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摘要： 目的探讨抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶对心力衰竭后室性心律失常的影响及其机制。方法家兔随机分为假手术安慰剂组、假手术NADPH氧化酶抑制剂（apocynin）组、心力衰竭安慰剂组、心力衰竭apocynin组。通过容量超负荷联合压力超负荷建立家兔心力衰竭模型。apocynin和安慰剂以15mg／d口服。8周后，行超声心动图检查观察动物心脏结构和功能的变化。通过在体电生理研究分析兔左心室3层心肌单相动作电位复极90％的时限（MAPD90），观察室性心律失常诱发情况，检测心室颤动（室颤）阈值。运用比色法检测心肌超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平。利用Western blot法检测心肌缝隙连接蛋白43（Cx43）的蛋白表达。结果心力衰竭兔出现明显心脏扩大和心功能异常，3层心肌MAPD90延长[内层（179．8±5．8）ms对（137．0±4．5）ms；中层（180．6±8．6）ms对（137．3±4．8）ms；外层（175．0±11．3）ms对（136．3±3．9）ms；P〈0．05]，室性心律失常诱发增多，室颤阈值显著降低（10．8±2．4）V对（21．0±2．8）V（P〈0．05），心肌SOD活力降低（91．0±10．1）U／mgprotein对（160．3±14．2）U／mgprotein（P〈0．05），MDA水平升高（3．0±0．3）nmol／mgprotein对（1．2±0．1）nmol／mgprotein（P〈0．05），Cx43蛋白表达显著降低（0．5对0．9，P〈0．05），且以磷酸化Cx43降低为主（P〈0．05）。apoeynin干预可显著改善心力衰竭兔心脏功能，降低氧化应激水平[SOD（132．7±8．8）U／mgprotein对（91．0±10．1）U／mgprotein；MDA（1．9±0．2）nmol／mgprotein对（3．0±O．3）nmol／mgprotein（P〈0．05）]，减少室性心律失常诱发，提高室颤阈值（17．4±1．6）V对（10．8±2．4）V（P〈0．05），增加Cx43蛋白表达（P〈0．05）。结论心力衰竭后氧化应激水平升高导致Cx43蛋白降低，是心力衰竭后室性心律失常发生的病理生理机制之一，抑制NADPH氧化酶可能是治疗心力衰竭后室性心律失常的方向之一。
关键词: 心力衰竭 ；氧化还原酶类 ；缝隙连接 ；心律失常
被引量
4
会议时间： 2012-09-13
摘要： 目的 Rotigaptide是新型抗心律失常肽,可增强细胞间缝隙连接传导,阻止缺血诱导的室性心动过速。本研究旨在观察Rotigaptide对心力衰竭后室性心律失常诱发的影响及其机制。方法 18只新西兰大耳白兔随机分为对照组(n=6)、心力衰竭组(n=6)、心力衰竭+Rotigaptide干预组(n=6)。采用主动脉反流联合腹主动脉缩窄建立容量-压力超负荷诱导的心力衰竭兔动物模型。Rotigaptide以1.5μg/kg静脉负荷量给予后以94ng/kg/min静脉泵入。对照组和心力衰竭组给予等量生理盐水干预。20min后行电生理检查,采用自制电极记录左心室单相动作电位,采用程控刺激测定左心室有效不应期(ERP)和心室颤动阈值(VFT),观察室性心律失常诱发情况。实验结束后去左心室组织,采用Real-time PCR检测缝隙连接蛋白43 mRNA表达情况。结果心力衰竭后左心室缝隙连接蛋白43 mRNA表达显著降低,心室ERP显著增加[(132±12)ms vs(106±14)ms,P<0.05],VFT明显降低[(6±1)V vs(20±3)V,P<0.05)],这些改变导致恶性室性心律失常(VT/VF)诱发率(5/6)明显增加。Rotigaptide干预可显著缩短ERP[(113±9)ms vs(132±12)ms,P<0.05],提高VFT[(15±2)V vs(6±1)V,P<0.05],降低VT/VF诱发(1/6),但对单相动作电位时程和缝隙连接蛋白43 mRNA表达无明显影响。结论 Rotigaptide降低兔心力衰竭后心室ERP,提高VFT,降低室性心律失常诱发,而不影响缝隙连接蛋白表达,可能为未来心力衰竭后室性心律失常治疗的潜在药物之一。
关键词: 心力衰竭 ；室性心律失常 ；Rotigaptide ；缝隙连接 ；增强剂
摘要： 第一部分:临床探索房颤患者血清儿茶酚抑素水平 研究背景: 交感神经的过度激活,交感与副交感神经的失衡均可致心房神经与电重构,经电环路及触发环路,触发并维持房颤(atrial fibrillation,AF)的发生。儿茶酚抑素(catstatin,CST)不仅能显著抑制肾素-交感-儿茶酚胺的作用,同时发挥降血压、扩张血管、减弱心肌收缩力、抗心衰、参与天然免疫反应。 已有研究发现血清CST水平在高血压患者中降低,而在心肌梗死、心力衰竭、OSA患者中升高;而现有研究对AF患者血清CST水平仍存在争议,且大部分研究所纳入的AF患者均合并有高血压或冠心病或糖尿病等基础疾病,势必会影响AF患者血清CST的真实情况。因此,本章中利用Elisa试剂盒检测临床无其他基础疾病的AF患者血清CST水平,并初步探讨CST对AF的预测价值。 研究目的: 利用Elisa试剂盒检测临床无其他基础疾病的AF患者血清CST水平,并初步探讨CST对AF的预测价值。 研究方法: 收集2020年7月至2021年4月于南昌大学第二附属医院住院治疗的AF患者及同期行健康体检者的血清,用Elisa试剂盒检测血清CST水平。纳入及排除标准:1.年满18周岁;2.既往未行AF射频消融术;3.既往无以下疾病:高血压、心力衰竭、冠心病、支架置入、心肌炎、OSA、心脏瓣膜病、糖尿病、高脂血症、甲亢甲减、原发性醛固酮增多症、嗜铬细胞瘤、恶性肿瘤。全部实验设计均通过南昌大学第二附属医院临床实验管理伦理委员会认证及许可,且全部签署知情同意书后入组。 研究结果: 严格按照纳入与排除标准,连续入选2020年7月至2021年4月于我院心内科住院的无其他基础疾病的AF患者18例为AF组,另外收集同期于我院体检中心行健康体检者29例为con组。与健康对照组相比,AF组患者的年龄增大(59.38±6.25 vs 66±8.43,P=0.0035)、入院心电图QTc间期延长(409.4±20.97 vs440.4±44.73,P=0.0023)、血清LDL(2.71±0.59 vs 2.26±0.74,P=0.0364)及空腹血糖(5.42±0.88 vs 4.68±0.80,P=0.0097)均降低。而与健康对照组相比,AF组血清中CST水平显著高于健康对照组(138.37±97.62 vs 269.90±106.6 pg/ml,P<0.0001)。 结论: 在孤立性AF患者血清中CST表达水平明显增高,可能与交感神经过度兴奋,CST代偿性增高所致,而增高的CST并不足以对抗过度兴奋的交感神经作用。 第二部分:在体电生理检测CST对AF犬模型的调控作用 研究背景: 本团队的前期研究在心梗大鼠模型中发现,予外源性补充CST可经降低交感神经兴奋性对抗心梗后室性心律失常的发生,对心脏具有一定保护作用。在第2章我们在无其他基础疾病的AF患者中,观察到血清CST升高,结合既往研究提示CST可能通过调节心脏自主神经参与了AF的发生发展。因此,在本章中,我们采用左心房快速起搏技术构建AF犬模型作为研究对象,外源性补充CST并通过在体电生理检测以观察CST对AF犬模型的调控作用。 研究目的: 采用左心房快速起搏技术构建急性AF犬模型作为研究对象,外源性补充CST并通过在体电生理检测以观察CST对AF犬模型的调控作用。 研究方法: 利用左心房快速起搏技术构建犬急性AF模型,通过在体电生理检测CST对AF发生发展的调控作用,将成年雄性比格犬随机分为4组(每组N=6只):对照组(con组),房颤组(AF组),正常+CST给药组(con+CST组),房颤+CST给药组(AF+CST组);给药组均予静脉滴注CST 5nmol/kg/h。分别于刺激前及刺激后每隔1h检测各组左心房动作电位(atrial action potential,APD)、有效不应期(effective refractory period,ERP)及其离散度以及心率变异性(heart rate variability,HRV)。收集犬的血清进行去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)Elisa检测,并收集左心房组织进行HE、Masson染色及免疫荧光观察酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、神经生长因子(growth associated protein 43,GAP43)、肾上腺素α1、β1及β2受体的分布情况。 研究结果: AF组在予左心房快速起搏刺激2h后可自发发生阵发性AF,持续2-5s后可自行停止,同时AF组中AF的诱发率为83.33%,AF+CST组中AF诱发率为13.3%。