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摘要： 目的研究红树植物角果木内生真菌J62的活性次生代谢产物。方法采用多种柱色谱技术进行分离纯化,根据理化常数和波谱数据与文献对照鉴定化合物的结构,采用滤纸片琼脂扩散法测定化合物抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和白色念珠菌(Candida albicans)活性,利用MTT法测定各化合物的体外细胞毒活性。结果从角果木内生真菌J62发酵液中分离鉴定了10个化合物,分别为:反式桂皮酸(1),3,4-二甲氧基苯甲醇(2),2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4,5-dimethoxy-benzenemethanol(3),尿嘧啶核苷(4),similin B(5),coibanol C(6),hymatoxin C(7),5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol(8),豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇(9)和crispin A(10)。化合物1,2和7具有抗金黄色葡萄球菌活性,化合物1和2具有抗白色念珠菌的活性;化合物2和5对肿瘤细胞株K-562显示有生长抑制活性。结论化合物1~10均为首次从内生真菌J62中分离得到。其中化合物7的抗金黄色葡萄球菌活性和化合物5对慢性髓原白血病K562细胞株的细胞毒活性均为首次报道。
关键词: 角果木 ；内生真菌 ；化学成分 ；结构鉴定 ；抗菌活性 ；细胞毒活性
被引量
17
会议时间： 2016-09-25
摘要： 红树植物生长在热带与亚热带的海岸潮间带。由于其生长环境独特,使得红树富含许多特殊的内生微生物。本课题组之前从海南特有药用红树尖瓣海莲（Brguiera sexangula var.rhynchopetala）中分离得到lOO多株内生微生物,并从其中的匐柄霉属内生真菌Stemphylium sp.3323l中分离得到12个新化合物,其中的一些次级代谢产物表现出较好的抗肿瘤及抗菌活性。在我们进一步对红树微生物研究中,本课题组从药用红树角果木（Ceriops tagal）中分离得到50多株内生真菌以及lO多株放线菌。通过综合运用生物活性和HPLC筛选,优选出一株具有生物活性且代谢产物丰富的青霉属真菌进行了系统的研究。在活性追踪条件下我们分离得到了3个新的链状化合物及1个已知化合物（1-4）,其中化合物1与2为一对差向异构体。
关键词: 角果木 ；青霉属真菌 ；直链化合物
摘要： 红树林植物(Mangrove plants)是一类非常独特的海洋生物,由于其所处的特殊生境,不仅使红树植物演生出特殊的次级代谢产物生物合成途径,而且为红树林内生真菌提供了特殊的宿主环境,使红树植物内生真菌种类丰富,构成了海洋真菌的第二大生态群。角果木Ceriopstgal作为民间药用植物,其化学成分的研究一直受到关注,角果木内生真菌较于红树科其它植物内生真菌被研究较少,其内生真菌多样性还未被系统发掘。本研究选取了角果木为研究对象,从3个不同采样点、5个不同器官组织对角果木内生真菌进行系统发育研究和多样性分析,对角果木及其内生真菌中获得的代谢产物进行分离、结构鉴定和生物学评价,以期为开发新的红树林天然药物资源提供新思路。(1)从角果木的975个组织块中分离到内生真菌408株,采用分子生物学的手段结合形态鉴定,初步确立其分类地位。将164个形态型归属于真菌界2个门,5个纲,10个目,23个属,45个种。其中23个形态型鉴定到属,1个形态型未确定分类地位。所鉴定真菌中子囊菌门Ascomycota占97.8%,担子菌门真菌Basidiomycota占2.2%。与之前角果木内生真菌研究结果相比,本研究中3个采样地的角果木内生真菌多样性更为丰富。角果木内生真菌定殖率、与分离率受宿主不同部位器官的影响比地理位置影响更加明显。A采样地定殖率与分离率均是花>胚轴>枝>根>叶,B采样地定殖率与分离率均是花>枝>根>叶,C采样地定殖率与分离率均是胚轴>枝>根>叶。总体表现为定殖率与分离率均是花(胚轴)>枝>根>叶。宿主生境(海水盐度)和宿主器官部位对生物多样性与物种丰富均有影响,3个采样地香浓指数(H')和物种丰度均是A(海水盐度为19‰)>C(海水盐度为16‰)>B(海水盐度为11‰),基本表现出一定范围内海水盐度越高,内生菌有更高的物多样性与物种丰富度,当然这一规律仍然需要更多的研究案例来验证。角果木内生真菌群落组成在不同采样地和不同器官间均存在差异,不同器官之间差异更明显。A采样点的最优势目是炭角菌目Xylariales,最优势属是拟盘多毛孢属Pestalotiopsis,最优势种是忽视拟盘多毛孢Neopestalotiopsis chrysea;B、C采样点的最优势目肉座菌目Hypocreales,最优势属是镰孢菌属Fiusarium,但最优势种分别为层出镰刀菌Fusarium proliferatum和木贼镰刀菌Fusarium equisetf。从不同器官方面,根和枝的最优势目为炭角菌目Xylariales,葡萄座腔菌目Botryosphaeriales为叶片中的最优势目,胚轴的最优势目为肉座菌目Hypocreales,煤炱菌目Capnodiales则是花的最优势目;根、枝、叶、胚轴、花的最优势属分别是壳梭孢属Neofusicoccuum、炭疽菌属Colletotrichum、多节孢属Nodulisporium、镰孢菌属Fusarium和枝孢菌属Cladosporium。在所分离鉴定出的内生菌中,只有Fusariumproliferatum、Pestalotiopsis microspora、Colletotrichum gloeosporioides、Aspergillus sydowii 几种真菌在同时从 3个采样地分离到。还没有发现在所有器官都存在的菌种,多数内生真菌都表现出宿主器官的偏好性和对宿主生活环境的选择性。如Fusarium oxysporum只从C采样点的胚轴中分离到。