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摘要： 目的:了解福建省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因型的分布特征和流行情况,同时分析MTB基因型与其耐药的关系。方法:选取2017—2019年福建省结核病耐药监测点的477株MTB临床分离株作为研究对象。采用对硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长实验法进行菌种初步鉴定,并采用传统固体比例法对9种抗结核药物[异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)、链霉素(streptomycin,Sm)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、卡那霉素(kanamycin,Km)、氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卷曲霉素(capreomycin,Cm)、丙硫异烟胺(prothionamide,Pto)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)]进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。应用熔解曲线法间隔区寡核苷酸分型(McSpoligotyping)技术对菌株进行基因分型。结果:477株MTB菌株中北京基因型有245株,占51.4%;T家族有44株(含2株T,28株T1,7株T2,T3和T4各3株,1株T5),占9.2%;H家族有35株(含13株H,1株H1,21株H3),占7.3%;EAI家族有11株(含10株EAI2-Manila,1株EAI5),占2.3%;LAM3、Manu2和X1家族各有1株,分别占0.2%;所属家族未定义或不明确的有139株,占29.1%。聚类分析显示,各基因型家族主要流行型为北京家族的SIT1(44.9%,214/477)、T家族的SIT53(2.5%,12/477)、H家族的SIT742(1.9%,9/477)、EAI家族的SIT19(1.5%,7/477)。各家族MTB菌株与INH的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=10.311,P=0.036),其中,EAI+LAM+Manu+X家族菌株对INH的耐药率最高[28.6%(4/14)];对RFP的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=14.366,P=0.006),其中,EAI+LAM+Manu+X家族菌株对RFP的耐药率最高[21.4%(3/14)];对Ofx的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=23.643,P=0.000),其中,H家族菌株对Ofx的耐药率最高[17.1%(6/35)];对PAS耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=9.550,P=0.049),其中,未定义家族菌株对PAS的耐药率最高[4.3%(6/139)]。结论:福建省MTB流行基因型以北京基因型为主,同时应重视未定义家族菌株的流行并加强对T家族、H家族和EAI等家族菌株的监测。菌株对INH、RFP、Ofx和PAS的耐药性与各基因家族相关。
关键词: 分枝杆菌,结核 ；基因型 ；DNA,核糖体间隔区 ；聚合酶链反应 ；抗药性,细菌
被引量
6