与con组相比,AF组心房APD90时程(251.3±90.59 vs 134.7±20.05ms,191.4±74.01 vs 120.1±18.04ms,P<0.001)及ERP(116.6±16.12 vs 89.43±7.976ms,P<0.05)明显缩短,而ERP离散度(9.125±3.758 vs 26.67±11.96ms,P<0.05)增加。与AF组相比,AF+CST组APD90时程(115.8±21.59 vs 169.6±14.31ms,P<0.05)及ERP(89.43±7.976 vs 153.0±39.79ms,P<0.05)明显延长,而ERP离散度(26.67±11.96 vs 17.50±3.536ms,P<0.05)明显降低。而与con组相比,con+CST组APD呈下降趋势,但差异无统计学意义,ERP及其离散度无明显改变。 与con组相比,AF组中血清NE水平呈增高趋势(2090±380.2 vs 2569±59.91 pg/ml,P>0.05),HRV略降低(23.72±6.260 vs 20.71±3.095ms,P>0.05);与AF组相比,AF+CST组中NE明显降低(2569±59.91 vs 1767±39.24 pg/ml,P<0.05),而HRV明显升高(20.71±3.095 vs 61.16±8.162ms,P<0.0001)。HRV频域分析显示,与con组相比,AF组低频区(LF)显著升高(1.518±0.641vs 174.4±49.07ms,P<0.0001),高频区(HF)无明显改变(2.073±0.682 vs 10.95±1.144ms,P>0.05),LF/HF明显升高,但无统计学差异(1.534±0.2183 vs 2.191±0.7173,P>0.05;与AF组相比,AF+CST组HF明显升高(10.95±1.144 vs 1782±807.1ms,P<0.0001),而LF/HF明显降低(2.191±0.7173 vs 0.4316±0.1809,P<0.01)。与con组相比,con+CST组LF、HF及LF/HF均无明显差异。 HE及Masson染色可见AF组较con组及AF+CST组的心房肌细胞排列松散,细胞肿胀明显,肌原纤维断裂增多,但纤维化程度未见明显异常。免疫荧光结果显示,与con组相比,AF组中TH数量增多(90.31±9.045 vs 120.8±18.08,P<0.05),呈红色线状,广泛分布于心房肌细胞膜上;β1受体数量下降(86.68±38.84 vs 50.61±0.9391,P<0.01),β2受体数量稍增多(103.6±13.41 vs 128.42±41.58,P>0.05)。与AF组相比,AF+CST组中TH数量明显降低(120.8±18.08 vs 68.81±6.934,P<0.01),β1数量显著增多(50.61±0.9391 vs 78.47±35.21,P<0.05),β2受体数量减少(128.42±41.58 vs 95.79±27.15,P>0.05)。而各组α1受体(51.64±9.456 vs 65.50±23.10 vs 64.85±3.255 vs 81.37±36.58,P>0.05)及GAP43(83.49±15.15 vs 79.25±6.214,68.31±10.13,89.48±26.23,P>0.05)无明显改变。 结论: 在急性AF犬模型中,外源性补充CST可通过抑制交感神经过度兴奋及提高迷走感神经作用,并可通过上调β1受体数量并降低β2受体数量,从而发挥延长急性AF犬模型心房APD时程及ERP的作用,对AF的发生及维持具有一定拮抗作用。 第三部分:CST影响AF发生及维持的分子机制 研究背景: 在第3章中我们已在急性AF犬模型中,观察到AF可通过促进GAP43表达,激活神经纤维再生,同时激活交感神经TH引发心房神经重构作用;另外还可通过缩短APD时程及心房ERP,促进心房电重构,从而促进并维持AF的发生发展。而给予CST后,神经纤维再生减少且交感神经活性明显下降,使得交感与迷走神经再平衡,从而抑制AF的发生发展。而其影响AF的发生发展的具体分子机制尚不清楚。 研究目的: 本章为探讨CST影响AF的发生发展的分子机制,通过分子生物学技术检测影响心肌细胞APD及电传导的相关分子蛋白,明确CST经心脏自主神经参与调控AF发生电重构的具体分子机制。 研究方法: 收集各组犬左心房组织,运用Westernblot检测缝隙连接蛋白Cx43及Cx40,离子通道蛋白Nav1.5、Cav1.2、Kv4.3、HCN4及NCX的分子水平变化。研究结果: 与con组相比,AF组中Nav1.5(0.3567±0.1862 vs 0.053±0.03615,P<0.05)、Cav1.2(0.3243±0.1394 vs 0.028±0.006,P<0.01)、HCN4(1.105±0.4889 vs0.1183±0.1354,P<0.0001)、NCX(0.465±0.021 vs 0.0533±0.0057,P<0.01)及Kv4.3(0.4380±0.0.1875 vs 0.0933±0.059,P<0.01)均明显下降,差异具有统计学意义。与AF组相比,AF+CST组中NCX(0.0533±0.0057 vs 0.080±0.0141,P>0.05)及Kv4.3(0.0933±0.059 vs 0.2775±0.1893,P>0.05)略有增加,但仍未达con组正常水平,差异无统计学意义;而Nav1.5(0.053±0.03615 vs 0.1200±0.082,P>0.05)、Cav1.2(0.028±0.006 vs 0.061±0.041,P>0.05)及HCN4(0.1183±0.1354 vs 0.034±0.024,P>0.05)无明显差异。 与con组相比,AF组中Cx43显著下降(0.925±0.2475 vs 0.220±0.1308,P<0.05),Cx40无明显改变(1.298±0.5012 vs 0.830±0.028,P>0.05),Cx43/Cx40略降低(0.4667±0.3014 vs 0.3167±0.06658,P>0.05)。与AF组相比,而AF+CST组Cx43表达增加(0.220±0.1308 vs 0.820±0.6788,P<0.05),但仍未达正常水平,Cx40显著下降(0.830±0.028 vs 0.1967±0.1401,P<0.05),Cx43/Cx40略升高(0.3167±0.06658 vs 0.430±0.1054,P>0.05)。 结论: 在急性AF犬模型中,快心房率可下调Nav1.5、Cav1.2、Kv4.3、NCX、HCN及Cx43造成心肌细胞APD及ERP的缩短,心肌细胞兴奋异质性的增加,有利于AF的发生与维持。而外源性补充CST可能通过抑制交感神经活性与再生作用,可能经上调Cx43的表达水平,下调Cx40的表达水平,从而发挥延长急性AF犬模型中心房APD时程及ERP的作用,因此,CST对AF的发生及维持具有一定拮抗作用。本研究结果为后续药物治疗AF提供新的作用靶点。
关键词: 儿茶酚抑素 ；心房颤动 ；心脏自主神经 ；动作电位 ；有效不应期
摘要： 第一部分正中神经调控抑制下丘脑背内侧核刺激所诱发的室性心律失常研究背景:本研究假设正中神经调控(median nerve stimulation,MNS)可以抑制下丘脑背内侧核刺激(dorsomedialhypothalamus stimulation,DMHS)所诱发的室性心律失常,并通过记录左侧星状神经节电活动(left stellate ganglion activity,LSGA)探索相关机制。研究方法:21只新西兰大耳白兔麻醉后被随机分为三组:(1)A组(n=7):对照组,给予6阵DMHS,每阵DMHS持续30s,休息30min后进行下一阵DMHS,正中神经刺激器只安装不开启刺激;(2)B组(n=7):正中神经刺激组,给予6阵DMHS,方案同组A,并于第3阵DMHS前5分钟同时给予正中神经电刺激(刺激参数:脉宽0.5ms,频率5Hz,刺激强度为两倍刺激阈值),正中神经刺激持续时间为40min;(3)C组(n=7):左侧星状神经节电信号记录组,于基线、第一阵DMHS后、第二阵DMHS合并正中神经电刺激后立即记录左侧星状神经节电信号,记录时间为5min。研究结果:右侧DMHS可反复诱发室性心律失常事件。DMHS同时给予正中神经电刺激可较单纯DMHS显著降低异常室性心律失常的心搏数(7±3,9±2bpm对29±8,27±9bpm,p<0.05)及显著缩短左侧星状神经节异常放电活动时程(14±6 对 40±18s,p<0.05)。研究结论:正中神经电刺激可以显著抑制DMHS所诱发的室性心律失常,机制之一为正中神经电刺激可显著抑制左侧星状神经节的异常放电活动。第二部分低强度左侧迷走神经刺激抑制急性心肌梗死后室性心律失常的可行性及相关机制研究研究背景:迷走神经刺激已被广泛的投入到治疗室性心律失常及心力衰竭的研究中。既往研究中,多于缺血前或缺血时开启迷走神经刺激,不符合临床实际。本研究拟采用不影响心率的低强度左侧迷走神经刺激并于心梗后2小时开启刺激,以观察其对心肌梗死后室性心律失常的影响并深入探讨相关机制。