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摘要： 目的基于LC-MS考察薏苡仁油干预三阴性乳腺癌原位荷瘤小鼠肿瘤生长的代谢组学情况。方法建立乳腺癌原位荷瘤小鼠模型,随机分为正常对照组、模型组和薏苡仁油给药组,薏苡仁油给药组灌胃给予薏苡仁油(7.5 mL·kg-1·d-1),连续灌胃给药14 d后,处死小鼠,取瘤组织并保留各组血清。HPLC-LTQ-Orbitrap Elite液质联用技术检测各组小鼠血清中的代谢变化并鉴定差异性代谢物。结果薏苡仁油显著抑制4T1乳腺癌细胞的体内生长(P<0.05),正常对照组、模型组及薏苡仁油给药组小鼠的血清代谢产物呈现不同的分布,通过正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),找到正常对照组和模型组、模型组与薏苡仁油给药组,分别比较组间变量权重(VIP)均>1、P<0.05的差异代谢物。与正常组比较,有16种代谢物在模型组显著变化,包括孕烷三醇、溶血磷脂[18∶3(9Z,12Z,15Z)]、溶血磷脂乙醇[0∶0/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]、溶血磷脂[22∶5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]、溶血磷脂[22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)]、丙酮酸、2,6-二氨基-4-羟基-5-N-甲基甲酰胺基嘧啶、N-乙酰基-L-苯丙氨酸、十七烷酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、乙酸视黄酯、6-羟基-5-甲氧基吲哚葡糖苷酸、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,其中代谢物N-乙酰基-L-苯丙氨酸水平提高,其他代谢物水平降低,并在薏苡仁油给药后这些差异代谢物均有显著回调趋势(P<0.05)。结论薏苡仁油可能通过调控三阴性乳腺癌小鼠体内的花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及丙酮酸代谢等途径发挥抗肿瘤作用。
关键词: 薏苡仁油 ；非靶向代谢组学 ；三阴性乳腺癌 ；花生四烯酸代谢
被引量
32
摘要： 世界卫生组织国际癌症研究机构最新发布的数据显示,乳腺癌现已取代肺癌成为全球发病率最高的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)表达均为阴性的乳腺癌,与其他分子分型的乳腺癌相比,TNBC具有易复发转移、整体预后差等特点。TNBC对内分泌治疗及抗HER2治疗不敏感,化疗是其主要的系统治疗手段。随着基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白组学、微生物组学的蓬勃发展及对TNBC分子分型的深入研究,针对不同靶点的靶向治疗药物和针对免疫检查点的免疫治疗药物的出现,如多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]抑制剂、人滋养细胞表面抗原2(trophoblast cell-surface antigen 2,TROP-2)抗体药物偶联物、pembrolizumab、atezolizumab、durvalumab等,已为TNBC的治疗提供新的手段,正在改变TNBC的临床实践。“精准治疗”“分类而治”是未来发展的方向。本文以TNBC的分子分型为基础,对其靶向治疗和免疫治疗研究的新进展进行归纳总结,以期为今后TNBC精准治疗策略提供参考。
关键词: 三阴性乳腺癌 ；分子分型 ；精准治疗 ；靶向治疗 ；免疫治疗
被引量
21
摘要： 目的:2020年女性乳腺癌(Breast cancer,BC)已经超过肺癌,成为全球癌症发病的主要原因之一,也是导致女性癌症死亡的主要原因。其中三阴性乳腺癌(Triplenegative breast cancer,TNBC),约占总体乳腺癌的15-20%,由于其不表达雌激素受体(Estrogen receptor,ER),孕激素受体(Progesterone receptor,PR)和人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)等特点,缺乏有效的治疗手段。目前,化疗仍是其主要的治疗手段,但获益有限。与其他亚型相比,TNBC具有更高的侵袭性,高转移性,高复发率和预后较差等特点。随着对TNBC在基因方面的分析取得重大进展,通过深入研究影响TNBC预后相关的生物标志物,对提高治疗的精准度具有重要的临床意义。为对影响TNBC预后的机制进行深入研究,从数据筛选出的对TNBC预后相关性最高的两方面入手。首先,从肿瘤独特的能量代谢方式出发,这种代谢表型的特点是优先依赖糖酵解(葡萄糖转化为丙酮酸然后产生乳酸的过程)以不依赖氧气的方式。也被称之为“Warburg效应”。相较于线粒体氧化磷酸化,肿瘤细胞中的糖酵解有几个关键性的优势,首先,糖酵解产生ATP的速率快,足以支撑肿瘤细胞的增长;其次,乳酸释放到细胞外空间中,也为正常的细胞提供酸性和敌对的微环境,进一步给肿瘤细胞的增长提供优势环境;另外,糖酵解中间体的累积也是肿瘤在生长和增殖过程中为了增加其重量而不可或缺的一部分。也有研究证明肿瘤细胞进行糖酵解的速率也和其对化疗的抗性存在的一定的联系。因此,糖酵解与肿瘤恶性表型及患者预后之间的相互作用关系十分明确,从糖酵解的角度出发,找到影响TNBC预后的生物标志物是具有一定价值的。另一方面,对TNBC预后影响较为重要的是免疫功能。从免疫的角度出发,目前,TNBC是最有可能从免疫治疗中获益的一种亚型。随着对细胞免疫学和肿瘤-宿主免疫相互作用的了解的增加产生了新的免疫治疗方法,包括阻断免疫检查点,诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)激活,过继性细胞转移(Adoptive cell transfer,ACT)-基础疗法和肿瘤微环境的调节(Tumor microenvironment,TME)以促进CTL活动等。然而,对于不同亚型的TNBC,免疫治疗的效果并不相同,找到能在免疫治疗中明显获益的患者,提高免疫治疗的精确度或者在一定程度上提高免疫治疗疗效,改善患者预后,具有非常重要的临床价值。研究方法:1、生物信息学分析:(1)从基因表达汇编数据库(Gene expression omnibus,GEO)获取三阴乳腺癌的转录组数据和相应的临床数据;通过癌与癌旁基因对比筛选在肿瘤中的差异表达基因,进行富集分析,筛选显著影响TNBC预后的相关性因素;(2)人类代谢组学数据库(Human metabolome database,HMBD)中获取糖酵解相关基因集;从免疫学数据库(The Immunology Database and Analysis Portal,Imm Port)获取免疫相关基因集;从GEO官网中下载TNBC数据集(GSE58812)后进行差异分析后取交集,获得TNBC中癌与癌旁差异表达的糖酵解相关基因和在TNBC中差异表达的免疫相关基因;(3)基于上述筛选得到的差异表达的糖酵解相关基因和免疫相关基因中,以P<0.05为标准,应用单因素Cox回归分析得到具有预后意义的糖酵解相关基因和免疫相关基因。