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摘要： 禽致病性大肠杆菌(Avain pathogenic Escherichia coli,APEC)是肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)的重要成员,是引起禽类局部或全身性感染的急、慢性传染性细菌病的重要病原。APEC与新生儿脑膜炎大肠杆菌(NMEC)的基因型具有高度同源性,两者的多种毒力基因相似,均可引起宿主脑膜炎。基因毒素Colibactin是细菌产生的一种杂合非核糖体肽/聚酮化合物次级代谢产物,可引起真核细胞染色体不稳定和DNA损伤,其由pks基因岛(clbA至clbS共19个基因)编码合成,而pks基因岛与B2族肠外致病性大肠杆菌的毒力因子(黏附素、溶血素、毒素和铁载体)密切相关,均是导致大肠杆菌性脑膜炎重要的毒力因子,但Colibactin是否与APEC脑膜炎的发生直接相关并不清楚。ClbA是Colibactin合成中的一种磷酸泛肽基转移酶(PPTase)。ClbC是一种编码Colibactin的PKS模块中独特结构的酶。本文利用Red同源重组系统构建了 clbA、clbC缺失株与回补株,探索clbA和clbC基因对Colibactin合成的影响。结果发现,clbA和clbC基因缺失株分别与bEnd.3细胞相互作用时,巨细胞增多症和H2AX组蛋白磷酸化的现象与野生株相比明显减弱,表明clbA、clbC基因的缺失减少了细胞DNA的损伤,影响了 Colibactin的正常合成,说明clbA、clbC基因是Colibactin合成的关键基因。ClbA作为Colibactin合成的关键酶,还可以促进铁载体的产生。RyhB是一种调节细菌铁稳态的非编码小RNA,可调控大肠杆菌clbA的表达。但RyhB对clbA的具体调控机制,以及RyhB是否参与Colibactin装配线上其他基因的调控还不清楚。为此,本研究构建了 APEC ryhB缺失株和回补株,利用qRT-PCR检测了野生株和ryhB缺失株中clbA和clbC基因的转录,结果发现ryhB基因的缺失导致clbA和clbC的表达下调。通过生物信息学预测及双质粒荧光报告系统研究RyhB对clbA和clbC的调控机制,结果显示RyhB对clbA的表达起直接调控作用,而对clbC的表达起间接调控作用。表明Colibactin的合成受RyhB调控。为研究Colibactin是否与APEC脑膜炎的发生直接相关,RyhB作为clbA的调节子是否通过调节Colibactin合成影响APEC致病性。本文利用APEC野生株,clbA,ryhB缺失株和回补株感染小鼠试验检测了一系列脑膜炎相关指标。结果发现,与野生株相比,clbA与ryhB缺失株感染的小鼠角弓反张等神经症状明显减少或消失,血脑屏障通透性未被明显破坏,脑部等各脏器的载菌量以及脑组织中炎症因子的表达均明显下降。clbA回补株很大程度上恢复了其毒力作用,ryhB回补株的毒力也有一定的恢复。以上结果表明clbA和Colibactin与APEC引起的脑膜炎的发生直接相关。而RyhB虽然负调控clbA的转录,但同样与脑膜炎发生相关,推测RyhB通过上调Colibactin以外的其他致脑膜炎相关的毒力基因增强了 APEC XM的致病性。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；Colibactin ；clbA ；RyhB ；调控 ；致病性
摘要： 禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli, APEC）是一种重要的肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC），该菌能与多种病毒或其他细菌混合感染，引起禽类出现腹膜炎、心包炎、脑膜炎和败血症等严重的呼吸道症状或全身性感染，给养禽业的发展造成严重的经济损失。该菌与致新生儿脑膜炎大肠杆菌（Neonatal meningitis E. coli, NMEC）同源性较高，具有跨物种传播的潜质。由于APEC潜在的人畜共患性严重威胁公共卫生和食品安全，现已引起全球的广泛关注。因此，加强APEC防控研究意义重大且迫在眉睫，而研究新型、有效的防控措施首先要深入、全面地认识APEC的致病机制。 细菌非编码小RNA（Small non-coding RNAs，sRNAs）是一类长度介于40~500 nt不编码蛋白质的 RNA 分子，是细菌响应外界环境变化进而做出迅速应答的适应性调控因子。现有的研究表明，sRNAs主要参与细菌新陈代谢的调节、群体感应的调控、细菌耐药性的调控等多个方面。近年来随着多组学技术的迅速发展，sRNAs在调控致病性大肠杆菌毒力基因表达中发挥的作用也得到了初步探索，但有关APEC 菌株中 sRNAs调控经典毒力基因尤其是荚膜相关基因的研究尚未有报道。本研究通过对APEC 致病过程中发挥重要调控作用的潜在 sRNAs进行筛选鉴定，获得一个新型sRNA分子，并初步探索了其生物学功能及其调控APEC毒力的分子机制。 1. 新型sRNA60的鉴定及其对APEC XM菌株毒力的影响 本研究首先对实验室前期通过RNA-seq测序获得的APEC XM菌株中的89个候选sRNAs进行基于长度和结构的预筛选，进一步通过Northern Blot技术进行验证，并结合RNAfam数据库的比对结果，确定一个稳定表达的新型 sRNA，命名为 sRNA60。我们进一步通过 5’，3’-RACE确定该 sRNA 的转录起始和终止位点，并利用 RNAfold 软件预测了该 sRNA 的二级结构。NBlast比对结果显示，sRNA60广泛存在于K1型致病性大肠杆菌中，且序列高度保守。为研究sRNA60对APEC毒力的影响，我们构建了sRNA60缺失株及其回补株，分别对禽类（以雏鸡为模型）和哺乳动物（以小鼠为模型）进行体内攻菌试验，同时也比较了野生株、sRNA60 缺失株和回补株在鸡血清和人血清中的抗血清杀伤的能力。体内、体外的结果均显示，在缺失sRNA60后APEC XM菌株的毒力极显著下调。本研究表明sRNA60是一种具有调控APEC XM菌株毒力的新型sRNA分子。 2. sRNA60靶基因的筛选与鉴定 为确定sRNA60调控的靶基因，我们通过差异蛋白质组学技术对野生株和sRNA60缺失株之间差异表达的蛋白质进行了鉴定，以明确sRNA60调控的靶基因。结果显示，与野生株相比，sRNA60缺失株中共有10种蛋白发生2倍以上的显著上调表达，12种蛋白发生2倍以上的显著下调表达。结合IntaRNA软件的预测，我们选取在sRNA60缺失株中发生2.7倍显著下调表达的荚膜相关蛋白KpsM作为sRNA60的潜在调控靶标。Western Blot结果显示，在缺失sRNA60后，KpsM表达水平显著下降，这一结果与蛋白组数据一致。为进一步研究sRNA60对靶基因kpsM mRNA的调控作用，我们一方面通过翻译融合实验比较了KpsM 在野生株、sRNA60 缺失株及其回补菌株中的表达量，结果显示，与野生株相比，KpsM在 sRNA60 缺失株中显著下调表达，而在回补株中表达量恢复到野生株水平。此外，我们还利用IntaRNA软件对sRNA60与kpsM mRNA的杂交热点区域进行了预测，并通过RNA-RNA凝胶阻滞迁移率试验（REMSA）证实sRNA60可以与包括杂交热点区域在内的kpsM mRNA片段直接结合。以上结果表明，sRNA60对靶基因kpsM具有直接正向调控的作用。 3. sRNA60对KpsM作用机制研究 为了研究sRNA60正向调控kpsM mRNA的分子机制，我们首先测定了sRNA60缺失前后kpsM mRNA的半衰期。结果表明，sRNA60的缺失对kpsM mRNA的半衰期并没有显著影响。据此，我们推测，sRNA60可能通过调控kpsM mRNA的翻译起始进而正向调控KpsM表达。因此，我们对kpsM mRNA的二级结构进行了预测，发现其SD序列与其5’ UTR区域通过碱基互补配对形成SD-antiSD结构，该结构可能阻碍了核糖体结合于kpsM mRNA链，进而影响了kpsM mRNA的翻译起始。而sRNA60通过与kpsM mRNA链上SD-antiSD结构附近的碱基结合，解除了原有的翻译抑制，使核糖体能够与kpsM mRNA链上的RBS区域正常结合，从而促进了kpsM mRNA的翻译起始。我们通过对antiSD序列进行突变初步验证了这一猜想，但具体的调控机制仍待进一步的实验验证。同时，我们通过RNA-Protein EMSA证实Hfq蛋白与sRNA60直接结合，该结果表明Hfq蛋白作为一种重要的分子伴侣蛋白也参与sRNA60介导的调控。 本研究首次鉴定出具有调控禽致病性大肠杆菌荚膜基因表达的新型sRNA分子，并从分子水平阐明sRNA60调控禽致病性大肠杆菌毒力的分子机制。相关结果将为APEC菌株中sRNAs的研究奠定基础，为肠道外致病性大肠杆菌毒力调控机制的研究提供新视野。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；非编码小RNA ；毒力基因 ；基因表达 ；致病性
摘要： 禽致病性大肠杆菌(Avain pathogenic Escherichia coli,APEC)是肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)的重要成员,可引起禽类的心包炎、肝周炎、脑膜炎、败血症等,对养禽业危害巨大,APEC还是潜在的人畜共患病原体,对公共卫生构成潜在威胁。RyhB是一种大小为90 bp的非编码小RNA(sRNA),主要参与调控铁稳态,还可调控三羧酸循环、氧化应激、能量代谢、耐酸性和毒力基因表达等,前期研究发现RyhB有助于APEC致小鼠脑膜炎的发生,而病原菌抵抗血清杀菌,在血液中存活并引起菌血症是导致脑膜炎发生的前提。为探究RyhB是否在APEC抵抗血清杀伤过程中发挥调控作用及其调控机制,本研究分析了RyhB对APEC抵抗血清杀菌作用的影响,筛选出该过程中RyhB调控的靶基因并研究其调控机制,进一步研究了 RyhB是否通过调控血清抵抗相关基因调节APEC致病性,为APEC的致病机制研究和防控提供了理论基础。
首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定APEC XM在LB中振荡培养和鸭血清低氧(氧浓度2.5%)条件处理下ryhB的转录水平,结果发现ryhB在鸭血清中的转录水平显著高于LB培养基,表明血清诱导了 RyhB的表达。ryhB缺失不影响APEC XM在LB培养基中的生长,但能显著降低APEC XM在鸭血清中的存活,表明RyhB可响应血清和低氧的压力环境并大量表达,调控APEC XM抵抗血清杀伤作用,有助于APEC在此环境下存活。
为进一步探究RyhB调控APEC抵抗血清杀伤的机制以及筛选RyhB调控的靶标基因,我们对血清处理的APEC XM和ryhB缺失株进行转录组测序,分析ryhB缺失对APEC基因转录水平的影响,结果发现:ryhB缺失后,共有283个差异表达基因(Different Expression Genes,DEGs),其中147个上调基因,136个下调基因;差异表达基因GO富集分析结果显示,主要富集到细胞黏附、多糖运输、亮氨酸生物合成和铁离子稳态等生物过程;富集到4铁4硫簇结合、铁离子结合和电子转移活性等分子功能;细胞组成主要富集到菌毛。KEGG通路富集分析结果显示,主要与代谢和分子运输相关,包括双组分系统、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、ABC转运系统等通路。挑选10个差异表达基因进行qRT-PCR,结果发现转录组数据与qRT-PCR结果一致,证明转录组测序可信度较高,可做下一步分析。对差异表达基因分析发现ryhB缺失导致荚膜基因簇的14个基因表达量显著下降,最高降低200多倍,说明RyhB对荚膜基因有正调控作用,可能通过某种调控机制直接调控荚膜的合成。