研究方法:植入埋藏式心律转复除颤器(implantable cardioverter defibrillator,ICD)和左侧迷走神级刺激器后,将存活的16只犬随机分为三组:假手术组(n=5);心梗对照组(n=6);心梗后迷走神经刺激组(n=5)。迷走神经刺激组的神经刺激器于心梗后120min开启,其余两组的神经刺激器均关闭。所有犬饲养三周后处死。通过ICD记录各组犬心梗后室性心律失常事件及进行T波电交替检测。心梗对照组和心梗后迷走神经刺激组两组间差异表达的基因通过基因芯片(affymetrix genechip canine genome 2.0 array)进行检测并通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse-transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)进行验证。免疫组化法检测梗死边缘区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、生长相关蛋白 43(growth-associated protein 43,GAP43)、神经丝(neurofilament,NF)及缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)染色,评估低强度左侧迷走神经刺激对心梗后心脏神经重构及缝隙连接蛋白的影响。通过心脏超声检测各组犬心梗后左室重构。通过酶联免疫吸附试验(Elisa)检测血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎症因子水平。研究结果:心梗术后3周,相较于心梗对照组,低强度左侧迷走神经刺激可以在不影响心率的前提下显著降低室速(12.3±5.4对74.7±7.5,p<0.05)、室颤(0.25±0.21对l±0.44,p<0.05)事件。基因芯片共发现206个差异表达基因(fold change>1.5,p<0.05),其中55个基因表达上调,151个基因表达下调,所涉及的主要分子通路包括 Toll 样受体、JAK-STAT、NF-κB、TNF、MAPK、AGE-RAGE、内质网蛋白质处理、补体级联反应等。超声结果提示,低强度左侧迷走神经刺激可以显著提高犬左室射血分数(44.5±0.4对26.3±7.5,p<0.05)、显著降低左室舒张末内径(4.2±0.9对3.4±0.2,p<0.05)。免疫组化结果提示心梗后迷走神经刺激组TH、GAP43、NF阳性染色神经密度均明显降低,迷走神经刺激可显著抑制Cx43的减少,差异有统计学意义。Elisa结果提示,低强度左侧迷走神经刺激可以显著降低心梗后IL-6、TNF-α血清浓度,并显著抑制心肌TNF受体1(TNFR1)的表达。低强度左侧迷走神经刺激可显著抑制微伏级T波电交替的幅度(8.7±4.6 vs.13.8±7.8 μV,p<0.001)和信噪比(Kscore,1.3±2.4vs.3.0±4.4,p=0.017)。研究结论:于心梗后120min行低强度左侧迷走神经刺激可以在不影响心率的前提下显著降低心梗后三周内室性心律失常的发生。基因芯片分析发现与低强度左侧迷走神经刺激相关的差异表达基因共有206个。低强度左侧迷走神经刺激抑制心梗后室性心律失常的相关机制涉及改善心梗后心室重构、神经重构、心电不稳定性及抑制炎症反应等。第三部分ICD/CRTD家庭监测自主神经相关数据与心脏性猝死的关系(一)、夜间平均静息心率变异性对埋藏式心律转复除颤器患者恶性室性心律失常及全因死亡的预测作用研究目的:本研究通过回顾性分析埋藏式心律转复除颤器(ICD)家庭监测系统所传输的数据,探索夜间平均静息心率变异性对远期恶性室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs)及全因死亡的预测作用。研究方法:本研究回顾性分析了 318例ICD植入患者的家庭监测数据及临床资料。以ICD植入后并开启家庭监测的30天为观察窗口,记录30天中家庭监测系统所传输的平均静息心率(每天2:00到6:00的平均心率)并计算其平均值(AVHR)和标准差(SDHR)。主要研究终点为ICD正确识别的VAs事件,次要研究终点为全因死亡事件。研究结果:平均随访时间为32±10个月。所纳入的318例患者中,有179例(56.3%)患者发生过VAs事件,123例(38.7%)患者发生过Shock治疗事件,37例(11.6%)患者发生了全因死亡事件。平均SDHR为4.5±3.0bpm。通过受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析获得 SDHR=3.685bpm 为其预测VAs的切点值。通过Kaplan-Meier分析,SDHR≥3.685bpm的患者的VAs事件(HR=1.885;95%confidence CI=1.362-2.609;p<0.001)、Shock 事件(HR=1.637;CI=1.11-2.414;p=0.013)、全因死亡事件(HR=2.42;CI=1.266-4.627;p=0.008)及联合终点事件(HR=1.872;CI=1.365-2.567;p<0.001)的风险均显著增高。单因素和多因素Cox比例风险模型结果提示,SDHR≥3.685bpm是VAs事件、Shock事件、全因死亡事件及联合终点事件的独立危险因子。研究结论:在ICD植入患者中,基线SDHR>3.685bpm是远期恶性室性心律失常事件及全因死亡事件的独立危险因子。第三部分ICD/CRTD家庭监测自主神经相关数据与心脏性猝死的关系(二)、埋藏式心律转复除颤器及心脏再同步化治疗除颤器患者的日常活动度对心源性死亡的预测作用研究背景:日常活动度可以预测多种疾病的预后,然而目前尚无研究在ICD/CRT-D植入人群中探索其与心源性死亡的关系。研究目的:本研究的目的是通过回顾性分析ICD/CRT-D所记录的日常活动度,探索日常活动度是否能够预测心源性死亡事件?如果能,那么日常活动度低到何种程度可以预测心源性死亡事件?潜在的机制是什么?研究方法:本研究回顾性分析了 845例ICD/CRT-D植入患者的家庭监测数据和临床资料。计算ICD/CRT-D植入后30-60天的平均日常活动度和心率变异性(PPvariability)。主要研究终点为心源性死亡,次要研究终点为全因死亡。研究结果:845例患者ICD/CRT-D植入后30-60天的平均日常活动度为11±5.8%(每天活动158.4±83.5分钟)。通过受试者工作曲线(ROC)分析获得,日常活动度=7.84%(每天活动113分钟)为其预测心源性死亡的切点值。平均随访时间为31.1±12.9个月(3个月至60个月)。通过单因素Cox比例风险模型分析发现,日常活动度与心源性死亡及全因死亡均密切相关。通过多因素Cox比例风险模型校正混杂因素后,日常活动度<7.84%的患者较日常活动度≥7.84%的患者的心源性死亡风险增高3.639倍(HR=3.639,95%CI=2.42-5.471,p<0.001),全因死亡风险增高 3.677 倍(HR=3.677,95%CI=2.535-5.334,p<0.001)。通过 Spearman 相关性分析发现日常活动度与HRV呈正相关(相关系数为0.6012,p<0.001)。研究结论:ICD/CRT-D植入后30-60天的平均日常活动度<7.84%的患者的心源性死亡及全因死亡风险均显著增高。日常活动度与心率变异性呈正相关,也可反映自主神经调节的平衡程度,其对自主神经的影响可能是其能够预测心源性死亡及全因死亡的机制之一。
关键词: 正中神经刺激 ；情绪激动 ；室性心律失常 ；左侧星状神经节 ；低强度左侧迷走神经刺激 ；心肌梗死 ；室性心律失常 ；基因芯片 ；心脏神经重构 ；夜间静息心率 ；心率变异性 ；埋藏式心律转复除颤器 ；室性心律失常 ；家庭监测 ；日常活动度 ；心率变异性 ；心源性死亡 ；埋藏式心律转复除颤器 ；心脏再同步化治疗除颤器
被引量
4
摘要： 研究背景：
糖尿病和冠心病是目前临床常见的两种疾病,糖尿病合并心肌梗死患者室性心律失常发生率明显增加,死亡率也随之增加。国内外研究发现,心肌梗死患者并发室性心律失常与梗死后细胞和组织水平的电重构即离子通道重塑有关。离子通道重塑包括离子通道或转运体的表达、调控和相关蛋白伴侣的改变。这些病理生理重塑主要发生于钠通道、钾通道、钙通道、钙转运体、缝隙连接蛋白、超极化激活的非选择性阳离子通道等。上述变化促使动作电位时程延长,复极离散度增加,传导异常,使得心肌电生理特性发生改变而出现电学的失稳态,最终导致致命性心律失常和心脏性猝死的发生。
糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷导致的以慢性血糖水平增高为特征的代谢异常综合征。其中,2型糖尿病约占90%,其病因未明,多数患者确诊时已存在慢性并发症,如心、脑、肾、眼、神经等部位病变,这也是2型糖尿病致残、致死的主要原因。目前公认高血糖是糖尿病各种慢性并发症的主要诱发因素,但高血糖并非直接参与并发症形成,而是高血糖先引起体内多种生化指标的改变,进而损害各个脏器导致并发症的发生。既往国内外研究高血糖引起的生化改变机制复杂多样,如非酶类糖化过程增强、氧化还原应激反应、醛糖还原酶激活、二酰基甘油-蛋白激酶C通路活性增加等。但糖尿病并发症发生机制十分复杂,其具体的病理生理及分子机制至今尚未完全阐明。糖尿病的心血管系统并发症严重影响糖尿病患者的临床预后,而冠心病及自主神经病变则为引起糖尿病患者心力衰竭和猝死发生率增加的重要因素。除了血管病变外,心肌细胞功能本身也存在明显异常,表现为心肌细胞收缩力下降及电生理特性的改变,后者又表现为心肌细胞动作电位时程显著延长。钾通道电流是引起心肌细胞动作电位复极的重要电流,糖尿病对心肌细胞动作电位的影响,部分是通过对钾离子通道的影响而导致。人们应用动物模型来研究糖尿病对心肌的影响,至今已比较成熟的方法是链脲佐菌素或四氧嘧啶所导致的胰岛素缺乏而诱发糖尿病,最常用的模型为链脲佐菌素模型,链脲佐菌素通过选择性破坏胰岛β细胞而诱发糖尿病。在这一模型,心脏很快出现电生理和机械特性的改变,其电生理改变主要表现为动作电位形态和时程的改变,在心电图上则表现为QT间期延长及T波低平。对心肌细胞离子流研究的一个重要发现则为瞬间外向性钾电流密度降低,这一变化在心室的心外膜心肌较心内膜心肌明显。另有动物实验研究也显示糖尿病心肌细胞动作电位时程延长部分系由于外向复极钾电流特别是瞬间外向钾离子电流降低所致。
现已明确,高血糖和急性心肌梗死后,心脏局部肾素-血管紧张素系统激活,其中心环节是血管紧张素Ⅱ识别其特异性受体,通过一定的信号途径激活G蛋白,进而激活磷脂酶C,使细胞内三磷酸肌酸和二酯酰甘油的合成增加,进而激活心肌蛋白激酶C,过度表达蛋白激酶C激活丝裂素活化蛋白激酶,将信号导入细胞核内,激活转录基因,引起多种生长刺激因子表达异常如C-fOS等,磷酸化非常广泛的蛋白质底物,导致细胞骨架蛋白合成障碍、心肌细胞受损、心肌异常生长、心肌重塑、心功能减低。缬沙坦是一种特异的AT1受体竞争性拮抗剂,具有剂量依赖性,其通过与AT1跨膜区氨基酸作用,阻止血管紧张素Ⅱ与AT1受体结合,阻断血管紧张素Ⅱ诱导的生物学效应。动物研究已证实,缬沙坦可通过拮抗AT1受体减轻或改善心房纤维化所致的局部传导异常,减少去甲肾上腺素的释放,改善心房复极的不均一性,以及抑制心房电重构。最新NAVIGATOR研究发现缬沙坦能有效预防新发糖尿病达14%,显著降低空腹血糖、餐后2小时血糖。国内对心肌梗死大鼠模型的研究证实缬沙坦可改善心肌梗死后心室肌的电重构。但缬沙坦对糖尿病合并心肌梗死的心室肌电重构影响国内外尚未见报道。糖尿病心肌梗死后是否进一步影响心室肌电重构也未见报道。本研究通过构建糖尿病合并心肌梗死兔动物模型,运用实时荧光定量PCR的方法和Western blot方法,对糖尿病合并心肌梗死后心室肌细胞瞬间外向钾离子通道蛋白及基因表达的变化特点进行了探讨,并应用不同剂量的缬沙坦对其进行不同阶段干预研究,以期发现其与室性心律失常的关系,以便指导临床,改善糖尿病合并心肌梗死患者的预后。
目的：
探讨糖尿病兔心肌梗死后心室肌瞬间外向钾离子通道蛋白及基因表达的变化以及缬沙坦对此变化的影响。
方法：
1.选择健康新西兰兔作为研究对象,通过高脂高糖喂养2个月后由耳缘静脉注射四氧嘧啶(80mg/kg)制作糖尿病模型,成模后改为普通饲料继续单笼喂养4个月,并随机分为糖尿病+心肌梗死组(DM+MI组)、糖尿病假手术组(DM组)和非糖尿病假手术组(对照组),通过结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,最终每组14只。手术后所有入选成活兔均常规喂养2个月,在3%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下迅速开胸取出心脏,剪取左心室梗死周围区心肌组织,用冷生理盐水冲洗后,DEPC水漂洗,分装于冻存管置于液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR方法和Western blot方法观察心室肌钾离子通道Kv4.2、Kv4.3和Kv1.4的基因及蛋白表达变化。
2.选择造模成功的新西兰兔随机分为6组：安慰剂组(placebo group, Group P)、低剂量组(low dose Group, Group L)、中等剂量组(moderate dose Group, Group M)、高剂量服药6周组(high dose of medication6weeks Group, Group H,)、高剂量服药8周组(high dose of medication8weeks Group, Group H2)和高剂量服药10周组(high dose of medication10weeks Group, Group H3)每组10只。GroupL组给予5mg/(kg·d)缬沙坦灌胃6周；Group M组给予10mg/(kg·d)缬沙坦灌胃6周；Group H1组给予30mg/(kg·d)缬沙坦灌胃6周；GroupH2组给予30mg/(kg·d)缬沙坦灌胃8周；Group H3组给予30mg/(kg·d)缬沙坦灌胃10周。Group P组给予生理盐水代替缬沙坦灌胃6周。分别在6周、8周或10周后,在3%戊巴比妥钠麻醉下迅速开胸取出心脏,剪取左心室梗死周围区心肌组织,用冷生理盐水冲洗后,DEPC水漂洗,分装于冻存管置于液氮中保存备用,采用实时荧光定量PCR方法和Western blot方法观察心室肌钾离子通道Kv4.2、Kv4.3和Kv1.4的基因及蛋白表达变化。
结果：
1. DM+MI组和DM组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均显著低于对照组(P<0.05),而Kv1.4显著高于对照组(P<0.05)；DM+MI组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平显著低于DM组(P<0.05),而Kv1.4并无显著升高(P>0.05)。
2. DM+MI组和DM组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表达量均显著低于对照组(P<0.05),而Kv1.4显著高于对照组(P<0.05)；DM+MI组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表达量显著低于DM组(P<0.05),而Kv1.4并无明显变化(P>0.05)。
3.分别与Group P比较,各治疗组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均显著升高(P<0.05),而Kv1.4反而显著降低(P<0.05)；Group M, Group H1、Group H2和Group H3兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均显著高于Group L(P<0.05),而Kv1.4并无显著升高(P>0.05)；与Group H1比较,Group H3兔心室肌Kv4.2和Kv4.3mRNA水平均显著升高(P<0.05),而Kv1.4无显著变化(P>0.05)；不论是Kv4.2、Kv4.3还是Kv1.4,在Group H1和GroupH2间mRNA水平并无明显变化(P>0.05)。
4.分别与Group P比较,各治疗组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),而Kv1.4反而显著降低(P<0.05)；Group M、Group H1、Group H2和Group H3兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表达水平显著高于Group L(P<0.05),而Kv1.4并无显著升高(P>0.05)；与GroupH1比较,GroupH3组兔心室肌Kv4.2和Kv4.3蛋白表达均显著升高(P<0.05),而Kv1.4无显著变化(P>0.05)；不论是Kv4.2、Kv4.3还是Kv1.4,在Group H1和GroupH2间蛋白表达量并无明显变化(P>0.05)。
5.分别与Group P比较,各治疗组在实验的终末期,其空腹血糖水平明显下降(P<0.05)。
结论：
1.糖尿病兔心肌梗死后心室肌瞬间外向钾离子通道基因及蛋白表达发生了改变即电重构现象,可能是心肌梗死后室性心律失常易感性增加机制之一。
2.缬沙坦可改善糖尿病兔心肌梗死后心室肌瞬间外向钾离子通道基因及蛋白表达,修复糖尿病合并心肌梗死心室肌电重构,这可能是降低室性心律失常发生率的重要原因。
3.缬沙坦对实验糖尿病心肌梗死兔的空腹血糖有一定改善作用。
4.缬沙坦疗效呈时间和剂量依赖性,长期治疗效果更明显。
关键词: 心肌梗死 ；钾离子通道 ；糖尿病 ；兔
被引量
1