为防止避免拟合,利用最小绝对收缩选择算子(Least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)回归分析进一步筛选预后相关糖酵解相关基因和免疫相关基因;(4)应用多因素Cox回归分析以计算风险评分,将患者分为高、低风险组绘制Kaplan-Meier生存曲线,并利用癌症基因组图谱数据集(The Cancer Genome Atlas,TCGA)进行验证;(5)GEPIA2在线网站验证EFNA3在癌与癌旁的表达高低;(6)利用CIBERSORT”R”包分析不同cluster间免疫细胞浸润差异;2、体外细胞实验:(1)利用q RT-PCR验证关键分子处理前后在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中的变化;(2)利用Western blotting验证关键分子处理前后在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中的变化;(3)利用Transwell实验在体外检测敲减和过表达EFNA3对TNBC迁移能力的影响;(4)利用MTS实验在体外检测敲减和过表达EFNA3后对TNBC增殖能力的影响;(5)利用乳酸测定和葡萄糖消耗试剂盒检测处理前后细胞培养液上清中的乳酸和葡萄糖水平的变化;(6)利用MTS实验检测在过表达EFNA3的基础上,敲减PFKFB3后对TNBC细胞的增殖能力的影响;(7)利用核浆分离试剂盒检测PFKFB3在核内和浆内蛋白水平的表达变化;(8)利用Western blotting检测在过表达EFNA3后,分别加入放线菌酮(Cycloheximide,CHX),氯喹(Chloroquine,CQ)和MG132后,PFKFB3在蛋白水平的表达变化;(9)利用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)证实PFKFB3相连的K48位点的泛素化(Ubiquitin)水平的变化和EFNA3对ALK酪氨酸磷酸化的修饰的调控;(10)利用免疫组化检测小鼠乳垫成瘤的肿瘤标本中EFNA3以及PFKFB3的表达;(11)用质谱分析证明EFNA3与间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)的结合并采用Hdock软件进行蛋白质-蛋白质间的分子对接进行验证;利用IP检测并证实EFNA3与ALK相结合;(12)利用Western blotting实验检测EFNA3对ALK下游通路的影响,以及在加入蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)抑制后,EFNA3对PFKFB3的调控的变化;(13)利用MTS实验在体外检测敲减和过表达HSPA6后对TNBC细胞增殖能力的影响以及与正常人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)在联合抗程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)的基础上进行共培养后对肿瘤细胞的杀伤作用;(14)检测过表达HSPA6的全基因在m RNA水平上的变化,进一步对差异进行通路与功能富集,并与在线数据集筛选出的差异基因的富集分析取交集,筛选出主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)II类分子HLADR类分子和促进丝裂原活化蛋白激酶通路(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路;(15)利用Western blotting和流式检测过表达HSPA6后对MHCII类分子HLADR和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化修饰的影响;(16)通过在线数据库(Cistrome Data Browser),推测p-CJUN作为转录因子促进HLA-DR表达的得分。3、体内模型构建:(1)建立裸鼠乳垫成瘤模型,体内实验验证敲减EFNA3对TNBC增殖能力的影响;(2)利用敲除Prkdc和IL2RG基因的高度免疫缺陷模型NYG小鼠皮下注射对照组和HSPA6过表达组的TNBC细胞,建立人源肿瘤细胞系异种移植(cell derived xenograft,CDX)模型后,通过尾静脉注射正常人外周血的PBMC建立人源化的免疫微环境,比较是否联合抗细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)治疗更有疗效。结果:1、糖酵解和免疫功能显著影响TNBC预后,通过在线数据集筛选TNBC癌与癌旁差异基因,进行功能富集后,结果显示糖酵解和免疫作为影响TNBC预后的关键性因素。2、糖酵解相关基因EFNA3可作为TNBC患者独立预后因素,通过在线数据筛选出TNBC差异基因并与糖酵解数据集取交集,进行单因素和多因素COX回归分析,证明差异基因可作为TNBC患者的独立预后因素,进一步通过在线数据验证EFNA3在TNBC组织中的表达均高于癌旁组织;3、免疫相关基因HSPA6可作为TNBC患者独立预后因素,通过上述筛选方式将TNBC差异表达基因与免疫数据集取交集,进行单因素和多因素COX回归分析,证明HSPA6可作为TNBC独立预后因素且与免疫具有一定的相关性。4、EFNA3高表达能促进TNBC的迁移、增殖和有氧糖酵解:在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中敲减EFAN3时,TNBC细胞的迁移、增殖能力减弱;而在MDA-MB-231和MDA-MB-468中过表达EFNA3时,则能上调TNBC细胞的迁移和增殖能力;且过表达EFNA3后,促进TNBC细胞的乳酸生成和葡萄糖消耗;5、体内实验验证EFNA3促进三阴性乳腺癌的增殖。通过小鼠乳垫成瘤实验验证,过表达EFNA3后,促进了体内TNBC细胞的增殖;6、EFNA3通过促进糖酵解关键酶PFKFB3的表达促进TNBC细胞的增殖和有氧糖酵解。过表达和敲减EFNA3后,糖酵解中的关键酶PFKFB3的蛋白表达水平与EFNA3存在同向的变化;且在过表达EFNA3的基础上,敲减PFKFB3后,MDA-MB-231的增殖能力较前减弱;EFNA3也是通过促进PFKFB3蛋白水平的变化,进一步影响了肿瘤细胞的有氧糖酵解;7、EFNA3促进PFKFB3核内的表达,促进增殖。过表达EFNA3后,核浆分离后检测PFKFB3核内,浆内的蛋白均有升高;构建PFKFB3入核过表达质粒后,MDA-MB-231细胞系中,细胞周期相关蛋白CDK的蛋白水平有所升高;8、EFNA3抑制PFKFB3蛋白酶体途径的降解。过表达或敲减EFNA3后,PFKFB3的m RNA水平没有变化,首先考虑可能对降解途径的影响,在过表达EFNA3的基础上,分别加入蛋白合成抑制剂CHX、自噬抑制剂CQ、蛋白酶体抑制剂MG132,并检测PFKFB3的蛋白水平的变化,只有加入MG132后,PFKFB3蛋白水平较前上升,且与PFKFB3相连的泛素位点K48有所减少;9、EFNA3与ALK结合。通过质谱分析,在线分子对接以及免疫共沉淀实验进一步验证了EFNA3与ALK的结合;10、EFNA3促进ALK下游AKT的磷酸化进而促进PFKFB3的表达。敲减EFNA3后,在MDA-MB-231细胞中,检测ALK下游通路的变化,结果显示磷酸化的AKT变化较为明显;在过表达EFNA3的基础上,加入AKT抑制剂后,PFKFB3的蛋白水平无明显变化。11、HSPA6在TNBC中高表达,但并不影响增殖。过表达和敲减HSPA6,在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中,细胞增殖能力均无明显变化;12、HSPA6促进PD-1单抗联合PBMC杀伤作用。过表达HSPA6后,将MDA-MB-23和MDA-MB-468细胞与激活后的PBMC在加减PD-1的条件下进行共培养,结果显示HSPA6促进了PD-1联合PBMC的杀伤作用;13、HSPA6促进MHC II类分子HLA-DR的表达。过表达HSPA6后,在MDA-MB-231细胞系中进行全转录组测序,检测出HSPA6促进MHC II类分子中的HLA-DR在蛋白水平的表达;14、HSPA6通过促进MAPK通路中JNK的磷酸化促进HLA-DR的表达。基于上述全转录组测序,进行通路富集,筛选相关通路MAPK通路并通过在线数据分析进行验证;过表达和敲减HSPA6后,在MDA-MB-231细胞系中检测MAPK通路相关蛋白的变化,
关键词: 三阴性乳腺癌 ；EFNA3 ；糖酵解 ；HSPA6 ；免疫治疗