利用双质粒荧光系统研究RyhB对荚膜基因的调控机制,结果发现ryhB可与荚膜基因簇kpsF5’UTR区碱基互补配对,从而激活促进荚膜基因翻译,促进荚膜合成,表明RyhB可直接调控荚膜基因合成。利用λ-Red重组技术成功构建了荚膜基因APEC XM Δneu单缺失株、APEC XM Δ ryhB Δneu双缺失株以及相应回补株,测定了ryhB和neu单、双缺失对APEC XM荚膜合成和抗吞噬能力的影响,结果显示,ryhB和neu的缺失均降低了 APEC XM抗吞噬的能力,双缺失株则更为显著;ryhB单缺失株的抗吞噬性略高于neu单缺失株,表明ryhB可调控荚膜的合成抵抗巨噬细胞吞噬;ryhB的缺失显著降低荚膜生成量、减弱了抵抗巨噬细胞吞噬功能。
雏鸭感染试验发现,与野生株相比,ryhB和neu缺失株均降低了对雏鸭的致病性;ryhB、neu基因双缺失株对雏鸭毒力下降更为显著;与neu单缺失株相比,ryhB单缺失株对雏鸭致病力更弱,具体表现在对雏鸭的临床症状和脏器病变程度减轻,血液和脏器载菌量下降。推测RyhB除了调控荚膜基因的表达,还可调控其他相关毒力基因的表达。基于ryhB和neu的缺失对APEC XM毒力的减弱效果,可为APEC减毒活疫苗的开发提供材料和基础。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；RyhB ；RNA-seq ；荚膜 ；调控机制 ；致病性
摘要： 肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是人类和畜禽重要感染性病原,能够引起机体的系统性感染,包括脑膜炎、尿路感染、菌血症、败血症等,危害人和动物健康,造成公共卫生隐患,带来严重经济负担。与共生性大肠杆菌相比,ExPEC编码一系列毒力因子,来保证其能够在宿主体内逆境中生存和引发感染。
机体的先天免疫系统在识别和清除入侵微生物方面至关重要。宿主内的低铁环境限制病原菌对铁这一必需营养元素的摄取,阻碍病原在宿主中的定植和存活。补体系统是先天免疫反应的核心组成部分,不仅能够直接裂解病原菌,还能通过免疫调理作用促进巨噬细胞对病原的吞噬。ExPEC包括尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli,UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(neonatal meningitis E.coli,NMEC)、败血症型大肠杆菌(Septicemic E.coli)、猪源肠外致病性大肠杆菌和禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicE.coli,APEC)。不同致病型ExPEC在血清型、毒力因子、致病机制等方面相似性极高。ExPEC能克服营养限制、绕过宿主的补体攻击,导致宿主的系统性感染。探索ExPEC逃逸铁限制性环境和补体攻击的机制有助于进一步阐明细菌的致病机制,为大肠杆菌的防控提供理论依据。
1.ExPEC结合转铁蛋白利用铁对其生长和存活的影响
转铁蛋白(TF)是宿主中重要的含铁蛋白,一些病原菌能够通过结合TF来获取铁。研究发现ExPECRS218菌株可以利用全载铁TF(holo-TF)中的铁其在限制性培养基、热灭活血清和巨噬细胞中的生长和存活能力。胶体金电镜和荧光检测发现ExPEC RS218菌株能够在细菌表面结合holo-TF,不结合apo-TF。荧光检测也发现巨噬细胞THP-1中的ExPEC也能结合胞内的holo-TF。通过钙黄绿素荧光淬灭试验和ELISA检测,确认ExPEC菌株RS218能够摄取holo-TF中的铁。Westernblotting未在ExPEC菌株的胞质中检测到TF,表明ExPEC不会将holo-TF摄取到胞质。以上结果表明ExPEC菌株RS218在细菌表面结合holo-TF并摄取其中的铁,为ExPEC表面TF结合蛋白的研究奠定基础。
2.EFG结合holo-TF的机制研究
本研究利用生物素pull-down、双向电泳和质谱分析,筛选并鉴定ExPEC菌株RS218表面的holo-TF受体。结果发现延伸因子G(EFG)是一种潜在的TF结合蛋白。通过Far-Western blotting、ELISA板结合试验、生物素pull-down和蛋白抑制试验,确认EFG与holo-TF的互作。EFG能够特异性结合holo-TF而不结合apo-TF。通过检测holo-TF与EFG互作后的apo-TF的生成,发现EFG并能够释放其中的铁。通过构建EFG结构域缺失或片段缺失的重组蛋白,确认EFG的N端结构域具有结合holo-TF能力,C端结构域则具有释放TF中铁的功能。利用外源蛋白表面表达载体,将EFG及其结构域外膜表达在非致病性大肠杆菌BL21中,在整菌水平上证明EFG及其结构域的结合holo-TF和释放holo-TF中的铁两个功能。EFG在细菌表面的过表达能显著增加细菌与巨噬细胞中holo-TF的结合,并显著提高细菌在巨噬细胞内的存活能力。本研究结果揭示ExPEC菌株RS218利用EFG参与铁获取的新机制,有助于揭示ExPEC抵抗营养免疫的分子机制。
3.EFTu结合holo-TF的机制研究
除 EFG 外,ExPEC 菌株 RS218 的延伸因子 Tu(Elongation factor Tu,EFTu)也被筛选为潜在的holo-TF结合蛋白。本研究利用免疫双荧光检测、菌落印记和Western blotting 确定 EFTu 是 ExPEC 的表面蛋白。利用 Far-Western blotting、ELISA板结合试验和蛋白抑制试验确认EFTu与holo-TF特异性结合,同时ELISA板结合试验确认EFTu不结合apo-TF。通过检测holo-TF与EFTu互作后的apo-TF的生成,发现EFTu并能够释放holo-TF的铁。构建EFTu结构域缺失的重组蛋白,发现EFTu的每一个结构域都参与结合holo-TF以及释放TF中的铁。利用表面过表达载体发现EFTu在非致病性大肠杆菌中的过表达不仅增强细菌结合holo-TF的能力,还促进细菌对holo-TF中的铁的吸收。血清存活试验表明EFTu显著提高大肠杆菌在热灭活人血清中的存活率,这种促进作用与holo-TF的添加剂量呈正相关,但与apo-TF无关。本研究揭示EFTu在结合holo-TF以促进细菌吸收铁方面的新功能,表明EFTu是ExPEC的毒力相关因子。本研究也有助于揭示ExPEC的铁获取机制和致病机制。
4.ExPEC结合H因子逃逸补体攻击的机制研究
H因子(Factor H,FH)是补体系统中一种重要的调节蛋白。本研究发现,ExPEC菌株RS218可与血清中的FH结合。采用脱硫生物素pull-down与液相色谱-串联质谱相结合的方法,对ExPEC的FH结合膜蛋白进行鉴定。鉴定结果显示多个碳水化合物代谢酶(Carbohydrate metabolic enzymes,CMEs),包括乙酸激酶、果糖-二磷酸醛缩酶、延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基、L-乳酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶和丙酮酸脱氢酶均为FH结合蛋白。利用GST pull-down和ELISA板结合试验发现这七个蛋白可从血清中募集FH,并且这七个蛋白结合FH具有剂量依赖性,蛋白浓度越高,结合FH的能力越强。蛋白抑制试验证明每个蛋白均能显著降低ExPEC对FH的募集作用(P<0.05)。以上试验揭示这7个蛋白能够从血清中募集对FH。通过免疫荧光试验、菌落印迹试验和Western blotting试验,确定这七个蛋白均位于ExPEC菌株RS218的外膜。ELISA检测发现细菌表面的FH募集水平和C3b沉积水平分别以FH浓度依赖性方式显著增加和减少(P<0.05)。抗吞噬试验表明FH募集显著增强ExPEC抵抗人巨噬细胞THP-1调理吞噬作用的能力(P<0.05),而且募集的FH越多,ExPEC的抗调理吞噬能力越强。本研究揭示ExPEC利用细菌表面的CMEs结合FH,降低C3b在细菌表面的沉积,进而增强抗调理吞噬能力来逃避补体杀伤作用的新机制。
关键词: 肠外致病性大肠杆菌 ；转铁蛋白 ；延伸因子G ；延伸因子Tu ；血清耐受 ；胞内存活 ；补体系统 ；H因子 ；调理吞噬
摘要： 根据致病性和致病机制的不同,致病性大肠杆菌可以分为肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)和肠道内致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic Escherichia coli,IPEC)。肠道外致病性大肠杆菌主要包括禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli,APEC),尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)和致新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal Meningitis E.coli,NMEC)。禽致病性大肠杆菌是家禽业最重要传染病病原之一,也是潜在的食源性致病菌,主要引起禽类呼吸道感染、全心炎和败血症。人源ExPEC可以引起尿路感染或导致新生儿败血症、脑膜炎。肠道内致病性大肠杆菌根据其致病特征主要分为六类:产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC),肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC),肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC),肠聚集性大肠杆菌(Enteroaggregative coli,EAEC),肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli,EIEC)和弥散黏附型大肠杆菌(Diffuse adhesive E.coli,DAEC)。它们共同的特点是通过分泌不同的毒素作用于人或动物的肠上皮细胞引起严重的腹泻,在临床上危害最严重的是ETEC、EHEC和EPEC,每年对畜牧业和养殖业造成严重的经济损失。ExPEC和IPEC严重威胁人和动物的健康,加强对ExPEC和IPEC防控的研究,对养殖业和公共卫生均具有重要的意义。在ExPEC和IPEC的防控中存在的共同问题是依赖于抗生素的防控造成了耐药菌株的不断涌现以及抗生素残留问题,因此迫切需要研制新的替代方法。但是,ExPEC和IPEC的致病机理及调控机制不清楚。虽然目前已鉴定出ExPEC和IPEC大量毒力相关的因子,但是仍然有潜在的致病因子需要发掘,而且这些毒力因子在致病过程中发挥的作用及其调控机制仍然不是很清楚。ArcA和FNR作为全局调控因子,在调节大肠杆菌从有氧到厌氧环境的适应性方面发挥重要的作用。ArcA通过调节细菌对抗活性氧的酶促防御系统而发挥作用,FNR作为氧感应调节子,控制大量酶对细胞外氧气状态的反应,但是ArcA和FNR是否在ExPEC和IPEC的致病过程中发挥重要的作用有待进一步研究。本研究首先通过对ExPEC在LB和鸭血清微氧条件下的转录组进行测序,筛选差异表达基因,对其致病性及ArcA和FNR对这些基因的调控机制进行了研究。同时我们对采自临床上具有腹泻或急性死亡症状仔猪的95株大肠杆菌进行了耐药表型的检测,并进行了全基因组测序,分析了耐药基因型及毒力基因,初步探索了 ArcA和FNR对ETEC毒力基因表达调控的分子机制。1转录组测序分析揭示ExPEC适应宿主体内环境的分子机制ExPEC既能威胁人和动物的健康,又对畜牧业和家禽业造成严重的经济损失,因此对其致病机理的研究十分必要而且迫切。我们首先通过转录组测序比较了 ExPEC分别在血清和LB低氧条件下差异表达的基因。在错误发现率小于10%,两比较之间的q值不大于0.10的限制条件下,发现总共有427个基因在血清中被显著地上调,390个基因显著下调。