摘要： 目的评价耐多药（MDR）及广泛耐药（XDR）MTB菌株对抗结核新药乙胺丁醇（EMB）类似物SQ109的耐药性，为SQ109的临床应用提供依据。方法收集首都医科大学附属北京胸科医院2014年7月至2016年12月临床分离培养阳性的MTB菌株，共计223株，包括MDR菌株109株，XDR菌株114株。采用微孔板阿尔玛蓝显色法检测SQ109对菌株的最低抑菌浓度（MIC），确定流行病学界值（ECOFF值）；采用RD207基因作为北京基因型和非北京基因型的分离标准进行基因型鉴别，并比较不同基因型菌株耐药情况；根据临床药物敏感性试验（简称“药敏试验”）结果将菌株对EMB的耐药情况进行分类，并比较EMB耐药菌株和敏感菌株对SQ109耐药率的差异。结果根据临床MTB菌株对于SQ109的MIC值频数分布情况，确定ECOFF值为1．000mg／L。XDR菌株耐药率为4．4％（5／114），MDR菌株中无耐药菌株，两者耐药率差异无统计学意义（Fisher精确概率法，P〉O．05）。109株MDR菌株中有8株非北京基因型，114株XDR中有10株非北京基因型。北京基因型菌株对SQL09耐药率为2．4％（5／205），非北京基因型菌株中未发现耐药菌株，两者耐药率差异无统计学意义（Fisher精确概率法，P〉0．05）。223株菌株中共有138株EMB敏感菌株和85株EMB耐药菌株。EMB敏感菌株对SQ109耐药菌株数为1株，耐药率为0．7％（1／138）；EMB耐药菌株对SQ109耐药菌株数为4株，耐药率为4．7％（4／85），两者耐药率差异无统计学意义（Fisher精确概率法，P〉O．05）。结论SQ109在体外药敏试验中表现出对MDR-MTB和XDR-MTB菌株具有良好的抑菌效果。北京基因型菌株与SQ109耐药性无相关性。菌株对EMB的耐药性与对SQ109的耐药性无相关性。
关键词: 分枝杆菌 ；结核 ；抗药性 ；多种 ；细菌 ；基因型 ；因果律 ；SQ109
被引量
4
摘要： 目的 了解福建省耐多药结核分枝杆菌（MDR-MTB）对吡嗪酰胺（PZA）的耐药水平及基因型分布情况,分析PZA耐药水平及基因型之间的关系。方法 收集2007—2008年和2010—2011年福建省耐药监测点共119株MDR-MTB临床分离株,采用WHO推荐的方法进行耐药性检测,应用间隔区寡核苷酸分型技术（Spoligotyping）进行基因分型,对分型结果上传至SpolDB4.0数据库,并进行聚类分析。结果 119株MDR-MTB菌株对PZA的耐药率为36.97%（44/119）。耐PZA菌株对链霉素（Sm）的耐药率为70.45%（31/44）,高于PZA敏感菌株对Sm的耐药率[50.67%（38/75）],差异有统计学意义（χ 2=4.45,P=0.035）;耐PZA菌株对乙胺丁醇（EMB）的耐药率为81.82%（36/44）,高于PZA敏感菌株对EMB的耐药率[52.00%（39/75）],差异有统计学意义（χ 2=1.58,P=0.001）。北京基因型菌株占67.23%（80/119）;非北京基因型菌株占32.77%（39/119）,共有16个基因型（含8个新发现的基因型）,其中常见的是H家族（含H和H3）和T家族（含T1、T2、T3和T5）。北京基因型菌株对PZA的耐药率（38.75%,31/80）与非北京基因型菌株对PZA的耐药率（33.33%,13/39）间差异无统计学意义（χ 2=0.33,P=0.566）。 结论 福建省耐多药结核病患者临床分离株对PZA耐药的问题应引起重视,对PZA耐药与对Sm和EMB耐药有关;MDR-MTB菌株主要为北京基因型,北京基因型与非北京基因型菌株对PZA的耐药率未见差异。
关键词: 分枝杆菌,结核 ；结核,抗多种药物性 ；吡嗪酰胺 ；基因型
被引量
2
【会议论文】 •
+7位作者
会议时间： 2018-08-25
摘要： 目的评价耐多药(MDR)及广泛耐药(XDR)MTB菌株对抗结核新药乙胺丁醇(EMB)类似物SQ109的耐药性,为SQ109的临床应用提供依据。方法收集首都医科大学附属北京胸科医院2014年7月至2016年12月临床分离培养阳性的MTB菌株,共计223株,包括MDR菌株109株,XDR菌株114株。采用微孔板阿尔玛蓝显色法检测SQ109对菌株的最低抑菌浓度(MIC),确定流行病学界值(ECOFF值);采用RD207基因作为北京基因型和非北京基因型的分离标准进行基因型鉴别,并比较不同基因型菌株耐药情况;根据临床药物敏感性试验(简称"药敏试验")结果将菌株对EMB的耐药情况进行分类,并比较EMB耐药菌株和敏感菌株对SQ109耐药率的差异。结果根据临床菌株对于SQ109的MIC值频数分布情况,确定ECOFF值为1.000 mg/L。