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【学位/博士】 • 熊小蔚 • 南昌大学 • 导师：周为民 • 2020年

摘要：目的:充分探讨紫檀芪对核相关因子Nrf2在动脉粥样硬化疾病中调控性作用以及其与TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路之间的关联性,探究紫檀芪改善动脉粥样硬化疾病的病理机制。材料与方法:随机选取成年SD大鼠60只,采取主动脉内皮损伤方法制备大鼠动脉粥样硬化损伤模型,将大鼠随机分成以下几组:Control组（大鼠腹腔内注射生理盐水）;Nrf2-p组（大鼠腹腔内注射Nrf2拮抗剂）;Pterostilbene组（大鼠灌胃紫檀芪溶液）;Pterostilbene+Nrf2组（大鼠灌胃紫檀芪+Nrf2激动剂）。大鼠继续培养4周,悉数将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠大体情况分析;形态学分析:HE染色分析各组大鼠主动脉内皮细胞形态;免疫组织化学染色、免疫荧光染色分析各组大鼠主动脉内皮细胞中Nrf2、Survivin、Bax、Bcl-2蛋白浓度阳性率表达;ELISA检测各组大鼠主动脉内皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-1β中浓度表达;细胞增殖与凋亡:CCK-8检测各组大鼠主动脉内皮细胞增殖趋势;Annexin V-FITC/PI双染法检测各组大鼠主动脉内皮细胞凋亡率;线粒体指标分析:线粒体膜电位分析及ATP合成能力定量分析;ROS活性氧分析;双荧光素酶检测系统检测各组大鼠主动脉内皮细胞Nrf2、TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白活性表达;TEM检测各组大鼠主动脉内皮细胞中凋亡小体分析;RT-PCR检测各组大鼠主动脉内皮细胞中Bax、Bcl-2、Survivin、Nrf2蛋白mRNA分析;Western-blot检测各组大鼠主动脉内皮细胞中Bax、Bcl-2、Survivin、Nrf2、TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白浓度表达分析。结果:各组大鼠体重变化:2周（造模）以内,各组大鼠体重增长幅度较低,大鼠体现出较缓的生长模式,在分组处理后3周6周各组大鼠的生长趋势差异性较大,比较趋势为Nrf2-p0.05,数据差异不具有统计学意义;血清相关指标分析:血脂水平分析TC、TG、LDL-2浓度变化体现出相同的趋势,各组数据比较为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p,HDL-C数据分析体现出相反的趋势,各组数据相比,P<0.05,数据差异具有统计学意义;抗氧化应激能力分析:MDA分析:比较趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p,SOD的水平表达则体现出相反的趋势,各组数据相比,P<0.05,数据差异具有统计学意义;动脉血管内皮功能分析:NO、6-keto-pGF浓度变化体现出相同的趋势,比较趋势为Nrf2-pNrf2,6-keto-pGF表达浓度分析体现出相反的趋势,各组数据相比,P<0.05,数据差异具有统计学意义;病理组织形态学分析:HE染色:对照组及大鼠及Nrf2拮抗剂组大鼠动脉壁中膜以及外膜分界线不清楚,细胞核出现固缩现象,细胞内伴随一定程度空泡现象,细胞的管腔内出现血栓碎片;在紫檀芪及Nrf2激动剂加入后,其纹理清晰性较好;免疫组织化学染色、免疫荧光化学检测:Bax蛋白:各组数据比较趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p;Nrf2,Survivin,Bcl-2:各组数据的比较为Nrf2-pNrf2;炎性状态分析:ELISA检测:TNF-α、IL-6及IL-1β浓度表达各组数据比较趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p,各组数据之间比较,P<0.05,差异具有统计学意义;脂质沉淀累积:对照组及Nrf2拮抗组可以明显的看见脂质沉淀具有不同程度累积,随着Nrf2在细胞在表达含量的增加,细胞的脂质沉淀累积减少,各组大鼠细胞脂质沉淀的累积量比较趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