,抑制岛叶兴奋性可缓解神经病理性痛。除了躯体痛,岛叶还接受由臂旁核和丘脑中继的一般内脏信息的传入,但是岛叶在慢性内脏痛的发展过程中的作用目前还少有报道。为解决上述问题,我们在本文中主要进行了两方面研究。第一部分研究中,我们首先综合光遗传学和化学遗传学方法明确了岛叶各亚区在痛觉信息传递与调控中的不同作用;随后利用束路示踪技术探讨了MD-aIC神经通路的解剖学特征;最后综合光遗传学和化学遗传学方法探讨了MD-aIC通路对痛觉信息传递及其负性情绪的调控作用。第二部分研究中,我们结合形态学、分子生物学、电生理学、药理学和化学遗传学方法观察了慢性胰腺炎（CP）内脏痛情况下aIC的突触可塑性改变及其分子机制,以及aIC对慢性胰腺炎内脏痛信息传递及其负性情绪的调控作用。本文分为以下四部分进行阐述:一.岛叶各亚区参与痛觉信息传递与调控的功能学研究目的:探讨岛叶各亚区在痛觉信息传递与调控中的不同作用。方法:本部分采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）的方法建立神经病理性痛模型,利用von Frey法测定足底机械痛阈（PWT）,利用旷场或高架十字迷宫实验检测动物的焦虑行为。（1）利用免疫组化技术观察SNI小鼠IC内FOS的表达变化;（2）向C57小鼠双侧aIC注入r AAV2/9-h Syn-h M3D（Gq）-m Citrine或r AAV2/9-h Syn-h M4D（Gi）-m Citrine,腹腔注射CNO非特异性地兴奋和抑制aIC,观察对正常小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（3）向C57小鼠双侧p IC内注入r AAV2/9-h Syn-h M3D（Gq）-m Citrine或r AAV2/9-h Syn-h M4D（Gi）-m Citrine,腹腔注射CNO非特异性地兴奋和抑制p IC,观察对正常和SNI模型小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（4）向C57小鼠双侧aIC注入r AAV2/9-Ca MKIIa-Ch R2-m Cherry,蓝光激活aIC锥体神经元,观察对正常小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（5）向C57小鼠双侧p IC注入r AAV2/9-Ca MKIIa-Ch R2-m Cherry,蓝光激活p IC锥体神经元,观察对正常小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（6）向GAD2-cre小鼠双侧aIC内注入r AAV-h Syn-DIO-h M3D（Gq）-m Cherry和r AAV-h Syn-DIO-h M4D（Gi）-m Cherry,腹腔注射CNO特异性兴奋和抑制aIC的GABA能神经元,观察对正常和SNI模型小鼠机械痛阈和探索样行为的影响。结果:（1）与sham组相比,SNI模型小鼠IC各部FOS阳性神经元数量均增加。（2）非特异性兴奋aIC不仅降低正常小鼠的PWT,还能减少动物在旷场中央区的活动时间,但对运动总路程没有影响;非特异性抑制aIC对正常小鼠的PWT和旷场行为没有影响。（3）非特异性兴奋p IC神经元降低正常小鼠的PWT,但对其旷场行为没有影响;对SNI小鼠的PWT和旷场行为也没有影响。（4）非特异性抑制p IC对正常小鼠的PWT和旷场行为没有影响;可缓解SNI小鼠的机械痛敏,但对旷场行为无影响。（5）激活aIC锥体神经元降低正常小鼠的PWT,减少动物在高架十字迷宫开放臂的活动时间,而对运动总路程没有影响。（6）激活p IC锥体神经元降低正常小鼠的PWT,但对其高架十字迷宫行为没有影响。（7）抑制aIC内GABA神经元可在正常小鼠上诱发机械痛敏;特异性激活aIC内GABA神经元可缓解SNI小鼠的机械痛敏和焦虑情绪。结论:IC各亚区均参与了神经病理性痛信息的传递或调控。激活aIC可在正常小鼠中引起机械痛敏和焦虑,而激活p IC仅在正常小鼠中诱发机械痛敏而非焦虑情绪。岛叶的促痛促焦虑作用是其锥体神经元介导的,而GABA神经元起到相反的作用,提示前馈抑制机制参与了岛叶内痛觉信息的处理。二.丘脑背内侧核-吻侧岛叶神经通路的形态学研究目的:探讨MD-aIC神经通路的神经解剖学特征。方法:（1）利用RV跨单突触逆行示踪系统对aIC和pIC内锥体神经元和GABA能神经元的单极传入神经元进行全脑筛查;（2）利用逆行示踪病毒证实MD内VGlu T2神经元投射到aIC;（3）利用顺行示踪病毒证实MD-aIC神经通路的存在;（4）利用AAV跨单突触顺行示踪系统证实MD向aIC内谷氨酸能神经元和GABA能神经元发出直接投射。结果:（1）我们将RV跨单突触逆行示踪病毒注入Ca MKIIa-cre和GAD2-cre小鼠的aIC,观察到aIC内锥体神经元和GABA能神经元的单极输入神经元在全脑的分布和数量没有明显区别。端脑中,同侧aIC、aIC附近皮质区、梨状皮质（Pir）、杏仁核（AMY）有大量投射神经元。丘脑中,MD、腹后内侧核（VPM）、丘脑后核（Po）和束旁核（PF）有大量投射神经元;腹后外侧核（VPL）、腹内侧核（VM）、丘脑下核（Sub）和丘脑腹后核小细胞部（VPPC）有中等量神经元;其他中线和板内核群有少量神经元。脑干中,逆标神经元可见于腹侧被盖区（VTA）、黑质致密部（SNC）、中缝背核（DR）和臂旁核（PBN）。（2）我们将RV跨单突触逆行示踪系统分别注入Ca MKIIa-cre和GAD2-cre小鼠的p IC,观察到p IC内锥体神经元和GABA能神经元的单极输入神经元在全脑的分布和数量没有明显区别。p IC的单突触传入神经元在端脑和脑干的分布与aIC相似,但在丘脑中有明显差异:VPPC和VPM和有大量神经元,VPL、Po和PF内有中等量神经元,MD几乎无神经元。（3）我们将逆行示踪病毒retro AAV2-h Syn-DIO-Ch R2-EYFP注入VGlu T2-cre小鼠的aIC内,在aIC全层均观察到大量EYFP标记的神经终末,在MD内侧部可看到EYFP标记的胞体。（4）我们将顺行示踪病毒r AAV2/9-Ca MKIIa-m Cherry注入C57小鼠的MD,可在同侧aIC无颗粒皮质观察到大量纤维终末。（5）我们向VGlu T2-cre和GAD2-cre小鼠MD内注入顺行跨突触示踪病毒sc AAV2/1-h Syn-FLEX-Flpo,向同侧aIC注入r AAV2/9-h EF1a-f DIO-EYFP,在两种小鼠同侧aIC无颗粒皮质区均可观察到GFP标记的神经元。结论:岛叶同一亚区内锥体神经元和GABA能中间神经元的全脑单极输入网络没有明显区别,而不同亚区的全脑单极输入网络存在明显差异,主要体现在丘脑:MD主要向aIC进行投射,而几乎不向p IC投射。MD谷氨酸能神经元向aIC的锥体神经元和GABA能神经元均存在直接突触联系。三.MD-aIC神经通路参与痛觉信息传递与调控的功能学研究目的:探讨MD-aIC神经通路在情感性痛觉信息传递和调控中的作用。方法:（1）向正常C57小鼠MD注入rAAV2/9-hSyn-hM3D（Gq）-m Citrine和r AAV2/9-h Syn-h M4D（Gi）-m Citrine,腹腔注射CNO兴奋和抑制MD,观察对其机械痛阈和旷场行为的影响;（2）向正常C57小鼠MD注入光遗传学病毒r AAV2/9-Ca MKIIa-Ch R2-m Cherry,在同侧aIC内置入光纤,蓝光刺激激活MD-aIC神经通路,观察对其机械痛阈和高架十字迷宫行为的影响;（3）将逆行示踪病毒retro AAV2/2-CMV-b Globin-cre注入正常C57小鼠的aIC,在MD内注入cre依赖的化学遗传学病毒rAAV-h Syn-DIO-h M3D（Gq）-m Cherry以兴奋向aIC投射的MD神经元,观察对正常小鼠机械痛阈和旷场行为的影响;（4）将RV单突触逆行示踪系统中的辅助病毒和RV-En VA-Ch R2-ΔG-ds Red分别注入建立SNI模型的GAD2-cre小鼠的aIC中,MD上方植入光纤以激活向aIC内GABA神经元投射的MD神经元,观察对SNI小鼠机械痛敏和旷场行为的影响。结果:（1）激活MD可降低正常小鼠的PWT,减少动物在旷场中的中央区活动时间,但对其运动总路程没有影响;抑制MD对正常小鼠的PWT和旷场行为没有影响,但可缓解SNI小鼠的机械痛敏。（2）利用光遗传学激活MD-aIC神经通路可降低正常小鼠的PWT,减少动物在高架十字迷宫开放臂的活动时间,但对其运动总路程无影响。（3）利用化学遗传学激活向aIC投射的MD神经元可降低正常小鼠的PWT,减少动物在旷场中央区的活动时间,但对其运动总路程没有影响。（4）特异性激活向aIC内GABA能神经元投射的MD神经元可缓解SNI小鼠的机械痛敏和焦虑情绪,但对其运动总路程没有影响。结论:激活MD降低正常小鼠的足底机械痛阈,诱发焦虑样情绪的产生,这与激活MD-aIC神经通路的效应是一致的,MD-aIC通路可能介导了情感性痛觉信息的传递。在该通路中,aIC内GABA能神经元通过前馈抑制对aIC内痛觉信息传递起到抑制作用。四.吻侧岛叶对慢性胰腺炎内脏痛信息传递的调控作用目的:探讨aIC对慢性胰腺炎内脏痛信息传递的调控作用。方法:（1）利用三硝基苯磺酸（TNBS）胰管注射法建立慢性胰腺炎大鼠模型,随后进行血清学指标与行为学检测,验证模型的建立是否成功;（2）利用免疫组化观察CP大鼠IC内FOS的表达变化,利用免疫印迹观察aIC内VGlu T1,NR2B和Glu R1的表达变化;（3）利用多通道场电位记录和全细胞膜片钳记录技术对CP大鼠aIC的兴奋性突触传递指标,突触可塑性指标和神经元兴奋性指标进行检测;（4）向双侧aIC注射AMPAR拮抗剂CNQX和NMDAR拮抗剂AP-5,观察对CP大鼠腹壁机械痛敏的影响;（5）向双侧aIC注入r AAV2/9-m Ca MKIIa-h M4D（Gi）-m Cherry,腹腔注射CNO特异性抑制aIC锥体神经元兴奋性,观察对CP大鼠腹壁机械痛敏和焦虑情绪的影响。结果:（1）TNBS组大鼠胰腺组织出现了腺泡萎缩和炎性细胞浸润等病理学改变,血清淀粉酶、脂肪酶和总胆红素明显增加;行为学检测表明TNBS组大鼠腹壁机械痛阈值明显降低,在旷场中的运动总路程和中央区运动路程减少。（2）与sham组相比,CP大鼠IC各部FOS表达上调。（3）场电位记录结果表明,与sham组相比,CP大鼠aIC的输入（刺激强度）-输出（激活通道的数目）曲线向左移动,TBS刺激后突触后场电位增加的斜率和幅度明显低于sham组。（4）通过全细胞膜片钳记录方式观察到,与sham组相比,CP大鼠aIC内Ⅱ-Ⅲ层锥体神经元的输入（注射电流强度）-输出（放电数目）曲线明显向左移动,rheobase current减少,静息膜电位上升;aIC的Ⅱ/Ⅲ层神经元s EPSC的频率和幅度均明显增强,双脉冲易化比值减小;AMPAR和NMDAR介导的EPSC的输入（刺激强度）-输出（EPSC幅值）曲线明显左移;AMPAR介导的EPSC的整流指数(I-40m V/I+50m V)明显增加,
关键词: 岛叶 ；丘脑背内侧核 ；神经病理性痛 ；慢性胰腺炎内脏痛 ；突触可塑性 ；负性情绪 ；光遗传学 ；化学遗传学 ；抑制性中间神经元
摘要： 研究背景 骨癌痛（Bone cancer pain,BCP）是原发性或者转移性骨肿瘤引起的慢性疼痛。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年新增1000万癌症患者，约三分之一的恶性肿瘤会发生骨转移。绝大部分骨肿瘤患者会出现不同程度的慢性疼痛。由于目前对骨癌痛机制的认识不足以及临床现有治疗措施的局限性，约50%的骨癌患者疼痛未得到有效控制。长期慢性疼痛给患者及其家人带来巨大痛苦，严重影响患者生活质量，甚至使患者丧失生活自理能力。所以，对骨癌痛机制的深入研究，以期为癌痛治疗提供有效的治疗措施，是目前亟待解决的重大问题。 基于对多种骨癌痛动物模型的研究，目前对骨癌痛的独特机制有了初步了解，认为骨癌痛与其它慢性疼痛不同，涉及多种炎症介质、细胞因子、多种受体和离子通道，既有炎性痛，又有神经病理性疼痛的成分。要破解骨癌痛发生这个错综复杂的分子网络，沿用传统的研究方法，从单一基因、或单个因素入手是无法解释和阐明这些现象的本质及其相互之间的因果关系并取得突破性进展的。 利用基因组学为平台，应用基因芯片分析技术，可以从细胞、组织、器官和生物体整体水平上研究结构和功能各异的各种分子及其相互关系，能够定量描述和预测生物功能、表型和行为，能客观真实地反映机体的整体变化。因此，本实验拟应用寡核苷酸微阵列芯片及生物信息学技术，研究骨癌痛模型与神经病理性痛模型、炎性痛模型大鼠脊髓水平基因表达谱差异，筛选出―脊髓组织骨癌痛特异性基因‖，进而利用计算生物学方法，采用统计学中聚类分析，探讨骨癌痛发生发展过程中脊髓组织分子水平的改变与疼痛行为学的关系，发掘在骨癌痛发病机制中起关键作用的特异基因表型。 中枢敏化是指脊髓和脊髓以上部位对疼痛信号传导的放大过程,是目前解释神经病理性疼痛，炎性痛等多种慢性疼痛出现痛觉过敏和痛觉超敏的主要理论。临床资料和基础实验研究提示，脊髓水平的中枢敏化是骨癌痛产生和维持的重要机制。在脊髓水平,背角是疼痛的调制主要部位，也伤害性信息的初级整合中枢。外周伤害性信息经初级传入纤维传入背角后，在此中继、整合,再由投射神经元向上位脑结构传递，最终产生痛觉。因此，目前对疼痛形成中脊髓敏化的研究也多集中在背角部位。 突触传导的可塑性改变是疼痛产生过程中脊髓敏化的重要机制之一。突触可塑性是指突触效能在某些因素的作用下出现不同程度的增强或减弱的特性。突触的可塑性改变包括两方面，一个是对现有突触结构的修饰，改变突触递质的释放而增强或减弱突触的传导性能，另一个是长时程突触可塑性调节机制，是通过增加或减少突触的数量来调节突触的传递效能。有研究报道，突触重塑导致脊髓敏化是骨癌痛发生的重要因素，但突触重塑的方式及其具体机制都不清楚。由于骨癌痛是一个长期慢性进展的过程，突触重塑过程也将是一个长期的持续变化，因此我们假设骨癌痛脊髓敏化是通过增加兴奋性突触数量来实现突触传递增强的。但是，新的突触的形成需要神经元轴突或树突延伸以及有导航作用的分子引导新生突起精确对接才能完成，而这个过程的分子机制也不清楚。 Slit homolog2protein(Slit2)是一种神经轴突的导向分子，在神经系统发育过程有重要作用。能够刺激神经元轴突生长和延伸以及侧支的形成[28-30]，调控神经元迁移，并且通过对生长锥的导向而指导突触的形成和功能性神经网络的建立。Roundabouthomolog1(Robo1)属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族成员，是slit2的受体，通过与slit2结合对神经元和生长锥产生排斥作用，参与调控发育中的中枢神经轴突定向延伸，促进轴突生长和调控神经纤维束化、定位以及突触的形成。研究显示Slit2和Robo1可能在病理状态下参与神经系统结构性重塑过程。因此我们假设，在骨癌痛形成过程中，Slit2和Robo1结合后，发挥了分子导向作用，促进轴突分支靶向性迁移而引导突触形成。为了证实Slit2和Robo1结合导致脊髓中新突触的形成而诱发骨癌痛脊髓敏化这一假说，本实验拟建立大鼠骨癌痛模型，利用RNA干扰技术等分子生物学技术，论证Slit2和Robo1在骨癌痛形成中的作用以及对神经元轴突延伸和突触形成的影响。以期从一个全新的角度揭示骨癌痛发生的机制，为骨癌痛是治疗寻找新的靶点 研究方法与结果 1.骨癌痛大鼠脊髓特异性基因表达谱的筛选 方法选择雌性wistar大鼠，随机分为4组：正常组，骨癌痛组，神经病理性疼痛组和炎性痛组。分别制作乳腺癌细胞胫骨种植的骨癌痛模型，L5脊神经结扎的神经病理性疼痛模型和弗氏完全佐剂（CFA）足底注射的炎性痛模型。模型建立后，进行痛阈测定。在疼痛发展的不同时期分别取各组大鼠脊髓腰L4-6进行基因芯片检测。采用统计分析筛选表达差异的基因谱，结合聚类分析和分子注释功能数据库分析特异基因之间的相互作用，模拟疼痛的分子路线图。 结果基因芯片检测结果提示在炎性痛早期，有2245个基因表达上调，其中包括479个基因仅在早期表达上调，515个基因持续上调至疼痛进展期，有1093个基因则在整个炎性痛发生发展过程中是持续上调。在疼痛的进展期共有2089个基因表达上调，其中263个基因仅在这个时间段上调，另外有118个基因从疼痛进展期出现上调，并持续至后期。在炎性痛的后期有1679个基因表达上调，其中有310个基因仅在后期出现表达上调。 神经病理性疼痛大鼠脊髓组织基因芯片检测结果提示在疼痛早期，有1570个基因表达上调，其中包括227个基因仅在早期表达上调，301个基因上调持续至疼痛进展期，有884个基因则在整个神经病理性疼痛发生发展过程中持续上调。在疼痛的进展期共有1560个基因表达上调，其中265个基因仅在进展期上调，另外有110个基因从疼痛进展期开始出现持续表达上调。在神经病理性疼痛的维持期有1476个基因表达上调，其中有342个基因在疼痛维持期才出现表达上调。 骨癌痛基因芯片的结果提示在骨癌痛早期，有1383个基因表达上调，其中包括381个基因仅在早期表达上调，155个基因上调持续至疼痛进展期，有691个基因则是在骨癌痛发生发展过程中是持续上调。在疼痛的进展期共有1740个基因表达上调，其中414个基因仅在这个时间段上调达，另外有480个基因从疼痛进展期开始出现持续表达上调。在骨癌痛的维持期则有1908个基因表达上调，其中有581个基因在疼痛的维持期出现表达上调 综合分析三种大鼠疼痛模型基因芯片分析的结果显示，有352个基因仅在炎性痛发生发展中持续表达上调，196个基因仅在神经病理性疼痛的进展过程中持续表达上调，而骨癌痛中有216个基因持续表达上调。有344个基因在三种慢性疼痛进展中均持续表达上调。 2. Slit2/Robo1促进兴奋性突触形成诱发骨癌痛 方法选择雌性wistar大鼠，随机分为5组：假手术组(Sham)，骨癌痛组(BCP)，对照病毒组(BCP+NC-LV)，Slit2干扰病毒组（BCP+siSlit2-LV）和Robo1干扰病毒组（BCP+siRobo1-LV）。建立骨癌痛模型并进行脊髓内病毒注射。模型建立成功后进行痛阈测定。3W后处死动物进行取出，用HE染色观察肿瘤细胞侵犯胫骨情况。用免疫组化多重标记法结合RT-PCR和Western blot检测大鼠脊髓腰膨大部分Slit2，Robo1，Rhoa的表达；用免疫共沉淀检测Slit2和Robo1之间的直接作用；用电镜检测脊髓背角突触形成情况；用免疫组化双标结合RT-PCR和Western blot检测背角兴奋性突触的形成及相关标记物表达情况。 结果HE染色结果显示乳腺癌细胞接种的大鼠胫骨骨髓腔中有大量的癌细胞，癌细胞向骨质扩散，突破骨髓腔，随着病程延长，癌细胞骨质侵犯进行性加重，后期可出现病理性骨折。机械痛阈测定结果显示，癌细胞接种后第9天，大鼠接种癌细胞侧的后肢出现痛阈下降，随病程进展疼痛进行性加剧，癌细胞接种对侧后肢痛阈没有改变。siSlit2-LV明显缓解大鼠骨癌痛的症状，而Robo1则显著加剧疼痛。免疫组化结果提示Slit2，Robo1和Rhoa均广泛共表达在脊髓背角的神经元上。定量实验分析显示在骨癌痛大鼠脊髓背角中Slit2表达上调，Robo1和Rhoa表达下调；RNA干扰慢病毒成功的下调大鼠脊髓背角中Slit2和Robo1的表达。而且siSlit2-LV下调Slit2表达的同时导致Robo1和Rhoa的表达上调，siRobo1-LV显著下调Robo1和Rhoa的表达，但不影响Slit2的表达。电镜检测突触数量和免疫组化双标检测突触标记蛋白表达均提示骨癌痛大鼠脊髓背角兴奋性突触数量明显增多，siSlit2-LV可减少骨癌痛大鼠脊髓背角兴奋性突触的形成，而Robo1则明显增加兴奋性突触的形成。RT-PCR和Westernblot对突触标记蛋白的定量研究结果与免于组化一致。 3. Slit2/Robo1促进轴突延伸诱导兴奋性突触形成 方法原代培养大鼠皮质神经元。将细胞随机分为4组：正常组（Normal）,对照病毒组(NC-LV)，Slit2干扰病毒组（siSlit2-LV）和Robo1干扰病毒组（siRobo1-LV）。在细胞培养液中加入慢病毒转染5天后，用荧光显微镜观察病毒转染情况，用免疫组化多重标记法结合RT-PCR和Western blot检测神经元上Slit2，Robo1，Rhoa的表达；利用免疫组化观察神经元形态变化；用免疫组化双标结合RT-PCR和Western blot检测神经元兴奋性突触形成及相关蛋白的表达情况。 结果免疫组化结果提示Slit2，Robo1和Rhoa共表神经元上。定量检测结果显示干扰慢病毒成功的下调神经元中Slit2和Robo1的表达。siSlit2-LV下调Slit2表达的同时导致Robo1和Rhoa的表达上调，siRobo1-LV显著下调Robo1和Rhoa的表达，但不影响Slit2的表达。siSlit2-LV明显减少神经元轴突的长度和分支数量，而Robo1则显著增加轴突长度和促进轴突分支形成。siSlit2-LV可减少神经元兴奋性突触的形成，而Robo1则明显增加兴奋性突触的形成。 4.统计学处理 统计学分析采用SPSS18.0统计软件，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析（AnalysisofVariance,ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。 研究总结 一、主要研究结果 1.利用基因芯片分析了骨癌痛，神经病理性痛疼和炎性痛发生发展过程中相关的脊髓基因表达谱。并筛选出与骨癌痛形成有关的脊髓特异性基因表达谱。利用分子功能关联分析，模拟与骨癌痛形成分子网络图。 2.骨癌痛大鼠脊髓中Slit2表达上调，Robo1和Rhoa表达下调；RNAi慢病毒下调Slit2表达则明显缓解骨癌痛，而下调Robo1表达则显著加剧骨癌痛。 3.骨癌痛大鼠脊髓中兴奋性突触数量明显增多；RNAi慢病毒下调Slit2表达则明显减少突触数量，而下调Robo1表达则显著进一步增加突触数量。 4. RNAi慢病毒下调Slit2表达则减少原代培养的神经元轴突长度和分支数量，而下调Robo1表达则显著增加突长度和分支数量。 5. RNAi慢病毒下调原代培养神经元中Slit2表达则明显减少兴奋性突触形成，而下调Robo1表达则显著增加突触形成。 二、研究结论 1.骨癌痛和炎性痛以及神经病理性疼痛三者的发生机制既有共同之处，又有各自的特性。其调控过程不仅是一个复杂的分子网络式整合过程，同时也是一个动态进展的过程，在不同时期有不同基因调控网络。 2.骨癌痛大鼠脊髓中Slit2表达上调，通过与Robo1结合，抑制Robo1和Rhoa的表达，参与骨癌痛的形成。 3. Slit2通过与Robo1直接结合，抑制Robo1和Rhoa的表达，促进大鼠脊髓背角兴奋性突触的形成而导致骨癌痛发生。 4. Slit2通过与Robo1结合，抑制Robo1和Rhoa的表达，通过促进神经元轴突的延伸和分支形成，以及Slit2介导的轴突导向作用诱导兴奋性突触的形成。 三、创新之处 1.本研究首次分析了分别与骨癌痛、炎性痛和神经病理性疼痛发生发展密切相关的特有的基因表达谱以及慢性疼痛形成共同的基因表达谱。