XDR菌株耐药率为4.4%(5/114),MDR菌株中无耐药菌株,两者耐药率差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P> 0.05)。109株MDR菌株中有8株非北京基因型,114株XDR中有10株非北京基因型。北京基因型菌株对SQ109耐药率为2.4%(5/205),非北京基因型菌株中未发现耐药菌株,两者耐药率差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P> 0.05)。223株菌株中共有138株EMB敏感菌株和85株EMB耐药菌株。EMB敏感菌株对SQ109耐药菌株数为1株,耐药率为0.7%(1/138);EMB耐药菌株对SQ109耐药菌株数为4株,耐药率为4.7%(4/85),两者耐药率差异无统计学意义(Fisher精确概率法检验,P> 0.05)。结论 SQ109在体外药敏试验中表现出对MDR和XDR菌株具有良好的抑菌效果。北京基因型菌株与SQ109耐药性无相关性。菌株对EMB的耐药性与对SQ109的耐药性无相关性。
关键词: 分枝杆菌,结核 ；抗药性,多种,细菌 ；基因型 ；因果律 ；SQ109
【会议论文】 •
+7位作者
会议时间： 2018-08-03
摘要： 目的评价耐多药(MDR)及广泛耐药(XDR)MTB菌株对抗结核新药乙胺丁醇(EMB)类似物SQ109的耐药性,为SQ109的临床应用提供依据。方法收集首都医科大学附属北京胸科医院2014年7月至2016年12月临床分离培养阳性的MTB菌株,共计223株,包括MDR菌株109株,XDR菌株114株。采用微孔板阿尔玛蓝显色法检测SQ109对菌株的最低抑菌浓度(MIC),确定流行病学界值(ECOFF值);采用RD207基因作为北京基因型和非北京基因型的分离标准进行基因型鉴别,并比较不同基因型菌株耐药情况;根据临床药物敏感性试验(简称"药敏试验")结果将菌株对EMB的耐药情况进行分类,并比较EMB耐药菌株和敏感菌株对SQ109耐药率的差异。结果根据临床菌株对于SQ109的MIC值频数分布情况,确定ECOFF值为1.000 mg/L。XDR菌株耐药率为4.4%(5/114),MDR菌株中无耐药菌株,两者耐药率差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P> 0.05)。109株MDR菌株中有8株非北京基因型,114株XDR中有10株非北京基因型。北京基因型菌株对SQ109耐药率为2.4%(5/205),非北京基因型菌株中未发现耐药菌株,两者耐药率差异无统计学意义(Fisher精确概率法,P> 0.05)。223株菌株中共有138株EMB敏感菌株和85株EMB耐药菌株。EMB敏感菌株对SQ109耐药菌株数为1株,耐药率为0.7%(1/138);EMB耐药菌株对SQ109耐药菌株数为4株,耐药率为4.7%(4/85),两者耐药率差异无统计学意义(Fisher精确概率法检验,P> 0.05)。结论 SQ109在体外药敏试验中表现出对MDR和XDR菌株具有良好的抑菌效果。北京基因型菌株与SQ109耐药性无相关性。菌株对EMB的耐药性与对SQ109的耐药性无相关性。
关键词: 分枝杆菌,结核 ；抗药性,多种,细菌 ；基因型 ；因果律 ；SQ109
摘要： 【目的】了解云南地区76株结核分枝杆菌基因型的分布特征。阐明云南省结核患者MTB的基因型与耐药分子特征之间的关系,为结核防控提供有价值的信息。【方法】1.收集云南省传染病医院检验科结核室,2021年04月至2021年10月结核培养阳性菌株76株,采用MIRU-VNTR15位点分型技术进行基因分型,用软件将分型结果进行聚类分析,根据成簇计算近期传播率。2.利用一代测序技术进行耐药突变位点的检测,了解该地区结核杆菌的耐药情况,基因型与耐药性是否相关。【结果】1.76株MTB临床分离株15个VNTR位点检测结果显示,Hunter-Gaston指数从0.103到0.815,分辨力高的位点是Mtub21、MIRU26、MIRU31、Mtub4、QUB11b、QUB26、QUB4156;分辨力的中等位点是Mtub39、MIRU10、Mtub30、ETR A、MIRU16、MIRU40;低分辨力位点是ETR C、MIRU4。2.76株结核杆菌分型得到三个家族基因群,分别是北京型52株、NEW-1型18株和URAL型6株。