Phellinus noxius只定殖于B采样点叶片中,Cytospora sp.只从A采样点枝条中分到等。(2)用乙醇浸泡后,通过超声提取法获取角果木胚轴有效成分。通过反复过正相硅胶柱、反相硅胶柱和葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)柱层析、HPLC等手段,从角果木胚轴二氯甲烷段和石油醚段分离得到单体化合物分离获得23个单体化合物。通过波普解析手段(1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、ESI-MS、EI-MS)以及对文献的参照对比,鉴定出其中14个化合物结构式。其中包含11个三萜类化合物(化合物1-3,5-11),1个倍半萜(化合物4)和2个甾体类化合物(12、13)。并且首次从角果木中分离到倍半萜类化合物。(3)通过有效的抗菌活性筛选得到目标菌株Cytospora sp.(MG948459),使用优化的培养基将目标菌株进行下一步发酵产物的提取和分离。获得28个单体化合物。采用波普分析技术(1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、ESI-MS、HR-ESI-MS、LC-MS)对分离得到的单体化合物进行深入研究,并结合参考文献加以比对,鉴定出18个化合物的结构式。包含有3个倍半萜类化合物(C1、C13、C14),5个酚类化合物(C6、C10、C11、C12、C15),6个甾体类化合物(C5、C7、C8、C9、C16、C17),1个吡喃酮类化合物(C3),1个苯并呋喃酮(C4)和2个异香豆素类化合物(C2、C18)。其中化合物C1、C2、C3为新化合物,化合物C13、C14为一对反顺异构体。(4)所将角果木及其生真菌代谢Cytosporasp.所得单体化合物进行生物学活性评价。分别选取动物病原菌大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、白色念珠菌CAlbicans和植物病原菌胶孢炭疽菌C.gloeosporioides、稻瘟病菌M.oryzae、芽孢枯草杆菌及subtilis等8个菌株作为指示菌株,肝癌细胞HepG2作为指示细胞进行抗菌和抗肿瘤筛选。其中角果木胚轴化学成分中具有抑菌作用的成分(化合物13、3、6、7、11)占所有化合物的50%;Cytospora sp.代谢产物中具有抑菌作用的真菌代谢产物(化合物C6、C7、C9、C1、C2、C4、C12、C13、C14、C15、C16)占所有化合物的73%,证明之前对菌株进行的抗菌活性筛选有效。化合物C11对肝癌细胞HepG2具有较强抑制作用,其ICs0值达到3.50±0.68μg/mL,比阳性(5.66±0.48μg/mL)对照更强。值得进一步研究。
关键词: 角果木 ；胚轴 ；内生真菌 ；多样性 ；Cytospora sp. ；代谢产物 ；生物活性
被引量
2
摘要： 真菌来源的次级代谢产物是开发新型药物的重要物质来源,近年来,发现新结构、新活性的次级代谢产物超过50%来源于真菌。因此深度挖掘真菌中天然活性化合物,既是研究热点,也是为药物研发提供必要的物质来源,并具有重要的科学意义。基于基因组测序技术及信息生物学的发展,结合传统方法,本研究对四株红树林植物内生拟茎点霉属真菌Phomopsis sp.和拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis sp.的全局调控因子进行过表达调控,以及对一株红树林植物角果木来源的内生拟内黑盘壳菌Endomelanconiopsis endophytica的次级代谢产物进行研究以及抗肿瘤和免疫抑制的生物活性评价。对分别来自红树植物正红树、红海榄、海莲、红茄苳的四株内生真菌Phomopsis sp.DHS18、Pestalotiopsis sp.HHL13、Phomopsis sp.HL4、Pestalotiopsis sp.HQD6的全局调控因子进行过表达调控激活。通过分析四株真菌的全基因组序列,挑选出五个调控因子Lae A,Lae B,Mcr A,Pfccl A,Pfhda A,成功构建出18个过表达质粒,转化原生质体,构建过表达的转化子,筛选过表达菌株。通过对过表达突变菌株与野生型菌株的小发酵的次级代谢产物的检测对比发现,全局调控因子Lae A和Lae B对菌株基本正调控,有利于增加次级代谢产物的产量,而全局调控因子Mcr A则对菌株负调控,次级代谢产物的产量有所下降,Pfccl A和Pfhda A的调控不太确定,菌株次级代谢产物的产量有增有降。基于以上结果,表明过表达真菌的全局性调控因子这一调控策略能够激活真菌沉默基因簇,从而丰富真菌次级代谢产物的结构多样性。对角果木内生拟内黑盘壳菌Endomelanconiopsis endophytica进行固体发酵并用乙酸乙酯萃取得到粗提物,综合使用正相/反相硅胶柱、葡聚糖凝胶柱以及半制备高效液相等多种现代色谱分离技术,并综合利用核磁共振谱、高分辨质谱及紫外等多种方法来确定化合物的平面结构,共分离鉴定了12个化合物,主要包括其他类化合物（1、2、3）,生物碱类化合物（4、5、6）,甾体类化合物（7）,异香豆素类化合物（8、9、10）,芳香类衍生化合物（11、12）。其中化合物1、2为新化合物,化合物4、7首次从Endomelanconiopsis endophytica的次级代谢产物中分离得到。生物活性评价结果表明,化合物1、7、9对肿瘤细胞Hep G2具有明显的抑制活性,其IC50值分别是19.46±1.43μM、0.87±0.41μM、26.56±0.96μM,化合物1、7对肿瘤细胞A549具有较好的抑制活性,其IC50值分别是28.62±2.03μM、10.23±1.51μM。化合物1-12均无免疫抑制活性。
关键词: 内生真菌 ；过表达 ；全局调控因子 ；次级代谢产物 ；生物活性