通过分析发现这些基因可以归为四类:运动性和趋化性相关基因flgBCDEFGHILM、fliACDGHKLMNOPS、motAB、cheAW等;氮和各种氨基酸代谢相关基因;碳中心代谢途径和呼吸链相关基因citCDEFXG、citAB、ybdS、frdABCD等;以及大肠杆菌胞外多糖(ECP)生物合成相关的基因包括脂多糖(LPS)、肠杆菌科细菌共同抗原(ECA)、荚膜、肽聚糖、荚膜异多糖酸、Yjb胞外多糖(yjbEFGH)和D-核糖转运基因(rbsDCBA)等。这项研究揭示了 ExPEC适应宿主系统感染的分子机制。2 ArcA调控ExPEC运动性、趋化性及代谢转录组测序分析明,当ExPEC培养在血清中和微氧条件下时,一系列运动性、趋化性和代谢性基因的表达均发生显著上调,但是这些相关基因的表达调控分子机制仍不清楚。我们对这些基因的启动子区域能结合的调控因子进行了预测,发现氧感应调节因子ArcA可能对其发挥调节作用。荧光定量PCR结果表明在cheA、cheW、cheA&W、motA、motB、motA&B、citC等基因在血清低氧条件下,在AarcA缺失株中的表达量与野生株相比均极显著地降低,ArcA提示直接或间接地调控这些基因的表达。反转录PCR进一步证实motA、motB、cheA和cheW共用一个启动子,而且EMSA结果表明ArcA蛋白可以直接和这个启动子区域相结合从而发挥调节作用,证实ArcA能直接调控这些基因的表达。动物试验结果也表明,arcA、motAB和cheA缺失株的毒力显著下降,而citCDEFXG基因簇的缺失对毒力的影响不显著。但是,在模拟体内环境的鸭血清微氧培养过程中,ΔcitCDEFXG与野生株相比在迟缓期和对数期的生长速度明显降低。这表明,柠檬酸盐代谢对ExPEC的微氧生长有一定的促进作用,而且对大肠杆菌的血清存活起重要作用。进一步对柠檬酸代谢相关的基因的研究发现,ArcA可以直接调控柠檬酸发酵基因的表达,同时也可以通过CitA/CitB二元调控系统间接调控柠檬酸发酵基因的表达,进而调控细菌在应对低氧血清条件下的能量利用。本研究证明ArcA可以通过对ExPEC运动性及趋化性和代谢性基因的直接调控影响细菌的毒力。3 FNR调控ExPEC代谢及抗血清能力转录组研究发现在应对宿主血清和低氧条件下,参与大肠杆菌柠檬酸代谢和胞外多糖生物合成相关的基因的表达量显著升高。受前面ArcA调控机制的启发,我们对这些基因的启动子区域是否能够结合另一个氧感应调节因子FNR进行了预测,发现FNR可能对其发挥调节作用。基因敲除后的功能试验发现,fnr基因的缺失极显著地降低了 ExPEC对柠檬酸的利用,进一步的研究结果证实FNR可以直接调控柠檬酸发酵基因的表达,同时可以通过CitA/CitB二元调控系统间接调控柠檬酸发酵基因的表达。另一方面,qRT-PCR结果表明,11个代表荚膜异多糖酸、荚膜、肠杆菌科细菌共同抗原、Yjb胞外多糖、肽聚糖和LPS等6个ECP合成途径相关基因的转录表达水平在血清中与LB相比均显著上调。但是,fnr基因的缺失显著降低了 11种ECP生物合成基因的表达,而且互补株中各基因的表达又能恢复到野生型的水平。这些结果表明,FNR直接或间接地正调控ECP生物合成基因的表达。EMSA试验分析进一步表明,FNR蛋白可以直接与荚膜合成基因和荚膜异多糖酸生物合成基因带有FNR结合位点的启动子区域结合,但是不能和去除FNR结合位点的启动子区域结合,表明氧气感应因子FNR可以直接促进荚膜和荚膜异多糖酸基因的表达。同时,FNR还可以通过Rcs信号系统调节荚膜异多糖酸,Yjb胞外多糖和肽聚糖的生物合成基因的表达。动物毒力测定试验的结果也表明ECP的生物合成能显著增强ExPEC的致病性。这些研究结果表明全局调控因子FNR,CitA/CitB和Rcs二元调控信号转导系统协调调节ExPEC在宿主血清中代谢和ECP生物合成基因的表达,增加ExPEC的血清抵抗力,从而增强ExPEC的致病性。4 ArcA和FNR对ETEC毒力基因表达调控的分子机制产肠毒素大肠杆菌可引起人或动物严重的腹泻,发热以及急性死亡。因此对于ETEC的耐药性,流行性以及致病分子机制的研究可以有效防控ETEC,降低由于ETEC感染带来的危害。本研究首先对采自美国13个州具有严重腹泻症状仔猪的95株大肠杆菌进行了耐药表型的检测,然后我们通过全基因组测序对这些菌株的耐药基因和毒力基因进行了分析,筛选出一株具有代表性的ETEC菌株用于表达研究。既然ArcA和FNR在对肠道外致病性大肠杆菌的毒力调控中发挥重要作用,那么它们是否也调控IPEC的毒力基因呢?因此我们对ETEC进行了研究。由于ETEC入侵肠上皮细胞的第一步是对细胞进行黏附,因此,我们首先检测了 ArcA和FNR是否影响细菌的黏附,试验结果发现arcA和fnr的缺失显著降低了细菌对细胞的黏附能力,暗示它们对黏附基因可能存在调控,因此检测了该ETEC菌株包含的黏附素基因fed基因簇和eaeH。fed基因簇的缺失影响细菌的黏附能力,进一步检测野生株和ArcA缺失株与细胞互作后fedA的表达量,发现fedA只在野生株中表达,预示ArcA对其进行正调控,通过EMSA试验证明了 ArcA可以直接和fedA的启动子区域相结合。eaeH的缺失对ETEC的黏附影响不大,arcA的缺失导致了 eaeH基因表达量的升高,说明ArcA对其为负调控。对两种肠毒素ST和LT的研究发现,ArcA在厌氧条件下对eltA是负调控,在有氧条件下对eltA是正调控;而对于热稳定毒素,在有氧和厌氧条件下都是正调控。对溶血素基因的研究证实,ArcA对两种溶血素基因都是正调控作用。FNR对这些基因调控表达的研究证明FNR对eaeH黏附素以及eltA肠毒素为负调控,对其他基因均为正调控作用。这些结果表明ArcA和FNR可以通过对fedA、eaeH、eltA st2、hlyCAB、D、hlyE等毒力基因的直接调控而影响ETEC的致病作用。
关键词: 肠道外致病性大肠杆菌 ；产肠毒素大肠杆菌 ；ArcA ；FNR ；毒力基因 ；调控机制
被引量
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摘要： 禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia.coli,APEC）引起严重危害养殖业发展的重要细菌性传染病,APEC与尿道致病性大肠杆菌（UPEC）和新生儿脑膜炎大肠杆菌（NMEC）同属肠外致病性大肠杆菌（Ex PEC）,APEC与上述两种感染人的致病性大肠杆菌有高度的基因同源性,具有重要的公共卫生学意义。非编码小RNA（s RNA）在细菌中普遍存在,不直接翻译蛋白但是细菌重要的调控因子,在细菌致病性调控上发挥着重要作用。研究表明细菌中发现约140种s RNA,存在于大肠杆菌中近90种,此中Ryh B是现在报道调控细菌靶m RNA数量最多的s RNA,最开始发现于大肠杆菌中。Ryh B普遍存在于大肠杆菌包括APEC中,其作为APEC关键的调节因子,可通过影响APEC生物被膜形成、趋化性以及耐酸性等方面的来调控APEC的致病性。本实验室前期已构建AE17Δryh B并进行Label-free蛋白组学测序及生物信息学预测筛选出Ryh B的靶基因cys E。本研究利用Red重组技术在AE17、AE17Δryh B的基础上,进一步构建基因缺失株AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E,针对单双缺失株及野生株进行转录组学测序分析并比较其生长曲线、运动性、生物被膜形成能力等生物学特性差异及致病性强弱,为研究cys E基因的功能、调控作用及cys E与ryh B基因之间的调控作用奠定基础。详细研究内容如下:1.禽致病性大肠杆菌Δcys E、Δryh BΔcys E AE17菌株的构建极其致病性分析本实验在野生菌株AE17及已构建AE17Δryh B的基础上采用Red同源重组技术,构建cys E基因的单双缺失株。经cys E-IN-F/cys E-IN-R、cys E-OUT-F/cys E-OUT-R、ryh B-IN-F/ryh B-IN-R、ryh B-OUT-F/ryh B-OUT-R引物PCR验证以及测序检测显示成功构建出cys E基因单缺株AE17Δcys E及双缺株AE17Δryh BΔcys E。采用CCK-8检测各菌株感染DF-1细胞细胞存活率确定菌株感染DF-1细胞模型的条件为细菌单菌落数与细胞数比例为1:50且共培养时间为2h。通过FITC和PI双染观察细胞凋亡情况、流式检测细胞凋亡率以及动物攻毒试验LD50的测定得出AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E的毒力与AE17相比均有所下降。2.AE17、AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E RNA-Seq分析本实验针对AE17、AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E进行转录组学测序分析,筛选出AE17Δryh B与AE17差异基因1001个,此中上调的有459个,下调的有542个;AE17Δcys E与AE17差异基因1232个,此中上调有625个,下调有607个;AE17Δryh BΔcys E与AE17差异基因991个,此中上调有475个,下调有516个。AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E与AE17相比差异基因共有668（67.41%）个基因重叠。GO分类分析得出各缺失菌株与野生菌株的差异基因富集于氧化代谢过程及氧化还原过程等。KEGG分析得出各缺失菌株与野生菌株的差异基因富集于不良环境中微生物代谢、鞭毛组装以及β-内酰胺耐药性等。荧光定量PCR验证差异基因得出cys E基因缺失后APEC生物被膜形成及运动性相关基因转录水平下降,ryh B、cys E基因缺失后APEC运动性相关基因转录水平较cys E基因缺失后有所提高。3.AE17、AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E的生物表型分析本实验通过对野生株和缺失株的生长曲线的测定得出ryh B缺失后以及ryh B、cys E共同缺失后对APEC生长速度无影响,cys E缺失后APEC生长速度在对数期有所降低。结晶紫改良法生物被膜形成能力测定以及扫描电镜观察生物被膜形成能力得出各缺失菌株与野生菌株相比生物被膜形成能力均显著降低。运动能力测定结果显示AE17Δryh B运动能力与AE17相比无明显变化,AE17Δcys E运动能力与AE17相比显著下降（p<0.0001）,AE17Δryh BΔcys E运动能力与AE17相比下降（p<0.05）;透射电镜观察细菌鞭毛数目得出各缺失菌株鞭毛数目与野生菌株相比均减少,其中AE17Δryh B、AE17Δryh BΔcys E比AE17Δcys E数目多,结合荧光定量PCR运动性相关的基因转录水平的差异得出cys E基因的缺失降低了APEC运动能力,ryh B基因对cys E基因运动能力调控作用有代偿作用。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；RyhB ；cysE ；生物表型 ；致病性
被引量
1