摘要： 乳腺癌（BC）是女性多发、常见的恶性肿瘤,对女性身心健康及生活质量造成了严重威胁。乳腺癌常规治疗主要有手术切除,并行术后化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等。尽管目前的研究认为术后辅助治疗是预防复发和改善乳腺癌患者预后的重要手段,但并非所有的乳腺癌患者都可以从中获益。因此,寻找新的乳腺癌治疗靶点是目前亟需解决的焦点问题。 因多不饱和脂肪酸（PUFAs）代谢驱动的炎症是癌症的重要致病因素,但PUFAs代谢在乳腺癌进展中的作用尚不清楚。本研究首先利用基于PUFAs代谢的靶向代谢组学对乳腺癌患者血浆进行分析,发现亚油酸（LA）经细胞色素P450 2J2/2Cs（CYP2J2/2Cs）代谢生成的环氧十八烯酸（EpOMEs）在乳腺癌患者血浆中显著上升。对常见的乳腺癌细胞系和临床乳腺癌肿瘤切片组织分别进行免疫印迹（WB）和免疫组化（IHC）分析,发现与正常乳腺细胞系或乳腺非肿瘤组织相比,CYP2J2在MDA-MB-231、MCF-7和BT-474等肿瘤细胞系和HER2+（人类表皮生长因子受体-2阳性）,Luminal A,Luminal B和TNBC（三阴性乳腺癌）等肿瘤组织中均显著上调,揭示CYP2J2上调是血浆EpOMEs增加的关键,而CYP2J2/EpOMEs轴在乳腺癌发生过程中上调。进一步研究发现12（13）-和9（10）-EpOME具有较好的乳腺癌诊断价值。此外,我们还对MMTV-Py MT自发性乳腺癌小鼠进行研究,发现EpOMEs在乳腺癌小鼠血浆中也显著上升,且Cyp2j8（人CYP2J2的同源基因）在肿瘤组织中显著高表达,验证了临床样本的检测结果。 为揭示CYP2J2/EpOMEs对乳腺癌的作用,我们采用CYP450抑制剂Clotrimazole和Proadifen hydrochloride处理乳腺癌小鼠,发现小鼠的肿瘤重量、数目以及肿瘤体积均显著降低,这表明抑制CYP450能够减缓乳腺癌小鼠的肿瘤进展。为了进一步探究CYP2J2/EpOMEs轴促进乳腺癌进展的机制,我们通过CCK-8和Ed U实验发现在细胞中上调CYP2J2和添加EpOMEs均可增加乳腺癌细胞活力和增殖能力。细胞划痕和Transwell实验发现上调CYP2J2和添加EpOMEs均可促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。在细胞中敲低CYP2J2可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,回补EpOMEs可逆转敲低CYP2J2的抑制作用。根据临床乳腺癌组织IHC的结果提示,CYP2J2在TNBC中的表达量最高,因此我们选择TNBC细胞系MDA-MB-231来构建乳腺癌原位瘤模型和肺转移模型进行体内研究。体内实验发现过表达CYP2J2和添加EpOMEs均显著促进癌细胞成瘤和肺转移能力;而敲除CYP2J2则显著抑制癌细胞成瘤和肺转移能力,回补EpOMEs可逆转这一作用。 我们随后对公共数据库中转录组数据进行分析,发现CXCL9可能是CYP2J2/EpOME轴促进乳腺癌进展的关键环节。进一步研究发现:高表达和敲低CYP2J2可分别上调和下调CXCL9表达,体内和体外实验发现敲低CXCL9可显著减缓乳腺癌进展,而且,敲低CXCL9后可减缓EpOME对乳腺癌进展的促进作用。此外,通过蛋白质组学技术研究发现PLEC是EpOME下游靶蛋白,在细胞中能被EpOME上调,过表达和敲低CYP2J2可分别上调和下调PLEC。体外细胞实验发现敲低PLEC可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。乳腺癌原位瘤模型和肺转移模型研究表明敲低PLEC可抑制癌细胞成瘤和肺转移的能力,敲低PLEC可显著减缓EpOME促进乳腺癌进展的作用。WB检测发现,CXCL9的表达随着PLEC的敲低而下降,而PLEC的表达不随CXCL9的敲低而变化。此外,细胞热位移分析（CETSA）和免疫共沉淀（Co-IP）等实验发现12（13）-EpOME能够结合PLEC,且PLEC和CXCL9之间存在相互作用。这表明EpOME可能通过作用于PLEC来调控CXCL9在乳腺癌中发挥促癌作用。 综上,我们的研究表明,激活CYP2J2/EpOMEs轴可通过调控PLEC/CXCL9促进乳腺癌的生长和转移。本研究为乳腺癌诊断提供了潜在的生物标志物,也为乳腺癌防治提供了潜在的治疗靶点。
关键词: 乳腺癌 ；细胞色素P450 ；代谢组学 ；增殖 ；转移
摘要： 肿瘤细胞与其微环境的相互作用是肿瘤代谢重编程的一大重要特征,在影响肿瘤代谢的多种微环境中,缺氧是尤为重要的一个因素。缺氧是大部分实体瘤的共同特征,且在肿瘤代谢调控、侵袭、转移等各个方面均发挥着重要作用。对于缺氧对肿瘤代谢调控的研究,目前在基因组和转录组方面已有大量研究基础。缺氧会诱导缺氧诱导因子HIF的表达,HIF会调控多种代谢相关的基因和酶的表达进而影响肿瘤的代谢。而研究发现单纯地抑制HIF介导的通路,有时并不能抑制肿瘤的生长,即可能存在其他非HIF依赖的调控机制。已有研究发现了一些非HIF调控的基因及其调控机制,特别是某些显著变化的代谢物也会通过多种机制影响信号通路的传导进而参与缺氧应答。因而寻找致瘤代谢物为缺氧应答机制的研究提供了新的思路。代谢组学特别是同位素标记代谢组学,因其在代谢物及代谢通路分析方面的优势越来越被广泛地应用于肿瘤细胞代谢的研究中。目前,采用细胞代谢组学进行肿瘤缺氧的研究大多基于细胞及分子生物学的研究基础靶向地针对某一具体代谢物或者具体代谢路径进行下游验证研究,而对于整体代谢组的非靶向研究则相对较少。大量研究已表明代谢物也能参与信号通路及表观遗传的调控,进而诱发肿瘤的发生。因此对肿瘤细胞代谢组在特定条件下的组成和变化进行表征,有助于发现新的致瘤代谢物,为上游生物学研究提供新的方向。在此基础上利用稳定同位素标记的代谢组学方法,分析特定代谢物及相关通路的代谢变化,探索新的缺氧相关的代谢调控机制,为肿瘤发生发展的机制研究提供新的证据。本文主要以乳腺癌细胞为研究对象,采用基于GC/MS和LC/MS的非靶标代谢组学方法研究缺氧对细胞代谢的影响,筛选差异代谢物,发现显著变化的代谢通路,从而探究缺氧相关的代谢机制。进而建立基于GC/MS和LC/MS的同位素标记代谢组学方法,根据非靶标代谢组学的分析结果,靶向地分析中心碳代谢和谷氨酰胺回补路径相关的代谢变化,并与非靶标代谢组学结合更全面地分析缺氧对乳腺癌细胞代谢的影响。本研究工作主要包括四部分内容:第一部分,建立了基于GC/MS的细胞代谢组学方法,并以此分析了三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、ER+乳腺癌细胞MCF7和正常乳腺上皮细胞MCF10a在常氧和缺氧培养条件下细胞内代谢产物。结合多元统计分析,我们分别筛选出了33、26和17个组间差异代谢物,其中共同差异代谢物有6种,主要为氨基酸类。在缺氧条件下MDA-MB-231细胞有23种代谢物的相对含量显著降低,主要包括葡萄糖、PPP途径中间代谢产物、氨基酸（除丝氨酸外）及脂肪酸类;10种代谢物的相对含量显著增加,包括糖酵解和核苷酸中间代谢产物、丝氨酸、2-羟戊二酸、磷酰基乙醇胺和腐胺。MCF7细胞有21种代谢物的相对含量在缺氧的条件下显著降低,主要包括葡萄糖、TCA循环途径中间代谢产物、氨基酸及脂肪酸类;5种代谢物的相对含量在缺氧的条件下增加,包括糖酵解和核苷酸中间代谢产物及腐胺。MCF10a细胞则有17种差异代谢物的相对含量在低氧条件下显著降低,主要包括乳酸、柠檬酸、氨基酸及脂肪酸类。缺氧条件下,MDA-MB-231和MCF7细胞的糖酵解途径增强,TCA循环减弱;在MCF7和MCF10a细胞中均未筛选出显著变化的PPP途径的代谢产物;MCF10a对葡萄糖的利用减少,但与常氧组相比并没有显著差别。相比于MCF7和MCF10a,MDA-MB-231细胞在缺氧时其2-羟基戊二酸和丝氨酸的含量显著增高,PPP途径中间代谢产物的相对含量显著降低,推测可能与MDA-MB-231的高侵袭性和转移性相关。相比于正常乳腺上皮细胞MCF10a,乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7在缺氧时表现为典型的HIF1a调控相关的代谢变化。以上这些代谢变化的发生可能与缺氧环境适应及细胞生长维持的需要相关。第二部分,为进行全面的代谢组学分析,建立了基于LC/MS的细胞代谢组学方法。采用该方法我们初步探索了MDA-MB-231细胞在常氧和缺氧条件下细胞内代谢产物的变化。与基于GC/MS的研究结果相似,缺氧时糖酵解代谢产物6-磷酸葡萄糖显著增加,TCA循环代谢产物及某些氨基酸类显著降低。LC/MS检测到的代谢物多为极性和分子量稍大的代谢产物。除了糖酵解和TCA循环代谢产物及某些氨基酸类代谢物之外,我们还检测到核苷酸（如UMP,dCDP,XMP,GMP和ATP等）及核苷酸的衍生物（NAD+和NADP+）、辅酶A和脂类代谢物。因此基于LC/MS的代谢组学研究可以对GC/MS检测结果进行有效的验证和补充。第三部分,建立了基于GC/MS的同位素标记代谢组学方法,并根据基于GC/MS和LC/MS的非靶标研究结果,靶向地分析了MDA-MB-231和MCF7细胞在缺氧条件下葡萄糖代谢和谷氨酰胺回补反应相关的代谢通路的变化。