摘要： 内生真菌是结构新颖天然活性化合物的重要来源,充分挖掘利用内生真菌资源已成为全球追求的热点之一。红树林生长于热带、亚热带沿海潮间带滩涂上特殊的海洋生物类群,具有高盐胁迫、高矿物质渗透、频繁潮汐侵蚀等恶劣生境特征。红树植物内具有丰富的内生真菌资源,已成为海洋真菌的第二大类。红树内生真菌因其独特的生存环境与丰富的次生代谢产物而备受关注,掀起了广泛科研探索热潮,期间发现了很多具有抗生活性的化合物,成为海洋药物开发利用重要资源。独特的生存环境往往赋予红树植物内生真菌独特的生长代谢机制,从而形成结构新颖多样的次生代谢产物。同时,这些结构新颖的化合物具有良好的、广泛的抗生活性如抗菌、抗肿瘤、降血糖等活性,对新药的研发具有无限潜力。
角果木(Ceriops tagal)为一种红树科(Rhizophoraceae)角果木属(Ceriops)常绿灌木,其作为海南黎药的常用药用植物,具有多种生物活性。对角果木植物次生代谢产物的研究中得到了具有抗艾滋病、抗肿瘤、抑菌、抗氧化等多种生物活性的化学成分。然而,对于其内生真菌次生代谢产物的研究鲜有报道,前期本课题组对角果木内生真菌次生代谢产物研究中获得了多个具有抗肿瘤及抗菌活性且结构新颖的化合物,为了进一步对角果木内生真菌次生代谢产物的化学多样性及生物活性进行研究,寻找结构新颖的活性天然产物,本文对分离自海南东寨港红树林自然保护区的海南红树林植物角果木不同部位的95株植物内生真菌进行筛选。利用化学(TLC-特征显色)与生物学(抗菌、抗肿瘤、降血糖及乙酰胆碱抑制等)相结合的方法,从中筛选得到两株代谢产物同时具有生物活性及化学多样性的菌株J54和J6,对其进行了菌株鉴定,次生代谢产物及活性研究,同时对所得新化合物的生物合成途径进行了推到。
结合多种柱色谱法对内生真菌J54和J6发酵产物进行分离纯化,并通过理化性质及现代波谱技术(MS, IR, UV,1D-和2D-NMR等)鉴定化合物的结构,最终对各个单体化合物进行MTT法体外细胞毒活性测试、滤纸片法抗菌活性测试和体外降血糖活性测试。
从角果木叶片中内生真菌J54PDA发酵液中共分离得到16个单体化合物,经鉴定为：lyratols H-O (1-8)、aervecdysteriod D (9)、pteleifoside C (10)3-methoxyepicoccone (11)、2,4-二.羟基-3,5,6-三甲基苯甲醛(12)、mycosphine B (13)、 mycosphine A (14)、5-羟甲基糠醛(15)、对羟基苯己醇(16)。其中化合物1-8为一系列新的陪半萜化合物。
从角果木枝干中内生真菌J6大米固体发酵产物中共分离鉴定了7个化合物,
分别为：thermolides (17-21)、 rigidiusculamide C (22)、 citreoisocoumarin (23)、其中,17-23均为首次从角果木内生真菌中分离得到。
对所得化合物进行体外抗肿瘤、抗菌、降血糖及乙酰胆碱活性测试。测试结果表明,化合物1和化合物11对白血病细胞K-562都有不同程度抑制作用,ICso分别为90.1μM、52.2μM；化合物2对金色葡萄球菌具有抑制作用,抑制圈直径为9.4mm；化合物4和化合物23对白色念球菌具有不同程度抑制活性,抑制圈直径分别为21.8mm、11.2cm；化合物6具有降血糖活性,半抑制浓度为ICs0=2.27mM。
关键词: 角果木 ；内生真菌 ；次生代谢产物 ；结构鉴定 ；生物活性
被引量
1
摘要： 红树林(mangrove)作为生长于热带与亚热带海岸及河口潮间带的木本植物群落,长期处于强还原性、高矿物质组成、强酸、寡营养、强紫外辐射、强风、频繁的潮汐等极端环境之中造就了其独特而丰富的微生物种类。真菌作为其中的重要组成成分之一,种类丰富,组成了海洋真菌的第二大类群,不同类群之间的相互作用与环境因子的胁迫,造成红树林内生真菌不断进化形成特有的次级代谢产物合成途径、独特的调控机制以及与之相关的新基因,可以产生结构新颖、生物活性良好的化合物,成为天然产物的研究热点之一,一系列化学结构独特和生物活性活性显著的红树植物内生真菌次生代谢产物已被报道。角果木(Ceriops tagal)是红树科(Rhizophoraceae)角果木属(Ceriops)的常绿植物,是海南特有少数名族黎族常用药用植物之一。课题组前期由角果木各部分中分离获得了 95株内生真菌,并从其产物中获得10余个结构新颖和生物活性良好的化合物。本文在此基础之上,通过化学(TLC-特征显色和HPLC分析、数据库比对)和生物活性测试(抗菌、抗肿瘤、降血糖及乙酰胆碱酯酶抑制等)相结合的方法,从中筛选出1株次生代谢产物丰富和生物活性良好的菌株J5,通过分子生物学方法鉴定该菌株为Coriolopsis J5,综合多种现代分离手段对其次生代谢产物进行分离纯化,结合其理化常数和波谱数据分析对化合物结构进行鉴定,分别采用MTT法和滤纸片琼脂扩散法测定化合物的体外细胞毒活性及抗菌活性。从角果木内生真菌CoriolopsisJ5大米固体发酵产物中共分离获得27个化合物:5-(3-methoxy-3-oxopropyl)furan-2-carboxylic acid(1),1-(5-(2-hydroxypropanoyl)furan-2-yl)pentan-3-one(2),2-hydroxy-l-[5-(1-hydroxypentyl)-furan-2-yl]-propan-l-one(3),1-(5-(1,2-dihydroxypropyl)-furan-2-yl)pentan-l-one(4),5-(1-hydroxypent-4-en-1-yl)furan-2-carboxylic acid(5),5-(3-hydroxypentyl)furan-2-carboxylic acid(6),5-(1-hydroxypenty l)-furan-2-carboxylic acid(7),5-(2-carboxyvinyl)furan-2-carboxylic acid(8),methyl 5-(2-methoxycarbonylethy)furan-2-carboxylate(9),5-(2-carboxy-ethyl)-furan-2-carboxylic acid(10),2-咲喃甲酸(11),5-(hydroxymethyl)furan-2-carboxylic acid(12),coriolospter A(13),coriolospter B(14),conocenol