摘要： 禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是引发禽大肠杆菌病的重要病原菌,能引起禽类的局部或全身感染,严重危害养禽业的发展,因其与感染人的尿道致病性大肠杆菌(UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(NMEC)等都具有高度基因同源性,被认为是可污染食品的致病性大肠杆菌重要的基因储库,具有潜在的公共卫生学风险。铁吸收调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)作为调节细菌中铁离子代谢的重要的蛋白质,是由Fur基因所编码的,是目前研究最为广泛和深入的与铁代谢的相关蛋白质;Ryh B是一种大小为90个核苷酸的细菌非编码小RNA分子(s RNA),受到负调控因子Fur的调节,目前有报道:Ryh B作为目前研究中己知的调控细菌靶m RNA数目最多的s RNA,与细菌包括APEC的致病性有一定的关系,因此阐明Fur/Ryh B在调控细菌生物表型及致病性方面是否具有协同作用并筛选下游调控靶点,对于揭示APEC的致病机理有一定的参考价值。本研究以Fur、Ryh B以及Fur/Ryh B整体作为研究对象,通过构建单、双基因缺失株来探究Fur、Ryh B以及Fur/Ryh B对APEC生物表型、关键毒力基因转录水平的影响;通过转录组学技术分析三株菌的差异基因富集情况,筛选差异显著的毒力基因进行EMSA验证。具体结果如下:1.禽致病性大肠杆菌Fur/Ryh B的单、双基因缺失株的构建及生物特性比较本试验通过Red同源重组技术成功构建了Fur单缺株与Fur/Ryh B双缺株(Ryh B单缺株为实验室保存)。比较三株菌的生物特性,结果显示Fur和Ryh B的缺失并不影响APEC的生长性能;△Fur和△Fur/Ryh B显著减弱APEC的运动能力以及鞭毛的数量和长度,△Ryh B对该表型影响不显著;△Fur和△Fur/Ryh B显著增强APEC生物被膜形成能力,△Ryh B稍减弱APEC生物被膜形成能力;△Fur和△Ryh B对细菌的常用抗生素耐药性影响不显著,△Fur/Ryh B能显著增加APEC对复方新诺明的敏感程度;△Fur和△Fur/Ryh B显著减弱APEC的氧化应激耐受能力,△Ryh B对其影响不显著。2.禽致病性大肠杆菌Fur/Ryh B的单、双基因缺失株的差异表达基因分析将Fur、Ryh B单缺株与Fur/Ryh B双缺株进行转录学组学分析,结果显示:Fur基因缺失的前后,APEC有1286个差异表达基因,其中649个基因上调,637个基因下调;Ryh B基因缺失的前后,APEC有1001个差异表达基因,其中459个基因上调,542个基因下调;Fur/Ryh B双基因缺失的前后,APEC有1266个差异表达基因,其中668个基因上调,598个基因下调。对这些差异表达基因进行GO分析及功能分类,结果显示:△Fur影响的差异表达基因主要富集在氧化还原过程、氧化还原酶活性和辅因子结合,但差异显著的基因富集在纤毛或鞭毛依赖性细胞运动等与趋化性相关的基因上。△Ryh B影响的差异表达基因主要富集在有机物生物合成过程、细胞生物合成过程、生物合成过程。△Fur/Ryh B影响的差异表达基因主要富集在氧化还原过程,同样的,与细胞运动性相关的基因差异倍数最大。在差异最大的鞭毛相关通路中有94%的基因(34/36)表达发生了下调,下调倍数最大的为Fli C,下调了约12倍;上述结果与荧光定量PCR验证结果基本一致。3.鉴定禽致病性大肠杆菌Fur调控鞭毛组成的下游靶点成功构建BL21-pet28a-Fur重组载体并表达,Fur蛋白在16℃上清表达效果最佳并具有蛋白活性,测量目的蛋白浓度为0.3μg/μL。筛选鞭毛调控关键基因Flh D以及Fli A,合成生物素探针进行EMSA试验检测Fur蛋白与Flh D、Fli A基因相互作用情况。结果显示Fur蛋白不与Fli A的标记探针发生结合,能和Flh D的标记探针结合但没有观察到浓度依懒性,这说明Fur可能直接调控FlhD,从而下调鞭毛相关基因。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；铁吸收调节蛋白 ；非编码小RNA-RyhB ；生物表型 ；调控通路
被引量
2
摘要： 大肠杆菌是致病类型最多,研究最为广泛的模式菌之一。根据其基因组特点和携带毒力基因的不同,大肠杆菌可以分为共生菌、肠道致病性大肠杆菌和肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC)。ExPEC根据宿主和所涉组织器官的不同可以进一步分为尿道致病性大肠杆菌(UPEC)、脑膜炎型大肠杆菌(NMEC)和禽致病性大肠杆菌(APEC)等。该类大肠杆菌常引起脑膜炎、膀胱感染、肺炎、肾盂肾炎和败血症等。目前,大多数研究聚焦于禽源和人源肠外致病性大肠杆菌,而猪源ExPEC的报道相对较少,重要性缺乏认识。这主要是由于猪源与人源ExPEC祖系群存在一定差异,猪肉中分离的ExPEC数目也低于从禽肉中分离的ExPEC。然而,我们前期调查研究发现我国猪源ExPEC的发病率逐年升高,许多猪源ExPEC与人源ExPEC遗传背景和血清型相同。这些猪源ExPEC的流行病学特征、致病基因类型和致病机制仍然不清。因此,本研究对2006年-2007年间我国10个省的猪源ExPEC流行病学状况进行调查,对新发现的ST1687型脑膜炎型猪源ExPEC代表性菌株(PCN033)基因组特征进行分析,在此基础上选择潜在毒力相关调控基因(ydiv),研究其在猪源ExPEC致病中的作用与机制。这些研究可为后续该病的预防和治疗奠定基础。1.猪源ExPEC流行病学状况调查本研究对2006年至2007年间收集的81株已鉴定的猪源ExPEC样品,分别采免疫凝集和PCR法进行血清分群、祖系分群、多位点序列分型(MLST)和毒力基因分析。结果表明猪源ExPEC优势血清型为O11、O8、O138、O161和O101。81株猪源ExPEC在A、B1、B2和D四个祖系分群中均匀分布,而大部分禽源和人源ExPEC菌株主要来源于B2和D群。多位点序列分型结果表明,收集的猪源ExPEC主要由CC10、CC1687、CC88和CC58四个主要的克隆复合体组成。其中,CC1687的菌株均由我们新发现的序列型细菌组成。该类细菌大部分存在K1荚膜且部分菌株可从大脑和脑积液中分离,与人源脑膜炎型ExPEC类似,但缺乏人源脑膜炎型ExPEC中重要毒力因子,例如ibeA基因,表明CC1687可能具有其特殊的毒力基因组成。CC1687来源的菌株在我国不同的省份被分离到,说明该菌株已在多个省份流行。CC10复合体的部分ST型菌株在人源ExPEC中也有报道,说明猪源ExPEC也具有成为人畜共患病的潜在可能。2.不同宿主ExPEC的比较基因组学分析因不同宿主ExPEC菌株具有不同的毒力基因类型,猪源ExPEC可能与人源和其他动物源(牛源和禽源)ExPEC存在不同的毒力基因和致病机制。本课题组基于猪源ExPEC流行病学的调查结果,选取了我们新发现CC1687克隆复合体中致脑膜炎型强毒菌株(PCN033)测序,比较分析不同物种来源ExPEC,包括猪源(PCN033)、牛源(LS4)、禽源(APEC O1)和人源(CFT073和RS218)ExPEC的基因组差异,寻找猪源ExPEC宿主特异性和共性的毒力基因。通过对全基因组同源蛋白的Blast比较,我们发现脑膜炎型猪源ExPEC PCN033与其它宿主来源ExPEC比具有692个独特基因。COG分析表明这692个猪源ExPEC PCN033特有基因与有机物代谢分解相关,可能与其它菌株相比能够利用更多的有机物,这有助于其对不同环境的适应。对差异基因在基因组的位置分析,我们发现PCN033存在15个特有的基因岛,其中sGI1、sGI11和sGI13存在假定的六型和三型分泌系统,是潜在的毒力因子;猪源ExPEC在鞭毛系统、粘附因子和毒力基因上与其它宿主来源ExPEC存在一定差异,且人源脑膜炎型ExPEC重要毒力因子ibeA在猪源ExPEC中缺失。因此,猪源脑膜炎型ExPEC PCN033可能存在特殊的毒力因子或机制。这些毒力因子作用的调查可为脑膜炎型猪源ExPEC致病机制的研究奠定基础。3.猪源ExPEC鞭毛调控基因ydiv调控机制和功能研究在前期基因组分析的基础上,本课题组构建转录调控因子的突变株,并利用小鼠模型评估调控因子缺失菌株对毒力的影响。结果发现猪源脑膜炎型ExPEC PCN033缺失c-di-GMP结构域的假定调控蛋白Ydiv后,毒力显著下降,说明Ydiv在ExPEC PCN033毒力调控中的重要作用。我们通过RNA-seq法比较该缺失菌株和野生菌株转录组水平的变化,发现ydiv基因可以影响12个基因的表达,其中大部分基因与鞭毛相关。运动性试验也证实ydiv基因可以影响PCN033细菌的运动能力。在对ydiv调控机制的研究中,我们通过细菌双杂交试验,发现Ydiv可以与鞭毛调控蛋白FlhD发生蛋白-蛋白相互作用;表面等离子共振试验发现Ydiv蛋白可以与鞭毛调控基因flhDC和ydiv自身的启动子发生结合。在对ydiv功能研究中,我们发现?ydiv突变株在体外实验中对脑微血管内皮细胞的粘附能力增强,且这种粘附能力增强依赖于突变株导致的鞭毛表达上调,而无鞭毛的双突变菌株?ydiv?fliA对血管内皮细胞粘附能力回复。在体内试验中,?ydiv突变株对大脑粘附能力不变,而对其它组织的粘附能力显著下降。上述研究表明鞭毛是猪源ExPEC PCN033对脑微血管内皮细胞的粘附因子。感染清除试验表明ydiv突变株组织载菌量的下降是由于突变菌株鞭毛的大量表达导致其与野生菌株比更容易被宿主清除,推测鞭毛的表达可以促进免疫吞噬细胞的识别和清除。巨噬细胞吞噬试验结果与我们推测相符合,即?ydiv菌株被巨噬细胞吞噬率高于野生菌株,而?ydiv?fliA菌株被巨噬细胞吞噬率低于野生菌株,表明鞭毛可以介导免疫吞噬细胞对ExPEC的识别和吞噬。这些研究表明鞭毛是猪源ExPEC对血管内皮细胞的重要粘附因子,Ydiv一方面可以通过蛋白-蛋白作用和蛋白-DNA作用的双重机制抑制鞭毛基因的表达,减少ExPEC被免疫吞噬细胞识别和清除,促进ExPEC在宿主体内存活,另一方面Ydiv通过自身负反馈调节避免对鞭毛的过度抑制,保留其对脑组织的粘附和侵入能力。
关键词: 猪源肠外致病性大肠杆菌 ；流行病学调查 ；比较基因组 ；调控蛋白 ；鞭毛调控 ；ydiv
被引量
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摘要： 禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)隶属于肠道外致病性大肠杆菌(Extra-intestinal E.coli,ExPEC),是引起禽类(如鸡、鹅、火鸡等)肠道外感染的常见病原体之一,可造成禽只局部炎症或以败血症为主的系统性感染,严重威胁养禽业的健康发展。在APEC入侵感染宿主的过程中,有多种毒力因子发挥着重要作用,如黏附素、铁摄取系统、保护素、荚膜、侵袭素等。外膜蛋白A(Outermembrane protein A,OmpA)作为外膜蛋白复合体(Outer membrane protein complex,OMPs)的主要成分之一,在维持细菌外膜结构的稳定性,参与代谢及调控,协助APEC的粘附和入侵,以及在参与宿主免疫调节等方面发挥着重要作用。自噬(Autophagy)是细胞进化的一种自我保护机制,可将错误折叠的蛋白质或损伤的细胞器进行降解,除了在维持细胞稳态中有重要作用外,自噬还能保护宿主抵抗病原体的侵害。而目前关于APEC OmpA对宿主细胞自噬作用的相关研究还未见报道。此外,研究发现热休克蛋白gp96(Glyeoprotein96)作为OmpA结合的受体,可协助脑膜炎致病性大肠杆菌入侵人脑微血管内皮细胞,破坏血脑屏障,从而引起脑膜炎的发生,而作为gp96同系物的鸡源热休克蛋白Hsp108(Heat shock proteins 108)能否协助APEC侵染宿主细胞,目前尚未得到验证。本研究从自噬的角度阐述APEC OmpA的致病机制,探讨OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用;并验证OmpA与Hsp 108蛋白的互作关系,进一步探究OmpA诱导自噬以及APEC侵染是否与Hsp108蛋白有关,为进一步研究APEC OmpA的生物学功能及其协助APEC逃逸宿主细胞的清除作用奠定基础。1禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA的原核表达及纯化首先构建原核表达质粒pET28a-ompA,转化至大肠杆菌BL21感受态进行诱导表达,随后经Ni-NTA亲和树脂对重组蛋白进行纯化,将纯化后的蛋白进行复性。将OmpA蛋白刺激鸡巨噬细胞HD11后观察APEC E058株在细胞内的增殖情况;利用qRT-PCR检测OmpA对HD11细胞炎症因子产生的影响。