通过在培养基中添加13C-葡萄糖来具体分析葡萄糖代谢变化,我们发现MDA-MB-231和MCF7细胞在缺氧条件下其TCA循环受到抑制。该结果与非靶标代谢组学研究结果一致。另外,我们发现在缺氧条件下,MDA-MB-231细胞内葡萄糖经PPP生成的丙酮酸增加,而在MCF7细胞中则未检测到这种显著变化。而在非靶标代谢组学研究部分,MDA-MB-231缺氧组的PPP中间代谢产物的相对含量是降低的,MCF7缺氧组则没有筛选到显著变化的PPP中间代谢产物。在缺氧条件下MDA-MB-231和MCF7 TCA循环中间代谢产物未标记率增加,表明非葡萄糖代谢通路增强。通过添加U-13C-谷氨酰胺作为底物,我们研究了缺氧条件下谷氨酰胺代谢路径的变化,发现MDA-MB-231和MCF7在缺氧条件下谷氨酰胺回补路径和还原性羧化作用增强。此外,苹果酸到丙酮酸的转化增强,表明苹果酸酶的表达可能发生了变化。基于GC/MS的同位素标记代谢组学研究结果结合非靶标代谢组学研究,充分证实了同位素标记代谢组学在具体代谢物及代谢通路分析方面的优势。第四部分,初步建立了基于LC/MS的同位素标记代谢组学方法。我们分别采用两种类型的质谱仪进行了数据采集,并对所得数据分别采用了不同的软件方法进行同位素标记代谢物的筛选。利用人工方法进行同位素标记代谢物的筛选,共得到同位素标记代谢物18个,包括糖酵解和TCA循环中间代谢产物及核苷酸类。根据α-酮戊二酸/谷氨酸/天冬氨酸/柠檬酸推测MDA-MB-231在缺氧条件下TCA循环和丙酮酸羧化作用减弱。采用软件进行同位素标记代谢物的自动筛选,正负离子模式分别筛选出53和36个同位素标记化合物,经统计分析得到12个差异代谢物,除了糖酵解中间代谢产物和核苷酸外,主要为脂类。对同位素标记代谢物的筛选,采用手动提取方式工作量太大且靶标性较强,易忽略潜在差异代谢物;采用自动筛选得到的代谢物多为脂类和核苷酸类,该类物质本身合成代谢反应较为复杂,因而其代谢通路的归属也较为困难。在以后的研究中可以有效地结合两种方式,以更加全面地筛选出同位素标记代谢物进行代谢通路的分析。
关键词: 肿瘤代谢 ；缺氧 ；代谢组学 ；同位素标记代谢组学 ；GC/MS ；LC/MS
被引量
2
摘要： 丰城鸡血藤（Callerya nitida var.hirsutissima Z.Wei）为一种传统中药。生长于江西、福建、湖南、广东、广西等地的山坡旷野或灌丛中。其性味微甘、苦、温,能行气活血,具有活血补血、舒经活络之功效,可有效解决气滞血瘀使气血畅通。为探究丰城鸡血藤及其活性化合物抗乳腺癌的药效作用机制,更好的服务于临床,本课题进行了以下研究。目的:通过网络药理学以及分子对接技术筛选出活性化合物可能作用的靶点,并结合体外药效作用机制研究,阐明其在体外分子层面的作用机制,并运用代谢组学策略探寻与丰城鸡血藤治疗乳腺癌相关的潜在生物标志物以及有关的代谢途径。方法:1、通过网络药理学筛选出丰城鸡血藤抗乳腺癌的潜在活性化合物以及作用靶点,建立丰城鸡血藤、潜在活性化合物、乳腺癌、靶点这四者的网络模型图,并预测其可能的作用机制以及结合位点,通过结合能的大小表征受体和配体的结合潜力。2、基于网络药理学以及分子对接结果进行体外药效作用机制研究。通过培养三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系,采用CCK-8实验进行吸光度的检测探究丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物,以及活性化合物木犀草素、白桦脂酸、异甘草素对细胞增殖的抑制作用。通过划痕实验计算空白区域的变化情况,观察各给药组抑制乳腺癌细胞的迁移情况。采用Annexin V-FITC/PI双染法进行流式细胞术检测两个不同萃取部位以及三个活性化合物诱导乳腺癌细胞凋亡情况的研究。利用PI染色和流式细胞术检测488nm处红色荧光下两个不同萃取部位以及三个活性化合物影响细胞周期变化情况。进行Western Blot技术检测药物作用后对乳腺癌细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白、VEGFA蛋白、周期蛋白、Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达情况。利用实时荧光定量pcr检测药效作用较好的部位及活性化合物对wnt/β-catenin通路相关基因的影响。3、采用液质联用技术对丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物、活性化合物白桦脂酸给药后的细胞内代谢物进行数据采集,得到精确分子量、裂解规律以及二级质谱数据进行多元统计分析,鉴定得到的差异代谢物结合富集分析结果明确了具体的代谢途径。结果:1、收集到丰城鸡血藤38个活性成分,相关潜在靶点388个,TNBC靶点3919个,丰城鸡血藤治疗TNBC靶点277个。主要作用于PIK3R1、PIK3CA、MAPK1、AKT1、SRC等多个靶标,主要涉及PI3K/AKT信号通路、细胞周期相关通路、癌症中的中心碳代谢（CCM）通路、癌症中的Micro RNA相关通路等与治疗TNBC有关的通路。2、各给药组对乳腺癌细胞增殖均有不同的程度的抑制作用,其中丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物以及活性化合物白桦脂酸对细胞增殖抑制作用最为显著。在丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物组作用48 h时,其IC50为91.41μg·ml-1。活性化合物白桦脂酸组作用48 h时,其IC50降低为25.95μmol·L-1。丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物、白桦脂酸可通过抑制PI3K/AKT信号通路激活,进而抑制AKT的表达从而达到抑制乳腺癌细胞生长的目的。丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、木犀草素、白桦脂酸、异甘草素可通过抑制细胞周期蛋白表达来达到阻滞细胞分裂的目的,进而抑制乳腺癌细胞增殖。与此同时木犀草素、白桦脂酸高浓度组可通过下调VEGFA表达抑制细胞侵袭,从而达到抗乳腺癌细胞增殖的目的。而在wnt/β-catenin通路研究中我们发现丰城鸡血藤三氯甲烷萃取物、木犀草素、白桦脂酸可使β-catenin蛋白表达显著降低。也发现各给药组均能显著下调Cyclin D1的表达。丰城鸡血藤三氯甲烷萃取物以及乙酸乙酯萃取物、木犀草素、白桦脂酸能够显著抑制GSK-3β蛋白的表达,并且白桦脂酸能够最为显著的抑制LRP5蛋白表达。乙酸乙酯萃取物组以及白桦脂酸组处理后的细胞APC蛋白表达上调最为显著。丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、活性化合物木犀草素高剂量组能够最为显著的诱导细胞的凋亡,且其他组也能够不同程度的诱导细胞凋亡。丰城鸡血藤乙酸乙酯部位萃取物组和异甘草素组能够最为显著的阻滞细胞处于G1期,除三氯甲烷部位萃取物组其他组也均能不同程度的阻滞细胞处于G1期或S期。3、两给药组和空白对照组细胞的代谢组数据能够明显分离,佐证了丰城鸡血藤乙酸乙酯萃取物以及单体化合物白桦脂酸的抗乳腺癌的干预作用。从差异代谢物的量化指标来看,给药后的部分生物标记物发生显著变化。共鉴定出42种差异代谢物分布于多个代谢通路中。其中有24种代谢物在萃取物组中表现为上调,17种代谢物在萃取物组中为下调。有21种代谢物在单体组中表现为上调,21种代谢物在为下调。富集分析结果发现其主要涉及到精氨酸和脯氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、氨酰-t RNA生物合成途径,差异代谢物主要与各类氨基酸和多种脂类等物质的代谢有关。结论:在MDA-MB-231细胞中,丰城鸡血藤三氯甲烷部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物以及木犀草素、白桦脂酸、异甘草素均能不同程度地抑制其增殖。除三氯甲烷部位萃取物以外其余各组也可阻滞细胞于G1期或S期以及各给药组均能够不同程度地诱导细胞凋亡。根据研究结果推断白桦脂酸表现出良好的抗乳腺癌活性可能的由于多通路多靶点的共同作用。实验发现白桦脂酸显著抑制PI3K/AKT通路的激活,以及能够降低影响细胞迁移的血管内皮生长因子VEGFA的表达,且降低能够促进细胞增殖的周期蛋白表达。与此同时在Wnt/β-catentin通路中还能有效抑制β-catentin的表达且促进APC的表达,抑制其在胞质中累计向细胞核转移,影响β-catentin与转录因子的结合,从而下调Cyclin D1表达进而抑制细胞的增殖、分化、成熟。而乙酸乙酯部位萃取物的作用机制可能与其能够抑制细胞周期相关蛋白CDK1、CDK4以及Cyclin D1蛋白有关。结合细胞周期实验结果发现,乙酸乙酯部位萃取物对于细胞周期的阻滞有较为明显的效果或与其能够较好的下调细胞周期相关蛋白有关。根据观察差异代谢物的变化情况发现乙酸乙酯部位萃取物与白桦脂酸抗乳腺癌作用可能通过引起氨基酸合成代谢、以及影响其能量来源从而发挥抑制乳腺癌细胞的作用。