C(15),ceriponol E(16),(3,5-dihydroxy-6-methoxy-4-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl 2,3,4-trihydroxybutanoate(17),14-acetoxy-15-hydroxyirpexan(18),15α-hydroxytrametenolic acid(19),3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oicacid(20),(20S,22E,24R)-5α,8α-表二氧-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(21),3,5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-diene(22),β-谷-甾醇(23),latifolicinin C(24),对羟基苯乙酸甲酯(25),棕榈酸-a-单甘油酯(26)和亚油酸(27),其中9个新化合物,4个新天然产物。生物活性测试结果表明:化合物18和22对人慢性髓原白血病细胞株K-562、人肝癌细胞BEL-7402和人胃癌细胞SGC-7901均具有细胞毒活性;化合物9和25具有抗菌活性。
关键词: 角果木 ；内生真菌 ；次生代谢产物 ；结构鉴定 ；生物活性
被引量
1
摘要： 人们已经从内生真菌中分离到各种各样的生物活性化合物和独特的化学结构,它们在农业、医药和工业中具有较高的开发潜力。海洋微生物作为一个重要的组成部分,海洋真菌代谢产物的多样性越来越被人们认可和接受。红树林真菌作为第二个最大的海洋真菌生态群,人们已经意识到,它们在红树林适应性方面具有非常重要的作用,且在新产品的筛选中他们也被认为是很有前途的来源。目前为止,有关中国红树植物角果木(Ceriops tagal)内生真菌的研究还鲜有报道。本研究以角果木为材料,从其根、叶、枝中共分离得到95株内生真菌,并对所分离得到的内生真菌进行初步形态学鉴定和抗菌活性筛选。对其中活性比较强的J3和J62菌株,在次生代谢产物的分离鉴定与活性筛选等方面做了较为系统的研究。
对中国红树植物角果木中分离得到95株内生真菌,依据其显微特征和菌落形态,将其中94株真菌归为半知菌类,即产孢的28株鉴定为13个属,其中青霉属(Penicilliumsp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)和枝顶孢霉属(Acremonium sp.)为优势属,剩下未产孢的66株真菌暂归为无孢菌群,还有1株属于担子菌纲。结果表明,中国红树植物角果木树叶的真菌在种群、数量及其组成方面与根、枝相比存在较大差异,此结果表明角果木内生真菌对其宿主植物具有一定的组织专一性。
对95株角果木内生真菌进行了抗菌活性和抗肿瘤筛选。结果显示,有7株具有抗金黄色葡萄球菌的活性,3株具有抗MASR的活性,有8株内生真菌至少对一种指示瘤株具有细胞毒活性,6株内生真菌对烟草青枯病原菌有抑制作用。这表明角果木内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源,其生物活性成分值得进一步研究。
采用多种柱色谱技术对化合物进行分离纯化,通过理化性质及现代波谱技术(MS, IR, UV,1D-和2D-NMR等)鉴定化合物的结构,经MTT法进行体外细胞毒活性筛选及滤纸片法进行抗菌活性测试。
从角果木叶片内生真菌J3发酵液中共分离得到11个化合物,分别是：2a-hydroxylxylaranol B (1),4β-hydroxylxylaranol B (2),1,3,5-trihydroxy-4-methoxy-xanthone(3), dihydropenicillic acid (4),1-methyl emodin (5),3,4-seco-sonderianol (6), cyclo(L-prolinyl-L-tyrosine)(7),2'-deoxythymidine (8),(3S,20S)-20-(propylamino-methyl)-pregn-7-en-3-ol (9), quinoline (10), uracil(11)。从内生真菌J62发酵液中共分离鉴定了10个化合物,分别为similin B (12), trans-cinnamicacid (13),3,4-dimethoxybenzyl alcohol (14),2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4,5-dimethoxy-benzen-emethanol (15), coibanol C(16), uridine(17),5,8-epidioxy-5a,8a-ergosta-6,22E-dien-3b-ol(18), stigmasta-7,22-diene-3b,5a,6a-triol (19), hymatoxin C (20)知crispin A (21).其中,化合物1和2为新的愈创木烷型倍半萜,化合物9为新天然产物；所有化合物均为首次从该角果木内生真菌中分离得到。
采用MTT法测定化合物的细胞毒活性,结果显示化合物3,6,7,12和14对人慢性髓原白血病细胞K562显示有生长抑制活性,化合物6对人肝癌细胞BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901和人慢性髓原白血病细胞K562三种指示瘤株均有细胞毒活性。采用滤纸片琼脂扩散法测定化合物的抗菌活性,结果显示化合物3,4,5,6,13,14和20具有抗金黄色葡萄球菌活性,化合物7,13和14具有抗白色念珠菌的活性。
关键词: 角果木 ；内生真菌 ；次生代谢产物 ；结构鉴定 ；抗菌活性
被引量
1
摘要： α-淀粉酶抑制剂(Alpha-amylase inhibitors)在临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高血脂、肥胖等病症；在农业上,α-淀粉酶抑制剂基因可作为抗虫基因,改良植物抗虫性,减少杀虫剂的使用；在酶学研究方面,可作为探究α-淀粉酶活性部位的分析工具,作为通过选择作用测定α-淀粉酶同工酶的反应物,作为蛋白质与蛋白质之间识别和相互作用的模林体系等。