摘要： 研究背景 心室颤动(简称室颤)是心源性猝死最常见的原因。近年来,随着电生理标测技术的进步和对心脏颤动的激动特点研究的深入,对室颤机制的认识有了很大进展,但快速心律失常要维持存在,折返激动仍是其最主要的机制。构成折返环的条件包括：①解剖上客观存在折返环；②单向传导阻滞；③传导速度和不应期的不一致。在这3个基本条件中,可兴奋组织的不应期是由单个细胞的电活动决定的,而单个细胞的兴奋要扩布到相邻的细胞,进而引起整个心肌组织的同步兴奋,则是由细胞间电耦联决定的,而细胞间电耦联通过缝隙连接(gap junction,GJ)来完成,GJ是组织被动电活动的主要物质基础。 细胞间GJ有两种连接方式：端—端(end-to-end)连接和侧—侧(side-to-side)连接,心肌各向异性的结构基础就取决于GJ的连接方式。正常心肌呈梭状排列,长轴方向GJ中端—端连接比例大,结合处阻抗较低,离子电流易于通过,电激动传导速度快,而短轴方向GJ中侧—侧连接比例大,电流通过结合处阻抗较大,电激动传导速度慢,呈“之”字形扩布,激动被分隔而碎裂,出现尖锐错折样传导,易于形成折返。侧—侧传导比例的增加,理论上有助于心律失常的产生及维持。 缝隙连接蛋白(connexins, Cx)是构成细胞间GJ的亚单位。Cx表达水平的降低和分布异常,可使心肌整体的传导速度减慢,传导的各向异性改变,从而形成折返环路的解剖学基础,诱发心律失常。在成年心室,GJ仅含有Cx43而且主要分布在闰盘内。我们前期的研究已经证实,心肌Cx43表达减少以及分布和排列紊乱造成的GJ重构参与了室颤的发生与维持,而缝隙连接增强剂ZP123可以通过减少或逆转Cx43的降解并使其分布排列趋于均一,从而降低除颤能量,使室颤易于转复。 Cx43属于磷蛋白,GJ通道的功能也受Cx43磷酸化的影响。在心肌细胞,磷酸化的Cx43(p-Cx43)才能构成有功能的GJ,而去磷酸化的Cx43不具备GJ的功能。那么,室颤的发生与转复过程中是否存在Cx43磷酸化水平的改变?Cx43磷酸化水平的改变对于室颤的维持与转复又有着怎样的影响作用?室颤时ZP123对缝隙连接的增强作用是否也包括上调Cx43的磷酸化水平?这些问题在我们前期的研究中未作深入探索,目前也未见相关报道。 电活动的均一性传导除了依赖于心肌细胞间的电偶联,还受细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的影响。正常生理状态下,心脏ECM的合成与降解维持着一动态平衡,其成分的过度生成或异常降解都可能会破坏心肌的力学性质和电生理结构,影响电活动的均一性传导。近年来研究表明,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitom of metalloproteinases, TIMPs)的调节对ECM的合成与降解起着非常重要的作用,在心肌组织中MMPs与TIMPs存在严格的平衡。这就提示,心肌MMPs/TIMPs比例失调有可能参与了室颤的发生与维持。但是MMPs与TIMPs在室颤的过程中究竟变化如何?对室颤的发生维持及预后又发挥什么样的作用?这些问题都不清楚,都非常值得研究和探索。 血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)是肾素一血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的主要活性成分,既往的研究结果证实其广泛参与了高血压、左室肥厚、心力衰竭等许多心血管疾病的发生和发展。近年来的研究还发现,Ang Ⅱ能够影响左室心肌的各项电生理指标而参与恶性室性心律失常的发生,而传统的降压药物血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)则能通过抑制循环与局部心肌组织Ang Ⅱ的生物学效应,减少恶性室性心律失常的发生。目前关于AngⅡ致室性心律失常的具体机制尚不明确,但有研究报道,AngⅡ可以减少Cx43的表达,减慢心肌细胞间的电传导,提示AngⅡ通过引起心肌细胞间的GJ重构而导致心肌电生理的异常。那么,这会不会就是Ang II参与室颤维持的蛋白分子机制呢? 因此,本研究拟通过建立长时程室颤动物模型,对以上未知的问题进行深入的探讨。 目的 一、观察心肌细胞膜Cx43的表达、分布及其磷酸化水平在室颤发生维持与转复过程中的动态变化。 二、观察心肌MMP-2/TIMP-2在室颤发生维持及转复过程的表达变化,并分析其与室颤预后的关系。 三、观察缝隙连接增强剂ZP123在不同室颤时程对Cx43的表达、分布及磷酸化水平的影响作用。 四、通过分析ZP123对除颤阈值、除颤成功率、ROSC和存活率等指标的影响,评价其对室颤转复的作用效果。 五、探寻AngⅡ参与室性心律失常的蛋白分子机制。 方法 一、通过建立长时程室颤动物模型,观察心肌Cx43及其磷酸化水平、MMP-2与TIMP-2在室颤发生与维持过程中的动态变化 (一)实验动物准备 1.随机选取成年家犬32只,雌雄不限。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉静注麻醉,气管插管,连接呼吸机,监测心电图。 2.所有动物行经胸超声检查,测量左房内径(LAD)、左室舒张期内径(LVDd)和左室射血分数(LVEF)。 3.穿刺股动、静脉,分别将压力导管送入主动脉和右心房,在X线下确定导线位置,并连于多导电生理记录仪,监测与记录主动脉收缩压(AOSP)、主动脉舒张压(AODP)和右房舒张压(RADP)。冠脉灌注压(CPP)=AOPD-RADP,平均动脉压(MAP)=1/3AOSP+2/3AODP。 (二)室颤动物模型的建立 1.动物随机分为4组：假手术组,8分钟室颤组,12分钟室颤组和30分钟室颤组,每组8只。假手术组只麻醉插管取心肌,不予致颤。 2.致颤：将体外电刺激器火线端与零线端的导电针头分别插入心前区左上方与右下方的皮下,以80V持续刺激5s可以成功的诱发持续性室颤。 室颤成功的标准：(1)心电图示室颤波形；(2)主动脉压力失去波动(近似一条直线),降至10～20mmHg以下。此时立即撤除呼吸机,模仿临床人类室颤状态。 (三)测定Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2在室颤不同时程中的表达水平 1.待各组持续相应的室颤时间,将动物用氯化钾处死,迅速开胸沿左心室长轴,留取0.5cm3大小的左心室游离壁心肌组织数块,一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分放入液氮中速冻,然后转存至-80℃冰箱冻存。 2.分别提取心肌细胞总蛋白及细胞膜蛋白,Western blot检测心肌细胞膜Cx43、p-Cx43,心肌MMP-2及TIMP-2的表达。 3.免疫荧光及激光共聚焦显微镜分析Cx43和p-Cx43的表达和分布。用Image-Pro Plus6.0软件分析荧光强度。 4.免疫组织化学染色法分析MMP-2与TIMP-2的表达水平。 二、观察心肌Cx43、p-Cx43、MMP-2/TIMP-2、AngⅡ在室颤转复过程中的表达变化,以及ZP123对Cx43、p-Cx43表达与分布的影响,评价ZP123对室颤转复的作用效果,同时探寻MMP-2/TIMP-2、AngⅡ与室颤预后的关系 (一)实验动物准备 1.随机选取家犬48只,雌雄不限。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉静注麻醉,气管插管,连接呼吸机,用体外自动除颤器监测心电图及血氧饱和度(Sa02)。 2.超声心动图及血流动力学检测：所有动物在致颤前及自主循环恢复(ROSC)后行经胸超声检查,测量LAD、LVDd和LVEF。穿刺股动、静脉,分别将压力导管送入主动脉和右心房,在X线下确定导线位置,并连于16道多导电生理记录仪,监测并记录AOSP、AODP和RADP。CPP=AOPD-RADP, MAP=1/3AOSP+2/3AODP。 (二)室颤动物模型的建立 1.实验动物随机分为6组：8分钟室颤ZP123组(8-min VF+ZP123组),8分钟室颤生理盐水对照组(8-min VF+NS组),12分钟室颤ZP123组(12-min VF+ZP123组),12分钟室颤生理盐水对照组(12-min VF+NS组),30分钟室颤ZP123组(30-min VF+ZP123组)和30分钟室颤生理盐水对照组(30-min VF+NS组),每组8只。 2.药物应用：3个ZP123组在致颤前给予ZP1231μg/kg静推+10μg·kg-1·h-1溶于50ml生理盐水微量泵泵入30分钟；3个对照组给予生理盐水50ml微量泵泵入30分钟。 3.心前区备皮后,将体外电刺激器的导电针头分别插入心前区左上方与右下方的皮下,待各组药物泵完后,立即按下体外电刺激器上的绿色通电按钮,80V,持续5s致颤。 (三)心肺复苏及电除颤 1.待各组室颤持续相应的时间后,立即开始胸外心脏按压(cardiopulmonary resuscitation, CPR),同时连接气囊,按压通气比为30：2,通气时不中断按压,通过POWERLAB系统监测压力波形判断和保证按压的效果,频率控制在100-120次/min,放松时胸廓恢复到正常位置,按压／放松时间比大致相等。 2.5个复苏周期即2min后,进行脉搏与心律评估,仍为室颤的给予双相波电除颤,若没有达到ROSC,则再按照前述进行下一个2min CPR,如此循环。