结果显示,成功构建原核表达质粒pET28a-ompA,经诱导表达及纯化后,获得分子量为38 KDa的重组蛋白OmpA-His。HD11细胞感染试验结果显示,OmpA蛋白对APEC E058株侵入宿主细胞及胞内存活发挥了重要作用。qRT-PCR结果显示,OmpA能够引起炎症因子IL-10、IL-6、IL-1β表达上升。2禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对宿主细胞自噬的影响为弄清作为APEC重要的毒力因子OmpA是否协助其逃避宿主细胞的清除作用,本研究探讨了 APEC外膜蛋白OmpA对宿主细胞自噬的影响。以APEC E058株为模版,PCR扩增ompA基因,克隆到pEGFP-N1载体上,构建真核表达质粒,将其转染至DF-1鸡胚成纤维细胞并检测OmpA的表达情况,同时将重组蛋白OmpA-His直接作用于HD11细胞,采用透射电镜、免疫荧光及Western blot的方法检测OmpA对DF-1和HD11细胞自噬的影响。结果显示,将重组质粒pEGFP-N1-ompA经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,获得大小为1038 bp和4700 bp的2条带,大小与载体和目的片段相符,经测序鉴定正确,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒转染至DF-1细胞,经免疫荧光及Western blot检测,成功表达大小为65 KDa的EGFP-OmpA蛋白;同时Western blot结果显示,DF-1细胞中OmpA的过表达可引起自噬标志性蛋白LC3 Ⅱ表达增加,另外在OmpA蛋白外源性刺激HD11细胞后,在随着蛋白浓度的提高以及刺激时间的延长,LC3 Ⅱ蛋白表达水平呈上升趋势。通过透射电镜可观察到过表达OmpA的DF-1细胞中形成单层或双层膜的自噬囊泡,同时在转染了 GFP-LC3质粒的细胞中,呈现绿色荧光点的聚集,这些结果均证明APEC OmpA蛋白能够诱导宿主细胞发生自噬。进一步研究发现OmpA能够抑制AKT/mTOR/p70S6K蛋白的磷酸化,进而通过该信号通路诱导细胞自噬。此外,OmpA影响自噬标志蛋白p62的降解,RFP-GFP-LC3检测显示OmpA可阻断自噬流的发生;经LC3 Turnover试验,证明OmpA能够引起HD11细胞中LC3 Ⅱ蛋白的蓄积。以上结果表明OmpA可以诱导细胞自噬,但其抑制自噬流的发生,引发细胞的不完全自噬,这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。3热休克蛋白Hsp108对APEC侵染及OmpA诱导自噬的影响为进一步弄清鸡源热休克蛋白Hsp108能否协助APEC侵染宿主细胞及参与OmpA诱导的自噬,本研究首先采用免疫共沉淀的方法验证OmpA与Hsp108蛋白的互作关系,接着利用CRISPR/Cas9技术对DF-1细胞hsp108基因进行敲除,构建hsp108基因敲除细胞系(hsp108/-DF-1);采用CCK-8检测hsp108基因敲除后,对DF-1细胞增殖的影响;将APEC E058株分别感染野生型DF-1及hsp1 08-/-DF-1细胞,观察其入侵及胞内增殖情况;通过免疫荧光观察Hsp108蛋白的亚细胞定位;最后通过Western blot检测在降低Hsp108蛋白表达的情况下,OmpA对DF-1细胞自噬的影响。结果显示,通过免疫共沉淀试验证实Hsp108蛋白与OmpA存在互作关系。利用pX458基因编辑质粒,成功对DF-1细胞的hsp108基因进行敲除,Western blot结果显示,Hsp108蛋白的表达量显著下降。同时CCK-8增殖试验结果显示,hsp108基因的敲除并不会影响细胞的增殖。将APEC E058株分别侵染野生型DF-1及基因缺失型DF-1细胞系,结果显示,hsp108基因的敲除,并不影响APEC入侵DF-1细胞的细菌数量,但显著提高了APEC在胞内的增殖水平。免疫荧光结果显示,Hsp108蛋白定位于细胞质中。在降低Hsp108蛋白表达后,OmpA同样能够引起DF-1细胞发生自噬,表明OmpA并未通过Hsp108蛋白诱导细胞发生自噬。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；外膜蛋白OmpA ；细胞自噬 ；热休克蛋白Hsp108
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摘要： 禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia.coli,APEC)引起严重危害养业发展的重要细菌性传染病,APEC与尿路结肠大肠杆菌(UPEC)和新生儿脑膜炎大肠杆菌(NMEC)同属于肠外致病性大肠杆菌(ExPEC),因APEC与上述两种感染人的致病性大肠杆菌有高度的基因同源性,对其的研究具有重要的公共卫生学意义。非编码小RNA(sRNA)在细菌中普遍存在,不直接翻译蛋白但却是细菌极为重要的调控因子,在细菌致病性上发挥着重要的调控作用。细菌中发现的近140种sRNA,约90种分布在大肠杆菌中,其中RyhB是目前己知调控细菌靶mRNA数目最多的sRNA,最初是在大肠杆菌中发现的,在大肠杆菌包括禽致病性大肠杆菌(APEC)中普遍存在,作为APEC重要的调节子,RyhB对APEC铁代谢的调控和对适应环境能力的调节具有重要作用,目前研究发现:RyhB可通过影响APEC生物膜生成、趋化性和耐酸性等方面的来调节或者影响APEC的致病性,但尚有很多疑问未解释清楚,其中APEC在侵染损伤宿主细胞过程中,RyhB具体影响了 APEC哪些致病作用以及对哪些致病过程起到了调控作用,阐明这些疑问对于揭示APEC的致病机制意义重大。1.sRNA-RyhB影响APEC损伤鸡气管黏膜上皮细胞分析RyhB缺失后主要影响了细菌的生物调节、生物膜、细胞成分组织、细胞定位、代谢过程、等过程,通过对上述生物过程的影响、生物黏附等生物过程,使细菌在RyhB缺失后对镁离子、铁离子、镍离子等离子代谢活动以及与黏附作用定植作用相关的基因的表达产生影响,使APEC对细胞的抗吞噬性,粘附性,以及适应对共培养环境的变化的相关过程来影响APEC对细胞的致病性。2 sRNA-RyhB影响APEC对HD11细胞损伤作用探究RyhB缺失后APEC对巨噬细胞的对粘附性以及抗吞噬性均有所下降,RyhB影响了 APEC对细胞的抗吞噬作用、细胞的对细胞的黏附作用。RyhB缺失后影响了 APEC对HD11细胞共培养的凋亡蛋白的表达并对巨噬细胞的刺激的相关凋亡通路的影响,RyhB缺失使得APEC对细胞的毒性降低促使APEC对细胞的凋亡进程的刺激减弱,对细胞的侵蚀力、粘附力、抗吞噬性总体减弱,对细胞凋亡刺激减弱,因此其导致共培养的细胞凋亡的时间要短长于APEC原始株。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；非编码小RNA-RyhB ；鸡气管黏膜上皮细胞 ；鸡巨噬细胞 ；细胞凋亡
被引量
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摘要： 禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是一种能引起家禽局部或全身性传染病的细菌,能与很多病毒性疾病和其他细菌性疾病并发。随着世界集约化养鸡行业的发展,大肠杆菌病的发病率和死亡率也逐步升高,给养禽业的发展造成了巨大的损失。在大肠杆菌研究中,人们提出了一种新的基因调节子,即为非编码小RNA(small non-coding regulatory RNA,sRNA),其在转录后可调节基因的表达水平,主要参与的调节途径包括转录翻译调控、铁代谢途径、糖代谢途径、膜蛋白生物合成、群体感应系统以及致病菌的致病力调节等。而RyhB也是小RNA的一种,在细菌致病调控网络中起到关键作用。此外,RyhB除了参与调节铁代谢外,在霍乱弧菌和痢疾志贺氏菌中,还发现RyhB的还能调控细菌动力、化学趋化、生物膜、酸性耐受力、氧化还原甚至毒力基因的表达等。因此,研究RyhB与APEC致病性之间的联系,为防控大肠杆菌病提出实验依据。本研究以实验室RyhB缺失株为基础,研究RyhB缺失条件下对细菌的生物学特性的影响,并利用蛋白质组学技术比较野生株与缺失株差异表达的蛋白,筛选出影响APEC毒力等相关特性的相关靶基因,进一步揭示了RyhB与APEC致病力之间的关系。具体研究内容和结果如下:1、sRNA-RyhB对禽致病性大肠杆菌生物学特性影响本实验分别从生长曲线实验、组织载菌量实验、菌体超显微结构观察实验、生物被膜形成能力检测实验、LPS完整性实验、环境耐受力检测实验等来研究禽致病性大肠杆菌RyhB对细菌的生物学特性影响。生长曲线实验结果表明,RyhB没有影响其生长性能;组织载菌量实验表明,注入△RyhB肝脏组织载菌量相比野生株的肝脏组织载菌量降低了6.91倍;超显微结构观察实验表明,同样的生长条件下,亲本菌AE17有完整的菌毛,而缺失株则没有完整菌毛;生物膜试验结果表明,RyhB基因缺失后,生物膜的形成能力减弱,回复株有所回复,但并没有回到野生株生物膜形成能力;LPS完整性实验结果表明RyhB缺失没有影响有LPS的完整性;环境耐受力实验表明,缺失株△RyhB对氧化不敏感,热应激增强,耐酸性增强,耐碱性减弱。2、sRNA-RyhB调控禽致病性大肠杆菌靶蛋白的筛选为探索RyhB可能调控的毒力基因。应用蛋白质组学技术,从蛋白水平比较野生株和缺失株之间差异蛋白表达情况。结果显示,与野生株相比,共发现62个差异蛋白。其中Omsc、Galu、Nlpe、Tata、GmhA、proX、inFA、cysE可能是RyhB直接调控的毒力相关基因。通过GO(Gene Ontology)分类结果显示,差异表达蛋白参与的细胞组分包括细胞膜、胞外区、细胞器、核质组成等;分子功能主要表现抗氧化功能、蛋白结合、催化活性、分子功能调节、信号传导、转运蛋白功能等;参与的生物学过程主要包括调控生物调节、运动过程、新陈代谢过程、多细胞生物学过程、应激反应、单一生物体调节过程等。通过实时荧光定量PCR技术检测其中10个差异蛋白基因的转录水平,结果与蛋白质组学一致。3、sRNA-RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力以及影响生物膜形成靶蛋白分析本实验基于蛋白质组学技术,筛选得到与酸性耐受力有关的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术对筛选的差异蛋白基因的转录水平进行检测,其结果与蛋白质组学结果一致。在筛选出的差异蛋白的基础上,结合在线预测软件筛选可能直接作用的与生物膜形成有关的靶蛋白。实验成功构建了pET28a-cysE表达载体,获得可溶性cysE蛋白,用Western Blot检测重组质粒表达产物,在蛋白大小约36kDa处有一条蛋白带,表明表达产物有良好的特异性。以上研究结果表明,RyhB的缺失能影响禽致病性大肠杆菌菌毛的表达并降低肝脏的载菌量、降低生物膜的形成、增强热应激、增强耐酸性、减弱耐碱性。表明RyhB在调控APEC毒力作用中扮演重要角色,并结合蛋白质组学技术筛选出与生物膜形成、酸性耐受力有关的蛋白。为后续研究RyhB调控靶点奠定了一些基础,同时也为进一步研究APEC的致病作用及宿主抗病机制提供一些实验依据。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；RyhB ；蛋白质组学 ；生物学特性 ；致病性
被引量