本课题对广西红树林自然保护区海水、海泥中的微生物以及红树林植物红海榄内生真菌进行α-淀粉酶抑制活性菌株筛选分离,根据菌株的形态与培养特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,确定该菌的归属。探究优化该菌最佳的培养和发酵条件,对其产生的α-淀粉酶抑制剂进行纯化方法研究,并对该物质的理化性质进行研究。
本论文研究的方法和主要结果如下：
1、菌株的分离筛选
采用常规稀释涂布分离法、内生真菌平板分离法,从海水、海泥以及红树植物中分离出36个菌株,对其发酵液分别采用a-淀粉酶抑制剂筛选模型的打洞法初筛和Bernfeld法进行复筛。海水、海泥共筛选到12株菌,内生真菌筛选到2株菌通过初筛模型,均对α-淀粉酶有一定的抑制效果,其中海泥菌株NTS-11的发酵液对α-淀粉酶的抑制活性最高,透明圈仅为2.18cm(对照组为2.80cm)。选取初筛的14株菌采用Bernfeld法进行复筛,并以阿卡波糖作阳性对照实验,结果显示,海泥菌株NTS-11的发酵液对α-淀粉酶有较强的抑制效果,1ml的发酵液原液与0.02mg的阿卡波糖抑制效果相当,对α-淀粉酶、唾液淀粉酶的抑制率分别为34.23%、29.36%,抑制酶活为266.1935U·100ml-1。
2、菌种鉴定
选取对α-淀粉酶抑制活性最高的菌株NTS-11,在Zobell-2216E培养基上进行划线培养,32℃培养2-7d后,菌落呈圆形,质地黏稠状,不透明,表面光滑且显淡黄色,中央隆起,边缘整齐,菌落与培养基结合疏松,易挑取；显微镜下显示,菌体粗长杆状,有厚荚膜；偶见芽孢,通过芽孢染色观察,芽孢呈两种形态,椭圆形或长杆状端生,菌体和芽孢的大小多在2-41μm范围内。
将菌株NTS-11接种于多种培养基上进行培养特征鉴定。结果该菌株在普通细菌培养基一LB培养基上生长速度较快,且能较好利用海洋细菌专用培养基,同时对部分常见单糖和二糖碳源能较好的利用,尤其在以D-麦芽糖和D-葡萄糖为碳源的培养基中,菌株生长速度较快,2d时菌落直径可达5mm左右。菌株在发酵过程中,利用葡萄糖发酵产酸,pH值不断降低,使甲基红试验呈阳性,有明胶液化能力,能分解含硫的氨基酸产生硫化氢,并在培养液表面形成少量的菌膜。该菌的某些生理生化特征与大肠杆菌等细菌一致。
提取菌株NTS-11的基因组DNA,采用细菌的通用引物对其进行16S rDNA基因PCR扩增,由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带,用UNIQ-10DNA胶回收试剂盒进行纯化并外送进行序列测定。16SrDNA序列测定结果显示,该序列长度为800bp。将序列通过BLASTN与GenBank文库中已有的序列进行比对,并用MEGA4.0软件构建Neighbour-Join系统发育树可知,该菌株与Pontibacillus属的两个模式种BH030004和BH030062有97%的同源性；结合形态、培养、生理生化及碳源利用试验与两个模式种BH030004和BH030062的各项试验指标比对,可认为NTS-11为芽孢杆菌科Pontibacillus属中度嗜盐菌的一个未定种,暂命名为Pontibacillus marine sp. NTS-11。
3、菌株稳定性实验及其发酵条件的研究
菌株Pontibacillus marine sp. NTS-11进行传代实验表明,该菌株经6代的传代培养稳定性较好,能利用的最佳碳源、氮源分别为麦芽糖和酵母膏；在发酵时间、培养温度、培养初始pH值、装瓶量这四个发酵培养条件中,发酵时间对菌株产α-淀粉酶抑制剂影响最大,其他由大到小依次是装瓶量、培养温度和初始pH值。各因素的最优水平为：时间144h,温度36℃,pH=9,装瓶量50ml。最优水平组合A2B2C3D1的发酵液表现出最高的对α-淀粉酶的抑制率,达到57.34%,同时该组合对唾液淀粉酶亦产生很好的抑制作用,抑制率为46.35%。对正交表数据进行方差分析,结果发酵时间和装瓶量对抑制率的影响达到显著水平。说明主要是发酵时间和装瓶量对发酵结果的影响起到最重要的作用。
4、α-淀粉酶抑制剂有效部位的筛选
取最佳发酵条件发酵的发酵液1L进行预处理,用液-液萃取法按极性由小到大的有机溶剂顺序进行萃取,回收几种有机相和最后剩余的水相进行浓缩,最后得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相各5m1。将萃取得到的浓缩液分别用打洞法及Bernfeld法与阿卡波糖阳性对照一起进行降糖活性的测定,得到抑制活性最高的水相,对α-淀粉酶的抑制率达到71.42%。
5、α-淀粉酶抑制剂的纯化
取对α-淀粉酶抑制率最高的水相进行降糖活性成分的分离纯化。采用D-101型大孔吸附树脂进行脱脂除盐,洗脱剂为甲醇-水系统,洗脱剂比例为0：10、2：10、5：10、10：0,每个比例洗脱3个柱体积,将洗脱液浓缩后采用Bernfeld法进行降糖活性测定,结果显示洗脱剂甲醇-水的比例为2：10的流分对a-淀粉酶的抑制率最高,达到66.32%。
将大孔吸附树脂粗分的样品用湿法上200-300目硅胶层析柱,洗脱溶剂系统为氯仿-甲醇系统,按极性从小到大梯度洗脱,比例依次为：20：1、15：1、10：1、6：1、4：1、2：1、1：1、1：3、1：5、0：10。每个梯度洗脱2个柱体积,洗脱液浓缩成等体积浸膏后分别进行a-淀粉酶抑制活性检测,结果在洗脱液氯仿：甲醇比例为2：1时,具有抑制活性的物质被洗脱出来,经浓缩后该流分对α-淀粉酶抑制率达到82.46%。
选取甲醇-水系统作为Sephadex LH-20柱层析洗脱剂继续分离降糖活性成分,洗脱剂比例为1：5,洗脱速度为1ml-min-1,每管接5m1,共接得30管流分,约3个柱体积(150ml), TLC法分别合并相同组分,Bemfeld法分别测定降糖活性。结果显示在50-80min时间内(即第10管～第16管),大量的目的产物被洗脱下来,对α-淀粉酶抑制率达92.72%,同时对唾液淀粉酶抑制率达79.54%。