产生70种基因型。独特基因型68(89.5%)种,余成4簇,每簇2株,共8(10.5%)株,成簇率5.3%。3.基因分型与性别、年龄、治疗史初治复治、HIV感染、影像征象及地域分布对比差异分析无统计学意义(P>0.05)4.成簇型与独特型在性别、年龄、分型、治疗史初治复治及地域分布差异分析无统计学意义(P>0.05)。5.药敏试验共发现16种耐药相关的氨基酸突变,分别是inh A基因中C15T氨基酸突变,kat G基因中S315T氨基酸突变,rpo B基因中D516V、H526R、S531Q、L533P氨基酸突变,emb B基因中M306I、M306V氨基酸突变,rps L基因中K88R氨基酸突变,Gyr A基因中A90V、G88C、D89N、D94G、D94A、D94Y,rrs基因中A1401G氨基酸突变。6.药敏显示该地区76株MTB总耐药率35.5%(27/76),单耐药率18.4%(14/76),多耐药率11.8%(9/76),耐多药率5.3%(4/76)。北京型52株、非北京型24株,北京型耐药率为40.4%(21/52),非北京型耐药率为25%(6/24)。7.基因分型与kat G基因中S315T氨基酸突变相关分析差异有统计学意义(P<0.05);基因分型与异烟肼药物耐药相关分析差异有统计学意义(P<0.05)。8.全敏感结核患者和耐药结核患者在性别、年龄、基因成簇和分型方面无统计学意义(P>0.05);在结核病史初治复治方面差异有统计学意义,初治耐药率明显低于复治耐药率(P<0.05)。【结论】1.Mtub21、MIRU26、MIRU31、Mtub4、QUB11b、QUB26、QUB4156七个位点是云南省76例结核患者MTB基因分型的首选位点,具有明显的遗传多态性。北京基因型菌株在云南省广泛分布,为占绝对优势的菌株,不同地州基因型群存在差异,大部分与总体的流行趋势相符。2.云南北京型MTB耐药率高于非北京型,且与kat G基因中S315T氨基酸突变和异烟肼药物耐药有统计学差异。
关键词: 结核分枝杆菌 ；基因分型 ；耐药结核 ；耐药突变位点
摘要： 1.北京耐药监测点结核分枝杆菌的耐药性研究目的:分析北京市怀柔结核病监测点结核分枝杆菌的耐药谱和基因突变情况。方法:收集2009年1月至2018年12月北京市怀柔区结核病患者临床分离株250株。采用比例法药物敏感性实验检测这些临床分离株对4种一线抗结核药及7种二线抗结核药的耐药谱。采用分子线性探针法快速检测对利福平(Rifampicin,RFP)和异烟肼(Isoniazid,INH)的耐药性。结果:235株被鉴定为结核分枝杆菌的分离株中有79株(33.6%)对一种或多种药物耐药。其中单药耐药18例(7.7%),多耐药19例(8.1%),RFP耐药28例(11.9%),耐多药(multidrug-resistance,MDR)24 例(10.2%),准广泛耐药7例(3.0%),广泛耐药2例(0.9%)。复治患者的耐多药比例高于初治患者(34.5%vs.6.8%,p<0.01),耐药菌株中RFP耐药主要是rpoB基因S531L位点突变(62.5%),INH耐药主要是katG基因S315T1位点突变,占62.9%。结论:北京怀柔结核病监测点复治患者所分离的结核分枝杆菌MDR率显著高于初治患者。详细的药物敏感性实验结果对耐药结核病的治疗至关重要。检测耐药菌株的常见基因突变可快速准确的诊断耐多药结核病,这也将改善患者治疗效果并降低传播率。2.北京地区复治结核病耐药性研究目的:掌握北京地区复治患者结核分枝杆菌分离株的耐药情况。方法:对北京地区2017年1月至2019年12月复治肺结核患者展开调查,通过菌株库信息的比对,查找出已登记的第一株和最后一株来自同一患者的结核分枝杆菌配对菌株134对268例,采用分子线性探针法快速检测对利福平和异烟肼的耐药性。对复治患者末次分离株进行比例法药物敏感性实验。结果:北京地区复治患者初始分离株中单耐INH 比例为9.0%,高于末次分离株中单耐 INH 比例(X2=4.254,P<0.05)。复治患者 MDR 率为 29.9%(40/134),复发患者MDR率为23.1%(18/78)。非复发的复治患者MDR率高于复发患者(X2=4.090,P<0.05)。