关键词: 丰城鸡血藤 ；乳腺癌 ；白桦脂酸 ；UPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS ；MDA-MB-231
摘要： 目的:代谢重编程被认为是肿瘤的一种基本特征,越来越多的证据显示多种肿瘤依赖谷氨酰胺代谢,为快速增殖的肿瘤细胞提供代谢能量,为核苷酸、氨基酸、脂肪酸合成等物质代谢提供碳源和氮源,为维持细胞活性氧(ROS)平衡稳定提供还原性产物。小分子抑制剂CB-839作用于谷氨酰胺代谢的关键酶——肾型谷氨酰胺酶(GLS1),从而发挥抗肿瘤作用。已有多篇文献报道谷氨酰胺酶抑制剂对多种实体瘤有抑制作用。本文旨在探讨GLS1改变和乳腺癌分子病理类型与预后的相关性,研究谷氨酰胺代谢异常对三阴乳腺癌生物学行为的影响及其机制,为探寻三阴乳腺癌新的治疗靶点进行有益的探索。方法:(1)本研究采用组织芯片免疫组化染色的方法检测221例乳腺癌组织GLS1的表达情况,探索GLS1与各临床特征的关系,分析GLS1的表达与患者临床预后的关系。(2)在体外实验中利用Western Blot和Ch IP-seq研究MYC与GLS1的相关性和调控机制。(3)剥夺实验研究乳腺癌细胞系对谷氨酰胺代谢的依赖性。(4)细胞毒性实验研究GLS1抑制剂CB-839对乳腺癌细胞生长的影响。(5)应用基于LC-MS的同位素标记代谢组学技术,研究CB-839对裸鼠皮下移植瘤代谢的影响。(6)细胞毒实验和克隆形成实验评估CB-839与卡铂联合用药的相互作用。(7)DNA纤维染色检测CB-839与卡铂联合用药对DNA复制的影响。(8)通过流式细胞术检测CB-839与卡铂联合用药诱导的细胞周期阻滞。(9)构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察CB-839与卡铂联合用药的协同抗肿瘤作用,在瘤体组织内进一步验证其分子作用。结果:(1)本实验发现三阴乳腺癌组织中GLS1较其他分子病理类型乳腺癌组织高表达。GLS1高表达的患者总生存期显著短于GLS1低表达患者。(2)体外实验证实GLS1在三阴乳腺癌细胞系中高表达,并且与MYC的表达量呈正相关。MYC蛋白可直接结合到GLS1的启动子区域,调控GLS1的表达。(3)体外剥夺实验证明三阴乳腺癌高度依赖谷氨酰胺代谢,使用CB-839可抑制肿瘤生长。(4)体内实验证实短期口服给药CB-839可抑制谷氨酰胺转化为谷氨酸,减少进入TCA循环的α-酮戊二酸和各下级代谢产物,同时抑制羧化还原反应干扰脂肪酸合成。(5)谷氨酰胺酶抑制剂与卡铂联用对GLS1高表达细胞系有协同抗肿瘤作用。(6)发现CB-839与卡铂联合用药通过减少还原性谷胱甘肽(GSH),促进氧化应激,从而增加DNA损伤,抑制DNA复制,引发G1期阻滞等机制产生抗肿瘤效应。(7)体内实验进一步证实CB-839和卡铂联合用药促进DNA损伤,抑制细胞增殖和瘤体生长,延长小鼠生存时间。结论:GLS1表达与乳腺癌患者分子病理类型和临床不良预后相关。三阴乳腺癌中GLS1表达量显著高于其他乳腺癌类型,提示三阴乳腺癌高度依赖谷氨酰胺代谢。使用GLS1抑制剂CB-839可降低以谷氨酰胺为底物的TCA循环和还原羧化代谢,减少各级代谢产物的合成,显著抑制三阴乳腺癌的细胞生长。CB-839联合卡铂通过促进细胞氧化应激,增强DNA损伤,抑制DNA复制,引发细胞周期阻滞等机制协同抑制肿瘤。本研究揭示了三阴性乳腺癌新的潜在治疗靶点,并为肿瘤代谢治疗与传统化疗的联合提供了新的思路。
关键词: 谷氨酰胺代谢 ；谷氨酰胺酶 ；三阴乳腺癌
被引量
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摘要： 乳腺癌（BreastCancer,BC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，成为女性死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌（TNBC）是最难治疗的BC亚型，其侵袭性高、转移率高、易复发，对患者的生存构成了极大的威胁。放疗和化疗依旧是TNBC最佳的治疗方案，但由于其预后较差，很可能会出现化疗耐受的情况，进而增加肿瘤的复发风险。因此，探索关于TNBC的分子机制，寻找关键靶点，开发相应的靶向药物颇为重要。 蛇床子素(Osthole,OST)是一种简单的香豆素衍生物，已被证明其可通过抑制癌细胞的增殖，阻滞细胞周期和介导凋亡等多种机制，对多种类型的肿瘤发挥抗肿瘤活性。然而，OST对TNBC的作用机制尚未清楚。 目的： 本研究主要目的是以小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞和4T1荷瘤小鼠为研究对象，考察OST对4T1型TNBC的抑制作用及从代谢组学的角度探讨其作用机制。 方法： 1.OST对4T1细胞生长的影响 本章节的研究对象是4T1细胞，首先，MTT法检测OST对4T1细胞活力的影响，筛选出适宜的给药浓度和时间;然后，采用流式细胞术检测OST对4T1细胞周期和凋亡的影响。 2.OST对4T1荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 为了进一步验证OST对TNBC的抑制作用，本章用4T1细胞皮下接种构建三阴性乳腺癌4T1荷瘤小鼠模型，将小鼠分组：正常对照组（Control组），模型组（Model组）、环磷酰胺组（CTX组，阳性对照组）、蛇床子素低剂量组（OST-L组）、蛇床子素高剂量组（OST-H组）。CTX组小鼠，通过腹腔注射的方式每隔一天给予30mg/kg的CTX。每天分别给予OST-L组50mg/kg和OST-H组200mg/kg的OST，以灌胃的方式给药14天;Control组和Model组灌胃等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。每日对肿瘤的生长状况进行监控，测量大小，画出各组肿瘤的生长曲线。给药完毕后，采集小鼠血样，取肿瘤组织称重，计算抑瘤率。 3.OST对4T1细胞代谢的影响 本章节主要研究OST对4T1细胞代谢的影响，方法是：基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学结合在线数据库分析OST对4T1细胞代谢物的影响，利用多元性统计分析差异代谢物，并筛选主要的代谢通路。 4.OST对4T1荷瘤小鼠代谢的影响 本章以4T1荷瘤小鼠为研究对象，研究OST对4T1荷瘤小鼠代谢的影响，方法是：首先采用代谢组学分析OST对各组小鼠血清代谢物的影响，再利用多元性统计分析血清中的差异代谢物，筛选出关键的代谢通路。 5.整合分析OST抑制TNBC的作用机制 本章节主要对OST干预4T1细胞和4T1荷瘤小鼠引起的潜在代谢物差异以及代谢通路变化进行比较和分析，最后关注于与脂质代谢相关的代谢通路。分别检测4T1细胞和4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中mTOR、SREBP1和FASN等蛋白表达水平。期望找到OST抑制TNBC的相关靶点，揭示OST抑制TNBC发生发展的相关机制。 结果： 1.OST抑制4T1细胞的生长 OST可剂量依赖性抑制4T1细胞的增殖，其抑制效应随时间的延长而更强。此外，OST可以显著诱导4T1细胞周期在S期阻滞，并以剂量依赖的方式诱导4T1细胞凋亡。 2.OST抑制4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长 在抑制肿瘤生长方面，与Model组相比，CTX组、OST-L组和OST-H组的肿瘤大小和肿瘤重量均明显减少，其中，CTX组显著性减少，OST-H组次之;CTX组、OST-L组和OST-H组的抑瘤率分别是78.95%，48.23%和67.02%。 