将纯化的样品用2m1甲醇溶解,采用HPLC进行分析,HPLC分析条件为：Waters515高效液相色谱仪, Waters2487双通道紫外检测器,Sun FireTM C18柱(4.6×250mm),进样量：5μl,柱温：室温,流速：1.0ml-min-1,检测波长254nm。结果在12.19min时出现一单峰,在1min左右时间内大量物质被洗脱下来,接取该组分,通过Bernfeld法检验,结果显示该物质对α-淀粉酶的抑制率为87.43%,抑制α-淀粉酶酶活为777.6614×87.43%=679.91U·100m1-1,是所筛选的α-淀粉酶抑制剂。该纯化物抑制α-淀粉酶的最适反应条件为：温度50℃、pH值7.0。最大抑制酶活为777.6614×94.51%=734.9678U·100m1-1,相当于1.202mg·ml-1阿卡波糖的抑制效果。通过化学成分预实验,初步显示该物质为糖苷类物质。
关键词: 微生物源α-淀粉酶抑制剂 ；抑制率 ；筛选 ；鉴定 ；纯化
被引量
10
摘要： 本论文包括三部分,第一部分为文献综述,第二部分为红树植物瓶花木(Scyphiphora hydrophyllacea Gaertn. f.)的生物活性成分研究,第三部分为红树林植物瓶花木内生真菌C22和C43的生物活性成分研究。
由于其特殊的生长环境,红树林植物富含结构新颖、具有生物活性的化合物,为了寻找红树林植物瓶花木中的活性成分及新颖结构,在活性筛选指导下,我们对所采集的瓶花木样品的化学成分进行了深入系统的研究。从瓶花木枝条的乙醇提取物中共分离得到12个化合物,通过质谱、红外、核磁(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HSQC、HMBC、NOESY)等现代光谱方法,并结合物理、化学的方法分析鉴定了它们的结构,包括8个环烯醚萜类化合物：scyphiphin C (1)、scyphiphin D (2)、hydrophylin A (3)、hydrophylin B (4)、shanzhiside methyl ester (5)、geniposidic acid (6)、shanzhigenin methyl ester (7)和1-epishanzhigenin methyl ester (8)和4个黄酮类化合物：山柰酚(9)、芹菜素(10)、和5,7,2'-trihydroxy-3,6,8,4',5'-pentamethoxyflavone (11)和5,7-dihydroxy-3,3',4',5'-tetra-methoxyflavone(12)。其中scyphiphin C (1)、scyphiphin D (2)、hydrophylin A (3)和hydrophylin B(4)为新化合物。化合物5、7-12为首次从该植物中分离到。化合物7和8的混合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的增贿显示了较强的生长抑制活性。
此外,为了可持续利月宝贵的红树林植物资源,我们对红树林植物瓶花木内生真菌进行研究。采集瓶花木的根、茎、叶并培养其内生真菌,从根中分离出25株内生真菌,从茎中分离出42株内生真菌,从叶中分离…10株内生真菌。对所分离到的内生真菌的发酵产物进行化学成分的分析和抗肿瘤活性筛选,结果发现菌株C22和C43显示出较强的抗肿瘤活性,对活性菌株进行大规模发酵,采用活性追踪的方法从菌株C22中分离得到两种抗生素：布雷菲尔德菌素A(13)和木霉菌醇(14)。从菌株C43中分离得到6个化合物,鉴定其结构分别为：细胞松弛素D (Cytochalasin D)(15)、7R*-10,11,12-Guaianetriol (16)、piliformic acid (17)、7S*-10,11,12-Guaianetriol(18)、去乙酰基细胞松弛素D (Zygosporin D) (19)和scyphiester (20)。其中scyphiester (20)为一新化合物。化合物13-20均为首次从瓶花木内生真菌中分离到。
采用体外肿瘤细胞生长抑制实验(MTT法)测试所分离到的化合物的抗肿瘤活性。发现其中化合物13、14、15、19对胃癌细胞SGC-7901有较强的抑制活性,其IC50分别为0.3цg／mL、2.0ug／mL、0.3ug／mL和0.4цg/mL。化合物13、14对肺癌细胞SMMC-7721也表现出较强的细胞毒活性,其IC50分别为0.4ug／mL和8.0ug／mL
关键词: 红树植物 ；瓶花木 ；内生真菌 ；次生代谢产物 ；细胞毒活性
被引量
2
摘要： 具有“海上森林”之称的红树林是分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落,是一种特殊的海洋生态系统,其中蕴藏着丰富的微生物资源。为了适应周期性遭受海水浸淹的特殊环境,红树植物及其共附生微生物可能具有适应该特殊环境的特殊代谢机制,从而代谢产生结构新颖、生物活性多样的代谢产物。红树林内生真菌是红树林微生物的主要组成类群,是海洋真菌的第二大类群,近年来,从其次生代谢产物中发现并报道了一系列化学结构新颖、生物活性良好的单体化合物,受到科学家们的广泛关注,成为天然产物研究的热点之一。角果木(Ceriops tagal)为红树科(Rhizophoraceae)角果木属(Ceriops)植物,木果楝(Xylocarpus granatum)为楝科(Maliaceae)木果楝属(Xylocarpus)植物,本研究组前期从角果木和木果楝各部分组织中分离得到上百株内生真菌,并从其次生代谢产物中分离获得多个结构新颖、生物活性良好的单体化合物。本次研究在研究组前期工作基础上,通过改变不同培养基条件对两株红树植物内生真菌HNWSW-1和HNWSW-2的发酵条件进行优化,结合化学分析(TLC与HPLC相结合)和生物活性检测结果,以最优发酵条件进行发酵,利用分子生物学方法对其进行鉴定,采用多种柱色谱技术对其次生代谢产物进行分离纯化,通过波谱数据分析结合理化常数对所得单体化合物的结构进行鉴定,同时,对所得单体化合物的抗菌活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、a-葡萄糖苷酶抑制活性、细胞毒活性及全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)抑制活性进行测试。