有耐药性变化患者共14例,占比为10.4%,其中10例(71.4%)患者分离株从敏感变为耐药,4例(28.6%)患者的分离株由耐药变成敏感。耐药菌株中,利福平耐药株以rpoB基因S531L位点突变为主(63.0%),70.5%的异烟肼耐药株为katG基因S315T1位点发生突变。比例法药敏结果显示复发患者任何耐药率为57.7%,非复发患者任何耐药率为53.1%。结论:北京地区复治患者初始分离株中单耐INH的比例比末次分离株高,非复发的复治患者MDR率高于复发患者,临床上一旦诊断为结核病,应该要立即治疗,联合、规范用药,坚持治疗防止发展为耐药结核病,甚至耐多药结核病。3.北京地区复治结核病患者菌型分析目的:通过比较北京地区复治结核病患者前后两次发病时菌株的基因型有无发生变化,从而了解患者的发病原因。再以复治结核患者末次菌株为研究对象,了解北京地区复治患者结核分枝杆菌的基因型及成簇特征。方法:以北京地区2017年1月至2019年12月复治肺结核患者为研究对象,通过RD105缺失基因法及15位点可变数目串联重复序列基因分型实验比较复治肺结核患者前后两次发病时结核分枝杆菌基因型的差异,从而判断结核病的发病原因。再以复治结核患者末次菌株为研究对象,评价该基因分型技术对北京地区复治患者结核分枝杆菌的分辨能力,对流行于复治患者中的结核分枝杆菌从系统发育学方面进行研究,掌握复治患者结核分枝杆菌的遗传特征。结果:复治患者内源性复燃占比为75.4%(101/134),外源性再感染比例为24.6%(33/134);复发结核病患者内源性复燃占比为65.4%(51/78),外源性再感染比例为34.6%(27/78)。获得性耐药比例为60%(6/10),原发性耐药为40%(4/10)。复治患者末次分离的134例结核分枝杆菌中,126例为北京型,8例为非北京型。134株结核分枝杆菌呈现110种基因型,包括2个同源复合群和25个独特型。33株菌成9个簇,成簇率为17.9%。结论:北京地区复治结核病患者发病的主要原因是内源性复燃,也存在小范围内的流行,且主要流行菌株为北京基因型,呈现出较高的遗传多样性。4.全基因组测序在耐多药结核分枝杆菌研究中的应用目的:通过全基因组测序了解复治MDR患者临床分离株的基因谱系以及传播关系,并对每株结核分枝杆菌的全基因组进行16种药的耐药性预测。方法:北京地区2017年1月至2019年12月期间复治肺结核患者临床分离株,经分子线性探针技术检测为MDR的40例菌株,采用改良的CTAB法提取结核分枝杆菌全基因组,通过全基因组测序掌握耐多药结核分枝杆菌的谱系特征及传播关系,通过提取各耐药位点的序列比对信息,分析各耐药位点的突变,根据数据库中突变和耐药关系,预测耐药表型。结果:40例经线性探针法鉴定为MDR的菌株中,全基因组测序显示有1例为利福平敏感菌株。40例结核分枝杆菌均为谱系2,其中亚谱系L2.2.1有33株,L2.2.2 有 7 株;29 株(72.5%,29/40)为“现代”北京型,11 株(27.5%,11/40)为“古老”北京型。40例菌株中2例成簇。共发现16个与耐药相关的基因,有11例菌株对同种抗结核药存在两个及以上耐药基因。结论:北京地区复治结核病患者MDR分离株主要为谱系2,“现代”北京型占多数,检测与耐药相关的基因位点突变可以预测耐药。
关键词: 结核分枝杆菌 ；复治 ；耐药 ；线性探针技术 ；多位点可变数目串联重复序列分析 ；全基因组测序
被引量
3
摘要： 目的:1.分析新疆南疆地区耐药结核病流行情况。2.研究南疆地区结核分枝杆菌基因型与耐药性之间的关系。3.分析常见抗结核药物包括异烟肼(INH)、利福平(RMP)、乙胺丁醇(EMB)和链霉素(STR)等耐药相关基因的突变在南疆地区结核分枝杆菌临床菌株中的分布情况及其与耐药关联性。方法:1.2017年1月-2018年12月期间,连续纳入项目定点医院确诊、登记且年满16周岁的结核病住院/门诊患者为研究对象,并对分离培养获得的结核分枝杆菌进行菌种鉴定及药物敏感性检测。2.采用Spoligotyping法对结核分枝杆菌进行基因分型。3.采用全基因组测序技术对346株结核分枝杆菌进行测序并进行单核苷酸多态性分析18个已知耐药相关基因区域的突变情况;计算耐药相关基因在相应药物的敏感株或耐药株的突变率。结果:1.