关键词: 骨癌痛 ；基因芯片 ；Slit2 ；Robo1 ；脊髓 ；突触
被引量
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摘要： 研究背景创伤是人类死亡的主要原因之一,随着交通等所致的各种意外和灾害发生而呈上升的趋势。创伤性颅脑损伤(TBI)作创伤中的一种,是神经外科最常见的急症之一,创伤后会造成严重的病理后果,特别是弥漫性脑损伤的致残率及死亡率较高。虽然创伤性颅脑损伤的总体死亡率由30年前的50%降至目前的30%左右,但是存活的患者中,轻度患者10%会遗留永久残疾,而中度和重度患者可达到66%和100%。近10年来,我国有条件的神经科开始重视创伤性颅脑损伤的基础研究和临床防治应用研究,但是如何使脑创伤患者得到妥善的治疗,使其造成的后果减少到最低的程度,损伤后的神经系统得到修复,一直是神经医学工作者面临的严峻挑战。研究表明,脑创伤对神经细胞的损害不仅发生在损伤的瞬间,而且在损伤后数天内继发损害更加严重,可引起一系列继发的神经细胞生化反应。它会加重致残程度和增加死亡率。目前我们已经认识到,脑损伤后将发生一系列细胞、分子事件,这一系列事件综合作用的结果将导致神经细胞死亡,进而造成颅脑结构和功能损伤。因此,研究脑创伤后继发性神经细胞死亡的发生机理,无疑对脑创伤后神经细胞功能的恢复有重要的意义,可为脑创伤后神经保护剂的应用提供理论依据对脑创伤的救治提供新的治疗前景。脑损伤后继发性脑损伤的主要机制包括：机械损伤导致的局部组织细胞缺氧、兴奋性氨基酸毒性作用、自由基损伤、神经细胞内Ca2+超载等,受累的神经细胞包括正常神经细胞和原发性损伤后变性的神经细胞。颅脑损伤后能够诱发机体产生的内源性损伤因子主要包括：乙酰胆碱、Ca2+、儿茶酚胺、兴奋性氨基酸、5-羟色胺、组织胺、血小板激活因子等。Cae+是其中最受重视的一个因子。目前认为颅脑损伤后脑细胞内钙超载对继发性脑损伤的发生和发展起决定性的作用,也是多种情况卜细胞死亡的最后共同通路。继发性脑损伤以脑水肿为例,脑水肿作为继发于多种颅脑疾病的最终病理现象,其发病机制是血脑屏障受损、脑缺氧、颅内静脉压增高等因素导致脑组织中水分的运输和平衡失调,水电解质在脑细胞膜内外的分布失衡而引起水分在脑细胞内或细胞外的病理性蓄积,导致脑体积增加和颅内压增高综合征,已有研究证实血脑屏障的通透性增加和细胞膜钙通道开放、钙超载在创伤性脑水肿的发生发展中起重要作用。在病理情况下,如脑外伤、脑缺血时,Ca2+早期大量入侵,细胞内Ca2+浓度急骤增加200倍,激活膜磷脂酶A2和磷脂酶C,兴奋多价不饱和脂肪酸,导致花生四烯酸(AA)代谢瀑布,钙泵活性减退,线粒体ATP能量产生不足,促发突触膜末梢兴合性氨基酸递质大量释放,激活突触后膜NMDA受体操纵的Ca2+通道,使Ca2+浓度进一步持续升高,导致神经元水肿死亡。同时Ca2+内流增加导致生成更多的自由基,导致更多溶酶体溶解和酶的释放,加重磷酸盐和蛋白酶对膜的破坏,最终导致脑细胞完全损坏。细胞内Ca2+超载可通过多种途径导致并加重脑水肿。钙离子作为神经元胞内的重要信使,参与神经递质的合成与释放、神经兴奋性的维持、突触的可塑性及酶活动等多种细胞功能的调节,也参与缺血、缺氧及中毒性细胞死亡等病理过程。钙离子的信使作用是通过胞浆内外浓度差的改变来实现。在静息状态下,细胞内外存在着10,000倍左右的浓度差。细胞依靠六种机制来维持其胞内外Ca2+稳态。(1)细胞膜对Ca2+有着极低的通透性,细胞膜作为屏障,组织细胞外Ca2+顺离子梯度渗入细胞内。(2)细胞膜上的钙泵偶联ATP水解功能,将细胞内Ca2+主动泵出细胞外。(3)细胞膜的钠、钙交换系统,在正常情况下钠离子顺离子浓度梯度进入细胞内时,Ca2+则逆浓度差由细胞内到细胞外,病理情况下则运转方向相反。(4)线粒体和内质网对Ca2+的隔离作用,线粒体把氧化代谢产生的氢离子排出线粒体,同时将胞浆中的Ca2+转移至线粒体内,内质网钙泵则主动将细胞浆中的Ca2+摄入内质网中。(5)胞浆中一些蛋白质与阴离子和Ca2+结合。(6)胞浆膜内侧的磷脂极性端也具有和Ca2+结合的能力。当细胞受到刺激兴奋时,胞浆中Ca2+浓度由于细胞膜上Ca2+通道开放、细胞膜及胞浆中结合钙的释放、线粒体和内质网释放Ca2+,可使胞浆中的Ca2-浓度上升,形成钙超载。临床和实验研究已证实,在脑损伤后神经细胞内存在钙超载。有学者采用45Ca免疫自显影技术观察实验性颅脑损伤动物不同时程脑组织钙含量变化发现脑挫裂伤动物脑组织钙含量在伤后2小时即显著增高,在24小时左右达高峰,持续约48小时,以后逐渐下降。黄勇华等通过脑内注射胶原酶建立大鼠脑出血模型,用电镜细胞化学技术,观察到神经细胞及毛细血管的超微结构有肿胀表现,细胞内可见多量Ca2+颗粒。用钙拮抗剂治疗后,细胞病理变化显著减轻,钙分布明显减少。贺晓生等在脑弥漫性轴索损伤(DAI)模型中发现：受损髓鞘内有大量细小钙颗粒,髓鞘损害程度与钙颗粒数量呈正相关：伤后晚期轴浆内可见粗大钙颗粒。神经细胞胞体及血管内皮细胞空泡化,也有钙颗粒沉着,内皮细胞官腔面出现微绒毛。认为DAI中轴索存在Ca2+超载,是导致DAI发生发展的重要因素。周国胜等发现Mg2+通过抑制兴奋性氨基酸的作用,减少Ca2+内流,具有明显的脑保护作用。故在一定程度上,细胞内Ca2+变化是细胞死亡的最后的共同通路,是神经细胞继发性损伤的主要原因之一。脑外伤后引起神经元细胞浆内钙超载的具体原因目前仍不十分清楚。现在普遍认为脑外伤后细胞外Ca2+大量流入神经元内,是造成神经细胞钙超载的主要原因。细胞受刺激后大部分细胞外Ca2+主要经电压依赖性通道(VDCC)和受体操纵性通道(ROCC)进入胞质。除此以外,脑外伤后继发的脑缺血、缺氧、ATP减少、钙泵失活,线粒体、内质网滞留Ca2+作用降低,酸中毒时氢离子浓度增高,氢离子、钙离子竞争统一结合位点,导致结合钙释放增多(此时Ca2+的释出对酸中毒有缓和作用),都将导致胞质内Ca2+浓度继续升高。在胞质内,Ca2+结合到作为效应物的专一性蛋白质钙调蛋白(CaM)上,然后CaM便能与专门的酶结合,从而导致微管解聚,神经元骨架破坏；突触前膜、突触后膜蛋白质过度磷酸化；神经元内钙对细胞膜钾离子通透性调节功能丧失；神经元内钙含量升高能明星抑制细胞能量代谢。近年来有关钙离子代谢的相关研究已有很多,其中国外学者在对非洲蟾蜍及斑马鱼胚胎的研究中提到的W nt5a/Frizzled-2信号途径,亦称为非经典Wnt/Ca2+途径,与细胞内钙的关系引起了我们的注意。相关研究显示,Wnt是一类分泌性糖蛋白,得名于Wg(wingless)与Int,是胞外信号分子的一个大的组成家族,参与调控多种发育过程,如细胞分化、细胞极性、细胞迁移和细胞增殖。Wnt蛋白与Frizzled受体家族中相应受体结合激活不同的胞质内信号途径,Wnt信号途径主要包括经典Wnt信号途径(β-连环蛋白的信号途径)和非经典Wnt信号途径(Ca2+信号途径)。Wnts,包括Wntl、Wnt3和Wnt8都能激活经典Wnt途径。与之相反,Wnt5a调节的非经典Wnt途径触发细胞内Ca2+释放。随着对Wnt/Ca2+信号途径的深入研究,下游信号逐渐被发现,Kuhl和Sheldahl证实了Wnt5a和Frizzled-2诱导的Ca2+增加途径能激活两种已知的Ca2+敏感酶,Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅠI(CaMKII)和蛋白激酶C(PKC)。与之相反,激活Wnt/β-连环蛋白途径的Wnt8和Frizzled-1并不激活CaMKⅡ和PKC。已有研究者提出将CaMKⅡ活性检测(活化后为p-CaMKII)作为非经典Wnt信号途径标志物的观点。研究目的一些研究提出Wnt5a是通过激活Frizzled-2受体,导致Ca2+动员而发挥作用的。对斑马鱼和非洲蟾蜍的研究,为非经典Wnt/Ca2+途径提供了第一手的证据。在单个细胞斑马鱼胚胎中注射Wnt5a mRNA时发现胚层上钙变化频率增大两倍,这是第一次发现钙在Wnt信号途径中具有第二信使的作用。Frizzle-2是Wnt5a配体的细胞表面受体,在斑马鱼中异位表达大鼠Frizzled-2能使细胞内钙释放增加,研究提示Wnt5a经由Frizzled-2受体刺激钙离子释放。目前研究集中在阐述wnt和Frizzled在低等动物,比如非洲蟾蜍和斑马鱼细胞或组织中如何结合以及结合后下游信号途径的表达,但Wnt5a/Frizzled-2信号途径在哺乳动物神经细胞中的是否存在,如果存在那么如何激活?激活后是否也可以引起细胞或组织中的Ca2+变化却知之甚少。已知在正常生理情况下,细胞内钙是神经系统中重要的第二信使,调节不同的细胞功能,是维持细胞的正常状态的重要因素,是细胞之间及其与外界进行信息交流的重要介质。但在某些病理的情况下,比如创伤性颅脑损伤(TBI),细胞损伤后这种稳定状态就被打破,导致细胞内的钙离子积聚直至钙超载发生,最终导致细胞的死亡。综合以上资料,钙离子超载是TBI的主要机制之一,Wnt5a/Frizzled-2信号途径又与细胞内的钙离子变化有关,那么两者之间有没有什么联系呢?Wnt5a/Frizzled-2信号途径在创伤性脑损伤这样特定病理环境中有没有可能被激活,在脑损伤机制中又扮演着什么样的角色呢?方法和结果本研究从以上几点假设为出发,经体外和体内两部分研究,最终证明了Wnt5a/Frizzled-2信号途径在哺乳动物的神经细胞中同样存在,且在脑损伤后能够激活并参与到了损伤后神经细胞钙离子超载的过程中。第一部分实验中我们首先培养了大鼠海马星形胶质细胞,而后使用QRT-PCR和Western-blot分别检测了大鼠正常星形胶质细胞中Wnt5a和Frizzled-2的基因及蛋白质的表达,以及正常细胞中钙离子的含量,结果肯定了我们的假设和猜测；接下来为了证明此途径在某种条件下被激活后,对细胞内的钙离子含量的影响,我们利用全基因合成的frizzled-2质粒,结合Lipo2000将其转染至正常的星形胶质细胞内,发现Wnt5a和Frizzled-2无论在基因还是蛋白水平上都发生了明显的增高,并且检测到了此途径激活特异性标志蛋白p-caMKⅡ的表达,同时细胞内的钙离子含量随之也发生了显著的升高,结果具统计学意义。这说明细胞内的钙离子水平的变化与此途径的激活有一定的相关性。但,是这条途径在某种条件下激活后导致了细胞内的钙离子水平增高么?针对这一问题,我们使用Stealth RNAi靶向沉默frizzlea-2基因,抑制Frizzled-2蛋白质的表达,最终抑制Wnt5a/Frizzled-2信号途径的活性,然后观察细胞内的钙离子水平是否发生变化。结果再次证实了我们的假设,Wnt5a与Frizzled-2基因及蛋白的表达明显降低,与之呼应的是途径激活特异性标志蛋白p-caMK Ⅱ的表达和细胞内的钙离子含量也明显的降低了。这说明,Wnt5a/Frizzled-2信号途径在某种条件下激活后,能够引起大鼠星形胶质细胞中的钙离子含量增高。第二部分实验采用QRT-PCR和Western-blot两种方法分别从基因和蛋白质水平检测Wnt5a和Frizzled-2在不同处理条件下的大鼠海马组织中的表达情况。实验结果证实与体外实验相符,Wnt5a/Frizzled-2信号途径同样存在于正常大鼠的海马组织中。我们发现,随着损伤后Frizzled-2的表达增高,Wnt5a以及细胞内的钙离子水平与正常组织的检测值相比也相应地增高了数倍。通过对此途径激活的特异性标志蛋白钙依赖性蛋白激酶Ⅱ(caMKⅡ活化形式p-caMKⅡ)的表达检测发现,在脑损伤后,伤侧海马组织中p-caMKⅡ的表达量显著增高,这说明Wnt5a/Frizzled-2信号途径在脑损伤后激活了,并且与细胞中钙离子的增幅相关。为了进一步证明Wnt5a/Frizzled-2信号途径的激活参与了损伤后海马细胞的钙离子超载过程,我们针对frizzlea-2设计了特异性的抑制剂StealthRNAi,利用体内转染试剂将Stealth RNAi通过立体定向注射的方法靶向沉默海马组织中frizzled-2基因,观察大鼠在脑损伤后Wnt5a和Frizzled-2的基因及蛋白在海马组织中的表达情况。
关键词: Wnt-5a/Frizzled-2途径 ；钙离子超载 ；创伤性脑损伤 ；全基因合成 ；siRNA
被引量
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摘要： 背景和目的：神经病理性疼痛是慢性难治性疼痛的常见类型，主要由中枢或外周神经系统损伤或疾病所引起，表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。中枢敏化是神经病理性疼痛产生的基础，前扣带回皮层（anterior cingulate cortex，ACC）作为与慢性疼痛相关的关键脑区，其可塑性变化是中枢敏化的重要体现。细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）与其调节亚基Cdh1是细胞内泛素-蛋白酶体系统中重要的E3泛素连接酶，最近研究显示其在谷氨酸敏感性、突触功能及神经元存活的调控中起着重要作用。但其是否参与神经病理性疼痛 AC C可塑性机制，尚不清楚。 本研究拟观察神经病理性疼痛大鼠ACC区APC-Cdh1及其下游底物的表达变化规律。通过构建表达Cdh1基因的重组慢病毒载体，上调该脑区APC-Cdh1活性。分别从行为学、形态学及分子水平观察慢病毒干预对ACC谷氨酸受体密度、突触形态功能及神经元存活的影响和机制，探讨APC-Cdh1在神经病理性疼痛ACC可塑性变化中的作用。 方法与结果： 1.神经病理性疼痛大鼠ACC区APC-Cdh1表达变化与痛觉超敏的关系 方法：实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC区APC-Cdh1的表达变化）：雄性SD大鼠48只，体重180-220g，随机分为2组（n=24）。1)假手术组（Sham组）：仅暴露坐骨神经及其分支;2)神经病理性疼痛模型组（SNI组）：参照Decosterd等方法，选择性损伤坐骨神经其下分支中的胫神经及腓总神经，保留腓肠神经，建立大鼠坐骨神经保留性损伤（spared nerve injury，SNI）模型。通过观察模型大鼠痛觉行为学变化，免疫组化检测大鼠 ACC疼痛相关蛋白c-Fos的表达，证实模型构建成功。模型建立后3、7、14 d，采用免疫组化及Western blot法检测两组大鼠ACC区APC-Cdh1、下游底物Skp2、SnoN及其上游调节激酶Cdk5/p35的表达。 实验二（ACC立体定位注射Cdh1过表达慢病毒对神经病理性疼痛大鼠痛阈的影响）：参照大鼠脑立体定位图谱（Paxinoset al.,2005），确定ACC坐标，分别将Cdh1过表达慢病毒（Lenti-Cdh1）及对照慢病毒（Lenti-control）通过立体定向注射入大鼠ACC（10μl，滴度2×108TU/ml）。慢病毒感染后3d，快速断头取脑，避光制作冰冻切片，荧光显微镜下观察ACC绿色荧光蛋白（GFP）的表达;分离ACC，提取总蛋白，Western blot法检测Cdh1外源性融合蛋白的表达，评价各型慢病毒在体感染情况。18只雄性SD大鼠，随机分为1)Sham+ saline组：假手术后7d，ACC立体定位注射0.9％氯化钠溶液（n=6）;2)SNI+ Lenti-control组：SNI模型建立后7d，ACC立体定位注射Lenti-control（n=6）;3)SNI+ Lenti-Cdh1组：SNI模型建立后7d，ACC立体定位注射Lenti-Cdh1（n=6）。模型建立前至慢病毒感染后14d采用von Frey细丝法测定三组大鼠机械痛阈的变化。 结果：术后1、3、7、14d，SNI组50%机械性缩爪阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）显著下降，与Sham组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化检测显示，SNI组术后3、7、14d，ACC疼痛相关蛋白c-Fos表达明显增加，从组织学上进一步证明了SNI模型构建的成功。免疫组化、Western blot检测发现，SNI大鼠术后3、7、14d，ACC区Cdh1总蛋白及APC主要成分APC2表达减少，且部分Cdh1出核转入细胞浆表达;Cd h1下游底物Skp2、S noN表达升高，上游负性调节激酶Cdk5/p35表达明显增加，与Sham组比较，统计学差异显著（P<0.05）。Cdh1过表达慢病毒Lenti-Cdh1 ACC内立体定位注射，上调APC-Cdh1活性可部分缓解大鼠神经病理性疼痛痛觉超敏，与对照慢病毒Lenti-control相比，SNI+Lenti-Cdh1组慢病毒注射后7d50%PWMT上升，并持续至慢病毒注射后14d，统计学差异显著（P<0.05）。 2.APC-Cdh1活性调节对神经病理性痛大鼠ACC神经元突触可塑性的影响及机制方法：实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC突触可塑性变化）：成年雄性SD大鼠54只，随机分为2组。1)Sham组：仅暴露坐骨神经及其分支（n=27）;2)SNI组：结扎并切断左侧胫神经及腓总神经，保留腓肠神经（n=27）。