所有动物首次除颤能量均为70J,第二次则增至100J,第三次增至150J,以后每次除颤均为150J。对于30min内未达到ROSC的动物不再继续复苏,达到ROSC (AOSP≥80mmHg且至少持续1min)的动物立即给予高级生命支持,并观察1小时。 3.计算各组平均除颤能量,除颤成功率,ROSC和存活(1小时)率。 (四)测定各组Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2的表达 1.达到实验终点的动物用氯化钾处死,迅速开胸沿左心室长轴,留取左室游离壁心肌组织。 2. Western blot检测心肌细胞膜Cx43、p-Cx43,心肌MMP-2与TIMP-2的表达水平。 3.免疫荧光及激光共聚焦显微镜分析Cx43和p-Cx43的表达和分布。 4.免疫组织化学染色法测定MMP-2及TIMP-2的表达。 (五)心肌AngⅡ含量的测定 1.制备心肌组织匀浆。 2.双抗体夹心ELISA法测定心肌组织AngⅡ含量。 结果 一、Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2在室颤发生与维持过程中的动态变化 (一)各组动物基础状态的比较 各组动物在体重、心率、LAD、LVDd、LVEF及血流动力学指标等均无统计学差异(P>0.05) (二)Cx43和p-Cx43在心室颤动发生与维持过程中的表达 1.免疫荧光染色结果 假手术组Cx43和p-Cx43荧光信号强,形态清晰,分布均匀,排列有序；室颤组随着室颤时程的延长,Cx43和p-Cx43荧光信号逐渐减弱,形态模糊,排列紊乱,呈现不均一分布。 2. Western blot分析结果 图像定量分析结果显示,与假手术组相比,心肌细胞膜Cx43表达水平随室颤时程延长明显下降(P<0.05)。12分钟室颤组和30分钟室颤组心肌细胞膜p-Cx43表达水平明显减少(P<0.05),而8分钟室颤组与假手术组相比无明显统计学差异,但仍有下降趋势(P>0.05)。 3.p-Cx43/Cx43比值随室颤时程延长而不断减小(P<0.05) (三)MMP-2与TIMP-2在心室颤动发生与维持过程中的变化 1.免疫组化与Western blot结果显示,与假手术组相比,室颤组TIMP-2表达水平随室颤时程的延长明显减少(P<0.05)。8分钟室颤组MMP-2表达水平与假手术组无统计学差异(P>0.05),但是在另外两个长时程室颤组(12分钟和30分钟室颤组)MMP-2表达水平明显增加(P<0.05与假手术组比较)。 2.室颤组MMP-2/TIMP-2比值较假手术组升高,而且随室颤时程延长逐渐增加(P<0.05)。 p-Cx43/Cx43与MMP-2/TIMP-2的比值变化 相关分析结果显示,p-Cx43/Cx43与MMP-2/TIMP-2呈显著负相关(r=—0.93,
关键词: 心室颤动 ；缝隙连接蛋白Cx43 ；基质金属蛋白酶 ；基质金属蛋白酶抑制剂 ；ZP123 ；血管紧张素Ⅱ
被引量
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摘要： 心肌梗死(myocardial infarction,MI)是冠心病的一种十分凶险的临床类别,具有发病急、病情进展快、程度重、近期和远期并发症多及预后差等特点,约50%的心血管系统疾病死亡事件可归因于MI。随着经济、社会等全球化进程的加速,MI已迅速成为世界第一位的死亡原因。MI后心律失常、心力衰竭等并发症是其不良预后的主要原因,其中心律失常尤其是各种形式的恶性室性心律失常(ventricular arrhythmia, VAs)是MI患者死亡的主要原因；有研究资料显示,大于50%的MI存活患者死于VAs事件。因此,越来越多的临床医师和科研工作者致力于MI后VAs发生机制及防治策略的探讨。随着近年来研究的逐步深入,心脏重构被认为是MI后一系列并发症发生的主要原因,其包含心肌重构、缝隙连接重构、自主神经重构及电重构等。研究提示,由缝隙连接介导的电冲动是维持正常心电功能的先决条件,其中心室肌细胞主要表达缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43),其相邻细胞之间的电耦联即由Cx43所组成的缝隙连接通道主导；各种病理状态下,Cx43的表达数量、分布方式和功能发生改变,即缝隙连接重构,均可能显著影响电冲动在心室肌细胞间传导的连续性、一致性,从而增加心律失常的诱发倾向。MI后交感神经重构与心律失常的关系近年来引起广大临床医生和科研人员的普遍关注。MI后心脏发生去神经纤维支配、神经出芽再生和交感神经过分再生和高支配,即为交感神经重构；在受损组织修复的同时这种非正常的神经重构增重了MI后心肌组织的电生理异质性,导致VAs易感性的增大。研究发现,炎症反应与MI后交感神经再生重构关系密切；巨噬细胞作为炎症反应的关键一环,可分泌神经生长因子(nerve growth factor,NGF),而NGF是神经再生的重要调控因素之一。巨噬细胞在不同环境条件刺激下,可发生表型转化,从而表现出功能截然不同的两个细胞亚群,即经典激活的M1型和替代性激活的M2型,二者是巨噬细胞功能上连续变化的两个极端,甚至互相抑制。M1型巨噬细胞参与炎症反应的启动和维持；而M2型巨噬细胞生成抗炎因子,终止破坏性的炎症反应,参与组织修复。研究发现,MI早期M1型巨噬细胞起主导作用。因此在MI发生后尽早有效抑制M1型巨噬细胞启动的炎症反应,调节NGF分泌表达,从而调控MI后交感神经再生重构,可能能够有效的防治MI后恶性VAs的发生、发展。ARB (angiotensin receptor blocker,ARB)在MI患者中的应用主要基于其可延缓MI后左心室重构、改善心功能等,其对MI后心肌组织心电生理特性影响如何,目前相关研究较少。LIFE试验、TRACE试验及AFFIRM试验等大型临床试验观察到,心功能不全和高血压病左心室肥厚患者使用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)和／或ARB后,新发房颤的发生率显著降低,提示二者均可能存在一定的抗心律失常作用；而有研究显示上述作用可能与ACEI和／或ARB可改善心房缝隙连接的重构有关,但二者对于MI后VAs的影响及具体机制的相关研究尚少。因此,我们推测MI后早期ARB干预可有效调控MI后缝隙连接重构,为MI后恶性VAs的防治提供新的理论依据和基础实验支持。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(hydroxy methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor),又称为他汀类药物,在临床上广泛用于患者血脂水平的调节；其同时具有抗血小板聚集、抑制单核-巨噬细胞的粘附和分泌、抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移、抗心律失常等调脂之外的多种作用；其中就其如何发挥抗心律失常作用目前相关的研究较少；新近研究证实其可诱导巨噬细胞表型自M1型向M2型方向转变。因此,我们推测MI后早期他汀类药物干预可通过影响巨噬细胞的表型和功能来调控炎症反应,调节NGF的分泌表达,从而改善MI后交感神经再生重构,可能成为MI后恶性VAs防治的有效手段之一在课题组既往研究基础上,本研究拟通过建立MI动物模型,进一步证实缝隙连接重构、交感神经重构与VAs的关系,探讨MI后巨噬细胞表型转化与心脏交感神经重构的关系；并给予ARB缬沙坦、他汀类代表药物阿托伐他汀干预,以期揭示二者抗心律失常作用及可能机制,为降低MI后VAs的发生提供新的思路,并为临床上MI后ARB、他汀类药物的早期应用提供进一步的理论依据。为明确阐述以上问题,本课题通过以下两个部分进行探讨：第一部分缬沙坦对心肌梗死后室性心律失常的影响及机制的实验研究目的：明确MI后缝隙连接重构与VAs的关系,并行ARB缬沙坦干预研究,确定其具有抗心律失常作用,以期为MI后VAs的防治及ARB的临床拓展应用提供新的思路。方法：SD大鼠随机分成3组：假手术组(Sham组),心肌梗死组(MI组),ARB缬沙坦干预心肌梗死组(ARB组)。采用开胸结扎左冠状动脉制造MI大鼠模型,术后次日分别予以等容积生理盐水及缬沙坦(30 mg/kg/day)灌胃。继续喂养至8周,所有存活大鼠均行血流动力学检查,并接受活体程序电刺激试验以诱发VAs。每组各选取10只大鼠处死后立即取梗死灶周、非梗死左室游离壁(left ventricle free wall,LVFW),利用免疫组织化学、Westernblot及透射电镜等方法观察Cx43的分布及数量；剩余各组大鼠行心室肌细胞分离,利用膜片钳技术记录心室肌细胞瞬时外向钾电流(transient outward potassium current,Ito)电流密度并进行统计学分析,以评价缝隙连接通道的功能。