3.OST抑制4T1细胞生长的可能机制 OST可引起4T1细胞的代谢絮乱，筛选和鉴定出32个显著差异潜在标志代谢物，主要涉及了磷脂生物合成、甲基组氨酸代谢、超长链脂肪酸的β氧化和嘧啶代谢等24条代谢通路。 4.OST抑制4T1荷瘤小鼠的可能机制 OST可引起4T1荷瘤小鼠血清的代谢絮乱，筛选和鉴定出90个显著差异潜在标志代谢物，主要涉及了组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、WarburgEffect、肉碱合成、脂肪酸代谢、甘油脂代谢、糖酵解、嘌呤代谢、短链饱和脂肪酸的线粒体β-氧化和长链饱和脂肪酸的线粒体β-氧化等72条代谢通路。 5.OST抑制TNBC的作用机制与mTOR/SREBP1/FASN信号通路有关 整合分析细胞和小鼠血清的代谢物和代谢通路，共筛出了磷脂生物合成、超长链脂肪酸的β氧化、α-亚麻酸和亚油酸代谢、支链脂肪酸的氧化、氨基糖代谢、天冬氨酸代谢和组氨酸代谢等19条在内的共同代谢通路。发现L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、PC和PE系代谢物等核心代谢产物涉及了氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢和核苷酸代谢等通路。脂质代谢通路验证结果表明，OST以浓度依赖性的方式分别下调4T1细胞和4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中mTOR、SREBP1和FASN等蛋白表达。 结论： 1.OST以剂量和时间双重依赖性抑制4T1细胞的增殖，显著地将4T1细胞阻滞在S期，并诱导4T1细胞凋亡。 2.体内实验结果表明，OST可以显著性抑制三阴性乳腺癌4T1荷瘤小鼠肿瘤生长。 3.OST对4T1细胞的抑制作用，所涉及的关键代谢通路有磷脂生物合成、甲基组氨酸代谢、嘧啶代谢和超长链脂肪酸的β氧化等。 4.OST对4T1荷瘤小鼠的抑制作用，主要涉及了组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、WarburgEffect、肉碱合成、脂肪酸代谢、甘油脂代谢、糖酵解、嘌呤代谢、短链饱和脂肪酸的线粒体β-氧化、长链饱和脂肪酸的线粒体β-氧化等代谢途径。 5.比较细胞与小鼠血清样本，得到了共同代谢通路，所包含显著代谢物有L-组氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、LysoPE(16:0/0:0)、LysoPC(16:0/0:0)、乳清酸、尿苷5''-二磷酸、左旋肉碱和尿酸等，可密切地影响细胞的增殖抑制或凋亡。此外，OST对TNBC的抑制作用机制可能与抑制mTOR/SREBP1/FASN信号通路有关。 综上所述，本研究探讨了OST基于体内外对4T1细胞和4T1荷瘤小鼠的药效和代谢的影响，筛选显著性差异代谢物和相关代谢通路，并用mTOR/SREBP1/FASN通路进行了脂质代谢的验证;研究结果揭示了OST可能通过mTOR/SREBP1/FASN信号通路调节代谢以抑制TNBC的肿瘤生长。
关键词: 乳腺癌 ；三阴性乳腺癌 ；4T1细胞 ；代谢组学
被引量
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摘要： 研究目的
乳腺癌新发病例数已超越肺癌,成为全球第一大癌症。三阴性乳腺癌是乳腺癌中最具有侵袭性的亚型,是临床治疗中的一个重要挑战。本研究中发现富含亮氨酸的五肽重复序列基因(Leucine Rich Pentatricopeptide Repeat Containing,LRPPRC)通过N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰途径参与三阴性乳腺癌代谢重编程的调控。因此,本研究旨在将m6A修饰与三阴性乳腺癌代谢重编程联系起来,阐明LRPPRC通过调控乳酸脱氢酶A(Lactate Dehydrogenase A,LDHA)/谷氨酸丙酮酸转氨酶2(Glutamate Pyruvate Transaminase 2,GPT2)的表达参与三阴性乳腺癌代谢重编程的具体分子机制,依此为三阴性乳腺癌的靶向治疗提供新的方向及理论基础。
研究方法
通过生物信息学数据库筛选出差异表达的LRPPRC作为研究对象。收集本院三阴性乳腺癌患者手术切除的标本,使用Western blot、q RT-PCR和免疫组织化学实验检测LRPPRC的表达;使用比色法m6A RNA甲基化定量检测试剂盒和Dot blot实验检测三阴性乳腺癌中的m6A修饰水平;通过Co-IP实验及细胞免疫荧光实验,检测LRPPRC与m6A修饰位点结合情况。
在三阴性乳腺癌细胞中分别通过CCK-8细胞计数实验、EdU细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验检测干扰LRPPRC表达后细胞的增殖能力。通过质谱方法,对转染包含LRPPRC干扰RNA质粒慢病毒的细胞系MDA-MB-231进行代谢组学检测分析。分别使用萤火虫荧光素酶ATP检测试剂盒、基于乳酸分泌检测的比色法细胞糖酵解检测试剂盒、基于2-NBDG探针的细胞葡萄糖摄取检测试剂盒检测干扰LRPPRC表达后细胞的总ATP水平、糖酵解水平以及摄取葡萄糖的水平。
通过测序技术寻找LRPPRC通过m6A修饰途径直接调控的下游靶基因。使用分子生物学实验验证LRPPRC直接作用的靶点m RNA—LDHA和GPT2;进一步地利用RNA pull-down技术探究LDAH/GPT2 m RNA m6A修饰位点与LRPPRC蛋白的结合情况;检测干扰LRPPRC后细胞LDAH/GPT2 m RNA半衰期;利用比色法乳酸脱氢酶活性检测试剂盒检测转染后细胞乳酸脱氢酶活性水平。分别通过CCK-8细胞计数实验、Ed U细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验和萤火虫荧光素酶ATP检测试剂盒方法进行拯救实验,进一步地确认LRPPRC通过靶向LDHA发挥生物学效应。
分别构建稳定干扰LRPPRC表达的裸鼠异种移植瘤模型,并分别给予小分子抑制剂FX-11、BPTES,观察LRPPRC通过调控LDHA及GPT2在体内对肿瘤生长的影响及机制研究。
研究结果
LRPPRC及m6A修饰水平在三阴性乳腺癌中高表达,LRPPRC在细胞质聚集并与m6A修饰位点存在结合。体外细胞实验表明低表达LRPPRC降低细胞糖酵解水平,抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖;过表达LRPPRC增强细胞糖酵解水平,促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。此外,低表达LRPPRC降低三阴性乳腺癌细胞糖酵解水平,可通过增强谷氨酰胺代谢进行能量回补。在分子机制方面,LRPPRC通过m6A修饰途径直接靶向调控LDHA和GPT2的表达。低表达LRPPRC可降低LDHA m RNA的稳定性,下调LDHA的m RNA和蛋白表达水平,同时增强GPT2 m RNA的稳定性,上调GPT2的m RNA和蛋白表达水平。拯救实验表明LRPPRC可通过调控LDHA的表达促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。最后,在LRPPRC过表达/低表达的裸鼠异种移植瘤模型中验证了其在体内对肿瘤生长的促进/抑制作用。
研究结论
本研究表明,三阴性乳腺癌中显著上调的LRPPRC可通过m6A修饰途径,靶向增强LDHA m RNA的稳定性,增强肿瘤细胞糖酵解,促进细胞增殖。低表达LRPPRC的情况下,LDHA表达降低,糖酵解水平下降,肿瘤细胞生长受到抑制,但与此同时LRPPRC靶向降解GPT2 m RNA的能力降低,GPT2表达升高,肿瘤细胞可通过增强谷氨酰胺代谢进行能量回补。因此,在靶向抑制LRPPRC表达的同时给予谷氨酰胺酶抑制剂可显著抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡,达到合成致死的效应。综上所述,本研究揭示了一种新的m6A修饰“阅读者”—LRPPRC介导的LDHA/GPT2信号轴,在三阴性乳腺癌代谢重编程中通过m6A修饰途径发挥重要的生物学效应。这不仅有助于进一步地了解m6A修饰在三阴性乳腺癌中发挥的重要生物学功能,也阐明了m6A修饰参与肿瘤细胞代谢重编程的角色,更是为LRPPRC作为三阴性乳腺癌潜在的治疗靶点提供了可靠的理论依据。