术后3、7、14d，紫外比色法测定大鼠ACC内兴奋性氨基酸谷氨酸的含量，免疫荧光法检测突触功能蛋白的表达变化，并分别提取ACC总蛋白及膜蛋白，Western blot法分析检测不同时间点突触后各型谷氨酸受体的表达情况。 实验二（APC-Cdh1与神经病理性疼痛大鼠ACC神经元突触可塑性变化的关系）：30只成年雄性SD大鼠，随机分为Sham组（n=15）和SNI组（n=15），参照Decosterd等方法，选择性损伤坐骨神经分支，建立大鼠神经病理性疼痛SNI模型。分别于模型建立后3、7d，采用免疫荧光和Western blot法检测SNI模型大鼠ACC区Cdh1相关蛋白EphA4的表达特点。并于术后第14d，利用免疫共沉淀技术，观察Cdh1相关蛋白EphA4与APC-Cdh1及各型谷氨酸受体之间的相互作用。 实验三（慢病毒过表达Cdh1蛋白对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元突触可塑性的影响）：成年雄性SD大鼠24只，建立SNI神经病理性疼痛模型，随机分为Sham组（n=6）、SNI组（n=6）、SNI+Lenti-control组（n=6）和SNI+ Lenti-Cdh1组（n=6）。SNI+Lenti-control组及SNI+Lenti-Cdh1组于模型建立后7d分别将Lenti-control及Lenti-Cdh1慢病毒通过立体定向注射入大鼠ACC（10μl，滴度2×108TU/ml）。慢病毒注射后14d，透射电镜观察大鼠ACC突触形态结构的变化。给予慢病毒后3、7、14d，Western blot检测ACC突触功能蛋白PSD95、Cdh1相关蛋白EphA4及谷氨酸受体GluR1的水平，评价APC-Cdh1活性调节对ACC突触可塑性的影响。 结果：术后3、7、14d，SNI组大鼠ACC内谷氨酸含量，突触功能蛋白突触素Syn1、PSD95及NMDA受体NR2B亚型的表达，与Sham组相比明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）;GluR1-AMPA受体总表达量，两组间无明显差异（P>0.05），但其胞膜表达量显著增加，与Sham组相比，差异显著（P<0.05）。Western blot和免疫荧光染色显示，SNI术后3、7d，与Sham组相比，SNI组ACC区APC-Cdh1相关蛋白EphA4表达降低（P<0.05）。免疫共沉淀检测发现，EphA4与Cdh1、APC主要成分APC2及谷氨酸受体GluR1间存在相互作用。与Sham组相比，SNI组大鼠ACC线粒体肿胀、突触后致密物增厚，突触间隙变窄。而ACC内立体定位注射Cdh1过表达慢病毒Lenti-Cdh1可逆转上述SNI导致的突触结构的改变。SNI+Lenti-Cdh1组慢病毒注射后7、14d，ACC内EphA4表达升高，PSD95及GluR1表达明显减少，与SNI+Lenti-contro l组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。 3.ACC神经元存活与神经病理性疼痛大鼠痛觉超敏的关系 方法： 实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC神经元凋亡及存活的变化）：SD雄性大鼠24只，体重180-220g，随机分为Sham组（n=12）及SNI组（n=12）。术后3、10d采用神经元特异性核蛋白NeuN标记神经元，通过免疫荧光和Western blot法检测ACC神经元的变化，并利用TUNEL技术及active caspase-3（Casp-3a）/NeuN免疫荧光双标染色观察模型建立后10 d大鼠ACC神经元的凋亡情况。 实验二（凋亡抑制剂TUDCA对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元存活及痛阈的影响）：36只SD雄性大鼠，随机分为3组（n=12）。1)Sham组：仅暴露左侧坐骨神经及其分支;2) SNI+saline组：SNI术前3d至术后隔日腹腔注射0.9%氯化钠溶液;3)SNI+ TUDCA组：SNI术前3d至术后隔日腹腔注射TUDCA（300mg/kg）。采用von Frey细丝法测定3组大鼠50% PWMT，评价痛觉行为学变化。术后10d，NeuN标记神经元，谷氨酸脱羧酶65/67（GAD65/67）标记GABA能抑制性神经元，免疫荧光及Western blot法检测ACC神经元的变化，并利用TUNEL染色观察神经元的凋亡情况。 结果：SNI组大鼠术后10dACC神经元数量明显减少，与Sham组相比，差异显著（P<0.05），且残存神经元排列松散，TUNEL染色可见大量凋亡细胞。Casp-3a/NeuN荧光双标检测显示，SNI术后10d，大鼠ACC内表达Casp-3a的神经元明显增多。术后4d，SNI+TUDCA组大鼠较SNI+saline组，50% PWMT明显升高，持续至术后10d，差异具有统计学意义（P<0.05）。与SNI+saline相比，SNI+TUDCA组ACC神经元数量显著增多（P<0.05），且TUNEL阳性凋亡细胞明显减少。免疫荧光、Western blot结果显示，SNI术后大鼠ACC内GAD65及GAD67蛋白表达降低;而TUDCA可抑制上述SNI相关的GAD蛋白表达下调（P<0.05）。 4.APC-Cdh1活性调节对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元存活影响的初步研究方法：实验一（神经病理性疼痛大鼠ACC凋亡相关底物Cyclin B1的表达变化）：成年雄性SD大鼠24只，随机分为Sham（n=12）、SNI（n=12）两组。Sham及SNI神经病理性疼痛模型建立后10d，分别采用免疫荧光及Western blot法检测两组大鼠ACC内APC-Cdh1凋亡相关底物Cyclin B1的表达。 实验二（慢病毒过表达Cdh1蛋白对神经病理性疼痛大鼠ACC神经元凋亡的影响）：36只成年雄性SD大鼠，180-220g，随机分为Sham组（n=12）、SNI+Lenti-control组（n=12）及SNI+Lenti-Cdh1组（n=12）。后两组大鼠SNI模型建立前3d，ACC分别立体定位注射Lenti-control及Leni-Cdh1慢病毒载体。SNI术后10d，TUNEL染色观察ACC神经元凋亡情况，Western blot检测Casp-3a及APC-Cdh1凋亡相关底物Cyclin B1的表达。 结果：免疫荧光、Western blot法检测发现，模型建立后10d，SNI组ACC内APC-Cdh1凋亡相关底物Cyclin B1表达与Sham组相比，明显增多，差异具有统计学意义（P<0.05）。而Cdh1过表达慢病毒Lenti-Cdh1注射入ACC，上调其内APC-Cdh1活性，可降低凋亡相关底物Cyclin B1的表达;抑制SNI引起的ACC神经元凋亡，与对照慢病毒组相比，SNI+Lenti-Cdh1组大鼠ACC内TUNEL阳性凋亡细胞数量明显减少，Casp-3a蛋白表达显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。 5.统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，SPSS18.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。 结论： 1.神经病理性疼痛大鼠ACC内APC-Cdh1活性下调，通过Cdh1过表达慢病毒上调其活性，可以部分缓解大鼠神经病理性疼痛。 2.APC-Cdh1可通过与EphA4相互作用泛素化降解突触后AMPA受体亚基GluR1，
关键词: 细胞周期末期促进复合物 ；神经病理性疼痛 ；前扣带回皮层 ；突触功能 ；可塑性机制 ；痛觉超敏
摘要： 研究背景疼痛是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验,疼痛带有强烈的情感成分,疼痛与负性情绪之间相互影响,压力可以抑制或加重疼痛,焦虑抑郁状态常常与更强烈的疼痛感受相关,尤其在慢性疼痛中,慢性痛在原发损伤消失后依然存在,然而,疼痛、恐惧、焦虑抑郁、认知和行为的复合机制还是个未解之谜。功能磁共振成像的结果表明没有慢性痛病史的个体与有疼痛恐惧躲避行为慢性腰痛患者杏仁核的激活有区别,同时两者杏仁核与前扣带回联系也不同。杏仁核还参与条件性恐惧行为的情感处理过程,而且处理疼痛记忆和痛动机。杏仁核参与了神经病理性痛疼痛信息的处理和神经可塑性过程,对杏仁核在疼痛过程中的作用研究可以让我们更好的认识疼痛机制。相关研究表明,内源性阿片系统参与疼痛调节的应激反应和情绪反应,阿片u受体的激活与痛感觉和情感评级的降低有关。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递,是主要的突触后谷氨酸兴奋受体,其GluAl亚型参与调节抑郁样行为反应。突触素(Synaptophysin, p38)几乎存在于所有神经终末的突触囊泡上,与神经递质的释放、突触可塑性变化密切相关。细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated Kinase, ERK 1/2)是Mitogen-activated protein kinase (MAPK)家族中重要成员,可响应神经递质、肽类激素、生长激素等等释放,介导(mediate)激酶RSK2(ribosomal S6 kinases,ERK的下游激酶)的活动,通过环腺苷酸反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein, CREB)的磷酸化,进而启动多种功能蛋白。这个过程广泛存在于在突触长时程可塑性改变和长时记忆的形成中,相关研究表明ERK-CREB通路不仅参与痛的感觉成分还参与痛情绪成分。慢性疼痛临床上常常伴随着负性情绪和认知行为异常,而不良情绪常常对慢性疼痛的产生和维持起到促进作用。慢性疼痛的治疗常常采取手术和药物的疗法,而其治疗效果不是很令人满意而且常常伴随比较多的副作用。针刺在中国有着几千年的漫长发展历程,临床研究报道针刺可以调节慢性疼痛及其伴随负性情绪。实验研究在慢性痛动物模型上观察到了针刺对慢性疼痛痛感觉方面有着较好作用,而针刺对痛情绪方面的作用机制研究由于需要尽可能模拟临床症状的动物模型和检测方法等的限制报道较少。我们之前在慢性痛结合负性情绪大鼠模型上的研究表明针刺可以改善痛的感觉成分及情绪成分的行为学反应,其机制有可能与降低CCI大鼠杏仁核内N-methyl-D-aspartate (NMDA)受体亚单位NR2A、NR2B、促皮质激素受体CRF-2R基因表达,上调神经痛负性情绪大鼠杏仁核CRF-2R、NR2B;γ氨基丁酸受体GABAaR、GABAcR基因表达相关,而其具体机制复杂,有待进一步研究。因此本实验在左侧坐骨神经结扎造成慢性痛,条件位置厌恶诱发负性情绪的大鼠模型上采用行为学观察电针“足三里-阳陵泉”对动物痛行为的感觉成分和情感成分的影响,并同时采用免疫荧光技术、免疫印迹技术观察杏仁核介导的痛感觉和情绪成分相关蛋白谷氨酸AMPA受体亚型GluA1、阿片μ受体(μ-opioid receptor)、突触素(Synaptophysin)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorelated-extracellular signal-regulated kinase, p-ERK1/2)、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorelated-cAMP response element binding protein, p-CREB)变化的分子生物学机制,并采用μ-阿片受体拮抗剂D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thra-mide (CTOP, a selective mu opioid receptor antagonist)、GluAl拮抗剂N-[3-[[4-[(3-Aminopropyl)amino] butyl]amino]propyl]-1-naphthaleneacetamide trihydrochloride (NASPM)杏仁核内微量注射等验证法,分析电针缓解慢性痛不同方面的机制,为针灸临床治疗慢性痛提供理论依据。材料与方法第一部分实验：Wistar雄性大鼠(230-260g)分为4组：正常组,CCI+NA(负性情绪negative affection)模型组,CCI+NA+电针(EA)组,CCI+NA+麻醉电针(AEA)组,每组8只。正常组除外,其余各组大鼠均实施左侧坐骨神经结扎术造成慢性痛,继而条件控制箱足底电刺激造成负性情绪模型。电针组和麻醉电针组电针刺激双侧“足三里”、“阳陵泉”,1mA,2/15Hz,每天1次,每次30分钟,共7天。电针干预后,即刻将放入条件控制箱。痛感觉维度采用痛觉测定仪测定大鼠双侧足底热辐射痛阈值,并取其健侧减患侧差值(PWLD),痛情绪方面测定大鼠在条件控制箱(CPA)停留时间。分别采用免疫荧光技术(6只鼠/组)、免疫印迹技术(6只鼠/组)观察杏仁核介导的痛感觉和情绪成分相关GluA1, μ-opioid receptor, Synaptophysin, p-ERK1/2, p-CREB蛋白的表达。第二部分实验：本实验使用30只雄性Wistar大鼠,随机分成5组：正常组,NA(负性情绪negative affection)模型组,NA+电针(EA)+生理盐水(NS)组,NA+EA+CTOP组,NA+EA+NASPM组,每组6只(数据完整为每组4只)。正常组除外,其余各组均行左侧坐骨神经结扎术结合条件控制箱3天足底电刺激造成慢性痛负性情绪模型。除正常组和模型组外,余下3组在立体定位仪上实施双边杏仁核埋管(Paxinos和watson大鼠脑图谱定位杏仁核(P2.5mm, L4.5mm, H7.7mm),双边分别微量注射生理盐水、阿片u受体拮抗剂(CTOP) (27μg/μL,0.25μL/次)GluAl拮抗剂(NASPM) (10μg/μL,0.25μL/次)。每次注射之后电针刺激双侧“足三里-阳陵泉”1mA,2/15Hz,每天1次,每次30分钟,共5天。电针结束后,测定大鼠双侧足底热辐射痛阈值,并取其健侧减患侧差值(PWLD),及疼痛负性情绪维度即大鼠在条件控制箱(CPA)停留时间。结果1、电针对慢性痛大鼠痛感觉和情绪成分行为反应的影响与正常组比较,模型组的PWLD显著增加(P<0.001),条件控制箱箱停留时间显著减少(P<0.001),与模型组相比,EA组或AEA组电针7天后PWLD均显著降低(P<0.05),EA组在条件控制箱停留时间显著增加(P<0.05), AEA组条件控制箱停留时间没有明显变化(P>0.05),电针干预后,动物痛阈增加同时NA减弱,麻醉电针则抑制了电针对NA的作用。2、电针对杏仁核内痛感觉和情绪成分相关兴奋性递质受体、抑制性递质受体、细胞内蛋白激酶表达变化的影响与正常组相比较,模型组杏仁核内MOR蛋白表达量显著增加(P<0.05), GluAl, Synaptophysin, p-ERK2, p-CREB的蛋白表达显著减少(均P<0.05)。电针7天后,EA组这5个蛋白,AEA组MOR, p-ERK2及p-CREB蛋白表达均明显上调(P<0.001、P<0.01、P<0.05),GluAl, Synaptophysin表达无明显变化(P>0.05)；与EA组比,AEA组MOR, p-ERK2, p-CREB的表达无明显差异(P>0.05), GluAl, Synaptophysin表达明显降低(P<0.05)。2、杏仁核内注射阿片u受体及GluAl拮抗剂验证阿片μ受体及GluAl在针刺对痛感觉和痛情绪中的作用造模后,PWLD值显著增加(P<0.001),电针2天各组未见明显变化(P>0.05),电针5天后,生理盐水组和GluAl拮抗剂组PWLD明显下降(P<0.01),而MOR拮抗剂CTOP组下降无显著性意义(P>0.05)。即说明杏仁核内注射盐水和谷氨酸GluAl受体阻断不影响电针的镇痛效应,而阻断MOR后,电针镇痛效应明显减弱。造模后,神经痛负性情绪大鼠在条件控制箱内停留时间显著缩短(P<0.001),电针2天、第5天,盐水组和MOR拮抗剂CTOP组的停留时间显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001),而GluAl拮抗剂NASPM组与模型组比较未见显著变化(P>0.05).说明杏仁核内注射生理盐水和MOR拮抗剂后,电针改善模型大鼠的负性情绪的效应仍然存在,而注射GluAl拮抗剂后,电针的上述效应消失。小结电针和麻醉电针均能改善神经痛负性情绪大鼠痛感觉成分,而只有电针改善了神经痛负性情绪大鼠痛情绪方面,麻醉下电针抑制了动物的情绪活动,也明显减弱了电针改善该模型大鼠负性情绪的效应。杏仁核内阿片μ受体,GluAl, Synaptophysin, ERK/CREB可能参与了这一过程,杏仁核介导的电针对痛感觉成分的作用可能与上调阿片μ受体有关,电针对痛情绪成分的作用可能与上调GluAl, Synaptophysin的表达相关。ERK2/CREB信号通路参与痛的感觉和情绪方面机制有待进一步探讨。p-ERKl各组没有明显差异。
关键词: 电针 ；慢性痛 ；负性情绪 ；杏仁核 ；阿片μ受体 ；GluAl ；ERK/CREB
被引量
5
摘要： 1、背景
拉莫三嗪(Lamotrigine, LTG)是一种新型的抗癫痫药,化学名为3,5-二氨基-6-(2,3-二氯苯基)-1,2,4-三嗪。它是一种苯基三嗪类化合物,主要作用于电压依赖性钠通道,对反复放电有抑制作用,也可能作用于谷氨酸相关的神经递质。拉莫三嗪能稳定突触前膜,抑制谷氨酸和天冬氨酸的释放。主要用于治疗癫痫、三叉神经痛等。口服吸收迅速,1.5-4h达到高峰。约55%与蛋白结合,几乎全部在肝脏代谢成葡萄糖醛酸苷,8%以原形从尿中排泄。
近年来,拉莫三嗪及其衍生物的神经保护作用而备受关注。Pisani等利用鸡胚视网膜,通过测定含有拉莫三嗪的培养液中乳酸脱氢酶的含量及组织学方法判断视网膜细胞受损程度,证明了拉莫三嗪对兴奋性氨基酸所致的神经损害具有保护作用。Galabresi等则利用大鼠皮质纹状体的脑片,将其放在装有培养液的记录槽中,通过调节氧和葡萄糖的输入量,产生缺血氧性损伤。在加入拉莫三嗪后,通过记录细胞内和细胞外的电生理改变,证实了拉莫三嗪通过抑制谷氨酸盐的释放发挥神经保护作用。除此之外,在一些体内的动物实验中,研究者相继发现拉莫三嗪对癫痫持续状态、对缺血性脑损害、对神经变性疾病均有保护作用。
拉莫三嗪的这种神经保护作用发生的机制主要是作用于电压依赖钠通道,抑制突触前膜谷氨酸的释放。学者Bacher等制作了短暂性脑缺血的模型,在缺血前1.5h分别静脉注射20mg/kg和50mg/kg拉莫三嗪,用微透析和高效液相色谱法测定谷氨酸的浓度,结果显示在海马区谷氨酸的浓度显著降低,提示拉莫三嗪的这种神经保护是作用于电压依赖钠通道,抑制了突触前膜谷氨酸的释放。我们已知,电压门控性钙通道(VGCCs)与神经元的兴奋性及传导性均有关系,并且第二信使系统受钙离子浓度的调节。VGCCs还可激活一系列酶的活性,对细胞产生毒性损害。有学者运用细胞外电记录技术,检测到放置在20mmol/L四乙胺溶液10min后的大鼠扁桃体脑片的兴奋性突触后电位比放置在正常培养液的大鼠小脑扁桃体脑片的电位要强235±12%,但同时也发现如果脑片事先经浓度为50mmol/L的拉莫三嗪预处理之后可使这种电位较正常组降低53.8±3.9%,由此提示拉莫三嗪可作用于VGCCs发挥神经保护作用。此外对离体脑皮层突触小体的研究中,发现拉莫三嗪通过减少突触前膜钙离子内流,以浓度依赖的方式,抑制由4-AP诱导的皮质纹状体谷氨酸的释放,还能减少因膜去极化产生的细胞内游离钙离子浓度升高；也有研究发现,其还能对N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)导致的细胞损害产生保护作用,这也提示拉莫三嗪可能具有更复杂的作用机制。