p;细胞增殖与凋亡:细胞增殖趋势:在转染后0小时的数据分析中,各组数据体现出相同的趋势,统计学数据P值均大于0.05,数据差异不具有统计学意义;转染后24小时、36小时、48小时:各组数据的比较趋势为Nrf2-pNrf2,各组数据之间比较,P<0.05,数据差异具有统计学意义;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡:各组大鼠主动脉内皮细胞的凋亡率比较趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p,各组数据之间比较,P<0.05,数据差异具有统计学意义;线粒体指标分析:线粒体微丝分布及膜电位:各组大鼠主动脉内皮细胞线粒体周围微丝分布密度及强度比较为Nrf2-pNrf2,随着Nrf2在细胞内表达增加以及紫檀芪的干预作用,细胞内线粒体从绿色的荧光低能量状态向红色荧光的高能量状态过渡;膜电位及ATP合成能力:各组细胞的比较趋势为Nrf2-pNrf2,P<0.05,数据差异具有统计学意义;ROS水平分析:各组大鼠主动脉内皮细胞表达趋势为Nrf2-pNrf2,各组数据之间比较,P<0.05,差异具有统计学意义;双荧光素酶检测系统:Nrf2、TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白:Nrf2:各组数据比较趋势为Nrf2-pNrf2,各组数据之间比较,P<0.05,数据差异具有统计学意义;TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白:各组数据的表达趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p,各组数据之间比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白活性表达:线粒体凋亡途径关键性蛋白酶Caspase-3及Caspase-9的浓度均发生了一定程度变化,各组数据比较Nrf2-pNrf2,各组数据之间比较,P<0.05,数据差异具有统计学意义,Caspase-8蛋白浓度的变化差异性较小;TEM检测:各组大鼠主动脉内皮细胞内凋亡小体的数量及分布程度比较为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p;RT-PCR检测:Nrf2各组大鼠表达趋势为Nrf2-pNrf2;Survivin、Bcl-2:表达趋势为Nrf2-pNrf2;Bax的表达趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p;Western-blot检测:Nrf2各组大鼠表达趋势为Nrf2-pNrf2;Survivin、Bcl-2:表达趋势为Nrf2-pNrf2;Bax的表达趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p;TLR-4、My88、NF-κB:各组数据的表达趋势为Pterostilbene+Nrf2Nrf2-p,各组数据之间比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:（1）各组大鼠动脉粥样模型建模成功,无死亡现象;Nrf2在大鼠动脉粥样硬化的发展过程中对其主动脉内皮细胞起到了一定的保护性作用;大鼠动脉粥样硬化现象出现好转,主动脉内皮细胞抗氧化能力增加,细胞的回复性逐渐增强;（2）在紫檀芪干预下,大鼠主动脉内皮细胞内Nrf2的表达增加,有效降低了TLR-4/MyD88/NF-κB细胞信号通路关键蛋白TLR-4、MyD88、NF-κB的表达,最终有效抑制大鼠主动脉内皮细胞的炎性状态、促进内皮细胞的增殖趋势,抑制其细胞凋亡;（3）紫檀芪调控大鼠动脉粥样硬化细胞凋亡过程主要通过线粒体途径来实现,其通过靶向调控Nrf2抑制TLR-4/MyD88/NF-κB细胞信号通路,有效增强血管内皮细胞线粒体的能量状态、抑制血管内皮细胞的凋亡进程;并充分结合Caspase家族激酶的变化,降低Bax蛋白的表达浓度、增加Bcl-2蛋白的表达浓度,最终抑制细胞凋亡进程,促进动脉粥样硬化疾病的恢复。

摘要译文

关键词: 紫檀芪 ；动脉粥样硬化 ；内皮细胞；半酰胺酸天冬氨基酸蛋白酶；细胞凋亡；核因子E2相关因子2 ；TLR4/MyD88/NF-κB信号通路

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