对角果木内生真菌Cladosporium sp. HNWSW-1的次生代谢产物进行研究,从中分离得到 13 个单体化合物:cladoconvolutin A (1),cladoconvolutin B (2),cladoconvolutin C (3), (10S)-3-(3, 3-dichloro-2-hydroxy-propyl)-8-hydroxy-6-methoxy-isochromen-1 -one (4) , (E)-7-hydroxy-5-methyl-2-(prop-1'-en-1'-yl)-4H-chromen- 4-one (5),(11R)-2,4,7-trihydroxy-6-(1-hydroxyethyl)anthracene-9,10-dione (6),(5S)-5-hydroxy-7-(4"-hydroxy-3"-methoxy-phenyl)-l-phenyl-3-heptan-one (7) , (7R)-methoxypurpuride (8),(5aS,9S,9aS)-1,3,4,5,5a,6,7,8,9,9a-decahydro-6,6,9a-tri-methyl-3-oxonaphtho[1,2-c]furan-9-y1 N-acetyl-L-valinate (9), 2-chloro-3, 5-dimeth- oxybenzyl alcohol (10),2-chloro-5-methoxy-3-methylphenol (11),ergosterolperoxide(3β-hydroxy-5,8-epidioxyergosta-6, 22-diene) (12),ilicicolinH (13)。其中化合物 1-6 个为新化合物,化合物7-13为已知结构化合物,并首次报道了化合物11的1HNMR谱和13CNMR谱数据。从木果楝内生真菌Xylaria sp. HNWSW-2的次生代谢产物中分离得到7个化合物,分别鉴定为:xylquinone (14),xylalkaloid (15),5-(1'-hydroxy-3'-methylpentyl)-2-(hydroxymethyl) -4H-pyran-4-one (16 和 17), astropyrone (18),guaidiol (19),吲唑(20)。其中化合物14-17个为新化合物,化合物20为首次从微生物的代谢产物中分离得到。生物活性测试结果表明:化合物7、10具有抑菌活性;7～10具有全齿复活线虫抑制活性;化合物6-10、13和18～19具有弱的乙酰胆碱酯酶抑制活性;1、6和18具有不同程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性;化合物1和化合物13对人肝癌细胞株BEL-7402和人子宫颈癌细胞HeLa具有细胞毒活性。本研究对两株红树林来源内生真菌进行研究,在其次生代谢产物中发现,部分单体化合物具有全齿复活线虫抑制活性,为研究农业病原线虫抑制剂提供科学基础。
关键词: 角果木 ；木果棟 ；红树植物 ；内生真菌 ；次生代谢产物 ；生物活性
被引量
2
摘要： 红树林湿地生态系统分布于热带和亚热带地区的海岸潮间带,为一种介于海洋和陆地之间的特殊的海洋生态系统。因为泥沙落叶的沉积,以及海水和空气的交替影响,该地理位置具有高温、高盐、低氧、酸性的土壤和水域环境,久而久之,生活在这里的红树林生物往往具有不同与海陆两地生物的生理机制和代谢途径,有潜力产生特殊化学结构的生物活性物质,为开发药物先导化合物提供了可能,因而具有巨大的研究利用价值。本论文采用现代化学分析方法和分离制备手段,对来自中国海南、泰国和马来西亚三个不同地域的红树林植物及其内生真菌的次生代谢产物进行了较为系统的化学成分研究,使用TLC、HPLC-DAD、LC-MS联用等技术快速追踪,采用正相、反相、凝胶柱层析和HPLC等方法分离纯化,利用旋光（ORD）、紫外（UV）、质谱（HRESIMS,ESIMS）和核磁共振波谱（NMR）等技术对分离得到的单体化合物进行结构鉴定。结果显示,从海南角果木中分离鉴定出12个化合物（C-1C-12）,分别为8个dolabrane二萜,1个pimarane二萜和3个lupane三萜,其中tagalsin V（C-1）和tagalsin W（C-2）为新dolabrane二萜;从泰国红树来源的拟盘多毛孢内生真菌Pestalotiopsis sp.xy18中分离得到7个化合物（X-1X-7）,分别为3个ɑ-吡喃酮衍生物,2个异香豆素衍生物,1个胸腺嘧啶脱氧核苷和1个甾醇类化合物,其中（5-hydroxymethyl-4-methoxy-6-methyl-2-oxo-2H-pyran-3-yl）methyl acetate（X-1）,3,5-bis（hydroxymethyl）-4-methoxy-6-methyl-2H-pyran-2-one（X-2）和6,8-dihydroxy-3-（hydroxymethyl）-7-methyl-1H-isochromen-1-one（X-3）为新化合物;从马来西亚红树来源的拟茎点霉内生真菌Phomopsis sp.I41的代谢产物中获得10个化合物（I1I10）,分别为2个新的十四元大环内酯（2E,6E,8E）-4,5-dihydroxy-13-methyl-oxacyclotetradeca-2,6,8-trien-1-one（I-1）和（2E,5Z,7E）-4,9-dihydroxy-13-methyloxacyclotetradeca-2,5,7-trien-1-one（I-2）,1个新的苯酚衍生物ethyl-1'-[1''-（3-acetoxyhexanoyl）-5,7-dihydroxyphenyl]acetate（I-3）,1个新的环己酮衍生物2,3,6-trihydroxy-2,5-dimethylcyclohex-5-enone（I-4）,1个倍半萜烯类化合物,2个细胞松弛素,1个左旋酪氨酸和2个甘油酯。综上所述,从这3种红树林生物的次生代谢产物中共分离得到了29个化合物,其中9个新化合物。