结果：1.MI组大鼠VAs诱发率较Sham组显著增加(P<0.01)；射血分数(ejectionfraction,EF)和心输出量(cardiac output, CO)较Sham组显著下降(P<0.05), 左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)和左室内压最大上升／下降速率(±dp/dtmax)亦显著降低(P<0.05)；免疫组织化学显示与Sham组相应部位相比,梗死灶周心肌组织Cx43分布不均一,含量降低(0.215±0.017,0.330±0.024,P<0.05),心室肌细胞Ito电流密度下降。2.与MI组相比,ARB组VAs诱发率显著下降(P<0.01)；EF和CO显著升高,±dp/dtmax亦显著上升(P<0.05),而左心室舒张末压力(left ventricleend-diastolic pressure,LVEDP)、LVSP下降(P<0.05)；梗死灶周心室Cx43含量增加(0.330±0.024,P<0.05)、分布不均一的程度减轻,Ito电流密度部分恢复。3.在LVFW,三组Cx43分布方式相对正常,但MI组Cx43含量与Sham组和ARB组相比显著下降(P<0.05),而在Sham组和ARB组之间未发现显著差异。4.Western blot结果同上述；同时,电镜检查发现,ARB缬沙坦干预可在一定程度上恢复心肌梗死后异常的Cx43分布。结论：1.MI后缝隙连接表现出数量的减少,空间分布的异常及功能的改变等,即缝隙连接重构,使心肌组织电传导的一致性丧失,其是导致MI后VAs发生的机制之一；2.MI后ARB缬沙坦干预能有效改善MI所致的缝隙连接重构,部分恢复下降的Ito电流密度,从而降低MI后VAs的易感性和发生率。第二部分阿托伐他汀对心肌梗死后室性心律失常的影响及机制的实验研究目的：探讨MI后巨噬细胞表型转化与交感神经重构的关系,明确他汀类药物阿托伐他汀干预对MI后巨噬细胞表型的影响及与MI后交感神经重构的关系,为MI后由交感神经重构引发的恶性心律失常的防治提供新的靶点,并为他汀类药物在临床的拓展应用提供理论依据和基础实验支持。方法：Wistar大鼠随机分为3组：假手术组(Sham组),心肌梗死组(MI组),他汀类代表药物阿托伐他汀干预心肌梗死组(Statin组)。开胸行左冠状动脉结扎制造大鼠MI模型,术后当日分别给以等容积PBS溶液及阿托伐他汀(10mg/kg/day)灌胃。7天后,所有成活动物行程序性电刺激诱发VAs。分离大鼠腹腔巨噬细胞分别给以脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+干扰素γ(interferionγ,IFN-γ)和白介素4(interleukin-4,IL-4)诱导细胞极化,选组1孔板LPS+IFN-γ诱导刺激的巨噬细胞给以阿托伐他汀干预,并利用流式细胞仪检测巨噬细胞极性,实时定量RT-PCR检测M1型巨噬细胞分泌的诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、M2型巨噬细胞分泌的精氨酸酶1(arginasel,Arg1)肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-a,TNF-a)口白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)相应mRNA的表达；利用免疫组织化学和免疫荧光染色的方法观察MI后梗死灶周巨噬细胞浸润情况及生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)口酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经纤维的密度与分布；Western blot检测心肌组织中NGF蛋白表达；实时定量RT-PCR检测心肌中NGF相应mRNA的表达；ELISA检测血清中NGF浓度。结果：1.对于分离的腹腔巨噬细胞,流式细胞仪检测提示LPS+IFN-γ和IL-4分别成功诱导刺激巨噬细胞向M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞转化；LPS+IFN-γ诱导刺激的细胞给以阿托伐他汀干预后,CD86/CD68双染阳性表达率(CD86为M1型巨噬细胞标记物,CD68巨噬细胞为标记物)显著下降,提示阿托伐他汀确实可促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。2.对于分离的腹腔巨噬细胞,L PS+IFN-γIL-4诱导刺激组iNOS和Arg1水平与对照组比较显著不同(P<0.01),提示巨噬细胞极性诱导转化成功。与对照组相比,LPS+IFN-y诱导刺激组IL-1β、TNF-α相应mRNA表达和IL-4诱导刺激组IL-1β、TNF-α相应mRNA表达显著升高(P<0.01)；但IL-4诱导刺激组二者表达水平低于LPS+IFN-y诱导刺激组。LPS+IFN-y诱导刺激的细胞给予阿托伐他汀干预后可明显升高Arg 1表达；并逆转IL-1β、TNF-α目应mRNA的升高趋势(P<0.01),提示阿托伐他汀干预后成功诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。3.巨噬细胞浸润：MI组梗死灶周存在大量CD68阳性巨噬细胞,且数量显著高于Sham组(P<0.01); CD163/CD68双染来标记M2型巨噬细胞(CD163为M2型巨噬细胞标记物),其在MI后第3天可计数到；与MI组相比,Statin组梗死灶周CD163阳性细胞计数显著增加(P<0.01),证实在MI后早期给以阿托伐他汀干预可促进巨噬细胞表型从M1型向M2型的转化。4.NGF蛋白及1nRNA表达：与S ham相比,MI组NGF表达明显上调；给以阿托伐他汀干预后,NGF表达明显下调。同时,NGF阳性的巨噬细胞数量明显下降。5.神经支配：(1)GAP43阳性神经纤维：Sham组几乎不可见；与Sham组相比,MI组梗死灶周神经纤维密度显著增加；与MI组相比,Statin组神经密度显著降低；(2)TH阳性神经纤维：S ham组可见其与心肌纤维一致的走形,分布均匀；与Sham组相比,MI组梗死灶周神经密度显著增加,且形态异常、空间分布混乱；与MI组对比,Statin组神经密度显著降低,生长形态及空间分布接近于正常化。结论：1.MI后巨噬细胞极性转化可影响NGF的表达,进而调节交感神经重构。2.阿托伐他汀通过促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化,下调NGF表达。3.MI后早期阿托伐他汀的应用可调节巨噬细胞极化,改善交感神经重构,从而发挥其抗心律失常作用。
关键词: 心肌梗死 ；室性心律失常 ；缝隙连接重构 ；缬沙坦 ；心肌梗死 ；室性心律失常 ；交感神经重构 ；炎症反应 ；阿托伐他汀
被引量
1
摘要： 心力衰竭(chronic heart failure, HF)是指心脏不能维持足够的心输出量以满足身体对代谢的需要和静脉血回流受阻的状态。心力衰竭是许多心血管疾病终末期的表现,是目前世界上面临的主要健康问题。根据欧洲心脏病学会(ESC)估计[1],在欧洲47个国家的10亿人口中患有心力衰竭者约占总人口的5%。美国Framingham、心脏研究也表明,心力衰竭人群的患病率和发病率随着年龄的增加而大幅度升高,人群中50岁年龄段者心力衰竭的患病率为1%,80岁年龄段则可升至10%,其中心力衰竭的年发病率在45-54岁人群中为0.2%,而在85-94岁年龄段则为4%。我国2000年大样本调查结果表明,心力衰竭者发病率为0.9%,随着年龄的增高,心力衰竭的发病率显著上升。心力衰竭预后差,死亡率高,研究表明,心力衰竭患者5年总死亡率及心功能Ⅲ-Ⅳ级患者的2年内死亡率均高于50%,其中约有30-40%的患者因发生恶性室性心律失常而猝死。因此,提高心力衰竭后心功能及防治心衰后室性心律失常是提高心力衰竭患者预后的重要措施。
心力衰竭时心肌收缩力呈渐进性明显下降,其基本环节是心肌细胞兴奋-收缩偶联的钙瞬变发生异常。RyR是一种细胞内钙释放通道,它位于肌浆网与细胞膜和T管L型钙通道相对应的交接处,与L型钙通道构成心肌细胞兴奋收缩偶联的基本功能单位。根据编码基因的不同,RyR可分为3个亚型：RyR1、RyR2、RyR3,在心肌组织中主要表达为RyR2,研究表明,在心力衰竭发生发展过程中,RyR2的结构和功能发生异常的改变。在生理情况下,心肌组织保持正常的节律性收缩依赖于每次心肌收缩后细胞内的钙离子能够迅速被清除,这主要通过肌浆网上的钙ATP酶(SERCA2a)将胞浆内的Ca2+泵回到肌浆网,此外,细胞膜上的钠钙交换体(NCX)也可将胞浆内的Ca2+排出细胞外,两者作用的结果使胞浆内的钙离子降低至初始浓度,心肌可恢复到舒张状态。心力衰竭时心肌钙瞬变的正性肌力作用减弱,心脏射血分数降低。