关键词: 三阴性乳腺癌 ；6-甲基腺嘌呤 ；代谢重编程 ；细胞增殖 ；富含亮氨酸的五肽重复序列 ；乳酸脱氢酶A ；谷氨酸丙酮酸转氨酶2 ；合成致死
摘要： 研究背景 皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)是临床上最常见的皮肤恶性肿瘤之一,占所有皮肤癌死亡人数的20%。部分晚期cSCC患者无法通过根治性手术得到有效治疗,只得接受全身综合性治疗。指南推荐的基于顺铂(Cisplatin,Cis Pt)联合放疗的综合治疗方案虽具有较高的治疗反应率,但因其较大的毒副作用在临床上应用受限。 西妥昔单抗(Cetuximab,Cet)作为一款安全性好、抗肿瘤作用强的靶向治疗药物,已被应用于高表达表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的结直肠癌及头颈部鳞状细胞癌的综合治疗中。近期研究表明,大部分cSCC亦高表达EGFR,西妥昔单抗联合顺铂的治疗方案有望应用于cSCC的综合治疗中。 抗体-药物偶联物(Antibody-drug Conjugate,ADC)是一种将抗体与细胞毒性药物(亦称为有效载荷)经化学接头偶联的方式而构建出的新型抗肿瘤药物。ADC药物中的抗体组成部分可精准识别肿瘤靶点,减少了对非肿瘤组织的影响,极大地提高了药物疗效并减少了毒副作用,可以同时发挥抗体的高度特异性与细胞毒性药物对肿瘤细胞的高效杀伤性,在肿瘤的综合治疗中备受关注。本研究旨在:(1)利用西妥昔单抗作为ADC药物中的抗体组成部分,选用基于顺铂化学修饰后的四价铂前药作为有效载荷,构建一款新型ADC药物;(2)从体外实验、体内实验以及代谢组学分析等多角度评估该新型ADC药物在cSCC中的靶向能力、安全性、有效性,探究其是否有望成为cSCC综合治疗的新选择。 方法 1.皮肤鳞状细胞癌细胞及动物模型中EGFR表达情况的测定。 (1)应用Western blot检测A-431细胞中EGFR表达(2)应用A-431细胞构建皮肤鳞状细胞癌原位小鼠模型,通过免疫荧光检测小鼠肿瘤组织及癌旁皮肤、肌肉组织中的EGFR表达情况。 2.新型抗体-药物偶联物的制备及表征。 (1)通过化学合成的方式制备四价铂前药C8Pt(IV)(2)应用核磁共振波谱仪对C8Pt(IV)进行核磁共振谱分析;应用超分辨率液质联用仪对C8Pt(IV)进行质谱分析。结合磁共振谱及质谱检测结果,验证合成产物化学结构。(3)通过化学合成的方式将西妥昔单抗及C8Pt(IV)进行偶联,制备新型ADC药物CetC8Pt(IV)。(4)通过ESI质谱分析确定抗体与药物的具体结合形式。(5)根据蛋白定量及铂定量结果,计算得出药物抗体比及药物浓度。(6)在体外模拟肿瘤内部高还原环境,通过药物释放实验测定Cet-C8Pt(IV)解离释放能力。 3.新型抗体-药物偶联物体外抗肿瘤能力评估。 (1)通过竞争抑制实验测定Cet-C8Pt(IV)对A-431细胞的靶向能力。(2)用荧光染料Cy5.5-NHS标记Cet-C8Pt(IV),通过激光共聚焦扫描显微镜对A-431细胞摄取Cet-C8Pt(IV)进行定性分析。(3)用荧光染料Cy5.5-NHS标记CetC8Pt(IV),通过流式细胞术对A-431细胞摄取Cet-C8Pt(IV)进行定量分析。(4)应用MTT法测定Cet-C8Pt(IV)的细胞毒性作用。(5)通过流式细胞仪检测CetC8Pt(IV)诱导A-431细胞凋亡能力。(6)通过克隆形成实验检测Cet-C8Pt(IV)对A-431细胞增殖能力的影响。(7)应用代谢组学的方法分析Cet-C8Pt(IV)的抗肿瘤作用途径。(8)应用激光共聚焦扫描显微镜观测药物处理后A-431细胞的DNA损伤情况,以验证代谢组学分析结果。 4.新型抗体-药物偶联物体内抗肿瘤能力评估。 (1)通过监测小鼠生活状态、体重及血液学指标探究Cet-C8Pt(IV)的药物安全性。(2)构建皮肤鳞状细胞癌原位小鼠模型及三阴性乳腺癌小鼠模型,通过小动物活体成像技术探究Cet-C8Pt(IV)的肿瘤靶向能力。(3)设计Cet-C8Pt(IV)的小鼠体内治疗方案,记录不同治疗处理后小鼠肿瘤体积变化。通过绘制抑瘤曲线、肿瘤组织及器官内铂含量测定、H&E染色、TUNEL染色等方式评估CetC8Pt(IV)的抗肿瘤能力。 结果 1.A-431细胞及皮肤鳞状细胞癌原位小鼠模型中的EGFR呈高表达状态,具备成为西妥昔单抗治疗靶点的选择条件。 2.我们按设计好的合成路径制备出了四价铂前药C8Pt(IV)及新型ADC药物Cet-C8Pt(IV)。表征结果表明,C8Pt(IV)及Cet-C8Pt(IV)化学结构正确,药物抗体比符合ADC药物特性。在模拟肿瘤的高还原环境下可高效释放出细胞毒性药物,对肿瘤细胞造成杀伤。 3.Cet-C8Pt(IV)可精准靶向至A-431细胞并被其高效内化摄取。CetC8Pt(IV)对细胞杀伤作用及诱导凋亡能力显著优于传统铂药顺铂及顺铂联合西妥昔单抗的临床经典治疗方案。代谢组学及KEGG富集分析表明,CetC8Pt(IV)可能通过影响肿瘤细胞维生素B6代谢途径而加剧肿瘤细胞凋亡及DNA损伤效应。这一作用机制区别于传统二价铂药,大大减少了肿瘤细胞的耐药性。 4.Cet-C8Pt(IV)具备良好的安全性,并且可靶向至EGFR高表达的人皮肤鳞状细胞癌原位小鼠模型肿瘤组织。经过肿瘤细胞对药物的内化摄取,CetC8Pt(IV)可在肿瘤部位快速蓄积和长效滞留,进而高效发挥其抗肿瘤作用。 结论 本研究成功制备了一种新型抗体-药物偶联物,其具备良好的肿瘤靶向能力,可以将细胞毒性有效载荷精准递送至肿瘤细胞内,增敏细胞凋亡能力并加剧肿瘤细胞的DNA损伤效应。该抗体-药物偶联物具有低毒副作用、高肿瘤杀伤能力的特性,有希望成为未来cSCC综合治疗的研究热点。
关键词: 皮肤鳞状细胞癌 ；抗体-药物偶联物 ；细胞凋亡 ；DNA损伤 ；肿瘤靶向治疗
摘要： 乳腺癌已替代肺癌成为全球第一大恶性肿瘤。其中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)作为乳腺癌所有亚型中最凶险性的一种亚型,其预防和治疗备受海内外科研工作者和医学者的关注。人参皂苷CK(ginsenoside CK,CK)是原有人参皂苷的去糖基化产物,具有多重功效。对于代谢活跃的癌细胞,有关人参皂苷CK在代谢方面抗乳腺癌的作用及机制报道很少。为了深入阐述CK的抗乳腺癌作用,本研究使用制备好的CK,系统的探索了其抑制TNBC的潜在机制。实验结果如下:(1)利用β-糖苷酶转化人参皂苷Rb1制备人参皂苷CK,通过制备色谱柱对转化后的产物进行分离纯化,使用核磁共振鉴定其结构。结果显示:转化48 h后,Rb1几乎全部转化为CK,经分离纯化后其结构鉴定同CK标准品结构,高效液相色谱分析得到的人参皂苷CK纯度为98%。(2)通过MTT实验验证不同乳腺癌细胞生长对谷氨酰胺(glutamine,Gln)的成瘾性并探究CK体外抗乳腺癌的增殖作用是否和谷氨酰胺成瘾性相关。结果表明:与低依赖谷氨酰胺生长的乳腺癌细胞相比,谷氨酰胺高依赖性的三阴性乳腺癌细胞对人参皂苷CK具有更强的敏感性。(3)建立SUM159乳腺癌异种移植模型,探究人参皂苷CK在体内的抗肿瘤效果。建模成功后腹腔给药4周,通过肿瘤体积、重量、H&E和TUNEL染色等考察CK对肿瘤组织的抑制作用。同时,通过检测肝肾、免疫功能指标和脏器H&E染色分析CK对裸鼠机体是否存在副作用。结果显示:人参皂苷CK可以显著抑制SUM159肿瘤生长且对机体无明显副作用。(4)通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放、抑制剂共培养、Hoechst 33342染色、蛋白免疫印迹实验,进一步观察CK对TNBC细胞的抑制作用并研究其引起细胞死亡的方式。结果表明:人参皂苷CK在体内外通过诱导TNBC细胞凋亡来抑制其增殖。(5)通过代谢组学、蛋白免疫印迹、q RT-PCR、ATP生成、谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、免疫组化、免疫荧光、沉默谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)以及谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)活性实验,探究CK对TNBC细胞中谷氨酰胺代谢通路的影响及其诱导细胞凋亡的作用机制。结果显示:人参皂苷CK通过抑制参与谷氨酰胺代谢相关酶的表达、降低谷氨酰胺代谢相关氨基酸利用度来抑制三阴性乳腺癌细胞的谷氨酰胺代谢,使ATP生成和GSH合成减少并刺激ROS积累;补充谷氨酰胺减弱了CK对TNBC细胞的抑制作用并恢复了GLS1表达,GLS1-SiRNA转染增加了CK诱导的细胞死亡、降低GLS酶活性和增加细胞凋亡,表明人参皂苷CK主要通过降低GLS1的表达来抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。综上所述,本研究阐明了CK通过降低GLS1的表达靶向三阴性乳腺癌谷氨酰胺代谢并诱导细胞凋亡,从而抑制TNBC细胞的增殖,此研究为CK作为谷氨酰胺代谢抑制剂在三阴性乳腺癌的应用提供了强有力的理论依据。