原发性三叉神经痛(Trigeminal neuralgia, TN)是一种单侧撕裂性或电击性阵痛的慢性疼痛综合症,历时数秒至数分钟,间歇期无症状。该病很难自愈,对患者及家属的生活造成心理和身体上极大的痛苦。TN的病因和发病机制目前尚不明确,长期存在中枢病变及周围神经病变等多种假说。中枢病变学说认为TN是属于一种感觉性癫痫发作,其发放部位可能在三叉神经脊束核内,也有人认为病变发生在脑干内,还有人认为下丘脑的损害也是引起TN的中枢性原因；周围病变学说认为病变在周围部,在三叉神经感觉根、半月神经节或其周围支及末梢。在周围病变学说中血管神经压迫学说是重要因素之一,除以上所述的中枢病变学说和周围病变学说之外,还有变态反应学说、病毒感染学说等。
由于TN的病因及发病机制尚不明确,临床上虽说治疗此病可选择的方法很多,但至今仍缺乏一种特效的治疗方法。TN作为一种慢性疼痛综合征,首选药物治疗,并且在短期内药物治疗对大部分的患者会起到有益的效果。我们支持TN是中枢或周围神经的一种癫痫样放电,有的学者通过神经电生理的研究,证实三叉神经脊束核,特别是尾侧亚核,确实存在着对伤害性刺激起反应的痛觉细胞,当三叉神经周围部的病理性冲动不断地长期地传入三叉神经脊束核内的某一部位,形成癫痫样放电兴奋灶,当受到外界刺激,可突然发作,诱发伤害感受器的爆发性冲动,产生疼痛,所以临床上常采用抗癫痫药物治疗。有报道指出,拉莫三嗪对TN和中枢痛有效。拉莫三嗪作为一种新型的抗癫痫药,国外学者Zakrzewska等采用双盲安慰剂对照交叉实验证实了其治疗TN有效。南方医科大学珠江医院口腔科自1997年开始应用拉莫三嗪治疗TN。
卡马西平(Carbamazepine, CBZ),又称酰胺咪嗪、卡马咪嗪、氨基甲酰环氧乙三烯,或称痛惊宁(Tegratol)、得理多,是一种抗癫痫药。通常服用卡马西平后吸收70%,6h后达血浆最高浓度,半衰期为13-17h,经肝脏代谢后排除。1962年国外学者Blom首次报道运用抗癫痫药卡马西平治疗TN并取得良好的临床疗效。半个世纪以来,卡马西平治疗TN的这种疗效被许多对照实验所证实。目前,拉莫三嗪与卡马西平治疗TN的临床对比资料尚不够多,而卡马西平作为治疗TN的经典药物,以卡马西平作为阳性对比,来评价拉莫三嗪治疗TN的临床疗效及其安全性更有说服力。
综合上述的研究背景,本实验以卡马西平作对照,评价拉莫三嗪治疗TN的疗效及其安全性。
2、目的
原发性三叉神经痛是一种临床上的常见疾病,本文通过以卡马西平为对比,评价拉莫三嗪治疗TN的临床疗效,以指导临床医师合理规范用药,为治疗TN提供更多的临床选择,为我们进一步了解和研究TN的发病机制和治疗方法提供临床资料。
3、资料和方法
3.1病例资料所有病例来自于1998年1月至2012年7月在南方医科大学珠江医院口腔科就诊的原发性三叉神经痛患者。参照国际头痛学会分类委员会制定的诊断标准,主要包括以下几个方面：(1)面部或额部的阵发性疼痛,持续几秒钟至2分钟；(2)疼痛至少应具备下述4个或4个以上的特征：①疼痛位于三叉神经一支或多支分布区；②疼痛性质呈阵发性、尖锐、浅表、刀刺样或烧灼样；③疼痛程度剧烈；④存在扳机点或饮食、说话、洗脸、刷牙等诱发疼痛发作；⑤存在疼痛间歇期。(3)无神经功能缺失体征。所有收集到的病例均符合TN的诊断且未进行其它治疗,神经系统临床查检无阳性体征,CT或MRI检查未发现颅内病变；血尿常规和肝肾功能检查无明显异常。按照以上诊断标准和病例排除标准我们一共收集到病例40例,其中男性14例,女性26例；平均年龄为：56.2±5.7岁。
3.2治疗方法40例患者按照就诊先后顺序编号,根据随机数字方法分成两组。已向患者或其监护人履行知情告知义务,并取得同意。拉莫三嗪组采取拉莫三嗪片治疗,起始剂量为25mg/d,每隔3-7d增加25mg,维持剂量为300-400mg/d。对照组采取卡马西平片治疗,起始剂量为100mg/d,逐渐加量,直到疼痛缓解,以最小有效剂量维持治疗,一般剂量为600-1200mg/d。两组疗程均为2个月。
3.3疗效评定由同一研究者按照视觉模拟评分法(VAS),记录每位患者治疗前及治疗后1个月、2个月疼痛分值。以前后VAS值的差除以治疗前VAS值的百分比作为评价指标,结果分为：①未缓解：比值<25%；②轻度缓解：25%≤比值<50%；③中度缓解：50%≤比值<75%；④明显缓解：75%≤比值<100%；⑤完全缓解：比值=100%。总有效率=(完全缓解+明显缓解+中度缓解)病例数／总病例数×100%。
4、统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,结果用均数±标准差(x±s)表示,均数的比较采用t检验,计数资料率的比较采用x2检验,当P<0.05时即认为差异具有统计学意义。
5、结果
5.1两组疼痛程度变化
治疗前,两组患者的VAS分值无显著差异。治疗后1个月、2个月,两组患者的VAS分值与治疗前相比均下降,差异具有统计学意义(P<0.01),但两组组间对比VAS分值无明显差异(P>0.05)。
5.2两组总体有效性评价
在治疗2个月后,卡马西平组总有效率为80%,拉莫三嗪组的总有效率为65%,在总体有效率上,两组对比没有统计学意义(P>0.05),但拉莫三嗪组在有效病例中的完全缓解率54.8%优于卡马西平组的18.8%,差异具有统计学意义(P<0.05)。
5.3两组安全性的比较
在整个研究过程中,没有患者因不能耐受而退出试验,也没有患者出现严重的不良反应。拉莫三嗪组有2例报告有不良反应：皮疹、头晕和恶心；卡马西平组有3例报告有不良反应：眩晕、恶心、嗜睡。未做特殊处理,减药后不良反应减轻或消失。
6、结论
本实验运用拉莫三嗪治疗TN并通过与卡马西平的对比,发现患者在治疗前后的疼痛程度存在显著差异,且并发症较少,证明拉莫三嗪对于TN的治疗是有效并且安全的。
关键词: 三叉神经痛 ；拉莫三嗪 ；卡马西平 ；疗效
被引量
5
摘要： [背景]臂丛神经根性撕脱伤(BPA)是一种伴随神经病理性痛(NPP)高发且损伤部位特殊的外伤性周围神经损伤。由于损伤因素会同时累及脊髓背根神经节(DRG)及相应节段损伤侧的脊髓背角(SDH),因此BPA是周围神经系统和中枢神经系统同时受累的交界性损伤。BPA致伤因素各异,损伤类型繁杂,累及范围广泛,受累及的神经根组合类型多样,因此明确诊断BPA并且制定合理有效的治疗方案对临床医生来说并非易事。更加棘手的是,BPA患者同时伴发NPP等严重并发症的发生率高达90%,然而目前可供临床医生选择的治疗和缓解NPP症状的方法非常有限并且疗效并不理想。近年基础研究结果显示,Wnt信号通路在神经系统发育过程中可发挥多种作用,其下游信号分子活化与突触的形成及结构和功能可塑性的调节密切相关,而突触可塑性改变又与NPP的发生息息相关。那么,Wnt信号通路是否也参与了BPA诱发NPP的过程；如果参与,其作用机制是什么现在仍不得而知。因此,本课题的研究目的希望能够发现Wnt信号通路是否参与了BPA诱发NPP的过程；如果参与,希望能够进一步揭示Wnt信号通路在BPA诱发NPP过程中的调控机制,为临床治疗BPA合并NPP患者提供基础理论支持,进一步探索出治疗和缓解此类患者疼痛症状的新思路或治疗切入点。[目的]1.建立臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛(BPA-NPP)大鼠模型,并对其进行行为学和分子生物学鉴定。2.检测Wnt信号通路相关分子在BPA-NPP模型组大鼠SDH中的表达和定位,进一步观察该通路对神经胶质细胞活化以及神经元突触可塑性的影响。3.探究抑制Wnt信号通路对BPA-NPP大鼠神经病理性痛行为学和SDH突触可塑性的影响。4.观察Wnt信号通路分子在BPA-NPP大鼠背根神经节(DRG)神经元中的表达,进一步探究其对钠离子信号通路Nav1.8表达的调控机制。[方法]1、撕脱大鼠臂丛神经C8和T1神经根,建立臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛(BPA-NPP)大鼠模型。利用von Frey纤维丝检测大鼠BPA损伤后机械性缩足阈值的改变；运用Hargreaves热辐射法检测大鼠BPA损伤后热缩足潜伏期的改变；运用丙酮喷雾实验进行大鼠BPA损伤后冷痛敏评分；根据旷场实验进行大鼠自主活动能力评价。Western blotting检测大鼠SDH和DRG中pERK的表达,免疫组织荧光三重标记观察c-Fos的表达。2、RT-PCR、Western blotting、免疫荧光双重标记检测BPA-NPP大鼠模型SDH和DRG中Wnt信号通路相关分子(Wnt-3a、Frizzled 4和β-catenin)的表达以及定位。Western blotting检测突触可塑性相关分子的磷酸化水平、Nav1.8、CCL2以及CCR2表达的变化。3、BPA-NPP大鼠鞘内置管给予不同剂量Wnt信号抑制剂IWP-2或氯硝柳胺(Nsm),再观察对大鼠行为学、SDH和DRG区域星形胶质细胞活化情况以及突触可塑性相关分子表达的影响。4、免疫组织荧光化学法检测神经胶质细胞活化标记分子(GFAP)与脊髓浅层突触形成相关蛋白(PSD-95和突触素)的表达。RT-PCR检测炎症因子的mRNA水平。全细胞膜片钳技术记录大鼠SDH浅层神经元微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)以及Nav1.8电流的变化。[结果]1、成功建立BPA-NPP大鼠模型。BPA损伤术后,大鼠术侧和对侧机械性缩足阈值降低,热缩足潜伏期(TWL)无明显变化,冷痛敏评分升高,自主活动能力无显著变化,且这种NPP的行为学变化至少可以持续至BPA术后28天。BPA-NPP组大鼠SDH和DRG中损伤相关分子pERK表达上调,SDH神经元活化标志分子c-Fos的表达增加。2、BPA-NPP大鼠SDH中Wnt-3a及其受体Frizzled 4和下游效应分子β-catenin表达上调,Wnt-3a主要表达于SDH星形胶质细胞和神经元中,而Frizzled 4和β-catenin则集中表达于神经元中。同时BPA损伤引起突触可塑性相关分子(CaMKⅡ,谷氨酸能受体亚型NR2B、CREB、PKC等)表达升高。3、BPA-NPP大鼠鞘内置管给予Wnt信号抑制剂IWP-2后,机械性缩足阈值升高,此效应可以维持约9天。IWP-2抑制Wnt信号后,星形胶质细胞活化减少,细胞促炎因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)水平显著降低,突触可塑性变化相关分子的磷酸化水平降低,SDH浅层新生突触形成相关蛋白PSD-95和突触素下调,同时SDH浅层神经元：nEPSCs受到抑制。4、BPA-NPP大鼠DRG中Wnt-3a、Frizzled 4和β-catenin表达上调,同时CCL2及其受体CCR2以及Nav1.8表达上调,IWP-2抑制CCR2和Nav1.8的表达而不影响CCL2的产生,CCR2拮抗剂可降低Nav1.8的表达以及电流。[结论]1.BPA损伤引起大鼠SDH和DRG中Wnt/β-catenin信号通路分子表达上调。2.BPA损伤导致大鼠SDH神经胶质细胞活化,促炎因子表达升高,同时活化的Wnt信号通路引起SDH神经元突触可塑性增加,痛敏阈值降低。3. CCL2/CCR2以及Nav1.8参与BPA损伤后DRG感觉神经元疼痛信号的传导,Wnt/β-catenin信号通路通过上调CCR2可增加Nav1.8从而引起NPP的发生。4.Wnt信号通路活化引起的SDH神经元突触可塑性的改变以及Nav1.8离子通道的激活对BPA后NPP的产生发挥重要作用。
关键词: 臂丛神经根性撕脱伤(BPA) ；神经病理性痛(NPP) ；Wnt/β-catenin信号通路 ；突触可塑性 ；CCL2 ；Nav1.8
被引量
2
摘要： 神经病理性痛是一种影响人类健康的顽疾，长期困扰患者并严重影响其生活质量，其对于健康的危害程度不亚于肿瘤。在痛觉信息传递过程中，中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)是中枢下行痛觉调制系统的关键结构，其中中脑导水管周围灰质腹外侧区(ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG)是机体对伤害性信息进行自身调制或整合的重要位点，它可被发自脊髓和延髓的第二级感受伤害性刺激的神经元激活，将伤害性信息投射至更高级中枢，进而对伤害性信息进行处理。同时，vlPAG也发出纤维加入下行调制系统，参与对延髓和脊髓背角内上行性伤害性信息传递的调控。因此，研究vlPAG脑区参与疼痛调控的作用机制，有助于了解神经病理性疼痛发生和维持的机制。以往研究表明，分布在外周及脊髓背角的超极化激活-环核苷酸门控的阳离子通道（hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated cation channels，即“HCN通道”）的异常活化引起的神经元异位放电是神经病理性痛产生和持续的重要因素，部分结果提示HCN通道阻断剂可能通过抑制脊髓以上的中枢发挥镇痛作用。vlPAG脑区可见HCN1和HCN2通道表达分布，但目前对于vlPAG脑区HCN通道参与神经病理性痛的发病机制尚需深入探讨。
HCN通道家族成员是上世纪90年代被克隆出，该家族由HCN1、2、3和4四个亚型组成，广泛分布在心血管和神经系统，其电生理功能的多样性一直吸引着众多研究者的目光。HCN通道最主要的特性就是通过调控神经元细胞膜生物学特性影响神经元的兴奋性及突触信息传递。研究表明，HCN通道是调控心血管及神经系统稳定的重要因素，在一系列以神经系统兴奋性异常改变为特点的疾病（如癫痫、脑缺血及神经病理性痛的研究）中，均检测到HCN通道功能发生异常改变。目前认为HCN通道，特别是HCN2通道在炎性痛和病理性痛中表达升高，激活速度加快，促进外周异位放电的形成；敲除HCN2基因之后能够明显抑制异位放电及缓解疼痛症状，且不影响动物的正常感觉及痛阈。这提示HCN通道异常改变在神经病理性痛的起始及维持中发挥重要作用，同时也提示cAMP信号途径在病理性痛发生及维持中发挥很重要的作用，但迄今为止对于vlAPG区HCN通道在神经病理性痛发病中的作用尚缺乏研究。我们推测在神经病理性痛过程中vlPAG脑区HCN通道可能出现表达、功能变化，使某些类型神经元电活动发生改变，进而参与或者诱导了病理性痛相关疾病症状的发生及维持。
本课题拟通过坐骨神经CCI (chronic constriction injury)手术制备神经病理性痛动物模型，运用形态学、电生理以及行为学技术，研究vlPAG脑区HCN通道在神经病理性痛调控中的作用；通过在体行为学及离体电生理实验，研究HCN通道抑制剂参与镇痛的具体分子及电生理机制；并以cAMP信号途径为切入点，初步探讨病理性痛过程中vlPAG脑区HCN通道功能改变的调控机制，为治疗神经病理性疼痛提供深入的理论基础。
方法：
1.通过坐骨神经CCI手术制备大鼠神经病理性痛模型，并通过实时定量PCR、免疫组织化学染色和Western blot定量观察vlPAG脑区CCI术后HCN1和HCN2通道mRNA水平和蛋白的表达及分布改变；
2.制备vlPAG脑内置管后的CCI大鼠模型，注射HCN通道阻断剂后，通过热辐射法和Von Frey(vFh)纤维丝检测大鼠热痛阈和机械性痛阈的变化；
3.脑片全细胞膜片钳技术观察记录正常及CCI组脑组织片vlPAG脑区神经元的HCN通道电流及神经兴奋性的变化情况。通过Biocytin标记对脑组织片vlPAG脑区记录细胞进行形态学鉴定。
4.应用“胞内cAMP检测试剂盒”检测正常及CCI组vlPAG脑区组织胞内cAMP水平的差异，全细胞膜片钳技术观察记录脑组织片vlPAG脑区神经元在分别给予AC激动剂FSK和HCN通道抑制剂后神经元兴奋性的变化。
结果：
1．成功制备了大鼠坐骨神经CCI神经病理性痛的动物模型，CCI术后大鼠热痛阈和机械性痛阈均显著降低，术后14d最明显，假手术组大鼠痛阈未见明显变化。CCI组大鼠的运动功能未受影响，与假手术组和正常组大鼠相比较无显著差异。
2．实时定量PCR结果显示大鼠CCI术后14d，其vlPAG脑区HCN1和HCN2通道mRNA水平均显著上调；免疫组织化学和Western blot结果显示大鼠CCI术后14d，vlPAG脑区HCN1通道和HCN2通道蛋白表达显著增加，神经元胞膜表达显著升高，且阳性神经元比例显著升高。
3. vlPAG脑区微量注射生理盐水后CCI大鼠的热痛阈和机械性痛阈均未发生明显变化；给予ZD7288后的CCI大鼠其损伤同侧后肢热痛阈和机械性痛阈明显升高，且差异具有统计学意义，HCN通道阻断剂ZD7288的镇痛效应具有剂量依赖性和时间依赖性，剂量越高效果越明显，且效果虽注射后时间迅速升高，而后逐渐降低。vlPAG脑区注射生理盐水或ZD7288对正常及模型动物的运动功能无显著影响。
4.全细胞膜片钳记录显示vlPAG脑区一类神经元具有HCN通道电流特性。与假手术对照组相比较，CCI组大鼠术后14d vlPAG脑区神经元HCN电流显著增强，激活曲线向去极化偏移，神经元兴奋性增加。应用ZD7288阻断HCN通道后，神经元兴奋性显著降低。Biocytin标记显示所记录细胞位于vlPAG脑区。
5.胞内cAMP检测结果显示CCI组的vlPAG脑区cAMP水平显著高于假手术对照组。全细胞膜片钳记录显示正常大鼠脑组织孵育AC激动剂后升高胞内cAMP水平后vlPAG脑区神经元兴奋性显著增强，同时应用HCN通道阻断剂ZD7288后，神经元兴奋性回落至接近正常水平。
结论：
1.神经病理性痛大鼠vlPAG脑区HCN1和HCN2通道表达水平发生改变，与神经病理性痛的发生及维持相关。
2.神经病理性痛大鼠vlPAG脑区Ih电流增强后参与调控神经元兴奋性改变，进而参与神经病理性痛的维持。
3.神经病理性痛发病过程中cAMP信号途径发挥重要的调控作用，cAMP通过调控vlAPG区某一类神经元HCN通道的功能，影响神经元兴奋性，使vlPAG发挥下行易化作用，参与神经病理性痛的发生及维持。
4.抑制vlAPG区HCN通道功能能够缓解神经病理性痛症状。
关键词: 中脑导水管周围灰质 ；HCN通道 ；神经病理性痛 ；ZD7288
被引量
3
摘要： 背景:
当脊柱疾患发展到后期严重阶段，多通过手术来解除局部压迫，重建脊柱稳定性，从而达到治疗目的。近三十年来，脊柱手术方式及内固定器械已得到极大发展，进行了各种复杂手术，也取得了一些令人鼓舞的疗效，然而部分患者在术后一段时期内仍感到严重而持续的疼痛不适，影响了患者的生活质量及对进一步治疗的信心。既往，我们把这种疼痛产生的原因都归咎于手术失败，但随着研究的深入，我们发现部分患者的疼痛表现有着更深层的病理机制，故称这种疼痛为神经病理性疼痛，其影响全球成千上百万人，就其本身而言，可认为是一种疾病。神经病理性疼痛机制复杂，目前对其了解尚不深刻，虽然根据已有的研究成果采取了一些对症治疗措施，但是疗效有限。
外周神经系统受到损伤可引起神经病理性疼痛，损伤形式多样，包括创伤、疾患、大型手术、肿瘤甚至是化疗等，其疼痛程度不等，可表现为自发性疼痛或诱发性疼痛等不同形式。研究发现，受损神经处可形成神经瘤，产生明显的异位放电;受损神经处和对应的背根神经节中会有明显的炎性细胞浸润;可伴有显著的基因表达调控改变等等。受体和通道性状的改变在神经病理性痛信息传递与调控过程中起至关重要的作用。实验显示，神经损伤后P2X3、TRPV和Nav1.8等通道的表达明显改变;5HT3a、GFRalpha2和GABAalpha5等受体也有明显的表达改变;神经元细胞膜上的Na+-K+泵也有表达改变。此外，神经系统可塑性的改变还包括轴突再生、突触重塑以及炎性因子、神经递质和神经生长因子等的上调或下调等复杂因素。
目前临床用于治疗神经病理性疼痛的药物有多种，但这些药物的作用机理主要是抑制神经元靶体、阻断神经传递，因此，它们可以抑制疼痛症状，但并非是治疗神经病理性疼痛潜在性的病理过程，治疗作用短暂且可产生严重的副作用。