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摘要： Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion system)是2006年在霍乱弧菌中被定义的新型分泌系统,其广泛存在于革兰氏阴性菌变形菌门中,为15-20个保守结构基因构成的基因簇,主要组分可分为尾鞘、基座,该系统激活后可分泌效应因子至靶细胞体内,靶细胞多为真核细胞或细菌,T6SS在许多致病菌中与致病性或细菌间竞争相关。溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein,Hcp)可形成六聚环复合体,由此互相堆叠形成纳米管道,构成T6SS尾鞘的重要组分,其分泌至胞外常作为T6SS发挥功能的标志。Hcp在T6SS中既作为重要组分,也作为效应因子或其分子伴侣发挥作用。在肠外致病性大肠杆菌中,对T6SS的研究并不多,主要集中在新生儿脑膜炎大肠杆菌RS218和禽致病性大肠杆菌中,T6SS均影响菌株的致病能力。在肠聚集性大肠杆菌中,T6SS主要参与细菌间竞争过程。许多菌株都含有不止一套的T6SS,或T6SS基因簇中hcp基因存在多个拷贝,通常不同的T6SS基因簇或不同的hcp拷贝在菌体的生物活动中发挥不同的功能。本实验室对猪源肠外致病性大肠杆菌PCN033菌株进行全基因组测序,发现菌株染色体上存在24.6 kbp大小的T6SS基因簇,其中含有2个hcp基因,基因簇外部还有1个hcp,分别命名为hcp1、hcp2、hcp3。本实验室已构建了Δhcp3缺失株,并对其基本生物学特性进行了研究,制备了Hcp1多克隆抗体,本研究利用同源重组原理构建了Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株,对其进行基本生物学特性的研究并与亲本菌株PCN033进行比较,主要内容包括以下几个方面:1.猪源肠外致病性大肠杆菌基因缺失株Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3的构建参照PCN033全基因组测序结果设计引物,以亲本菌株基因组为模板分别扩增hcp1、hcp2的上下游同源臂,串联构建重组的自杀性质粒p RE112Δhcp1、p RE112Δhcp2。通过接合转移将重组质粒导入亲本菌中,菌体自身的同源重组酶参与同源重组,利用Cm抗性和蔗糖敏感性进行正反筛选。先筛选Cm抗性、蔗糖敏感的单交换子,将单交换子于无盐LB中传代,再筛选出无Cm抗性、蔗糖耐受的菌株,用检测引物对菌株进行PCR检测,扩出小片段的菌株即为目的缺失株。如此获得Δhcp1、Δhcp2、Δhcp1Δhcp2Δhcp3。2.Hcp2、Hcp3多克隆抗体的制备及鉴定参照PCN033全基因组测序结果设计引物,以亲本菌株基因组为模板扩增hcp2、hcp3基因全长,分别连接于p ET30a、p GEX原核表达载体上,转化于E coli./BL21(DE3)中进行诱导表达获得融合表达蛋白Hcp2-His、Hcp3-His。利用镍离子亲和层析柱对蛋白进行纯化,所得目的蛋白作为免疫蛋白,免疫2月龄日本大耳兔,免疫完成后采取少量血清进行Western Blot检测,确定所制备的血清具有特异性,心脏采血日本大耳兔,收集血清置-80℃备用。3.猪源肠外致病性大肠杆菌hcp家族基因缺失株及亲本株细菌间竞争能力研究将缺失株及亲本株为捕食菌,以大肠杆菌K12菌株W3110为被捕食菌,捕食菌与被捕食菌互作后,对存活的W3110计数,以W3110的存活率来评价捕食菌的细菌间竞争能力。结果表明,hcp1、hcp2、hcp3全部缺失的菌株,W3110存活率上升最显著;在3株单缺失菌株中,相对于亲本菌株,hcp2缺失后,W3110的存活率显著上升;hcp1、hcp3缺失后,W3110的存活率略微有上升,但并不显著。推测在细菌间竞争过程中,hcp2发挥主要功能,hcp1、hcp3发挥辅助协同作用。4.猪源肠外致病性大肠杆菌hcp家族基因缺失株及亲本株致病性研究将缺失株与亲本株于37℃,5%CO2条件下进行细胞吞噬后存活试验及粘附侵入试验。利用猪肺泡巨噬细胞(PAM)进行的吞噬后存活试验表明,hcp家族基因缺失后,吞噬后的存活能力均下降,其中hcp1缺失后下降显著,三基因缺失株下降最明显。推测在吞噬后存活过程中,hcp1和hcp3发挥主要功能,hcp2发挥辅助协同作用。利用猪肾细胞(PK-15)进行的粘附侵入试验表明,hcp家族基因缺失后对粘附能力均无显著影响,hcp1、hcp2缺失后对侵入过程均有影响但不显著,只有三基因缺失株下降显著。推测hcp家族基因主要影响菌株的侵入能力而非粘附能力。将缺失株与亲本株腹腔分别以107、106、105CFU的剂量接种于4周龄昆明小鼠,记录小鼠死亡率。结果显示,相对于亲本株hcp家族基因缺失后,昆明小鼠死亡情况并无明显改变。将缺失株与亲本株分别以107CFU的剂量经尾静脉接种7周龄C57/BL3小鼠,对血液中的菌量及脑、肾、脾的载菌量进行计数比较,结果显示,hcp家族基因缺失后,在血液中的菌量和在组织中的载菌量均显著下降,且三基因缺失株下降幅度最大。推测hcp家族基因与菌体在机体内存活与定植相关,且3个hcp基因之间存在协同作用。
关键词: 六型分泌系统 ；hcp ；猪源肠外致病性大肠杆菌 ；基因缺失 ；生物学特性
被引量
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摘要： 禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是一类典型的肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E. coli, ExPEC),APEC通过呼吸道感染禽类,在呼吸道和肺组织定殖,强毒株能引起肺组织的严重病变和炎症反应,包括气囊炎和肺炎,强毒株可以突破肺脏的免疫防御进入血液,进而引起败血症和多系统混合感染。禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是危害养禽业的细菌性传染病之一,对养禽业造成严重损失,由于当前研究成果不能全面揭示APEC感染禽宿主的致病机制,并且APEC具有血清型多样性特征,目前没有有效防控APEC感染禽宿主的疫苗。本文对APEC 02:K1血清型菌株进行全基因组测序,通过比较基因组分析鉴定APEC基因组特征,对APEC流行毒株进行致病力评价,筛选和鉴定APEC新的毒力因子和转录调节因子,研究结果丰富了对禽致病性大肠杆菌致病机制的认识。1.APEC02:K1血清型菌株IMT5155全基因测序及比较基因组学研究本研究首次对APEC 02:K1血清型毒株IMT5155进行全基因测序,进行比较基因组学研究,分析IMT5155演化关系和基因蓝图,结果表明IMT5155与典型的ExPEC强毒株具有相近的演化关系;通过对IMT5155基因组的毒力岛分析,发现了一个APEC 02:K1血清型菌株特有的基因岛,这个新的基因岛命名为PAI I5515(GI-12);另外,两个六型分泌系统(T6SSs)分别位于IMT5155的基因岛GI-7和GI-16,并且普遍同时存在于ExPEC O1、02和018优势血清型菌株;IMT5155含有两个质粒,其中大质粒p1ColV5155含有多类毒力因子,其影响APEC的致病力;对B2ExPEC泛基因组中毒力因子进行分类和基因分布分析,结果表明B2群ExPEC强毒株基因组中部分类型的毒力因子为APEC/ExPEC特有的毒力因子,比如黏附素、侵袭素、毒素和涉铁系统等;通过4种动物模型对APECO1:K1和02:K1血清型菌株(中国分离株)进行致病力测定,结果表明这些菌株属于强毒株,能引起较强的禽大肠杆菌病,并且能引起大鼠乳鼠的脑膜炎,表明APEC O1:K1和02:K1菌株可能具有人畜共患潜力。2. APEC自分泌黏附素AatB的鉴定和功能分析通过比较分析APEC基因组发现了一个新的APEC自分泌黏附素基因aatB,其碱基序列长度为1017bp,编码一个36.3kDa的蛋白,对AatB结构预测分析证实其具有典型的AT结构域,包含N端信号肽、膜外功能域和C端β折叠跨膜域,基因分布检测表明aatB在APEC分离株分布率为26.4% (72/273),而aatB基因在ECOR D和B2群APEC菌株中分布率较高(接近70%)。本研究构建DE205B aatB的缺失株和互补株,实验证实aatB的缺失会降低DE205B对DF-1细胞的黏附能力和对雏鸭的致病力(LD50),并且降低DE205B在雏鸭肺脏内的定殖能力,而aatB互补株的致病力基本恢复至野生株水平,以上实验结果证实AatB与APEC的致病力有直接相关性,AatB能够影响APEC对宿主细胞的黏附定殖,并且Western blot证实AatB可以激发雏鸭产生对应的抗体。另外,生物被膜实验证实AatB能够介导无F I菌毛E.coli AAEC189生物被膜的形成能力。3. APEC自分泌黏附素UapB的鉴定和功能分析APEC强毒株DE205B编码一个典型的传统AT蛋白UpaB,本研究对该蛋白进行功能鉴定,并构建APEC强毒株DE205B的upaB基因缺失株,结合前期对APEC ATs(AatA和AatB)致病力的研究,构建了基因upaB、aatA和aatB的双缺失和三缺失菌株。PCR检测发现upaB基因在APEC菌株中的分布率为41.9 %,并且主要分布于ECOR B2和D群(分布率～70% );黏附试验证实UpaB介导DE205B对DF-1 cells的黏附,并且UpaB能提高无菌毛菌株AAEC189的凝集和形成生物被膜的能力;与野生株DE205B相比,upaB、aatA和aatB双缺失或三缺失菌株显著降低其对DF-1细胞的黏附能力和对雏鸭早期感染时在肺脏内定殖的能力,伴随着半数致死剂量(LD50)的上升;在DE205B△upaB/△aatA/△aatB早期感染阶段,RT-PCR检测发现该菌株的菌毛黏附素基因(yqiL和yadN)及空泡形成毒素基因vat(编码AT家族蛋白)的转录水平明显高于在体外LB培养时,因此推测在感染过程三缺失菌株DE205B△upaB/△aatA/△aatB试图通过上调毒力因子(YqiL、YadN和Vat)的表达水平以补偿其致病力;实验证实UapB、AatA和AatB均具有免疫原性,疫苗接种相关蛋白对雏鸭具有一定程度上的免疫保护力,因而ATs (UapB、AatA和AatB)可以作为APEC亚单位疫苗的候选对象。4.转录调节因子AutA/AutR调控禽致病性大肠杆菌感染的分子机制禽致病性大肠杆菌(APEC)通过呼吸系统感染禽类宿主,APEC可以迅速地调整毒力相关因子的表达模式以促进对宿主的感染定殖,在这个感染过程中需要特定的转录调节因子参与APEC毒力因子表达调控。这些受调节的毒力因子包含自分泌黏附素和K1荚膜,这两种毒力因子促进APEC黏附定殖于宿主的巨噬/非巨噬细胞,及利于APEC耐受血清杀菌作用。本研究发现并命名了两个新发现的转录调节因子AutA和AutR,基因autA和autR位于DE205B基因组的UpaB基因簇,基因分布检测证实UpaB基因簇主要APEC B2和D群分离株。RT-PCR和β半乳糖苷酶试验证实AutA和AutR共同调控DE205B黏附素UpaB的表达,电泳迁移分析和体外转录试验证实AutA和AutR可以直接与upaB启动子区域结合,AutA可以激活upaB转录,而AutR通过阻碍AutA的活性来抑制upaB转录。不仅如此,转录组分析发现AutA和AutR共同调节APEC 一百多个基因的mRNA转录,受调控的基因表达产物包括黏附素、K1荚膜和酸耐受系统等。进一步研究表明,在APEC与宿主相互作用的时,AutA和AutR共同调节K1荚膜和酸耐受系统的表型异质性表达。本研究证实在APEC与宿主细胞环境互作时,转录调节因子AutA和AutR能互惠型调控黏附素、K1荚膜和酸耐受系统的表达,AutA和AutR能介导DE205B的表型适应力,包括黏附能力、胞内存活能力、血清抗性、雏鸭肺脏内早期定殖和败血症等,AutR和AutR的表型异质性调节能促进APEC的感染。
关键词: 禽致病性大肠杆菌 ；比较基因组学 ；O2:K1血清型 ；自分泌黏附素 ；转录调节因子 ；毒力
被引量