大量研究证实,心力衰竭时心肌细胞的动作电位时程(the action potential duration, APD)是延长的,并呈间歇依赖和不同区域的复极离散度加大,与此同时,衰竭心肌的有效复极不应期也明显延长,并且与左心室舒张末期压力呈正相关,即心力衰竭越严重,心肌有效复极不应期越长。我们知道,心肌细胞复极电流主要由钾、钙及钠钙交换体电流参与。瞬间外向钾电流(transient outward potassium current, Ito)是钾电流中一个重要成分,主要发生在动作电位复极1期,Ito的降低可对动作电位平台期产生明显影响,这在很大程度上导致了心力衰竭时动作电位时程和有效不应期的明显延长。钠钙交换蛋白(sodium-calcium exchanger, NCX1)是膜蛋白超家族一员,是一种非ATP依赖的双向转运蛋白。它有正向转运和反向转运两种模式,多数研究表明,在心力衰竭的患者或动物模型中,心肌细胞NCX1的表达出现升高。然而,对于慢性心力衰竭时NCX1的作用机制,不同的研究结果则不尽相同,但是不管NCX1是正向转运还是反向转运,均有可能导致心律失常的发生。心肌细胞间的电兴奋通过缝隙连接进行传导,CX43是细胞间缝隙连接的主要蛋白之一。心力衰竭时,CX43蛋白数量、分布、结构等的改变对缝隙连接的活性和功能有重要影响。
参松养心胶囊主要由人参、黄连、甘松、麦冬、山茱萸、丹参、炒酸枣仁赤芍、桑寄生、土鳖虫、南五味子、龙骨等12味中药组成,具有活血通络,益气养阴,清心安神的作用。目前,对参松养心胶囊研究较多的是临床对比观察治疗心律失常的疗效比较及采用膜片钳技术研究单离子通道的电流变化情况,然而,直到目前为止,对于离子通道的上游调节研究甚少。基于此,本实验采用主动脉瓣反流和腹主动脉缩窄的方法,建立日本大耳兔心力衰竭模型,检测参松养心胶囊对心力衰竭心功能的影响,观察心室肌细胞瞬时外向钾电流通道蛋白kv4.2,肌浆网(SR)Ca2+释放通道RyR2,肌浆网钙泵SERCA2a,钠钙交换蛋白NCX1及缝隙连接蛋白(CX43)的基因和蛋白表达变化,并研究参松养心胶囊对其表达的影响,探讨参松养心胶囊可能的作用机制。为心力衰竭的临床治疗提供实验依据。
一、兔慢性心力衰竭模型的建立及参松养心胶囊的干预
目的用主动脉瓣返流术联合腹主动脉缩窄术方法建立日本大耳兔慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)模型,观察参松养心胶囊对CHF兔心功能及心室结构的影响。
方法健康日本大耳兔分为三组,分别为假手术组(sham operation, SO组)、心衰对照组(heart failure, HF组)、心衰参松养心胶囊干预组(heart failure with Shen Song Yang Xin, SSYX组；)。8周后分别观各组家兔生存情况和心衰指标。利用超声心动图观察各组模型术前、术后左室收缩末期内径(the left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左室舒张末期内径(the left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左室射血分数(left ventricular shot ejection fraction, LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS);动物处死后立即测量心脏重量,计算心脏体重比。
结果在整个研究过程中,假手术组大耳兔死亡2只,心衰对照组死亡6只,心衰参松干预组死亡4只,总死亡率为33.33%,心衰组和参松养心胶囊干预组死亡率无差别。心衰组和参松养心胶囊干预组LVESD、LVEDD、心脏体重比高于假手术组,LVEF、LVFS值较假手术组低(p<0.05)；参松养心胶囊干预组LVESD、 LVEDD、心脏体重比均小于心衰组,LVEF值较心衰组升高(p<0.05)。
结论采用主动脉瓣返流术联合腹主动脉缩窄术方法建立兔慢性心力衰竭模型技术可靠,参松养心胶囊对心力衰竭左心室功能降低和扩大有抑制作用。
二、参松养心胶囊对心力衰竭兔左室心肌肌浆网钙调控的影响
目的心力衰竭时心肌收缩功能下降与肌浆网钙调控密切相关,本研究通过观察参松养心胶囊对慢性心力衰竭家兔左室心肌细胞肌浆网膜上的ca2+释放通Ryanodine受体2型(Ryanodine, RyR2)、肌浆网钙ATP酶(sarco-endoplasmic reticulum ATPase2a,SERCA-2a)蛋白及mRNA表达变化,探讨参松养心胶囊对心力衰竭心脏功能作用可能的分子机制。
方法兔腹主动脉缩窄术后6周,取各组模型左室心肌组织,利用免疫印迹技术(western blot)测定假手术组和心衰组家兔RyR2受体、SERCA-2a的蛋白含量。利用逆转录定量PCR技术测定假手术组和心衰组家兔心室肌RyR2受体、SERCA-2a的mRNA表达变化。
结果1.心衰对照组左室心肌RyR2受体、SERCA-2a蛋白含量较假手术组明显减少,分别下降42.68%、40%(p<0.05); RyR2受体、SERCA-2a的mRNA表达明显低于假手术组(p<0.05),其下降程度分别为49.70%、73.01%。2.与心衰对照组比较,参松养心胶囊干预组RyR2受体蛋白含量及mRNA表达明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组；SERCA-2a mRNA表达较心衰对照组明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组,SERCA-2a蛋白含量均有所增加,但未达到统计学差异。
结论1.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞RyR2受体、SERCA-2a蛋白含量及mRNA表达下降,提示RyR2受体、SERCA-2a均参与慢性心力衰竭时肌浆网钙调节异常的发生发展。2.在早期对家兔慢性心力衰竭模型给予参松养心胶囊干预可改善细胞内肌浆网钙调控蛋白的改变,其机制可能与参松养心胶囊对肌浆网钙释放通道亚单位RyR2、肌浆内质网钙摄取亚单位SERCA-2a的mRNA和蛋白表达重构抑制作用有关,提示参松养心胶囊可改善左心室的收缩功能。
三、参松养心胶囊对心力衰竭心室肌电重构的影响
目的参松养心胶囊具有治疗心律失常作用,具体机制尚未阐明,本研究对负荷联合压力诱导的心力衰竭兔进行早期给予参松养心胶囊干预,兔腹主动脉缩窄术后6周对各组模型行左心室在体电生理检测。取左室游离壁心肌组织,观察瞬时外向钾电流(transient outward potassium current, Ito)通道孔道Kv4.2a亚单位、钠钙交换体1(sodium-calcium exchanger, NCX1)、缝隙连接蛋白43(connexin43, Cx43)的电重构作用,探讨其改善心力衰竭心功能及心律失常可能的机制。
方法利用免疫印迹技术(western blot)检测假手术组、心衰组和心衰参松养心胶囊干预组家兔心室肌Kv4.2a亚单位NCX1、Cx43的蛋白含量。利用逆转录定量PCR技术检测假手术组、心衰组和心衰参松养心胶囊干预组家兔心室肌Kv4.2a亚单位、NCX1、Cx43的mRNA表达变化。
结果1.与假手术对照组比较：心衰对照组左室心肌MAPD90、ERP和内、中、外膜TDR明显延长,室颤阈值(VFT)明显降低(P<0.05)；心衰组左室心肌Ito通道Kv4.2a亚单位、Cx43蛋白含量较假手术组明显减少(p<0.05),分别下降61.25%、49.83%；NCX1蛋白含量升高39.24%(p<0.05)。心衰对照组左室心肌Ito通道Kv4.2a亚单位、Cx43的mRNA表达明显低于假手术组(p<0.05),其下降程度分别为27.77%、48.31%；相反,NCX1mRNA表达较假手术组显著升高(p<0.05)。2.与心衰对照组比较,参松养心胶囊干预组MAPD90、ERP和TDR明显缩短,VFT明显升高(P<0.05)；参松养心胶囊干预组Kv4.2a亚单位蛋白含量及mRNA表达明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组。NCX1蛋白含量明显降低(p<0.05), NCX mRNA表达有一定程度减少,但未有统计学差异。Cx43mRNA表达较心衰对照组明显增高(p<0.05),但仍低于假手术组；Cx43蛋白含量均有所增加,但未达到统计学差异。
结论1.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞Ito通道Kv4.2a亚单位蛋白含量及mRNA表达下降,提示Kv4.2a亚单位改变是心力衰竭后Ito电流变化的主要机制之一。2.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞NCX1蛋白含量及mRNA表达升高,提示慢性心力衰竭时心肌细胞钠钙交换发生紊乱。3.慢性心力衰竭家兔心室肌细胞Cx43蛋白含量及mRNA表达降低,提示慢性心力衰竭时心肌细胞间缝隙连接功能降低。4.在早期对家兔慢性心力衰竭模型给予参松养心胶囊干预可抑制Ito、NCX1及Cx43的重构,其机制可能与参松养心胶囊对Ito的α亚单位Kv4.2、NCX1及Cx43mRNA水平的抑制作用有关,提示参松养心胶囊可抑制慢性心力衰竭左室心肌的电重构,降低心律失常的发生发展。
关键词: 心力衰竭 ；电重构 ；心室肌细胞 ；参松养心胶囊 ；家兔