南疆地区904例结核病患者总耐药率为46.1%,单耐药率14.3%,多耐药率为18.9%,耐多药率为12.9%,准广泛耐药率为4.4%、广泛耐药率为1.2%;且复治患者以上各类耐药类型发生率均高于初治患者,差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。总耐药顺位:耐 INH 30.0%、STR 19.9%、RMP 18.6%、莫西沙星(Mfx)14.4%、左氧氟沙星(Lfx)12.8%、利福布汀(Rfb)8.8%、利福喷丁(Rpt)8.4%、EMB 4.9%、卡那霉素(KAN)4.0%、阿米卡星(AMK)3.0%、对氨基水杨酸(PAS)1.1%、卷曲霉素0.9%,力克肺疾2.1%、丙硫异烟胺0.9%、克拉霉素0.8%、氯法齐明0.3%;初治组和复治组相比,复治患者结核分枝杆菌对INH、RMP、Rpt、Rfb、STR、Lfx、Mfx等常见抗结核药物耐药率均高于初治患者,差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。初治结核病患者Pre-XDR(准广泛耐药结核病)发生率和复治结核病患者总耐药率、耐STR、RMP、Rpt、MDR(耐多药结核病)和XDR(广泛耐药结核病)发生率在不同年龄组间差异均具有统计学意义(P值均<0.05);初治结核病患者中农民人群总耐药率、耐Mfx、KAN、AMK、PAS及多耐药结核病发生率均高于非农民人群,而复治结核病患者非农民人群耐RMP、Rpt、Rfb、STR、MDR和Pre-XDR发生率高于农民人群,不同职业人群差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。2.346株结核分枝杆菌可分为北京基因型和非北京基因型两大类基因型,分别占202株(58.4%)和144株(41.6%);非北京基因型菌株包括:CAS1-Delhi(47,13.6%),Ural-2(31,8.9%),T1(12,3.5%),EAI(11,3.2%),T2(5,1.4%),T3(3,0.9%),T2(2,0.6%),H3(2,0.6%),LAM9(2,0.6%),H1(1,0.3%),Ural-1(1,0.3%)和未知基因型(27,7.8%)。北京基因型和非北京基因型菌株患者在性别、居住地和治疗史上都无统计学差异,而职业为非农民人群感染北京基因型比例(68.2%)高于农民人群(χ2=8.19,P<0.01);小于30岁年龄组人群感染北京基因型比例(75.0%)高于其他年龄组(χ2=11.72,P<0.01)。北京基因型菌株以下耐药率高于非北京基因型菌株:总耐药率(52.1%VS 39.1%)、MDR(19.3%VS 7.6%)、耐 RMP(23.3%VS.9.0%)、耐 EMB(10.9%VS 4.9%)、耐 Mfx 比例(32.7%VS 13.2%),差异均具有统计学意义(P<0.01)。耐药相关因素分析显示,结核分枝杆菌北京基因型与非北京基因型相比,发生耐药和耐多药风险比分别为1.89(95%CI=1.16-3.09,P<0.01)和 4.02(95%CI=1.78-9.09,P<0.01);复治患者与初治患者相比,发生耐药和MDR风险比分别为1.65(95%CI=1.02-2.68,P<0.05)和6.9(95%CI=3.16-15.12,P<0.01)。3.全基因组测序结果显示,耐异烟肼结核分枝杆菌中:katG最常见突变类型为S315T,其在耐药菌株中突变率最高为41.5%,8株(7.5%)inhA启动子发生突变,10株(9.4%)oxyR-ahpC基因间隔区发生突变;iniA、iniB、BniC、ndh、kasA和efpA等基因突变频率在耐药和敏感菌株之间差异没有统计学意义(P>0.05)。60株RMP耐药株株中rpoB基因突变频率最高的密码子依次为 450(36/60,60.0%)、445(11/60,18.3%)、430(8/60,13.3%)和435(4/60,6.7%)。29株EMB耐药株中embB基因突变率最高的位点为Met306(16,55.2%)。70株STR耐药株中rrs基因530和912环区突变率最高的位点为A514C(8,11.4%),其次为 A908C(4,5.7%)和 C517T(1,1.4%);rpsL基因突变率最高的位点为K43R(25,35.7%),其次为K88R(9,12.9%)。结论:1.