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摘要： 大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是人类和动物肠道正常菌群之一。虽然大部分大肠杆菌属于无致病力的共生菌,但是少数克隆群经过不断进化产生了具有独特致病特性的大肠杆菌种群,主要可以划分为肠道致病性大肠杆菌（Intestinal Pathogenic E.coli）以及肠外致病性大肠杆菌（Intestinal Pathogenic E.coli,ExPEC）。禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic E.coli,APEC）是ExPEC的重要成员,不仅引起禽类的严重感染造成巨大经济损失,而且显示与人源ExPEC相似的毒力因子以及致病特性,具有潜在的公共安全隐患。Ⅵ型分泌系统（Type Ⅵ secretion system,T6SS）是一种革兰阴性菌广泛存在的纳米注射器,通过分泌多样的效应蛋白作为分子武器攻击靶细胞从而参与细菌间竞争及致病过程。许多致病菌可以借助T6SS接触性杀伤竞争者从而获得在定殖部位的生存优势。目前,T6SS在大肠杆菌致病过程中发挥的作用仍不清楚,在抗菌效应子鉴定及生存竞争机制的研究方面也需填补空白。1禽致病性大肠杆菌XM株编码两套功能不同的T6SSAPEC是引起禽类败血症和脑膜炎的重要病原微生物之一,已有的报道证实T6SS与其致病性相关。APEC主要编码两套T6SS基因簇,能够促进细菌对上皮细胞粘附、在宿主血液增殖以及免疫逃避机制,借此显著增强细菌毒力。溶血素共调节蛋白（Haemolysin coregulated protein,Hcp）是T6SS尾管的核心成分,也是效应子的转运受体和伴侣蛋白。我们的研究发现革兰阴性菌的Hcp蛋白可以分为4个亚群,APEC编码的三个Hcp蛋白分别属于三个不同的亚群。当前的研究表明这三个Hcp蛋白在APEC致病过程中发挥不同的功能,在雏鸭免疫接种试验中介导相异的免疫保护效果。为了探索引起上述功能分化的机制,我们开展了进一步研究。结果显示这三个hcp基因存在不同转录调控机制,其中血清的铁离子螯合环境能够解除Fur蛋白对hcp1转录的抑制,但是血清低营养条件激活hcp2B及其下游Effector/Immunity pair xmtU/xmtV的机制仍不清楚。进一步试验证实Hcp1介导Tle4磷脂酶的分泌及其抗菌活性发挥,Hcp2B则是XmtU肽酶毒性作用发挥所必需的。此外,Hcp蛋白结构的细微差异也是引起其功能差异的重要原因,尤其是Loop L2,3区域（Vs2）。试验结果显示Hcp1和Hcp2B的Vs2区域是其交付抗菌效应因子和抑制巨噬细胞吞噬所必需的。总之,转录调控的不同、蛋白结构LoopL2,3的差异,配套效应蛋白的不同可能导致了 Hcp蛋白及其所在T6SS功能的分化。2大肠杆菌vgrG基因岛编码多样的抗菌效应因子尽管vgrG基因岛的概念很早就已经被提出,但是基于vgrG基因岛鉴定T6SS效应因子的方法一直被忽视。大肠杆菌编码三套不同的T6SS基因簇,只有T6SS1基因簇编码一个vgrG基因岛,且在不同的菌株间存在极大的序列差异,然而两端的侧翼基因vgrG和icmF却总是保持很好的序列保守性。根据其这一特性,我们建立了 BlastN检索方法应用于大肠杆菌基因组数据库,检索到大量vgrG基因岛序列,分析编码的保守蛋白显示存在许多潜在的Effector/Immunity pairs,并可以区分为VT1-6六个不同的家族,其中VT1-2已经被报道为磷脂酶家族的抗菌效应因子。进一步的试验证实VT4编码Tge1同源的酶催化中心,发挥溶菌酶样活性介导靶细胞壁的溶解从而杀伤靶细菌,点突变技术破坏酶活性中心关键氛基酸则丧失溶菌活性。此外,VT6被预测为一种新的酰胺酶,试验证实具有裂解肽聚糖中D-lactyl-L-Ala酰胺键的能力,点突变破坏酶催化中心HxxVxxDG motif,产生的VT6H106RD112A蛋白则不具备上述DL酰胺酶活性。据此,我们将这种检索技术扩展到革兰阴性菌,从21个细菌物种中筛选到270个预测的VT效应子,可以区分为15个毒性酶家族。这些工作极大地扩展了我们对T6SS效应子编码形式及抗菌效应机制的认识。3 Hcp毒素融合蛋白代表一种新的T6SS抗菌效应子编码形式T6SS是一个广泛存在的分子武器,被许多细菌用于损伤宿主细胞或对抗竞争细菌。通过一个动态的注射机制,T6SS将多样的效应蛋白直接交付到受体细胞内。本研究报道一个新的T6SS效应子家族,其通过Hcp蛋白携带多样的C端毒性Domain,因此命名为Hcp-ETs。生物信息学检索显示Hcp-ETs在肠杆菌科成员中广泛存在,总计包括五种不同的毒素酶,组成了五种不同的Hcp-ET模块。为了验证上述检索结果,我们首先进行Hcp-ET1的功能验证,试验证实Hcp-ET1可通过HNH-DNA酶活性有效地抑制靶细菌的生长。进一步结果显示Hcp-ET2通过Tle1磷脂酶活性破坏靶细胞细胞膜从而介导细菌间对抗。此外,我们关注到有两个模块同时编码了两种DNA酶毒素,分别是Pyocin S3和Colicin-DNase。进一步分析发现Hcp-ET3-4模块甚至将两个毒素Domain融合在了同一个Hcp蛋白C端,并且在其下游编码了三个同源的免疫蛋白。然而,Pyocin S3和Colicin-DNase doamins之间的融合在某些细菌中被终止子突变打断,从而形成了 Hcp-ET34模块,其编码分离的hcp-et3和orphan et4（et4O1）基因。试验证实这两个毒素蛋白均具有DNA酶抗菌活性,尤其是下游的三个同源免疫蛋白可以同时中和两种毒素,此结果为首次被报道。在重复编码三个免疫基因的同时,下游序列还同时编码了三个et4O1基因片段,但均遭受了广泛的基因突变不能产生有功能的蛋白,暗示宿主菌不能承受多余的毒素蛋白,侧面印证了ET4O1确实发挥杀菌活性。4 PAAR-Rhs蛋白携带多样的C-端毒素显著扩展了 T6SS抗菌效应途径许多革兰阴性细菌借助T6SS装置接触性地杀伤竞争者,从而获得在定殖部位的生存优势。最近,携带C-端毒性Domain的Rhs蛋白被报道具有杀伤临近细胞的能力,是潜在的T6SS抗菌效应子。本研究在大肠杆菌中发现了一个扩展的Rhs蛋白,其C端携带一个功能未知的MPTase4毒性Domaim,命名为Rhs-CT1。试验证实Rhs-CT1通过MPTase4金属肽酶活性破坏靶细胞壁完整性,实现杀伤临近细菌的效应。通过分析Rhs-CT1的Domain构筑形式,发现在Rhs重复序列的N-端包含一个PAARmotif,而C-端则编码毒性Domain。在数据库中检索大肠杆菌中符合上述Domain构筑形式的Rhs蛋白,发现一系列PAAR-Rhs-CT蛋白,根据毒性Domain的不同区分为CT1-10。为了验证检索结果的可靠性,以Rhs-CT3为研究对象,试验证实该蛋白依赖T6SS装置分泌至靶细胞从而介导细菌间的对抗。进一步分析发现Rhs-CTs模块上游编码的VgrGoi和DUF1795蛋白是其实现抗菌能力所必需的,暗示DUF1795可能是一类重要的T6SS伴侣蛋白。此外,还有许多Rhs-CTs并未编码上游的伴侣蛋白,进化分析分类为Rhs-Nb家族,区别于编码伴侣蛋白的Rhs-Ca家族。Rhs-Nb蛋白与T6SS基因簇Hcp2B-VgrG2模块下游的Rhs蛋白具有很近的亲缘关系,试验证实Rhs-Nb-CT5借助Hcp2B-VgrG2模块实现分泌并发挥抗菌效应。将上述检索策略应用到整个革兰阴性菌,发现PAAR-Rhs-CTs家族总计在超过143个不同的细菌物种中编码3 6种不同的毒素,个别毒素甚至被30个以上细菌物种编码。PAAR-Rhs-CTs家族的发现极大地扩展了我们对T6SS抗菌效应途径的认识。
关键词: Ⅵ型分泌系统(T6SS) ；致病作用 ；抗菌效应子 ；Hcp ；VgrG ；Rhs
被引量
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摘要： 鸡大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌的某些致病菌株引起的鸡的一种细菌性传染病。禽致病性大肠杆菌(APEC)往往会导致鸡鸭等禽类心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、败血症等症状,APEC感染时可通过破坏气-血屏障进入血液循环,最终导致败血症的发生。鸡肺Ⅱ型上皮细胞在维持气-血屏障功能方面具有重要的作用。先前实验室已对鸡肺Ⅱ型上皮细胞进行了分离纯化,通过碱性磷酸酶和电镜观察发现所获得的细胞具有上皮细胞的特点。为了进一步确定鸡肺Ⅱ型上皮细胞的纯度,我们采取流式细胞术和免疫荧光法,通过CD74、TTF1、CK19、CK18、Vimentin等特异抗体染色,来确定细胞纯度。流式细胞术检测发现,鸡肺Ⅱ型上皮细胞占分离细胞数的96%,成纤维细胞占有0.7%,非肺的杂细胞占2%左右。细胞免疫荧光检测发现,除Vimentin外,其他抗体染色均可见特异性的免疫荧光。细胞的高纯度为探讨芦丁抑制大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞作用机理奠定了基础。APEC含有许多毒力因子,包括铁摄取相关基因(Iuc D、fyu A),I型菌毛A(Fim A、Fim B、Fim C),卷曲菌毛A(Csg A、Csg B),外膜蛋白A(Omp A)等。这些毒力因子与细菌铁摄取、代谢、黏附和侵袭等密切相关。细菌胞外聚集的信号分子AI-2可以通过群体感应系统对毒力因子转录水平进行调控,影响细菌的致病性。因此,在细菌方面,主要探讨了芦丁对大肠杆菌群体感应系统的影响,结果发现用50μg/m L和25μg/m L芦丁处理APEC-O78 4h时,相关毒力基因(Rpos、H-NS、iuc D,fyu A,Csg A、Csg B、Flic、Lsr B、Lsr K、Luxs、Pfs)m RNA分泌水平显著下降(p<0.05),芦丁可以通过降低AI-2的分泌来影响细菌生存压力基因的表达进而干扰群体感应系统,且芦丁可以降低APEC-O78生物膜的形成能力。在细胞方面,采取了转录组测序技术探讨了大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞的致病机理和芦丁的干预机制。首先,我们通过涂板法、LDH损伤测定法,确定了样品最佳处理方式为:50μg/m L芦丁预处理细胞4h后,再感染APEC-O78 4h后取样,进行转录组测序。结果发现,鸡肺II型上皮细胞(CP II)感染APEC-O78 4h,通过分析比较感染APEC-O78组和空白组,共有1390个表达差异显著的基因(P<0.05),其中上调基因有587个,下调基因有803个。转录组结果测序分析CP II细胞在感染APEC-O78后,免疫应答涉及到NF-kappa B信号通路、细胞凋亡、炎症应答紧密连接、细胞因子—细胞因子受体相互作用、Toll样受体等信号通路。CP II细胞预加药50μg/m L芦丁4h,再除去药物后感染APEC-O78 4h,通过分析比较感染APEC-O78组和加药组,共有222个表达差异显著的基因(P<0.05),其中上调基因有59个,下调基因有163个,芦丁可能通过调节鸡肺Ⅱ型上皮细胞的大肠杆菌感染、吞噬体、间隙连接以及糖酵解/糖异生、糖胺聚糖生物合成、磷酸戊糖途径等途径。综上所述,从细菌和细胞两个方面研究了芦丁抑制大肠杆菌侵袭鸡肺Ⅱ型上皮细胞的作用机理。在细菌方面,芦丁可以通过抑制AI-2的分泌而干扰群体感应系统,降低毒力基因的表达,从而抑制大肠杆菌对鸡肺II型上皮细胞的损伤。在细胞方面,转录组学分析显示,芦丁可能通过调节鸡肺Ⅱ型上皮细胞的大肠杆菌感染、吞噬体、间隙连接以及糖酵解等途径,抑制大肠杆菌所造成的损伤。这为芦丁在兽医学临床和其他生物学领域的应用奠定基础。
关键词: 芦丁 ；鸡肺Ⅱ型上皮细胞 ；群体感应 ；凋亡通路 ；转录组测序
被引量