就病理机制而言，神经病理性疼痛被认为是神经可塑性在外周和中枢神经系统中的一种表达形式。最近的研究显示，神经系统中的炎症反应在神经病理性疼痛的发生和发展过程中扮演重要角色。神经损伤后，多种炎性细胞因子，如白细胞介素(IL)-1β，IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-a等，在神经纤维和背根神经节(dorsalrootganglion，DRG)中被诱导表达，对背根神经节神经元胞体和轴突高兴奋性引起的外周敏化过程起重要作用。炎性细胞因子通过增强神经元的兴奋性突触传递，或抑制神经元的抑制性突触传递而产生长效作用。
基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)是一大类同源蛋白，具有肽链内切酶活性，可降解细胞外基质的大部分成分，其酶活性的发挥需要Zn2+及Ca2+的存在，现已有近三十种基质金属蛋白酶被确定。基质金属蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinase，TIMP)为其内源性抑制物，目前其家族成员共有四种。二者在体内可由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及平滑肌细胞等多种细胞合成和分泌，广泛分布于人体各组织。基质金属蛋白酶通过裂解细胞外基质中的蛋白、细胞因子和趋化因子，在炎症反应过程中发挥重要作用。在MMP家族20多名成员中，具有明胶酶活性的MMP-9和MMP-2最为被研究，MMP-9和MMP-2活性分别受TIMP-1和TIMP-2的抑制。
通过实验动物的脊髓神经结扎(spinalnerveligation，SNL)模型研究，发现脊髓神经结扎后可在背根神经节中诱导迅速(<1天)而短暂(<3天)的MMP-9表达上调，说明在早期阶段，MMP-9的抑制或表达缺失可以减轻神经病理性疼痛，作为MMP-9的特异性抑制物，TIMP-1对神经病理性疼痛的阻断作用在早期阶段特别有效，但在后期阶段则没有作用;而脊髓神经结扎后在背根神经节中MMP-2的表达上调则出现延迟性(>7天)和持久性(>21天)的特点，揭示MMP-2可能触发后期阶段的神经病理性疼痛的发生，MMP-2的作用可被其特异性抑制物TIMP-2所阻断。
综上所述，神经病理性疼痛发生的早期和后期阶段分别有MMP-9和MMP-2的参与，对背根神经节中MMP-9或MMP-2的表达进行抑制，也许可为神经病理性疼痛的预防和治疗提供一种新的思路。因为MMP家族成员众多，在神经病理性疼痛的产生病理机制中，分别起着不同的生理及病理作用，应用广谱的MMP抑制剂可能不会非常有效，并且会产生严重的副作用。而作为MMP的特异性内源性抑制剂，TIMP-1和TIMP-2可通过分别抑制MMP-9和MMP-2的活性，从而显著减轻疼痛反应，故认为TIMP及其衍生物在神经病理性疼痛的治疗上具有一定的潜能。本研究通过建立大鼠外周神经损伤模型，研究神经损伤对TIMP在背根神经节中的表达调控及分布的影响，来更好的理解神经病理性疼痛的发生和发展过程。
研究目的:
本课题通过检测正常大鼠背根神经节(DRG)中的基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)，明确在生理状态下TIMP家族成员是否有表达，及其表达分布;通过切除一段大鼠坐骨神经建立外周神经损伤模型，探讨当外周神经损伤后，TIMP家族成员在大鼠背根神经节中的表达是否发生改变，及其变化趋势。本实验预期通过一系列的相关实验研究达到如下目的：
1、有助于形成一套切实可行的实验动物模型及相关检测模式，为今后的研究做基础;2、检测在正常生理状态下，TIMP在大鼠背根神经节(DRG)中有表达，不同的TIMP家族成员其表达分布存在差异;3、揭示当外周神经损伤后，TIMP家族成员在大鼠背根神经节(DRG)中表达或分布的改变趋势;4、探讨TIMP家族成员在神经病理性疼痛病理机制中的不同作用，以期为神经病理性疼痛的治疗提供新的思路。
研究方法:
将成年Sprague-Dawley雄性大鼠随机分成对照组和实验组，实验组按术后第2天、第70天、第14天及第28天4个不同时间点随机分成4组。在实验组中，结扎并横断大鼠双侧坐骨神经形成动物模型，并于术后分批处死，取L4、L5的背根神经节标本待检测。对照组仅显露坐骨神经，未作其他干预处理，同法取标本待检测。采用Real-timePCR方法检测坐骨神经横断对大鼠背根神经节(DRG)中TIMP-1、TIMP2、TIMP3表达量的影响，并对实验数据进行统计学分析。采用原位杂交(Insituhybridization，ISH)方法显示外周神经横断对TIMP-1、TIMP-2、TlMP-3在大鼠背根神经节中的表达分布的影响。原位杂交实验结束后做免疫荧光标记，显示背根神经节中表达外周蛋白、P2X3、胶原纤维酸性蛋白及转录活化因子3的细胞。
结果:
1、在正常生理状态下，TIMP家族成员TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3在大鼠背根神经节中均有表达;TIMP-1mRNA阳性信号见于背根神经节神经元周围的卫星细胞中，而非神经元中;TIMP-2mRNA阳性信号见于背根神经节初级感觉神经元中;TIMP-3mRNA阳性信号见于背根神经节神经元周围的卫星细胞中。
2、坐骨神经横断后，背根神经节中的TIMP-1mRNA表达水平明显增加，在术后第2天达到峰值，并维持较高水平至术后第28天(与对照相比)，其差异具有显著统计学意义;TIMP-1mRNA的表达上调不仅见于神经元周围，而且在初级感觉神经元中有TIMP-1mRNA的强烈诱导表达;表达TIMP-1mRNA的神经元主要是中小神经元。
3、坐骨神经横断后，背根神经节中的TIMP-2mRNA的表达水平于术后第14天及第28天出现明显降低(与对照相比)，其差异具有显著统计学意义;正常状态下，约80％的神经元含有TIMP-2mRNA，而坐骨神经横断后第14天。TIMP-2mRNA标记神经元所占比率降至约53％。
4、坐骨神经横断后，TIMP-3mRNA的表达水平未发生明显变化，仍主要表达于背根神经节神经元周围的卫星细胞中;仅于术后第2天可见少数背根神经节神经元中有TIMP-3mRNA的诱导表达。
5、坐骨神经横断后2天，于胶原纤维酸性蛋白(GFAP，显示卫星细胞活性的一种标志物)阳性的卫星细胞中可见TIMP-1mRNA表达上调;约70％的TIMP-1mRNA阳性标记神经元为外周蛋白阳性细胞，而70％的外周蛋白阳性神经元中含有TIMP-1tuRNA。TIMP-1mRNA标记神经元中仅约46％的神经元为P2X3阳性细胞，而约72％的P2X3阳性神经元中含有TIMP-1mRNA。
6、坐骨神经横断后2天，约94％的TIMP-1mRNA标记神经元为ATF-3阳性神经元，而约89％的ATF3阳性神经元为TIMP-1mRNA标记神经元。
结论:
TIMP-1作为MMP-9的内源性抑制物，可在早期阶段逆转机械性异常疼痛;而TIMP-2作为MMP-2的内源性抑制物，则在后期阶段有镇痛作用。本实验通过检测在外周神经损伤后的不同时间段，TIMP-1、TIMP-2及TIMP-3在大鼠背根神经节中表达量及表达分布的改变，初步阐明了TIMP-1、TIMP-2及TIMP-3的不同表达模式。实验动物在术后一天即出现伤害性感受表现，说明在外周神经损伤的早期阶段，背根神经节中TIMP-1的显著上调不能中和MMP-9引起的疼痛效应。同时，神经损伤后诱导产生TIMP-1mRNA的神经元并非限定于背根神经节神经元的某个亚群，说明在背根神经节神经元中TIMP-1mRNA的表达也许与神经营养因子无关。TIMP-1mRNA主要在损伤背根神经节神经元中被诱导，说明ATF-3可能是TIMP1mRNA表达的关键因素。TIMP-2mRNA在外周神经损伤的后期阶段出现表达下调，导致MMP-2和TIMP-2间的平衡趋向于MMP-2，这也许可以解释神经病理性疼痛持续的原因。
关键词: 基质金属蛋白酶组织抑制因子 ；背根神经节 ；外周神经损伤 ；原位杂交
摘要： 慢性痛是一种十分常见的临床疾病,其中最复杂、最难治的便是由于组织或神经损伤导致的神经病理性痛(neuropathic pain)。由于疼痛症状迁延不愈导致其经常伴有焦虑和抑郁等负性情绪,两者交互恶化给患者造成极大的生理和心理负担。尽管人们对神经病理性痛的研究在外周神经系统和脊髓水平取得了一定的进展,但是对神经病理性痛状态下大脑内痛觉调控的高级中枢尚缺乏足够的认识。近年来岛叶皮层(insular cortex,IC)逐渐受到越来越多地关注,有报道指出损毁双侧IC可以显著缓解大鼠炎性痛和神经病理性痛样行为,同时因胶质瘤或脑梗累及IC的患者手术切除此区后会出现痛觉减退甚至消失的现象,提示IC在痛觉感知和调控中可能扮演着重要的角色。神经病理性痛所伴随负性情绪的产生和维持可能需要边缘系统内杏仁核参与,它可划分为内侧的杏仁中央核(central amygdaloid nucleus,Ce A)以及外侧的杏仁外侧核(lateral amygdaloid nucleus,LA)/杏仁基底外侧核(basolateral amygdaloid nucleus,BLA)。皮层与杏仁核之间的联系主要通过BLA介导,干预内侧前额叶皮质(medial prefrontol cortex,m PFC)-BLA神经通路可以调控动物的焦虑和恐惧记忆。然而IC-BLA间是否也存在类似的纤维联系?若存在,那么此通路在慢性痛,尤其是神经病理性痛状态下究竟发生何种改变?它是否也参与神经病理性痛及其伴随的负性情绪的调控?鉴于此,本研究综合利用形态学、分子神经生物学、电生理学和行为学等方法,研究了IC-BLA通路在神经病理性痛状态下的形态和功能可塑性改变,同时在上述基础上进一步应用光遗传学和化学遗传学干预IC-BLA神经通路并观察对神经病理性痛的调控作用。分为以下四个部分进行探讨:1.大鼠IC的传入和传出神经纤维联系(1)IC的传入神经纤维联系研究:将逆行示踪剂荧光金(Fluoro-Gold,FG)分别注射入大鼠前部IC(anterior insular cortex,AIC)或后部IC(posterior insular cortex,PIC)。标记结果可在切片后直接观察或行免疫组化染色后观察。结果可见FG逆标神经元主要分布于对侧IC、同侧初级运动皮层(primary motor cortex,M1)、腹侧眶皮层(ventral orbital cortex,VO)、丘脑中线核团、BLA、黑质致密部(substantia nigra,compacta part,SNC)、被盖腹侧区(ventral tegmental area,VTA)、中缝背核(dorsal raphe nucleus,DR)、臂旁核(parabrachial nucleus,PBN)、蓝斑(locus coeruleus,LC)等脑区和核团。(2)IC的传出神经纤维联系研究:将顺行示踪剂植物凝集素(Phaseolusvulgaris-leukoagglutinin,PHA-L)分别电泳注射入AIC或PIC。动物存活2 w后,先灌注固定,再行免疫组化染色,在显微镜下观察IC的传出纤维所到达的脑区或核团。结果可见PHA-L顺标的神经纤维和终末主要分布于对侧IC、同侧背外侧眶皮层(dorsolateral orbital cortex,DLO)、边缘前皮质(prelimbic cortex,Pr L)、伏核中央部(accumnens nucleus,core,Acb C)、BLA、丘脑背内侧核(mediodorsal thalamic nucleus,MD)、丘脑中央内侧核(central medial thalamic nucleus,CM)、以及尾侧的丘脑腹后核小细胞部(ventral posterior thalamic nucleus,parvicellular part,VPCC)、同侧的下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area,LH)、导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)、对侧中缝大核(raphe magnus nucleus,RMg)、孤束核(nucleus of the solitary tract,Sol)、三叉神经脊束核尾侧亚核(trigeminal caudal subnucleus,Vc)等。(3)向IC投射神经元的神经化学解剖学特点:利用免疫荧光双标染色方法观察了DR、LC、SN/VTA等区域内经典神经递质与FG逆标神经元的共存关系。结果显示DR内FG逆标神经元大部分含有5-羟色胺(5-HT)(89.8%);LC内全部FG逆标神经元都表达儿茶酚胺能神经元的标志物络氨酸羟化酶(TH)故向IC投射的LC神经元全部含有去甲肾上腺素(NE);在SN/VTA区可见约91.3%的FG逆标神经元呈TH阳性,表明它们含有多巴胺(DA)。以上结果提示IC可以接受来自丘脑中线核团的感觉信息传入,同时向脑内许多痛觉调控相关脑区和核团发出纤维投射。另外,许多经典神经递质可能都参与调控IC内的神经信息传递。2.神经病理性痛状态下IC-BLA通路的形态学改变(1)神经病理性痛大鼠对侧IC内Fos蛋白表达明显上调:利用坐骨神经选择性损伤(spared nerve injury,SNI)建立大鼠神经病理性痛模型。在该类模型动物上可以观察到双侧IC内表达Fos蛋白的神经元数量均增加,尤以对侧为著,提示神经病理性痛状态下IC内大量神经元被激活。(2)神经病理性痛刺激激活大鼠IC-BLA通路:将逆行示踪剂注射入大鼠BLA,可见FG逆标神经元广泛分布于IC内,主要位于III或V层,由前部向后部逐渐增多,且浅层所占比例逐渐升高。为了进一步观察IC-BLA投射神经元所含有的神经活性物质,又利用原位杂交结合免疫荧光三重标记的方法观察到IC向BLA投射的FG逆标神经元全部表达VGlu T1(vesicular glutamate transporter 1,VGlu T1),且大部分VGlu T1/FG双标神经元表达Fos,提示神经病理性痛能够激活谷氨酸能IC-BLA投射神经元。(3)神经病理性痛状态下大鼠IC神经元的突触可塑性改变:为了在超微结构水平进一步观察IC-BLA投射神经元在神经病理性痛状态下发生的变化,利用包埋前染色方法在电镜下观察了神经病理性痛后IC神经元突触后谷氨酸α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体亚型Glu R1与突触后膜间的关系。同时利用Western blot检测了突触后致密物质(PSD)内Glu R1和谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体磷酸化(p NR2B)的水平。结果显示神经病理性痛使纳米金颗粒标记的Glu R1出现明显的上膜(insertion)现象;Western blot检测说明PSD内Glu R1和p NR2B的表达均显著升高。上述结果提示神经病理性痛状态下IC内投射神经元发生了形态可塑性改变,主要表现为AMPA受体上膜和NMDA受体的磷酸化增加的现象。上述结果提示神经病理性痛可以使谷氨酸能IC-BLA兴奋性投射神经元的活性增强、IC-BLA投射神经元的突触后Glu R1出现上膜现象和PSD内Glu R1和p NR2B的表达明显升高。这些结果揭示了IC-BLA投射神经元在分子水平发生的可塑性改变。3.神经病理性痛状态下IC-BLA通路的电生理学研究为了从电生理角度阐明神经病理性痛状态下IC-BLA投射神经元发生的改变,将四甲基罗达明(TMR)注射入大鼠BLA以标记IC向BLA投射神经元,在离体脑片上钳制TMR逆标神经元并进行记录。(1)神经病理性痛明显增加IC-BLA投射神经元的自发兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,s EPSCs)的频率和幅值:在电压钳模式下,神经病理性痛组s EPSCs的频率和幅值都明显高于假手术(Sham)组,提示IC-BLA投射神经元经突触终末前释放的递质增多,突触后受体的反应性增强。(2)神经病理性痛明显增强IC-BLA投射神经元的兴奋性:在电流钳记录模式下,进一步检测了IC-BLA投射神经元的固有兴奋性改变。结果显示SNI后,IC-BLA投射神经元在给予一串外源性电流(400 ms,10-90 p A)刺激的情况下,动作电位的发放数目明显多于Sham组,提示神经元的固有兴奋性增强。(3)IC-BLA投射神经元兴奋性突触传递在SNI后明显增强:与Sham组相比,SNI后AMPA受体Input(刺激强度)-Output(EPSC幅度)曲线斜率明显增加,提示神经病理性痛状态下AMPA受体所介导的兴奋性突触传递明显增强。同样,如在灌流液中加入AMPA受体阻断剂CNQX之后,再观察NMDA受体的反应,结果显示NMDA受体Input-Output曲线斜率也明显增加,提示神经病理性痛状态下NMDA受体所介导的兴奋性突触传递也明显增强。上述结果说明神经病理性痛状态下IC-BLA投射神经元的自发放电,固有兴奋性以及兴奋性突触传递均增强。4.IC-BLA通路对神经病理性痛信息传递及其伴随负性情绪的调控作用最后,利用光遗传学和化学遗传学的方法特异性操控IC-BLA通路的活性,观察此通路对神经病理性痛及其伴随负性情绪的调控作用。进行光遗传实验时,将AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP/AAV-Ca MKII-e YFP病毒注射入小鼠双侧PIC,在双侧BLA埋置光纤,6 w后蓝光刺激双侧BLA并进行von Frey纤维丝机械性痛阈值检测、旷场试验和高架十字迷宫试验。在进行行为学实验前,先在离体脑片上记录并确认IC内被感染神经元可以被蓝光诱发动作电位,另外,蓝光照射也能够诱发BLA神经元的EPSC。进行化学遗传学实验时,将AAV-h Syn-DIO-HM4Di-m Cherry/AAV-h Syn-DIO-m Cherry病毒注射入Ca MKII-Cre小鼠双侧PIC,在双侧BLA埋管,6 w后经埋管向双侧BLA给予CNO,1 h后进行von Frey纤维丝机械性痛阈值检测,旷场试验和高架十字迷宫试验。(1)蓝光刺激可以诱发离体脑片的动作电位和兴奋性突触后电流:在IC深层(V层)钳制并记录荧光标记的神经元,采用5 Hz和10 Hz的蓝光刺激都能成功诱发动作电位(action potential,AP)发放。在BLA纤维密集区周围钳制并记录锥体神经元的EPSC,给予同样条件的蓝光刺激可见5 Hz及10 Hz都能成功激发出EPSC,在灌流液中加入AMPA受体阻断剂CNQX(10μM),则几乎能完全使激发出的EPSC消失。上述结果提示蓝光刺激可以诱发BLA神经元的EPSC,且此电流由谷氨酸能的AMPA受体介导。(2)使用光遗传学技术激活IC-BLA通路可促痛并导致动物出现焦虑抑郁样负性情绪:蓝光刺激双侧BLA可以明显降低AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP感染小鼠的后足机械性缩足阈值。此外,旷场试验结果显示当蓝光刺激双侧BLA时,可见AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP感染组小鼠的中央区活动时间占总时间百分比(Center time%)明显低于对照组;高架十字迷宫实验结果显示AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP感染组小鼠的开放臂进入次数占总次数百分比(OA entries%)以及开放臂活动时间占总时间百分比(OA times%)低于e YFP对照组,上述结果说明小鼠出现明显的焦虑抑郁样行为。(3)通过化学遗传学方法抑制IC-BLA通路可以部分逆转神经病理性痛并缓解焦虑抑郁样负性情绪:双侧BLA给予CNO 1 h后,AAV-h Syn-DIO-HM4Di-m Cherry(HM4Di)注射组小鼠的机械性痛阈值明显升高,与AAV-h Syn-DIO-m Cherry(m Cherry)对照组小鼠相比有统计学差异,此结果提示特异性抑制IC-BLA通路可以缓解神经病理性痛。此外,旷场试验结果显示HM4Di组较m Cherry对照组的Center time%增加;
关键词: 岛叶 ；杏仁基底外侧核 ；神经病理性痛 ；突触可塑性 ；负性情绪 ；光遗传学 ；化学遗传学
被引量
4