南疆地区结核病耐药情况严重,应采取有效的防控措施。2.南疆地区结核分枝杆菌主要以北京基因型菌株为主,同时,非北京基因型菌株呈多态性;该地区北京基因型与耐药、耐多药、耐利福平、耐乙胺丁醇和耐莫西沙星等有相关性;结核分枝杆菌北京基因型和抗结核病治疗史是发生耐药和耐多药的主要影响因素。3.katG(INH),rpoB(RMP),embB(EMB),rpsL、rrs530 和 915 环区(STR)等基因突变是南疆地区结核分枝杆菌对4种常见抗结核药物耐药的主要机制,以上基因中最常见的突变位点分别为rpoBS450L、katGS315T、embBMet306、rrsA514C、rpsLK43R和rpsLK88R 等。
关键词: 结核病 ；结核分枝杆菌 ；耐药 ；北京基因型 ；基因突变
被引量
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摘要： 结核病(Tuberculosis，TB)的控制和管理对全球卫生来说是一项巨大的挑战。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）是TB的病原体，可感染约三分之一的世界人口。多重耐药(multidrug-resistant，MDR)和广泛耐药(extensively drug-resistant，XDR)TB的迅速出现和流行使世界范围内持续威胁公共卫生的情况更加恶化。不恰当的治疗方案、患者对治疗的依从性、有限的快速诊断工具和药物靶点的变异都是导致耐药TB流行的关键因素。抗结核药物分子靶点的突变/氨基酸替代是产生耐药(resistance，R)的主要原因。这些突变可以影响负责药物激活/转化的酶的代谢活性。为了了解耐药途径，有迫切的需要探讨分子靶点与抗结核药物的相关性。 吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)、利福平（Rifampicin，RIF）、左氧氟沙星(Levofloxacin，LVX)和莫西沙星(Moxifloxacin，MXF)是MDR和XDR TB标准治疗方案的重要组成部分。这些抗结核药物对生长缓慢、休眠或非复制的持久性细菌有其独特的作用。PZA是在标准短程联合疗法中用于治疗药物敏感性结核病(drug-susceptible TB，DS-TB)和耐药结核病(drug-resistant TB，DR-TB)的四种一线药物之一。它在酸性pH值下具有低代谢，对非复制型持久性细菌具有独特的杀菌活性，因此有望成为现代一线TB药物治疗方案中不可替代的组成部分。PZA是一种前药，需要通过pncA基因编码的吡嗪酰胺酶(PZase)将其转化为吡嗪酸(POA)的活性形式。RIF具有广泛的抗菌谱，对分枝杆菌具有主要功效，它通过与一种酶建立稳定的复合物而抑制了DNA依赖性RNA聚合酶的活性，从而抑制了RNA合成的启动。RIF具有杀菌活性，对细胞内和细胞外生物都有有效的作用。而FQs（LVX和MXF）属于喹诺酮类药物，通过抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅵ睐发挥其功能，这些酶是复制、转录、重组和染色体超链等重要过程所必需的酶。FQs耐药的主要原因是DNA回旋酶中药物结合位点的断裂。 关于它们的作用机理存在一些不确定性，而关于耐药性的机理还存在更多不确定性。目前对这些一线和二线结核病药物的耐药率上升强调了对耐药Mtb临床株进行详细的表型和遗传特征分析，以揭示其耐药途径和TB流行情况的重要性。 在这项研究中，通过常规和现代方法对总共1000多种Mtb临床分离株进行了表型和遗传学表征。除人口学特征外，还根据所研究的抗结核药物选择了临床分离株。首先，为了研究PZAR临床分离株，在448株Mtb分离株中，269/448(60.04％)表现出对PZA的耐药性。这些PZAR Mtb菌株分别有78株MDR、119株pre-XDR和29株XDR-TB。中国南方地区MDR TB和前XDR TB的PZAR发生率明显高于其他地区。首次通过对Rv2044c-pncA-Rv2042c片段的遗传特性鉴定，发现了Rv2044c基因的新的非同义突变，该突变改变了PZase的活性，并产生了对PZA的抗性。