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摘要： 大肠埃希菌俗称大肠杆菌,是一类在自然界中广泛分布的革兰阴性菌。根据其致病性及致病机理的不同,大肠杆菌被划分为共生型大肠杆菌(Commensal Escherichia coli)、肠道致病性大肠杆菌(Intestinal pathogenic Escherichia coli,IPEC)以及肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)。肠道外致病性大肠杆菌是一类机会致病菌,长期地无症状地定殖于宿主肠道中。当宿主环境适宜时,能引起宿主的肠道外感染。ExPEC主要包括禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)、致新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis-associated Escherichia coli,NMEC)以及尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)。APEC可引起多种家禽的急性或慢性感染,导致全身、多组织器官的病变。人源ExPEC可以导致新生儿脑膜炎以及尿道感染。ExPEC潜在的人畜共患性严重威胁人类和动物的健康,加强对ExPEC防控的研究,对养禽业和公共卫生均具有重要的意义。在ExPEC的防控中目前存在着两个难题。首先,依赖于抗生素的防控造成了大肠杆菌耐药菌株的涌现以及抗生素残留问题,需要新的替代方法。大肠杆菌血清型众多,疫苗间交叉保护力弱,限制了疫苗免疫防控手段的开展。其次,ExPEC的致病机理不清楚。与IPEC相比,在致病过程中,ExPEC面临的环境更加复杂,需要躲避更多的宿主天然免疫系统的杀伤机制。目前虽然在ExPEC中鉴定出大量的毒力相关因子,但是这些毒力因子在致病过程中的作用仍然不是十分清楚。而关于ExPEC抵抗宿主天然免疫系统的机制更是知之甚少。本研究一方面试图通过蛋白质组学方法筛选ExPEC保护性抗原,并对其作为亚单位疫苗的可能性进行评估,另一方面通过转座子突变文库以及基因缺失技术,研究ExPEC躲避宿主天然免疫系统中溶菌酶杀伤作用的机制。1.APEC临床分离株的毒力评估根据菌株分离的时间和地点,从2007年～2011年在南京周边地区等地分离的467株鸭源APEC临床分离株中,挑取32株菌株作为代表菌株。通过新生SD大鼠细菌性脑膜炎模型,对这些菌株的毒力以及跨血脑屏障的能力进行了检测。并且利用PCR方法,从种系发育群和毒力因子分布两方面对受测菌株的分子特性进行分析。结果显示:各APEC菌株对新生SD大鼠的致死率从0%～100%不等,菌株间毒力差异较大。其中,有26株菌株能够从新生SD大鼠的脑脊液中重新分离获得,说明这些菌株具有穿透血脑屏障的能力。种系发育群分析发现,所有8株B2群菌株均能跨过血脑屏障,且其中4株菌株对新生大鼠的致死率接近100%,提示B2群菌株毒力更强,更易导致脑膜炎的发生。在毒力因子分布试验中,仅hlyA未在受测菌株中扩增出目的条带,其他基因均有分布。Cnf1/2的检出率最低,在1株不具有穿透血脑屏障的APEC菌株中检出。GimB和neuC是NMEC重要的毒力因子,检出率分别为9.375%和12.5%,分布于具有穿透血脑屏障的APEC菌株中,提示它们可能在APEC跨血脑屏障的过程中也发挥重要的作用。在检测的16个毒力相关因子中,14个基因分布于菌株DE205B。该菌株将作为研究APEC免疫保护性抗原的研究对象。2.APEC免疫保护性抗原的筛选及免疫效果的评价大肠杆菌血清型众多,疫苗的交叉保护力差,成为大肠杆菌疫苗研发的一个难题。为了寻找具有交叉保护力的亚单位疫苗,免疫蛋白质组学以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)被运用于APEC的免疫保护性抗原的筛选。提取APEC菌株DE205B(02:K1)的全菌蛋白,经二维电泳分离后,与鸭抗DE205B高免血清反应。结果鉴定出14个具有免疫反应性的蛋白点,分别代表11个不同的蛋白,包括外膜蛋白A(OmpA)和鞭毛蛋白(FliC)两个已知的免疫原。分子伴侣家族成员GroEL和另外8个蛋白是首次在APEC中发现的具有免疫反应性的蛋白。通过体外表达系统,成功表达了9个基因的重组蛋白。Western blotting结果显示,7个重组蛋白能够与鸭抗DE205B高免血清反应,其中重组蛋白GroEL、OmpA和FliC显示出较强的免疫反应性。攻毒保护实验结果显示,与已知的免疫原性蛋白OmpA和FliC一样,重组蛋白GroEL能够刺激动物机体产生高水平抗体,有一定的交叉免疫保护力。因此,GroEL可能是一种理想的免疫原,可作为APEC亚单位疫苗的候选对象。3.NMEC抗溶菌酶相关基因的筛选及缺失株的构建致新生儿脑膜炎大肠杆菌属于肠道外致病性大肠杆菌,是导致新生儿细菌性脑膜炎最主要的革兰阴性致病菌。在致病过程中,NMEC需要躲避宿主的先天免疫系统,在宿主的血液中存活并且增殖。溶菌酶是先天免疫系统中重要的防御物质之一,广泛的分布于宿主各组织细胞中,发挥着抵抗病原微生物入侵和清除入侵病原菌的作用。近年来虽然多种大肠杆菌溶菌酶抑制因子被发现,但是大肠杆菌逃避溶菌酶介导的杀伤作用的机制仍然不是十分清楚。因此,本试验利用PUT mini-Tn5 Km质粒,构建了一个含有15000个转座子突变株的突变文库用以筛选抗溶菌酶菌株NMEC38中与溶菌酶抗性相关的基因。结果鉴别出25个突变株,分别代表20个基因。其中,14个基因编码多种生物合成相关的酶,包括多糖的合成;1个基因编码DctM家族转运蛋白;1个基因编码PTS依赖的二羟基丙酮激酶操纵子调节蛋白;其余4个基因编码多个假定蛋白,具体功能未知。在这些转座子突变株中,菌株F172对溶菌酶敏感性最高。对转座子插入位点分析发现,包括F172在内的9个菌株(代表6个基因)的插入位点均位于galF至gnd基因簇之间。利用λred同源重组方法构建了galF至gnd基因簇内溶菌酶抗性相关基因的缺失株并进行了特性分析,结果显示与野生株相比,缺失株对溶菌酶的抗性均显著下降,且外膜的通透性也有不同程度的增加。4.NMEC脂多糖抑制溶菌酶活性的鉴定及分析脂多糖是革兰阴性菌所特有的细胞壁成份,具有广泛的生物学功能。在前期试验筛选获得的20个与溶菌酶抗性相关的基因中,6个基因位于galF至gnd基因簇。在大肠杆菌中,该基因簇常常与脂多糖O抗原的生物合成有关。为了研究这些基因在病原菌抗溶菌酶过程中的作用,提取了野生株NMEC38、缺失株和互补株的脂多糖。SDS-PAGE结果显示,野生株NMEC38的LPS图谱呈现多条条带,以梯级状排列;而缺失株LPS图谱中仅在靠近胶底处出现1～3条条带,说明缺失株的LPS结构发生了改变。Western blotting结果证实缺失株LPS缺失了O特异性侧链多糖部分。溶菌酶抑制试验和凝胶过滤层析试验证实NMEC38 LPS能够结合溶菌酶,抑制溶菌酶活性,协助病原菌抵抗溶菌酶的杀伤作用。利用酸水解法,进一步将野生株LPS裂解为O特异性侧链多糖和脂质A两部分。结合试验证实不论是侧链多糖还是脂质A均能与溶菌酶结合。但是,溶菌酶水解酶活性抑制试验显示只有O特异性侧链多糖能够抑制溶菌酶水解酶活性,提示脂多糖对溶菌酶的抑制作用是通过0特异性侧链多糖发挥作用。
关键词: 肠道外致病性大肠杆菌 ；毒力评估 ；保护性抗原 ；抗溶菌酶 ；脂多糖 ；O特异性侧链多糖
被引量
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摘要： 禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenic E.coli,APEC)是引起养禽业最严重的三种感染性疾病之一,同时它也是一种威胁人类健康的潜在食源性致病菌。本研究所用的XM(02:K1)菌株属于大肠杆菌系统进化树中的B2群,是从有败血症和神经症状的病鸭大脑中分离出的致病菌株。已有研究发现这一菌株可以引起乳鼠严重的脑膜炎症状。尽管大肠杆菌的致病机理已经得到了广泛的研究,越来越多的研究发现,除了已知的经典致病因子以外,仍然存在很多潜在的致病因子。本研究中,我们选择二元调控系统ArcB-ArcA中的ArcA基因进行研究,ArcB-ArcA二元调控系统是一种主要调控细菌适应环境中氧浓度的信号转导系统,该酶促防御系统可以促进细菌从有氧到厌氧状态下新陈代谢的转换,并且可以激活细菌对抗活性氧(ROS)。本研究首次发现ArcA还具有调节APEC XM的毒力的作用,因此,对ArcA参与调节APEC XM的毒力的作用机制进行了探索。利用RED同源重组技术构建了 APEC XM的arcA基因缺失株,并利用低拷贝质粒pGEN-MCS构建了 arcA基因的互补株,同时将pGEN-MCS质粒导入arcA基因缺失株中,构建了对照株。通过比较野生株、缺失株、互补株的生长速度以及致病力,分析aarcA对APEC XM的致病力作用。结果显示,缺失株的生长速度稍慢于野生株和互补株,但差异不显著。雏鸭半数致死量LD50测定的结果显示,野生株的LD50为 3.43×104 CFU,缺失株的 LD50 为 1.49×106 CFU,互补株的 LD50 为 6.37×104 CFU。表明缺失株的毒力显著下降,而互补株的毒力明显恢复。提示突变株毒力降低是真正由arcA基因缺失引起的。尽管试验结果表明arcA确实参与了 APEC XM的毒力调控,但是其毒力相关的机理仍然不清楚,因此对arcA缺失株和野生株XM分别在不同培养条件下进行转录组测序,以期找到arcA所调控的毒力相关基因。将野生株与缺失株分别在7日龄雏鸭血清和LB中微需氧条件下培养,提取两株菌的RNA,每组3个重复,进行转录组测序分析。arcA基因缺失株与野生株XM的转录组比较结果显示,在血清中,缺失株与野生株相比,p≤0.05,q≤0.1时,有129个基因表达量差异在2倍以上,为了验证RNA-Seq结果的准确性,我们筛选出grxA、flgB、flgK、fliC、fliD、oppB、oppD、yneI、Ildr、glc这10个基因进行荧光定量PCR验证,结果显示yneI、Ildr、glcF在缺失株中表达量显著上调,其余7个基因在缺失株中表达量显著下调,这与转录组测序分析的结果是一致的,并且所有基因荧光定量PCR的表达差异倍数均比转录组测序结果大。结果表明arcA对这些基因确实具有调节作用,同时也证实RNA-Seq的结果的真实可靠性。从转录组的分析结果中,在129个差异表达基因中并没有发现经典毒力因子,因此我们筛选出部分可能与大肠杆菌的致病性相关的基因,包括具有谷氨酸调控代谢功能的基因glnL、glnG,鞭毛合成功能的基因flgB、flgK、fliC、fliD、motD、motB,趋化性功能的基因cheA、cheW,柠檬酸代谢调控功能的基因citE:、citF、citC等,用荧光定量PCR进行验证,结果显示,这些基因在arcA缺失株中的表达水平与野生株中的存在显著差异,且变化趋势与转录组测序结果一致,表明arcA对这些基因确实具有调控作用,因此对这些基因进行进一步的研究,以期找到毒力相关基因。本研究利用RED同源重组技术,构建了 cheA、cheAW、motAW、flgBCDEFGHIJK、fliCD、citCEFXG、glnLG基因的缺失株,以7日龄健康雏鸭作为动物模型,选取1×107CFU,1×106CFU,1×1O5CFU三个不同剂量,每10只鸭子为一组,对野生株以及7个缺失株的毒力进行测定。腹腔注射感染后连续观察10天,记录鸭子死亡情况,并用fisher法统计差异显著性。结果显示,在攻毒剂量为1×105CFU时,cheA和motAB基因缺失株组的死亡数均为3,野生株组死亡数为8(p<0.05),差异显著,而flgBCDEFGHIJK、fliCD、citCEFXG、glnLG、cheAW缺失株与野生株的毒力差异均不显著。进一步的研究表明cheA、cheA&W、motA&B基因的缺失对APEC的体外生长并不产生显著的影响。这些结果提示ArcA通过对cheA、motA、motB等趋化性以及运动性相关基因的调控,从而参与对APEC致病性的调控。据我们所知,这是关于ArcA基因致病性作用研究的首次报道。
关键词: 禽致病性大肠杆菌(APEC) ；arcA基因 ；趋化性 ；运动性和毒力调节 ；缺失株 ；转录组
被引量
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