摘要： 疼痛是人们在不同的病理状态下由大脑所产生的一种不愉悦的感觉，而长期的慢性痛则在全世界的范围内成为严重影响患者生命质量的重要疾病。因此，阐明疼痛发生和传递的机制，开发更有效的镇痛新药以及临床上对于疼痛的靶向治疗，已经成为当今生命科学研究领域的热点问题[1]。
背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）和脊髓背角是躯体感觉信息（包括痛觉信息）传递和调控的初级门户，位于其内的谷氨酸在外周痛觉信息的传递中具有重要作用。已有的研究证实，在对痛觉信息的传递和调控过程中，谷氨酸是其中最主要的神经递质之一，谷氨酸在神经元的胞体合成后须由突触囊泡进行转运并胞吐释放才能发挥其兴奋性递质的作用，这种转运方式又必须借助特定的囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters, VGLUTs)来完成。近10年，研究人员利用快速发展的分子生物学技术成功地分离并克隆出了不同亚型的囊泡膜谷氨酸转运体，并将之命名VGLUT1、VGLUT2、 VGLUT3[2,3]。由于VGLUT1和VGLUT2广泛分布于谷氨酸能轴突终末内，故目前在国际上人们已经将VGLUT1和VGLUT2作为中枢神经系统内谷氨酸能终末的特异性标记物[4]。谷氨酸参与感觉信息的传递和调控的结构基础在于它不仅分布在投射神经元内，在中间神经元内也有广泛的分布，而新近研究也发现在长传导通路的各级核团和中间神经元内均有VGLUT2的分布；进一步的研究也证实DRG和脊髓背角内有大量的VGLUT2表达神经元和轴突终末[5]。
目前在国内外由于缺乏针对VGLUT2特异性的激动剂和拮抗剂，导致对VGLUT2所参与外周痛觉信息传递和调控机制的研究十分困难[6,7]。随着分子生物学技术的迅速发展，基因敲除技术很好的解决了这一难题。然而，基因敲除技术对于针对VGLUT2为疼痛的靶点，作为临床上开发有效的镇痛药而言显然是不现实的。随着基因阻断技术的发展，RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）为特定基因功能研究和相关疾病的治疗提供了一种全新的思路。
脊髓背角的中间神经元（同样作为躯体感觉信息传递和调控的关键部位），其内的VGLUT2与外周疼痛信息的传递和调控的关系如何，到目前为止尚不十分清楚。另外，脊髓内VGLUT2样阳性终末由于既来源于初级传入神经元（DRG），也来自于脊髓中间神经元本身，因此在慢性痛状态下，这两部分来源的VGLUT2究竟是怎样参与痛觉信息的传递和调控的，目前也无文献报道。针对这两个问题，我们拟综合采用RNA干扰技术结合顺行束路追踪、免疫荧光组织化学、细胞培养和电生理学技术从以下几个方面进行了研究。
第一部分：将携带有两种不同VGLUT2shRNA序列的慢病毒载体，感染在体外原代培养的脊髓神经元，进一步验证并筛选能够最有效下调脊髓神经元内VGLUT2表达的慢病毒载体。
目的：验证已经在体外培养的皮层神经元上筛选得到的可以特异性干扰VGLUT2表达的两种慢病毒是否能够有效地感染原代培养的大鼠脊髓神经元，筛选出能够最高效干扰培养脊髓神经元内的VGLUT2基因表达的慢病毒。方法：首先将这两种重组慢病毒直接感染体外培养的胚胎大鼠脊髓神经元，实验分为正常组、阴性对照组（空病毒载体组）、VGLUT2-shRNA-1组以及VGLUT2-shRNA-2组，分别观察各组大鼠脊髓神经元内绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达情况；同时运用免疫蛋白质印迹（Western Blot）技术检测VGLUT2蛋白的表达水平。结果：免疫荧光组织化学染色结果显示：阴性对照组、两组VGLUT2-shRNA慢病毒组脊髓神经元内均可以观察到GFP的荧光，提示这些神经元已经被慢病毒载体高效地感染；但两组VGLUT2-shRNA慢病毒组神经元内的VGLUT2的表达量要明显比正常组和阴性对照组低。Western Blot结果显示：两组VGLUT2-shRNA慢病毒组脊髓神经元内VGLUT2蛋白的表达量明显低于其他两组的表达量(P<0.05)，其中VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组VGLUT2蛋白的表达量分别占正常组表达量的62.42±1.12%和66.07±1.33%，但两组VGLUT2-shRNA慢病毒组组间的VGLUT2蛋白的表达量相比无明显差异(P>0.05)；阴性对照组和正常组之间相比也无明显差异(P>0.05)。结论：两组VGLUT2-shRNA重组慢病毒均能高效地感染原代培养脊髓神经元，并且能够下调脊髓神经元内VGLUT2的表达。
第二部分：将在体外有效降低VGLUT2的两种shRNA重组的慢病毒，通过定位注射方式注入大鼠脊髓背角，进而感染脊髓背角神经元，观察下调其内VGLUT2的表达对SNL神经病理性痛模型大鼠的机械性痛敏的影响。并利用膜片钳技术，在红外可视膜片钳下对下调脊髓背角内VGLUT2表达后大鼠的离体脊髓薄片背角浅层神经元的电生理特性进行分析。
目的：观察靶向下调大鼠脊髓背角内VGLUT2的表达对动物痛行为的改变以及对神经元的电生理特性和突触可塑性的影响。方法：（1）制备L5脊神经结扎（spinalnerve ligation，SNL）的神经病理性痛模型。(2)将在体外培养神经元上有效下调VGLUT2表达的两种shRNA重组慢病毒，通过定位注射方式感染大鼠脊髓神经元，观察对神经病理性痛模型大鼠疼痛相关行为的影响。(3)体外培养急性分离的大鼠脊髓薄片，并感染有效降低VGLUT2的shRNA重组慢病毒载体，观察对大鼠脊髓背角浅层神经元的电生理特性的影响。结果：(1)大鼠在SNL术后第1d即表现出明显的机械性痛敏和热痛敏，在第3d时痛敏最为明显。(2)重组的慢病毒可以高效地感染大鼠的脊髓背角神经元并抑制其内VGLUT2的表达；Western Blot结果显示：VGLUT2-shRNA-1组和VGLUT2-shRNA-2组VGLUT2蛋白的表达量下降，分别为正常组表达量的20.71±5.52%和19.74±3.92%；同时能够降低大鼠对于伤害性热和机械性刺激的反应阈值，并明显缓解SNL神经病理性痛模型大鼠的痛敏行为。(3)在体外培养急性分离的大鼠脊髓薄片上，脊髓背角神经元感染病毒后其自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)的幅度减小，频率有所降低。结论：靶向下调大鼠脊髓背角内VGLUT2的表达能够影响神经元的功能并缓解大鼠的痛行为。
第三部分：利用neurobiotin顺行束路追踪技术区分出脊髓背角内VGLUT2从DRG（初级神经元）和脊髓背角（二级神经元）的来源分布，并观察SNL神经病理性痛模型大鼠脊髓背角初级传入终末内VGLUT2的时程变化。
目的：观察SNL神经病理性痛模型大鼠脊髓背角初级传入终末内VGLUT2的时程变化。方法：利用neurobiotin顺行束路追踪技术标记所有DRG向脊髓背角浅层的初级传入纤维，利用VGLUT2的抗体标记脊髓背角内VGLUT2阳性终末的分布。通过neurobiotin/VGLUT2免疫荧光双标染色区分VGLUT2从DRG（初级神经元）和脊髓背角（二级神经元）的来源分布；并以此观察SNL模型大鼠在L5脊神经结扎后不同时间点脊髓背角内初级传入终末内VGLUT2的表达变化。结果：在脊髓背角内可以清晰地观察到neurobiotin顺行标记的初级传入纤维和终末，同时也可观察到部分阳性终末呈VGLUT2样阳性，这些neurobiotin/VGLUT2双标轴突终末的数量（%）随着SNL神经病理性痛的时间延长（0d，1d，3d，5d，7d）而逐渐增多。结论：脊髓背角初级传入终末内VGLUT2的表达增多可能与神经病理性痛导致的慢性痛的发生密切相关。
关键词: 谷氨酸 ；VGLUT2 ；神经病理性痛 ；DRG ；shRNA ；慢病毒 ；脊髓 ；大鼠
摘要： 研究背景：近年来，通过胶质细胞来控制神经病理性疼痛已成为一个有前景的研究方向。事实上，从外周到中枢神经系统，胶质细胞表型的改变在整个痛觉传导通路中都有过报道，而且在动物模型中，通过药理学方法抑制这些胶质细胞的活动可以缓解疼痛。胶质细胞和神经元之间复杂的相互作用，依赖于多种机制，包括胶质细胞的类型（星形胶质细胞，小胶质细胞，卫星细胞和雪旺细胞），调节作用的解剖学定位（外周神经，脊髓和大脑）和慢性疼痛的性质。近期的研究表明，在胞内一些特殊的级联反应通路，如MAPK途径和Wnt通路等都是胶质细胞活化参与慢性痛的潜在机制。
研究表明小胶质细胞在脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）诱导的神经病理性痛中扮演了重要角色，Toll样受体3（Toll like receptor，TLR3）在神经损伤后的小胶质细胞活化和痛觉过敏的发生中起到了关键的作用。另外，体外实验表明氯胺酮可以抑制小胶质细胞的活化，并且可能通过抑制TLR介导的信号通路降低促炎因子的基因表达。那么氯胺酮是否可以通过抑制小胶质细胞TLR信号通路来治疗神经病理性痛，目前还没有相关报道。
此外，星形胶质细胞也在SNL诱导的神经病理性痛中起到了关键作用。星形胶质细胞的活化相比小胶质细胞更晚而更持久，这和神经病理性痛的慢性化特点一致。研究报道海马区的星形胶质细胞Wnt信号通路参与了突触可塑性改变，而在脊髓背角，突触的可塑性改变恰恰是神经病理性痛慢性化的重要机制。那么脊髓背角星形胶质细胞Wnt信号通路是否参与了外周神经损伤所致神经病理性痛脊髓背角的突触可塑性改变，目前仍没有相关报道。
研究目的：基于以上研究现状和课题组前期的研究积累，本研究目的在于揭示鞘内注射氯胺酮是否通过抑制TLR3信号通路抑制SNL诱导的小胶质细胞的活化从而发挥抗痛觉过敏作用；此外，探索脊髓背角星形胶质细胞Wnt信号通路是否参与了外周神经损伤所致神经病理性痛的慢性化过程，以及相应调控机制。
研究方法：本研究应用行为药理学方法检测药物干预后实验动物痛行为学的改变；应用免疫荧光组织化学方法观察各种细胞以及蛋白活化和其解剖学定位；并进一步通过实时定量PCR和Western blot等方法定量分析相应蛋白分子的表达变化。
研究结果：实验一：行为药理学结果表明鞘内给予氯胺酮（30，100，300μg/kg）可以剂量依赖性缓解SNL所致神经病理性痛机械性痛觉过敏。免疫组化荧光染色的结果显示SNL术后3d脊髓背角小胶质细胞明显活化，而鞘内给予氯胺酮（30，100，300μg/kg）可以抑制SNL诱导的小胶质细胞的活化，并存在剂量依赖关系。同时SNL可以诱导脊髓背角p-p38的活化表达，并且其特异性表达在脊髓背角小胶质细胞。Western blot结果显示鞘内注射氯胺酮可以下调SNL诱导的p-p38的表达。另一方面，TLR3激动剂Poly I:C可以诱导机械性痛觉过敏以及脊髓背角的小胶质细胞的活化。而鞘内注射氯胺酮同样可以逆转Poly I:C诱导的机械性痛觉过敏并抑制小胶质细胞的活化。
实验二：免疫组织化学荧光染色结果显示，SNL可以诱导脊髓背角星形胶质细胞的活化，并且可以从术后3d持续到21d仍有较高表达。在SNL所致神经病理性痛大鼠模型脊髓中，Wnt-β-catenin信号通路中Wnt-3a主要表达于星形胶质细胞，而Frizzled-4和β-catenin主要表达于神经元。实时定量PCR结果显示，SNL可以诱导脊髓背角Wnt-3a基因在SNL后3天开始表达增高，而且与疼痛的进展有着时间上的相关性，35天时达到高峰，42天时有所下降；而Frizzled-4在术后7d开始高表达，一直持续到28天，35天开始下降；β-catenin同样也在术后7d开始高表达，21天后到达最高值，一直维持到35天，42天时有所下降但依旧在较高水平。Western blot结果显示Wnt-3a分子在术后3d开始表达增高，并且从14d到35d一直都维持在高水平。Frizzled-4在SNL术后3d表达略有升高，这种水平一直维持到35d。β-catenin的表达从14d开始明显上升，直到35天都维持在较高水平。而行为药理学结果显示，SNL术后1d，无论是给予Wnt-3a的中和抗体还是Frizzled-4受体阻断剂干扰Wnt通路都不能缓解SNL所致神经病理性痛，同样星形胶质细胞抑制剂也不能影响SNL所致机械性痛敏。而在术后3d或7d干扰Wnt通路或抑制星形胶质细胞活性，都可缓解SNL所致机械性痛敏。
结论：以上结果提示无论是小胶质细胞还是星形胶质细胞都在外周神经损伤所致神经病理性痛中发挥了极其重要的作用。鞘内注射氯胺酮可通过抑制TLR3介导的小胶质细胞p-p38信号通路活化而缓解SNL所致神经病理性痛机械性痛觉过敏。脊髓背角星形胶质细胞Wnt-3a分子及其相应信号通路参与了外周神经损伤所致神经病理性痛慢性化进程，且阻断该信号通路可以治疗神经病理性痛。本研究结论提示将脊髓背角胶质细胞作为研究神经病理性痛靶点将会为临床治疗神经病理性痛提供全新方法和理念。
关键词: 神经病理性痛 ；脊神经结扎 ；小胶质细胞 ；星形胶质细胞 ；慢性化 ；Toll样受体3 ；氯胺酮 ；Wnt-3a ；Frizzled-4 ；β-catenin
被引量
10
摘要： 近年来，慢性痛的机制研究取得了长足的进展，大量的受体、通道、激酶系统在慢性痛的发生、发展中的作用逐渐被揭示。炎症或损伤后感觉神经元第一级突触的谷氨酸能突触的功能性变化在慢性痛的发展和维持中起关键作用[1]。在慢性疼痛中枢敏化的过程中，NMDA受体同样发挥着重要的作用。免疫组织化学研究显示NMDA受体广泛表达于中枢神经系统突触后神经元上，同时大量的研究表明，NMDA受体也同时表达在突触前终末以及背根节（dorsal root ganglion, DRG）神经元上[2-5]。DRG位于外周神经系统，位于其内的中、小型神经元，包括其胞体及中枢突和外周突的A和C纤维，主要负责感受和传递痛觉信息，因此又被称为痛感受器或伤害性感受器（nociceptor）。由于这些受体可被痛感受器自身释放的谷氨酸所激活，所以又被称为痛感受器的自身受体或自受体(autoreceptor)。脊髓背角突触前终末释放谷氨酸可被多种因素影响，其中激活I类促代谢型谷氨酸受体[6]、P2X3受体会导致突触前末梢释放谷氨酸增加，而激活μ-阿片受体[7]、α2肾上腺素能受体[8]、CB1大麻素受体[9]、GABAB受体[10]以及II类和III类促代谢型谷氨酸受体[11]都可以导致突触前谷氨酸释放的降低。谷氨酸能突触的功能主要能被三个因素影响：①突触前谷氨酸能神经元释放的谷氨酸量；②进入突触间隙中谷氨酸转运体摄取谷氨酸的比率；③突触后膜上功能性谷氨酸受体的数量[12]。在其他神经系统的研究表明，突触前NMDA受体可以调节海马、小脑等部位的突触递质释放[13-18]。Bardoniet等[3]在正常动物的脊髓薄片标本上的研究表明，激活外周传入末梢的突触前NMDA受体，可以抑制脊髓背角eEPSC的幅值，延长eEPSC的潜伏期；进一步表明突触前NMDA受体的激活可以抑制脊髓背角Lamina II神经元的突触传递[3],这一结果提示突触前的NMDA自身受体可能对痛觉信息的传入产生负反馈调节作用。因此，突触前末梢释放的谷氨酸可直接作用于突触前的NMDA受体，产生复杂多样的作用。传统观念认为其最主要功能是作为负反馈抑制突触前递质的释放，从而防止突触间隙的递质浓度过高。 前期研究表明，激活吗啡耐受大鼠的突触前NMDA受体可以增强突触前末梢谷氨酸的释放[5]。在癫痫动物模型上，激活前脑突触前NMDA受体也可以导致突触前末梢谷氨酸的释放增加[19,20]。免疫组织化学和免疫印迹实验结果发现在损伤或炎症诱发的慢性痛状态下，痛感受器NMDA自身受体的表达水平明显升高[4,21-23]。功能学研究结果显示慢性痛状态下痛感受器NMDA自身受体的功能活动呈现明显增强，例如，实验性结肠炎诱发痛感受器NMDA自身受体的磷酸化水平显著升高、NMDA诱发的内向电流幅度和细胞内钙浓度明显上升[4]。这些研究结果均提示慢性痛状态下，痛感受器NMDA自身受体的功能状态显著增强。鞘内注射NMDA激活突触前NMDA受体可以导致外周终末释放P物质[24]。Yan等[25]发现，在外周损伤的情况下，突触前NMDA受体活动的增强则可以提高突触前谷氨酸的释放。在病理状态下，已有的行为学研究显示，局部注入NMDA受体拮抗剂对炎症或损伤诱致的痛过敏和神经元放电增强具有显著的抑制作用而非增强作用[26-28]。这些结果提示在炎症或损伤的情况下，突触前NMDA受体可能发生了活动依赖性改变，即在脊髓浅层由生理状态转为炎症病理状态时，突触前NMDA受体对突触传递的抑制效应转变成兴奋效应。尽管上述结果提示外周部位的NMDA受体可能在病理状态下具有致痛敏作用，但这些结果均来自于外周局部注入NMDA受体拮抗剂，而这些拮抗剂的特异性、作用时程以及确切的作用靶点都难以确定，因此上述结果还不能确切揭示痛感受器NMDA自身受体在病理状态下的具体作用及功能。综上所述，为了特异性地揭示痛感受器NMDA自身受体是否在慢性病理性痛中发挥着致痛敏作用，我们应用Cre-loxP技术在痛感受器上建立了条件性敲除NMDA自身受体的必需组分——功能亚单位NR1基因的转基因动物模型，即特异性地剔除痛感受器NMDA自身受体的正常结构和功能，而保留中枢神经系统以及非神经系统的NMDA受体结构和功能完整。 本研究在痛感受器上建立了条件性敲除NMDA自身受体的转基因动物模型，进一步研究突触前NMDA受体在生理状态以及病理状态下对伤害性感受神经元第一级突触的作用，从而研究病理过程中的突触前NMDA受体的活动依赖性改变，为进一步认识NMDA受体的作用和功能奠定基础。 有研究表明脊髓背角浅层的突触后神经元上的离子通道变化在慢性痛的中枢敏化过程中发挥重要作用。突触后神经元内Ca2+浓度的动态变化可以编码突触前后神经元的动作电位时序，进而启动引起突触传递效率改变的胞内过程[29-31]。一般认为，重复在EPSP之后刺激突触后神经元产生动作电位可以高度激活突触后NMDA受体，产生大幅度的Ca2+内流，激活钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKII)而导致LTP的产生。因此，突触后NMDA受体的功能性改变对中枢敏化的产生及发展起关键性作用。 CCL2又称为单核细胞趋化因子-1(monocytes chemoattractant protein1,MCP-1)，其可以招募单核细胞到达炎症、感染、外伤、局部缺血等部位。大量实验表明CCL2与疼痛密切相关[32-35]。电生理实验发现在培养DRG神经元上充灌CCL2可以导致细胞内钙离子浓度增加[36]。同时表现出神经病理性痛行为的动物DRG神经元在给予CCL2后可发生显著的去极化[35,37]。CCL2导致的痛感受器敏化可能是由于其激活了TRP通道以及抑制了K+电导[37-39]。Yang等的研究表明，CCL2抑制了一种电压依赖的不失活的外向流，推测可能是外向整流钾电流[40]。CCL2通过轴浆运输从DRG输送到外周神经终末，从而在皮内注射CCL2也可以直接导致机械痛敏反应的增强[41]。同时大量的研究表明，外周神经损伤后，CCL2可能作为一种神经调制，从外周神经到脊髓背角具有活动依赖性释放的特征[34,42,43]，即不同的病理条件可以通过调节CCL2的释放，进而影响病理性过程。 也有研究表明，CCR2也表达在脊髓背角神经元胞体[43,44]。但是神经元胞体上的CCR2结合了CCL2后如何发挥功能尚未见报道。我们的研究进一步发现，CCL2可以结合脊髓背角神经元上的CCR2，通过进一步激活细胞外信号相关蛋白激酶(extracellular signal regulated kinases，ERK)信号通路，从而导致脊髓背角突触后神经元NMDA受体通道功能的上调，进而对慢性痛发挥进行调节，而这种作用主要是通过NR2B亚单位介导的。炎症条件下，花生四烯酸可以通过Cox酶解产生前列腺素(prostglandin，PG)，其中前列腺素E2(PGE2)参与炎症反应，并可以刺激外周神经末梢引起痛觉敏化，而Cox-2的表达在炎症刺激下显著升高。而抑制Cox-2即可以抑制PGE2。研究表明，在海马PGE2可以作用于突触前EP2受体从而导致突触前谷氨酸释放的增加[45]。大量研究表明，PGE2可以诱导CCL2/MCP-1的释放[46,47]。