关键词: 红树林 ；内生真菌 ；角果木 ；拟盘多毛孢 ；拟茎点霉 ；Dolabrane二萜 ；ɑ-吡喃酮 ；异香豆素 ；十四元大环内酯
被引量
3
摘要： 海洋生物的多样性、复杂性及其生存环境的特殊性，使其次级代谢产物化学结构新颖、种类繁多，是新活性先导化合物的重要来源。从海洋生物中寻找具有药用价值的活性先导化合物作为一个重要的研究领域日益受到人们的重视。为了从海洋生物中寻找新的生物活性成分，本文对采自我国海南三亚附近海域的蕾二歧灯芯柳珊瑚、一种软海绵属海绵和一株红树林内生真菌进行了系统的化学成分和活性研究。<br> 从蕾二歧灯芯柳珊瑚Dichotella gemmacea分离并鉴定了50个化合物，类型包括萜类、甾体、神经酰胺和其它类，其中新化合物24个(DG-1～4)。50个化合物中有八放烷二萜39个：dichotellide A-X(DG-1～24)，juncenolide D(DG-25)，frajunolide C(DG-26)，juncin Q(DG-27)，praeolide(DG-28)，junceellin A(DG-29)，juncin Y(DG-30)，junceellolide D(DG-31)，junceellolide C(DG-32)，juncin D(DG-33)，11α，20α-epoxyjunceellilide D(DG-34)，frajunolide D(DG-35)，juncin U(DG-36)，juncin P(DG-37)，juncin Zi(DG-38)，junceellolide B(DG-39)；甾醇类4个：dichotellsteroid A(DG-40)，麦角甾-6，22-二烯-5α，8α-环二氧-3β醇(DG-41)，胆甾醇(DG-42)，胆甾-3-羟基-7-烯-6-酮(DG-43)；神经酰胺及其它类7个：N-正十五碳酰基-正十八碳-4(E)，9(Z)二烯鞘胺醇(DG-44)，N-正十六烷酰基-十八碳-4(E)烯神经鞘氨酯(DG-45)，(2S，3R，4E)-1，3-dihydroxy-2-[(nonadecanoyl)amino]-octadec-4-enc(DG-46)，1，3-二硬脂酸甘油酯(DG-47)，鲨肝醇(DG-48)，1-棕榈酸甘油酯(DG-49)，邻苯二甲酸正丁异丁酯(DG-50)。Dichotellide A-X(DG-1-24)为新的八放烷二萜类化合物，其中dichotellide A-E(DG-1～5)为自然界罕见的含碘八放烷二萜。<br> 从一种软海绵属海绵Halichondria sp.中共分离并鉴定了30个化合物，包括1个新化合物。这些化合物类型主要包括，11个甾醇：halichosteroid(SP-1)，3β-羟基-5，8，22-麦角甾三烯-7-酮(SP-2)，3β，5α-二羟基-7，22-麦角甾二烯-6-酮(SP-3)，3β，5α，6β-胆甾三醇(SP-4)，3β，5α，9α-三羟基-7，22-胆甾二烯-6-酮(SP-5)，3β，5α，9α-三羟基-7，22-麦角甾二烯-6-酮(SP-6)，3β-羟基-5-胆甾烯-6-酮(SP-7)，5α，8α-环二氧-6，22-麦角甾二烯-3β-醇(SP-8)，5α，8α-环二氧-6-胆甾烯-3β-醇(SP-9)，7，22-麦角甾二烯-3β，5α，3β-三醇(SP-10)，胆甾醇(SP-11)；6个糖苷和核苷类：sarcotride A(SP-12)，尿嘧啶脱氧核苷(SP-13)，胸腺嘧啶脱氧核苷(SP-14)，腺嘌呤核苷(SP-15)，methyl-β-D-ribofuranoside(SP-16)，3-吲哚甲酸(SP-17)，苯乙胺(SP-18)，对羟基苯乙胺(SP-19)，氮乙酰基酪胺(SP-20)，对羟基苯甲醛(SP-21)，对羟基苯乙酸(SP-22)，苯乙酸(SP-23)，异戊胺(SP-24)，胸腺嘧啶(SP-25)，胞嘧啶(SP-26)，二-(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯(SP-27)，N-正十六烷酰基-十八碳-4(E)-烯神经鞘氨酯(SP-28)，鲨肝醇(SP-29)，十五烷酸(SP-30)。其中halichosteroid(SP-1)为新的甾体类化合物。<br> 从红树植物内生异色拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis versicolor)的固体发酵产物中共分离并鉴定了15个化合物，包括5个新化合物。这些化合物分别为：pestalolA(P-1)，pestalol B(P-2)，pestalol C(P-3)，pestalol D(P-4)，pestalol E(P-5)，4-hydroxyphenethyl2-(4-hydroxyphenyl)acetate(P-6)，对羟基苯乙酸甲酯(P-7)，trans-harzialactone A(P-8)，pestalol F(P-9)，3-羟基-3-甲基-δ-内酯(P-10)，3β，5α，9α-三羟基-7，22-麦角甾二烯-6-酮(P-11)，ergost-22-en-3-ol(P-12)，麦角甾-6，22-二烯-5α，8α-环二氧-3-醇(P-13)，3β-羟基-胆甾烷(P-14)，邻苯二甲酸正丁酯(P-15)。其中pestalol A～E(P-1～5)为5个苯酚类新化合物。<br> 在化学成分研究的基础上，根据化合物的类型，检索相关文献并结合本研究现有的实验资源，对蕾二歧灯芯柳珊瑚和软海绵中分离得到的化学成分进行了抗肿瘤，抗菌和抗污损活性初筛。从被测试的样品中发现了一些具有潜在抗肿瘤和抗污损活性的化学成分。测试样品中有DG-3，DG-12，DG-17对SW1990(人胰腺癌细胞)有中等强度的细胞毒活性，IC50值分别为30，20，40μg mL-1(阳性对照为5-氟尿嘧啶，IC50为15.7μg mL-1)。<br>
关键词: 海洋生物学 ；蕾二歧灯芯柳珊瑚 ；软海绵 ；拟盘多毛孢菌 ；化学成分 ；抗菌活性 ；分离鉴定