与表型表征相比，遗传分析显示84.38％的PZAR菌株在pncA基因和上游侧翼区(UFR)中具有非同义突变和插入/缺失(Indels)，最高敏感度为83.64％，但综合评估了rpsA(2.60％)，panD(1.48％)，Rv2783c(1.11％)和Rv2044c(0.74％)这些其他分子靶点则能将分子诊断的敏感性提高到89.59％。另一个显着发现是，pncA上游区域的突变/Indels(A-11G，C-114del)与PZase调控和PZA抗性有关。此外，本研究在PZAR菌株中检测到57个新突变。 氟喹诺酮类耐药株中，LVXR Mtb为303/400株(75.75％)，MXFR Mtb为292/400株(73％)。约321/400株Mtb(80.25％)属于MDR、pre-XDR和XDR菌株。检测到，89.43％的突变发生在gyrA基因中，30.03％的突变发生在gyrB基因中。(A90，D94)和(T500，G510，G512)分别是gyrA和gyrB的喹诺酮类耐药决定区(quinolone-resistance determining regions，QRDRs)中突变最多的密码子。有趣的是，本研究首次发现了QRDRs外的18种新突变，包括gyrA中的(L105R，A126E，M127K，D151T，V165A)和gyrB中的(D461H，N499S，G520A)。Mtb分离株中LVX与MXF的交叉耐药率明显更高。 同样的，在150/175株(85.71％)的RIFR菌株中，78.85％属于MDR TB、前XDRTB和XDR TB组，显示出较高的发病率。遗传特征揭示了整个rpoB基因中69种不同类型的突变，包括RIF抗性决定区域（RIF-resistance determining region，RRDR）中的17种不同突变。RIFR菌株中的大部分突变在L430(P)，D435(V，N，G，E)，H445(Y，D，N，R，L)，S450(L，F)和L452(P)处检测到。非同义突变(K274Q+C897del)和(A286V)，以及插入/缺失(G1687del)，(T1835ins)是位于rpoB基因RRDR之外的新型突变，与对RIF的耐药有关。整个基因的测序分析显示，灵敏度为98.67％，略高于GeneXpert MTB/RIF分析的灵敏度96.00％。此外，＞70％的Mtb菌株属于北京基因型家族，所以通过基因型分析证明了Mtb的北京基因型在耐药Mtb菌株中占主导地位。有趣的是，总共鉴定出超过50株的Mtb菌株具有野生型的药物靶标编码区却通过未知机制产生了耐药性。 随着时间推移，用于快速检测Mtb耐药性的分子诊断越来越受到关注。尽管GenoType MTBDR sl测定法(Hain Lifescience GmbH)对FQ耐药性检测具有中等测试灵敏度和高特异性，同样GeneXpert-MTB/RIF试验也被推荐用于RIFR菌株的检测，但是这些测定法只能检测FQ中的QRDR和RIF的RRDR。热点区域之外的突变仍然无法通过这些方法检测到。对这些抗TB药物分子靶点的整个编码区和上游区进行DNA测序分析，发现了与耐药性发展相关的新突变。另一方面，就PZAR菌株的分子诊断而言，情况更加复杂，据所知，尚无WHO批准的具有体外诊断证书的分子测定法可用于快速检测结核分枝杆菌的PZA耐药性。关键原因之一是在pncA基因中发现了多个突变，而没有任何热点区域。此外，由于其他PZA相关分子靶点的突变以及未知的耐药机制，Mtb菌株也被发现对PZA具有抗性。 目前用于分子诊断的分析方法的局限性主要是缺乏与表型抗性的出现相关的所有基因组区域的知识，评估的靶点数量有限，以及发生在热点区域以外的突变导致未被检测到的抗性严重影响了诊断准确性和这些测试的临床用途。全面的表型和遗传研究的潜在有用性将有助于开发具有更高灵敏度和特异性的快速、可靠和成本效益高的分子检测方法。 重要的是基因突变对抗结核药物耐药性的影响，将新发现的突变作为诊断标记物在未来的分子测定中将是有价值的。此外，将TB耐药突变数据库作为参考库，将有助于耐药患者的早期诊断和制定有效的治疗方案。 更好地了解耐药机制对于合成针对耐药Mtb的新的有效药物从而成功治疗TB非常重要;此外还将促进快速和可靠的分子诊断工具的开发和应用，从而提高测试这些基本抗结核药物耐药性的可靠性。
关键词: 结核病 ；结核分枝杆菌 ；耐药机制 ；分子诊断