本研究结果表明，CCL2诱导的脊髓背角突触后神经元NMDA电流增强的作用不能被Cox-2阻断剂完全阻断，因此CCL2可直接作用于神经元胞体，通过ERK调节NR2B从而导致中枢敏化。 第一部分痛感受器NMDA自身受体的致痛敏作用及其机制 在慢性疼痛的中枢敏化过程中，NMDA受体发挥着重要的作用。大量结果提示外周部位的NMDA受体可能在病理状态下具有致痛敏作用，但是应用拮抗剂进行研究具有一定的局限性。目前的研究结果还不能确切揭示痛感受器NMDA自身受体在病理状态下的具体作用及功能，因此我们拟用在痛感受器上条件性敲除NMDA自身受体的转基因动物模型，进一步研究突触前NMDA受体在生理状态以及病理状态下对伤害性感受神经元第一级突触的作用，旨在研究病理过程中的突触前NMDA受体的活动依赖性改变，为进一步认识NMDA受体的作用和功能奠定基础。 结果如下： 1.建立SNS-NR1-/-小鼠 我们应用Cre-loxP技术在痛感受器上建立了条件性敲除NR1亚单位的转基因动物模型。电生理实验中，灌流给予NMDA可在NR1fl/fl小鼠中IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元上诱致一显著的内向电流，并且对NMDA受体拮抗剂AP5敏感；而NMDA诱发的内向电流在SNS-NR1-/-小鼠中几乎被完全阻断，说明在DRG神经元上，伤害感受性神经元的NMDA受体功能被完全敲除，而其他非伤害性感受神经元上的NMDA受体功能未受影响。 2.行为学表型 通过行为学研究发现，NR1fl/fl小鼠与SNS-NR1-/-小鼠的正常机械性痛域和热痛域没有显著性差异。在后肢足底皮下注射Capsaicin诱致的急性自发痛反应过程中，NR1fl/fl小鼠与SNS-NR1-/-小鼠在反应时间上也没有显著差异。Formalin诱致的第二相持续性自发痛反应程度在SNS-NR1-/-小鼠中显著低于野生型小鼠，而后肢足底注射CFA诱致的机械性痛域和热痛域则明显弱于野生型小鼠。 3.机制探讨 在DRG上应用全细胞膜片钳记录神经元，用串刺激使神经元释放谷氨酸，在串放电之后可以见到明显的内向电流，并且这个内向电流可以被NMDA受体阻断剂AP5所阻断。说明DRG释放的谷氨酸可以作用于周围神经元或者自身NMDA受体并发挥功能。 NR1fl/fl小鼠与SNS-NR1-/-小鼠的IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元静息膜电位、基强度以及阈值都没有显著差异。在CFA足底注射24h后，NR1fl/fl动物神经元的静息膜电位、基强度以及阈值显著降低，而SNS-NR1-/-动物的IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元的静息膜电位、阈值显著降低，但是基强度无变化。而在对照组中，NR1fl/fl小鼠及SNS-NR1-/-小鼠中DRG神经元的静息膜电位、基强度以及阈值无显著变化。 研究发现，在NR1fl/fl小鼠，IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元在采用不同斜率的斜波注入电流引起的神经元放电的个数在CFA注射24h后显著升高，而在SNS-NR1-/-小鼠IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元，CFA足底注射24h后并无显著变化。 通过电生理实验给予背根2Hz低频条件刺激，在NR1fl/fl小鼠向PAG投射的脊髓背角I层神经元上可诱导长时程增强现象(LTP)。而在特异性敲除突触前NMDA受体的SNS-NR1-/-小鼠上，向PAG投射的脊髓背角I层神经元上的LTP被显著抑制。 第二部分CCL2对脊髓背角Lamina II突触后神经元NMDA受体的直接作用 本文拟对脊髓背角Lamina II神经元NMDA受体进行检测，观察单核细胞趋化因子-1(MCP-1)对脊髓背角Lamina II神经元NMDA受体的作用，进一步阐释炎性致痛敏过程中，激活小胶质细胞以及星形胶质细胞释放的细胞因子、趋化因子不仅仅可以通过作用于小胶质细胞本身增强突触后神经元的反应性，也可以通过趋化因子直接作用于突触后神经元胞体，从而通过直接调控突触后胞体上NMDA受体的表达来调控神经元的反应特性，突触后NMDA受体的活动依赖性改变可以进一步引起中枢敏化，造成炎性损伤。 结果如下： 1. CCL2诱致动物痛行为反应增强 对11只8w C57BL/6动物进行行为学检测发现CCL2可以诱导痛行为增强。给予C57BL/6小鼠单次鞘内注射100μl的CCL2可以诱发炎症痛敏反应，导致缩足反射的潜伏期缩短。应用CCL2的天然受体CCR2的拮抗剂RS504393，可以抑制CCL2诱发的炎性痛敏反应。 CFA注射1d后，C57BL/6表现出持续的机械痛敏及热痛敏行为学表型。而腹腔注射RS504393后，CFA导致的机械痛敏及热痛敏被显著地抑制。CFA注射1d后，C57BL/6表现出的持续机械痛敏及热痛敏可以被NR2B的抑制剂Ifenprodil所阻断。
关键词: 慢性痛 ；N-甲基-D-天冬氨酸受体 ；突触前NMDA受体 ；突触后NMDA受体 ；单核细胞趋化因子-1 ；长时程增强作用
被引量
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摘要： 背景现今全世界1/6以上的人口遭受着持续或反复发作的慢性疼痛的折磨,生活质量受到严重影响。其中神经病理性疼痛,由于病程长、病因复杂和机制不明确的因素,导致目前针对它的治疗方法,包括神经阻滞治疗、外科治疗和物理疗法等均难以让人满意。寻找有效安全的治疗方法成为研究热点。2011年国际疼痛研究协会对神经病理性疼痛给出新定义：神经病理性疼痛是指躯体感觉神经系统的损伤或疾病所引起的疼痛。脊髓背角(spinal cord dorsal horn, SCDH)作为外周神经损伤进展为高级中枢病理改变的中间桥梁,是神经病理性疼痛中枢致敏的关键因素,也一直是神经病理性疼痛药物治疗研究的靶点。其中,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)在脊髓背角的过度表达,是神经病理性疼痛发生发展机制里的重要环节。外周神经损伤可导致脊髓背角神经元nNOS的过度表达,并伴有痛觉异常和痛觉过敏。全身或局部鞘内注射非特异性NOS抑制剂或选择性nNOS抑制剂,可以脊神经结扎或缓解坐骨神经慢性压迫模型中神经病理性疼痛的痛敏反应；而nNOS基因敲除鼠没有表现出神经损伤所诱导的机械痛敏。机体神经受到损伤,伤害性刺激信号传入到脊髓,产生过量兴奋性氨基酸与NMDA受体结合,激活NMDA受体,促进Ca2+内流从而激活nNOS。一方面通过催化L-精氨酸产生的一氧化氮(nitric oxide, NO),另一方面通过蛋白结构域与NMDA受体和突触后蛋白PSD等物质相互作用。nNOS参与了多种神经生理和病理过程,包括参与突触传递、可塑性的调节、海马的长时程增强、神经元的凋亡与再生、介导神经损伤和神经变性过程[虮。这种初级感觉神经元的病理改变,引起初级中枢敏化和突触重塑,最后导致高级中枢大脑皮层持久性功能改变。以小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)沉默nNOS过度表达或成为治疗神经病理性疼痛的有效途径。但由于缺乏可靠的基因载体,siRNA基因治疗的临床应用仍然受到极大限制。近年来,细胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPPs)作为基因传递工具受到广泛关注,CPPs能将siRNA等以非受体依赖的方式导入胞内发挥生物学效应。HIV-Tat (HIV transactivator of transcription)是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因编码的反式转录激活因子,是当前最受瞩目、研究最为深入的CPPs之一。富含碱性氨基酸的多肽片段,具有CPPs的穿膜活性,能将与之连接的基因片段高效快速地导入胞内,且不影响细胞的正常结构和功能,具有转染效率高、毒性低、稳定性好等优点。第49-57位(RKKRRQRRR)9个氨基酸是其发挥穿膜功能的核心序列。Alain Pluen等发现Tat核心序列经膜活化多肽LK15 (KLLKLLLKLLLKLLK)修饰融合形成的细胞穿膜肽Tat-LK15,其运载siRNA转染细胞的能力得到极大改善。因此,Tat-LK15或许可以作为一种良好的siRNA运载工具,明显优化RNA干扰技术在治疗神经病理性疼痛等方面的应用。我们推测Tat-LK15可以成为神经系统生物应用的良好基因载体。目的通过探讨离体条件下细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA对神经细胞的转染效率,细胞毒性和干扰效能,为Tat-LK15作为基因载体为介导基因治疗提供理论依据。进而探讨细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA干扰大鼠脊髓背角nNOS表达治疗神经病理性疼痛的可行性,为神经病理性疼痛的基因治疗提供新思路新策略。方法1.细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA的转染效率和细胞毒性初步研究。根据Alain Pluen Tat-LK15序列为RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLKLLK,由厦门博欣生物生物科技有限公司合成,检测纯度为86.59%。通过与LipofectamineTM RNAiMAX(Lipo)比较,探讨细胞穿透肽Tat-LK15对人肾上皮细胞(human embryonic kidney 293T cells,293T)和大鼠视神经节细胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)转染siRNA的效率和细胞毒性。①.Tat-LK15和siRNA以质量比为1：3、1：2、1：1、2：1、3：1混合孵育后经20%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过凝胶阻滞分析测定Tat-LK15与siRNA的最佳交联比。②.以羧基荧光素(Carboxyfluorescein,FAM)标记的siRNA为报告基因,Tat-LK15与siRNA的质量比分别为1:2、3:4、1:1、4:3、2:1(μg/μg),Lipo与siRNA剂量比分别为1:1、2:1、3:l、4:1v5:1(μL/μg),转染293T和RGC-5两种细胞。转染24h后,倒置荧光显微镜检测FAM显色并拍照,计算转染效率：每孔寻找3个代表性视野,各观察100个细胞,计算阳性细胞率。并以CCK-8法检测同等浓度下细胞存活率评估Tat-LK15细胞毒性。2.离体条件下细胞穿透肽Tat-LK1 5运载siRNA沉默RGC-5细胞神经元型一氧化氮合酶(nNOS)基因的表达。①.Tat-LK15与FAM-siRNA质量比为3：4、1:1.2:1孵育转染RGC-5细胞,与LipofectamineTM RNAiMAx对照,流式细胞术检测Tat-LK15介导FAM-siRNA转染效率；于6孔板中不同剂量Tat-LK15(1μg、2.5μg、5μg、10μg和20μg)孵育RGC-5细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率。②.以缺氧缺糖(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)和高盐(浓度145 mmol·L-1)的处理方式制备nNOS高表达的细胞模型。将RGC-5细胞随机分为5组：对照组、模型组、Tat-S组(Tat-LK15运载nNOS/siRNA转染模型细胞)、Lipo-S组(LipofectamineTM RNAiMAX运载nNOS/siRNA转染模型细胞)及Tat-N组(Tat-LK15运载NCsiRNA转染模型细胞),通过Q-PCR及Western Blot检测各组细胞nNOS在mRNA和蛋白表达水平。3.细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA干扰大鼠脊髓背角nNOS表达治疗神经病理性疼痛。①. Tat-LK15介导FAM-siRNA转染原代大鼠脊髓背角神经元细胞(RN-dsc),倒置荧光显微镜观察其转染效果。②.健康雄性SD大鼠50只,随机分为5组(n=10)：正常组(Control,C组)、假手术组(Sham组)、神经病理性疼痛组(SNL组)、Tat-LK15 nNOS/siRNA组(TS组)和Tat-LK15 NCsiRNA组(TN组)。采用脊神经结扎法(SNL)制作神经病理性疼痛模型,C组不予任何处理,Sham组仅暴露脊神经；SNL组、TS组、TN组构建SNL模型同时鞘内置管,于第7d开始每天分别鞘内注射10μL生理盐水、10μL含5 μg siRNA的Tat-LK15 nNOS/siRNA和Tat-LK15 NCsiRNA,持续7天。建模前1d及建模后3、7、10和14 d,用Von Frey hair触觉测量套件测定各组大鼠50%机械性刺激缩足反应阈值(50%PWMT, g)的变化；用足底测试仪测定各组大鼠热刺激缩足潜伏期(PWTL, s);第14d测定结束后冰面上摘取L4-6节段脊髓背角,均分为两份,存放液氮中。采用荧光定量Q-PCR方法,检测各组大鼠脊髓背角中nNOS mRNA表达变化。采用western-blot的方法,检测各组大鼠脊髓背角中nNOS蛋白表达的变化。结果1.①.通过凝胶阻滞分析测定Tat-LK15与siRNA质量比为2：1时,Tat-LK15可完全包裹siRNA,达到最佳交联。②.随着Tat-LK15和Lipo剂量的增加,siRNA转染效率逐渐提高。与凝胶阻滞分析结果一致,当Tat-LK15与siRNA配比为2：1 (μg/μg)时,RGC-5细胞的转染效率达到最高[(87.3±4.5)%],但低于Lipo与siRNA配比为5:1(μg/μg)时的最高转染效率[(96.2±3.2)%(P<0.05)]；作用于293T细胞时,两转染试剂的最高转染效率Tat-LK15 (2:1)转染效率为(93.1±3.0)%与Lipo (5:1)组(98.2±1.6)%没有统计学差异(P>0.05)。转染试剂剂量增加,Lipo细胞毒性显著增加,而Tat-LK15毒性无明显变化。转染效率最高时,Lipo (5μL)组293T和RGC-5的细胞存活率仅为[(77.8±4.1)%,(73.4±7.7)%]显著低于Tat-LK15 (2:1)组同种细胞的存活率[(91.0±3.7)%,(90.0±6.1)%](P<0.05)。2.①.流式细胞术检测结果表明,Tat-LK15与FAM-siRNA (50 nmol·L-1)质量比为最佳交联比2：1(μg/μg)时,转染效率最高(84.4±3.9)%,低于Lipo5μL的(95.6±2.4)%(P<0.05)。当Tat-LK15剂量为20 μg (6.1 μmol·L-1)时才出现一定细胞毒性,细胞凋亡率高于对照组[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%,P<0.05]。②.经过缺氧缺糖高盐处理后RGC-5细胞nNOS蛋白表达显著增高(P<0.05)；单纯OGD处理nNOS表达无明显变化(P>0.05)。因此,缺氧缺糖高盐处理可以得到理想的nNOS高表达细胞模型。Tat-LK15 siRNA复合物转染模型细胞结果表明：与模型组相比,Tat-S组nNOS mRNA表达降低63.1%,蛋白表达降低58.9%,差异有统计学意义(P<0.05)。Tat-N组与模型组,Tat-S组与Lipo-S组nNOSmRNA及蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。3.①经神经细胞特异性物质微管相关蛋白2(MAP2)和DAPI免疫荧光细胞化学鉴定,在荧光倒置显微镜下观察大鼠脊髓背角神经元RN-dsc细胞：结果显示RN-dsc神经细胞鉴定纯度高；FAM-siRNA绿色荧光广泛分布,转染效率好。②.鞘内注射Tat-LK15 nNOS/siRNA复合物对神经病理性疼痛大鼠50%机械性刺激缩足反应阈值(50%PWMT, g)和大鼠热刺激缩足潜伏期(PWTL)的变化。模型制备前,5组大鼠50%PWMT和PWTL基础值差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术Sham组比较,造模后的SNL组、TN组和TS组在模型之后3～7 d 50% PWMT减少(P<0.01), PWTL缩短(P<0.01)；正常组C组50%PWMT和PWTL差异无统计学意义。术后7d开始鞘内给药后,与神经病理性疼痛模型SNL组比较,鞘内注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS组在10～14 d50%PWMT增加(P<0.01),PWTL延长(P<0.01)；而鞘内注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN组50%PWMT (P>0.05), PWTL (P>0.05)差异无统计学意义。Tat-LK15-nNOS siRNA复合物对神经病理性痛大鼠脊髓背角nNOS表达的影响。与假手术Sham组比较,制备模型后SNL组脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表达上调(P<0.01),正常大鼠C组脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。鞘内给药后,与神经病理性疼痛组SNL组比较,鞘内注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS组大鼠脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表达显著降低(P<0.01)；而鞘内注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN组大鼠脊髓背角nNOSmRNA及其蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.离体条件下,细胞穿透肽Tat-LK15可以成功介导siRNA转染多种细胞,Tat-LK15与siRNA质量比2：1为最佳交联比,
关键词: 细胞穿透肽 ；小干扰RNA ；神经元型一氧化氮合酶 ；神经病理性疼痛 ；基因治疗
摘要： 研究背景
骨癌痛是一种典型的癌痛,其主要临床表现为：持续的进行性背景痛(Ongoing pain),爆发痛(Breakthrough pain)、痛觉超敏(Allodynia)以及痛觉过敏(Hyperalgesia)。目前临床上针对骨癌痛的治疗以药物治疗为主,包括阿片类药物和NSAID类、类固醇类等辅助药物治疗,但是仍有大约45%的患者的疼痛不能得到有效缓解,其原因一方面是长期使用阿片类药物可引起细胞表面阿片受体减少,需要更大剂量的外源性阿片类药物激动,产生药物耐受现象以及恶心,呼吸抑制等不良反应,另一方面是由于骨癌痛的机制不同于神经病理性痛和炎性痛,它是神经病理变化、炎性反应和组织坏死等因素的综合结果,其发生机制比较复杂,单独用一种镇痛药物治疗常达不到理想效果。
骨癌痛发生机制包括外周和中枢机制,在外周,肿瘤生长压迫骨组织和骨膜,肿瘤细胞和局部炎性细胞可释放致痛性细胞因子,肿瘤组织高代谢状态引起的局部缺氧和酸性化等微环境的改变,这些因素都可激活外周伤害性感受器,产生疼痛信号。在脊髓和脊髓上中枢,胶质细胞活化、脊髓内源性阿片系统功能受抑制、广动力范围神经元的活化、神经元突触重塑和兴奋性神经电活动的增加以及细胞因子的表达上调等,这些因素都可导致骨癌模型的中枢敏化,从而形成骨癌痛。
近几年的研究发现,趋化因子(如CX3CL1、CCL2、CCL5等)的表达上调也是骨癌痛发生的必要因素,研究发现,采用CX3CR1中和抗体阻断CX3CR1受体功能,可缓解骨癌模型大鼠的痛觉过敏状态；采用CCL2或CCR2的中和抗体均可预防大鼠骨癌痛的发生；肿瘤周围和脊髓CCL5的上调表达也是大鼠骨癌痛的诱导因素。本课题组前期实验中,基因芯片检测骨癌痛大鼠脊髓内的差异表达基因,发现趋化因子CXCL10及其受体CXCR3的表达水平在骨癌痛模型建模后7、14和21天表达均明显升高。由此我们推测,CXCL10的表达上调可能在骨癌痛的发生过程中扮演着重要角色。基于此,本研究将探讨CXCL10在大鼠骨癌痛的发生中的作用及其机制,并进一步研究CXCL10对癌痛治疗的常见药物——吗啡的镇痛作用的影响,以期寻找癌痛治疗的新靶点和新的治疗策略。
研究方法和结果
1.脊髓CXCL10/CXCR3通路在大鼠骨癌痛的发生中的作用
方法：
实验一、建立大鼠骨癌痛模型,分别采用real-time PCR和免疫荧光染色检测7、14和21天等时间点脊髓CXCL10和CXCR3的表达变化；实验二、给正常大鼠鞘内注射20ng CXCL10重组蛋白外源性上调脊髓内CXCL10的表达水平,观察其对大鼠机械痛阈的影响；实验三、自骨癌痛模型建立后第一天开始,分别给大鼠鞘内注射100ngCXCL10中和抗体和20μg CXCR3受体拮抗剂-AMG487以阻断CXCL10或CXCR3的功能,分别在1、3、5、7、10和14天测痛,观察对大鼠骨癌痛发生的影响。
结果：
在大鼠骨癌痛模型建立后7、14和21天脊髓CXCL10和CXCR3mRNA和蛋白的表达均明显升高,且在第14天表达上调最为明显,免疫组化结果显示,骨癌痛大鼠的对侧和术侧脊髓背角中CXCL10和CXCR3的表达均明显增加。给正常大鼠分别鞘内注射20ngCXCL10重组蛋白或10μL生理盐水(saline)后,与naive组和saline组相比,在给药后5mmin开始,CXCL10重组蛋白组大鼠的机械触觉痛阈明显下降(P<0.05),痛阈下降可持续到2h,说明CXCL10具有致痛作用。白骨癌痛模型建模后第1天至第14天,每日给大鼠分别鞘内注射CXCL10中和抗体和CXCR3受体拮抗剂AMG487,均可有效预防骨癌痛大鼠的痛阈下降(P<0.05),说明CXCL10/CXCR3通路的活化参与骨癌痛的发生过程。
2.小胶质细胞活化在CXCL10介导的大鼠骨癌痛发生中的作用
方法：
实验一、采用免疫荧光双标方法检测CXCR3和神经细胞标记物-NeuN(神经元标记物)、GFAP(星形胶质细胞标记物)或CD11b(小胶质细胞标记物)的共表达情况；实验二、建立大鼠骨癌痛模型,自建模后第1天开始,多次鞘内注射CXCR3受体拮抗剂-AMG487(20μg),在第14天取材,采用免疫组化方法观察脊髓小胶质细胞活化的状态；实验三、建立大鼠骨癌痛模型,分别在建模后1-7天或10-14天鞘内注射小胶质细胞抑制剂-米诺环素50μg(1次/),在第7天或14天米诺环素给药后30min给大鼠鞘内注射CXCL10重组蛋白20ng,测痛观察各组大鼠机械痛阈的变化。
结果：
免疫荧光双标方法检测结果显示,CXCR3可与神经元标记物NeuN大量共表达,广泛分布于大鼠脊髓灰质；CXCR3还可部分地与小胶质细胞标记物CDllb共表达,共表达细胞主要分布在脊髓Ⅳ-Ⅷ板层,说明CXCR3在脊髓主要表达在神经元上,还有一部分表达在小胶质细胞上。CIBP-vehicle组大鼠的脊髓小胶质细胞活化明显,表现为细胞分支变粗,细胞胞体变大,而采用AMG487阻断大鼠脊髓CXCR3的功能后,骨癌痛大鼠的小胶质细胞活化被抑制,说明阻断CXCR3功能可抑制骨癌痛大鼠的脊髓小胶质细胞活化。米诺环素可缓解骨癌痛大鼠早期和中晚期的痛觉敏化(P<0.05),米诺环素预处理对骨癌痛早期CXCL10重组蛋白诱导的痛阈下降没有明显的缓解作用,但可在骨癌痛进程的中晚期阻断CXCL10重组蛋白诱导的痛阈下降(P<0.05),提示在骨癌痛中晚期小胶质细胞活化参与了CXCL10诱导的痛觉敏化。
3. CXCL10对吗啡镇痛作用的影响
方法：
实验一、建立大鼠骨癌痛模型,在第14天先鞘内注射saline10μL或CXCL10中和抗体100ng,30min后鞘内注射吗啡10μg,采用Von Frey丝给各组大鼠测机械痛阈变化；实验二、给正常小鼠鞘内注射生理盐水10μL或小鼠CXCL10重组蛋白(rmCXCL10)30ng后,随后立即皮下注射吗啡10mg/kg,分别在给药前,给药后15、30、60、90和120min等时间点测机械痛阈。
结果：
鞘内注射CXCL10中和抗体和吗啡都可以缓解骨癌痛的痛觉过敏状态(P<0.01),而预先给予CXCL10中和抗体阻断CXCL10功能后,鞘内注射吗啡的镇痛作用明显增强(P<0.01)。saline-吗啡组小鼠的PWTs在15min后开始升高,在60min时上升到最高水平(14.17±2.04g),CXCL10重组蛋白干预的小鼠给予吗啡后,在60min时PWTs仅达到7.00±2.76g(P<0.01),说明吗啡的镇痛作用可被鞘内注射CXCL10重组蛋白减弱。
4.统计学处理
采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示；两组数据之间比较采用t检验,多时间点多组数据之间比较采用重复测量设计的方差分析(ANOVA repeated measurement),分析后采用LSD法检验统计学意义,P<0.05为差异有统计学意义。
研究总结
一、主要研究结果
1.骨癌痛大鼠脊髓内趋化因子CXCL10及其受体CXCR3表达上调；脊髓内CXCL10外源性过表达可引起正常大鼠的痛觉敏化,阻断CXCL10/CXCR3功能可预防骨癌痛的发生。
2. CXCR3表达于脊髓神经元和小胶质细胞中,阻断CXCR3功能可抑制骨癌痛大鼠脊髓内小胶质细胞的活化；抑制小胶质细胞活化可缓解骨癌痛晚期CXCL10重组蛋白诱导的痛觉过敏状态,并抑制骨癌痛大鼠脊髓内CXCL10的表达上调。
3.阻断CXCL10功能可增强吗啡对骨癌痛大鼠的镇痛作用,而鞘内注射CXCL10重组蛋白可减弱吗啡的镇痛作用。
二、研究结论
1.脊髓内CXCL10/CXCR3的上调表达参与骨癌痛的发生和维持；
2. CXCL10参与骨癌痛的发生与脊髓小胶质细胞的活化有关；
3. CXCL10的表达上调在癌痛的吗啡镇痛治疗起一个负性调节作用。
三、创新之处
1.本研究首次发现脊髓内CXCL10/CXCR3通路的活化可参与骨癌痛的发生,并且这一过程小胶质细胞活化有关,这为骨癌痛发生机制提供了新的进展和思路；
2.本研究首次发现了脊髓内CXCL10的表达上调对癌痛的吗啡镇痛治疗的负性调节作用。
四、展望
1.本研究发现脊髓CXCL10的表达上调参与了骨癌痛的发生过程,小胶质细胞活化参与了CXCL10功能的调节,继续深入解析CXCL10在骨癌痛形成过程中中枢神经系统内神经元-胶质细胞的cross-talk环路中的作用,有望进一步揭示骨癌痛的发生机制；
2.本研究发现CXCL10对骨癌痛的吗啡治疗起负性调节作用,在未来疼痛治疗中我们可结合骨癌痛复杂的发生机制对疼痛进行综合治疗,为临床上癌痛的治疗提供了新的启示。
关键词: 骨癌痛 ；CXCL10 ；致痛作用 ；小胶质细胞活化 ；吗啡镇痛
被引量
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摘要： 研究背景脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一类严重的中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤。流行病学研究表明,此类损伤多见于男性青壮年,最常发生于16-30岁的年轻人,车祸(40.4%)及高处坠落伤(27.9%)。脊髓损伤常造成患者生活质量严重下降,严重影响患者对生命的预期。在临床上,脊髓损伤呈现高发生率、高致残率、高耗费和低龄化的特点。为治疗SCI人们进行许多有益的探索,但至今,效果并不理想。急性SCI包括原发性和继发性两种损伤机制。原发性损伤是指受伤时由于椎骨的移位、脱位或者椎间盘突入椎管压迫脊髓或者骨折碎片刺伤脊髓而造成的脊髓的压迫和冲击,常引起脊髓的撕裂、挫裂及剪切,原发性损伤是在受伤当时即由外力产生,是不可逆的损伤。继发性损伤是在原发性损伤之后,由一系列的生物反应机制介导的复杂反应过程,常造成脊髓损害的进一步加重,其所产生的脊髓损害程度有时甚至超过了原发性损伤。继发性损伤的病理机制极为复杂,涉及到多种因素,且这些因素之间相互影响,交互作用,结果使最初病灶周围原来完整的组织发生自身破坏性病变。目前对继发性脊髓损伤的研究主要集中在以下的方面：损伤局部缺血缺氧、微循环改变,脊髓缺血后延迟性低灌注,免疫炎症反应,自由基反应及脂质过氧化等等。随着对SCI病理生理机制研究的深入,人们认识到脊髓损伤后的兴奋性氨基酸(EAAs)中毒起重要作用。在中枢神经系统内,兴奋性氨基酸(EAAs)神经递质主要包括谷氨酸(西u)和天门冬氨酸(Asp)。正常情况下它们存在于神经末梢的囊泡中,当神经冲动传达到神经末梢,引起神经末梢去极化时,通过Ca2+依赖方式间断地释放EAAs。释放入神经间隙的EAAs通过作用于特异性膜受体,引起一系列细胞第二信使的变化,从而将信息进一步往下传导。其本身则在内因酶的降解及重摄取过程中从突触迅速消除。EAAs在继发性脊髓损伤的神经毒素作用主要表现在两方面：一是在损伤后数小时内介导EAAs受体过度兴奋引起神经细胞急性渗透性肿胀,以Na+内流和CI-及水被动内流为特征；二是在损伤后数小时至数日内介导NMDAR过度兴奋所引起的神经细胞延迟性损伤,以Ca2+内流为特征,引起细胞内Ca2+超负荷,一方面可抑制线粒体生物氧化功能,ATP生成减少,加速磷脂酶降解,促进蛋白质溶解而直接引起神经细胞变性坏死；另一方面胞内钙超载,可产生大量的自由基,引发氧化应激反应。自由基化学性质活泼,氧化作用极强,严重破坏细胞膜正常结构,激活半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶家族(caspases),引起一系列酶的联级反应,最终导致细胞凋亡发生。SCI后轴突脱髓鞘,是脊髓损伤后另外一个重要的损伤机制,在脊髓损伤中也扮演着重要的作用。在中枢神经系统内,链鞘是由少突胶质细胞形成的包绕轴突的重要结构,轴突髓鞘化后,传导速度增加近100倍,有利于完成各种精细复杂的信息交流。同时,轴突髓鞘化后,有髓神经纤维保持跳跃式传导,节约了大量能量。而且,完整的髓鞘能限制谷氨酸盐及CD8+T细胞等对轴突的攻击。近年来的研究越发重视脊髓损伤后髓鞘及少突胶质细胞在神经修复中的作用。因此,寻求一种有效促进髓鞘组织再生的方法是脊髓损伤治疗的关键。然而,临床尚无促髓鞘形成的有效方法。目前NMDAR拮抗剂已被广泛应用在CNS损害所致神经元损伤。NMDAR离子通道的阻滞剂如氯胺酮、苯环已呱啶(phencyclidine)及MK-801能防止Ca2+进入细胞,避免胞内Ca2+超载及兴奋性毒性。NMDAR被用作治疗CNS损害的靶器,在急性SCI也有类似治疗作用机制。对脊髓损伤应用NMDAR拮抗剂(CPP)鞘内注射能有效地减轻神经功能和组织的损害,拮抗Na+、Ca2+内流,既可减轻神经细胞的损害,又可争取时间进行其他治疗。美金刚(memantine)是一种新型的具有低中度亲和力、电压依赖、非竞争性的NMDA(N-methy-D-aspastate)受体拮抗剂。化学名为1-氨基-3,5二甲基金刚烷胺,分子式为C12H21N·HC1,其相对分子质量为215.76,为纯白色或者白色粉末,溶于水。其最早是用于治疗中、重度的阿尔茨海默病(AD),随着研究的深入,美金刚逐渐用于其他疾病的治疗。美金刚作为NMDAR阻断剂,能有效阻断谷氨酸盐与其离子通道型受体的结合,减轻谷氨酸(Glu)病理性浓度升高导致的神经元损伤。美金刚在NMDAR中的结合位点与M矿有重叠,但与Mg2+不同,它与NMDAR的亲和力较低,使其结合后容易从受体中解离出来。另外美金刚具有电压依赖性,正常生理活动时,由于突触后膜的强烈去极化,使其从受体中解离出来,但在持续时间较长的中等程度的去极化时,比如在发生损伤时,美金刚仍将继续留在受体中,发挥封闭作用。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是一类来源于胚胎发育早期神经管腹侧神经上皮细胞,广泛分布于动物的中枢神经系统。少突胶质前体细胞作为成熟少突胶质细胞(OL)的祖细胞,能在多种因子的作用下迁移、分化为成熟的少突胶质细胞,参与中枢神经系统轴突髓鞘的形成,其较其他来源的干细胞有明显优势,OPCs移植是治疗脊髓损伤理想的细胞来源。鉴于研究已经证实OPCs中有NMDAR功能性表达,NMDAR介导的Ca2+内流也是脊髓损伤后OPCs死亡的主要机制。因此,本研究通过美金刚联合OPCs移植治疗脊髓损伤大鼠,一方面探讨美金刚能否阻断谷氨酸盐兴奋性中毒,减轻NMDAR的过度激活介导的氧化应激反应对脊髓的破坏；另一方面,探讨美金刚能否通过阻断谷氨酸盐对移植的OPCs的损伤,减少移植OPCs的死亡,促进移植细胞的存活与分化,更好发挥其髓鞘再生的功能。这将为脊髓损伤的治疗提供新思路。目的1、研究美金刚对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响及相关作用机制。2、通过美金刚联合OPCs移植治疗脊髓损伤大鼠,观察大鼠运动功能恢复,探讨损伤脊髓的氧化应激状态的变化及OPCs的存活与分化、轴突髓鞘再生情况。方法1、80只健康成年雄性SD大鼠,采用钳夹法建立大鼠T12脊髓损伤动物模型,并随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、美金刚组(C组)及MK-801组(D组),每组20只。术前及术后24h、72h、5d、7d进行运动功能BBB评分,并采用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸法检测损伤脊髓节段组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平；HE、尼氏染色观察损伤脊髓组织的病理学改变及Tunel法检测神经细胞的凋亡。2、原代培养获取足够数量的OPCs,并采用免疫荧光标记OPCs特异性抗体04进行鉴定。取健康成年雄性SD大鼠100只,采用钳夹法损伤大鼠T12脊髓节段,建立脊髓损伤动物模型,并随机分为模型组(A组)、PBS组(B组)、美金刚组(C组)、OPCs组(D组)、MEM+OPCs组(E组),每组20只。在完成美金刚注射后第1d、3d、5d、7d,每组大鼠各取5只取损伤段脊髓组织进行匀浆,进行SOD及MDA检测。造模完成后7天于损伤原位行OPCs移植。细胞移植后每周进行BBB评分,观察后肢的运动功能恢复；细胞移植后8周,进行免疫荧光双标记观察OPCs的存活与分化以及大鼠的髓鞘再生。结果1、脊髓损伤模型的建立实验过程中在动脉血管夹突然钳夹大鼠脊髓瞬间,大鼠尾巴出现短暂的连续性痉挛性摆动,双下肢短暂性连续性回缩样扑动,随后双下肢驰缓性瘫痪。钳夹脊髓处可见缺血暗区、水肿。脊髓损伤实验动物模型建立成功。2、少突胶质前体细胞(OPCs)的培养及鉴定原代培养第1天混合胶质细胞开始贴壁,第2天可见细胞成团贴壁生长,呈小圆形、卵圆形和多角形,第8-9天时可见明显的细胞分层现象,下层为融合成片的、铺满培养瓶底的星形胶质细胞,上层为紧密贴附在星形胶质细胞表面的OPCs, OPCs胞体呈小圆形、折光性较强,部分细胞伸出1、2个突起。通过振荡分离和差速贴壁等方法分离获得大量的OPCs,行OPCs免疫细胞化学检测鉴定,大部分细胞04抗体阳性。3、运动功能评分在第一部分实验中,美金刚干预组和MK-801干预组与模型组相比,大鼠后肢运动功能BBB评分显著增加,各时间点差异均具有统计学意义俨<0.05),但美金刚干预组与MK-801干预组在各个时间点BBB评分相比较差异无统计学意义(P>0.05)。在第二部分实验中,各实验组大鼠后肢运动功能BBB评分都随着时间延长,评分逐渐增加,美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组在各时间点上与模型组及PBS干预组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4、SOD、MDA检测在第一部分实验中,术后第1天各损伤组大鼠SOD值较假手术组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)；采用美金刚及MK-801干预72 h、5 d、7 d后,SOD水平逐渐上升,与模型组相比,差异显著(P<0.05),但第7d时,美金刚干预组、MK-801干预组与假手术组相比,SOD变化无显著性差异。美金刚干预组与MK-801干预组在各个时间点SOD值差异无统计学意义(P>0.05)。术后美金刚干预组、MK-801干预组MDA值逐渐下降,与模型组相比,各时间点MDA含量均具有显著性差异(P<0.05)。在第二部分实验中,SOD水平在模型组及PBS干预组中随着时间延长,SOD值逐渐降低；美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组SOD水平随着时间延长,SOD值逐渐升高,美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组在各时间点上与模型组及P3S干预组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。术后美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组MDA值逐渐下降,与模型组及PBS干预组相比,各时间点MDA含量均具有显著性差异(P<0.05)。5、HE、尼氏染色HE染色及尼氏染色结果发现假手术组各时间点大鼠脊髓组织结构未见明显异常；模型组脊髓组织灰质内可见大量出血灶,白质结构紊乱、出现空洞,灰白质交界不清楚,神经纤维排列疏松,神经细胞肿胀,间质可见炎性细胞浸润；美金刚干预组脊髓组织内也可见小量出血灶,细胞轻度肿胀,间质少量炎症细胞浸润；MK-801干预组脊髓组织内神经细胞轻度肿胀,神经纤维轻度疏松。尼氏染色可见模型组神经元、神经胶质细胞内尼氏体淡染、数量明显减少甚至消失,美金刚及MK-801干预组尼氏体结构规则,数量较假手术组稍减少。6、TUNEL细胞凋亡检测TUNEL法检测结果发现,术后第1天各损伤组大鼠神经凋亡细胞率较假手术组明显升高,差异有统计学意义(P>0.05)；随后各时间点美金刚干预组及MK-801干预组神经细胞凋亡率逐渐降低,3d、5d、7d较模型组差异有统计学意义(P<0.05),美金刚干预组与MK-801干预组在各个时间点神经细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。7、免疫荧光双标记观察OPCs的存活与分化镜下观察,CC1为成熟少突胶质细胞的标记物,在镜下被激发出红光,NG2为OPCs的标记物,在镜下被激发出绿光。美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组均可见到明显红光和绿光信号,联合干预组的阳性信号较其他组更为明显。8、免疫荧光双标记观察髓鞘的再生镜下观察,MBP为髓鞘的特异性标志物,在镜下被激发出黄光,NFM为轴突特异性标志物,在镜下被激发出绿光,各实验组均可见到髓鞘再生的荧光信号,美金刚干预组、OPCs移植组及联合干预组的髓鞘再生较模型组更为明显。9、统计学分析结论美金刚可以通过拮抗兴奋性谷氨酸盐毒性作用阻断过度激活的NMDAR功能,减轻大鼠脊髓损伤后氧化应激反应,减少脊髓损伤处神经细胞的凋亡,促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。美金刚联合少突胶质前体细胞(OPCs)移植治疗大鼠脊髓损伤,能有效地促进移植的少突胶质前体细胞存活与分化,促进髓鞘再生。
关键词: 美金刚 ；少突胶质前体细胞(OPCs) ；脊髓损伤 ；兴奋性氨基酸毒性作用 ；轴突再髓鞘 ；NMDARs
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