关键词: 人参皂苷CK ；三阴性乳腺癌 ；谷氨酰胺代谢 ；GLS1 ；凋亡
被引量
4
摘要： 目的:1、阐明三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）临床样本代谢组、蛋白组特征,筛选与TNBC发生相关的差异性靶点;2、明确谷胱甘肽过氧化物7（glutathione peroxidase 7,GPX7）在TNBC组织中表达情况及与预后相关性;3、探讨GPX7在乳腺癌细胞系中表达情况及是否抑制TNBC细胞生长;4、研究GPX7对TNBC紫杉醇耐药影响;5、探究GPX7对TNBC细胞铁死亡的影响及机制。
方法:1、从济宁市第一人民医院乳腺癌数据库中选取TNBC女性患者癌组织与癌旁组织共11对,对其通过代谢组、蛋白组及代谢组联合蛋白组进行鉴定数量分析、表达差异分析、基因本体（gene ontology,GO）功能分析、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析等生物信息学分析,筛选癌组织与癌旁组织中显著性差异表达蛋白及相关通路。2、使用仙桃学术、the cancer genome atlas（TCGA）数据库、gene expression profiling interactive analysis（GEPIA）以及TNBC组织芯片验证GPX7蛋白在TNBC组织中表达、预后相关性;3、利用western blot（WB）,quantitative real time polymerase chain reaction（q RT-PCR）检测GPX7在人类乳腺癌细胞系中表达情况,并构建GPX7慢病毒敲低细胞模型通过克隆形成实验、流式细胞仪测凋亡观察GPX7敲低对细胞增殖、凋亡的影响;4、运用CCK-8检测法观察GPX7敲低后不同浓度的紫杉醇对细胞活力的影响;5、通过WB实验、q RT-PCR检测GPX7敲低后相关铁死亡蛋白如酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-co A synthase Long chain family member 4,ACSL4）、谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达情况,使用铁死亡激活剂erastin进行铁死亡诱导,运用免疫荧光实验和流式细胞分析等分别观测GPX7敲低与药物erastin处理后的铁死亡相关检测指标如活性氧（reactive oxygen species,ROS）、亚铁离子(Fe2+)、脂质过氧化物（lipid peroxidation,LPO）及谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平变化。
结果:1、代谢组学联合蛋白组学分析中,差异蛋白和差异代谢物参与KEGG通路的共同通路有112种,而差异代谢物与蛋白共同参与数TOP30通路分类中,氨基酸及其类似物代谢通路有9个,占比30%。谷胱甘肽代谢通路作为其中差异性氨基酸代谢通路之一,其通路中GGCT、G6PD、GPX7、IDH2、TXNDC12蛋白表达上调,GSTM2表达下调。2、仙桃学术TCGA、GEPIA数据库显示GPX7蛋白在人类乳腺癌组织中相对于癌旁组织高表达。免疫组化染色80对TNBC和癌旁组织芯片中,48例癌组织中较癌旁组织高表达,占比60%,并且K-M生存曲线显示GPX7高表达与较差生存结果相关。3、WB、q RT-PCR提示GPX7在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB231、SUM-159中高表达,慢病毒感染敲低GPX7基因后,抑制了TNBC细胞增殖的能力,并促进了细胞凋亡。4、CCK-8实验显示GPX7敲低后,TNBC细胞的存活率明显低于对照细胞,细胞死亡数量增高。5、WB、q RT-PCR实验发现GPX7敲低后相关铁死亡蛋白GPX4呈现低表达,对应的ACSL4呈现高表达。免疫荧光实验提示GPX7敲低后,细胞ROS、Fe2+水平上升,erastin更加剧了这种现象;流式细胞分析显示GPX7敲低后细胞ROS、LPO水平上升,同样在加入erastin后这种现象更加明显;使用酶标仪检测GPX7敲低后细胞内GSH水平,提示GSH水平降低,同样加入erastin后GSH水平出现进一步降低。
结论:1、TNBC癌组织与癌旁组织代谢组学联合蛋白组学分析提示氨基酸代谢相关通路发生明显变化,其中谷胱甘肽代谢通路中蛋白GPX7癌较癌旁组织高表达。2、通过公共数据库进行生物信息学分析及组织芯片验证,GPX7在三阴性乳腺癌组织呈现高表达,并与预后相关。3、GPX7在三阴性乳腺癌细胞中呈现高表达,敲低后可抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。4、GPX7敲低可增加三阴性乳腺癌细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。5、GPX7敲低通过增加ROS、Fe2+、LPO产生、GSH耗竭以及调控铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL4的水平,促进三阴性乳腺癌细胞发生铁死亡。
关键词: GPX7 ；三阴性乳腺癌 ；紫杉醇 ；耐药性 ；铁死亡 ；GPX4/ACSL4信号通路
摘要： 癌症作为当前致死率最高的死亡因素之一,一直是科研人员致力攻克的重大难点。目前临床批准常用的抗癌药物,如阿霉素（DOX）、顺铂和紫杉醇等,经多年临床研究发现,它们在高效抗癌的同时也对正常细胞无差别攻击,产生严重的毒副作用。因此,研发毒副作用更小与抗癌活性兼备的新型抗癌药物迫在眉睫。β-葡聚糖作为一类具有抗肿瘤、免疫调节、降胆固醇、降血糖以及抗氧化等活性的生物大分子,同时具有独特的链构象及自组装特性,被赋予更多功能和应用前景。黑木耳作为我国常见的药食兼用真菌之一,其主要活性成分—黑木耳多糖也颇受关注。研究发现,黑木耳多糖为具有三螺旋构象的β-（1→3）-D-葡聚糖,显示较好的抗小鼠肝癌活性,抑制率高达75%,且基本无毒副作用。然而,其抗肝癌机制尚未阐明;同时,黑木耳三螺旋β-葡聚糖具有很强的自组装能力,可形成具有疏水空腔的纳米管结构,为其负载疏水客体分子提供了重要的结构基础。基于此,本论文从黑木耳中提取三螺旋β-（1→3）-D-葡聚糖,利用超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）基代谢组学从分子水平揭示黑木耳三螺旋β-葡聚糖与抗肝癌的潜在机制;同时利用多糖自组装特性、化学改性以及三螺旋构象转变等构建一系列纳米管状复合物,用于靶向递送抗肿瘤药物和纳米粒子,并深入研究黑木耳三螺旋β-葡聚糖纳米管状复合物的抗肿瘤活性及潜在机制。本论文的主要创新点包括以下几点:（1）首次利用UHPLC-MS基代谢组学从分子水平揭示黑木耳三螺旋β-葡聚糖（BFP）的抗人肝癌机制为:BFP通过诱导DNA损伤,减弱DNA损伤修复能力,抑制DNA合成来抑制肝癌细胞增殖;（2）基于BFP在水中自组装成疏水纳米管结构的独特自组装行为,成功将硒纳米粒子（Se NPs）包裹于BFP纳米管中,构建了BFP/Se NPs纳米复合物（BFP-Se）,首次发现BFP-Se可以通过直接与谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢（H2O2）反应产生活性氧自由基增强体内氧化应激,并利用代谢组学揭示BFP-Se促进细胞氧化应激的抗肝癌机制;（3）通过氧化改性BFP,利用席夫碱作用结合顺铂改性前药Pt（IV）,成功构建了负载抗癌前药的BFP纳米管状复合物（BFCP）,并证明BFCP在肿瘤还原微环境下控制释放Pt（Ⅱ）,达到精准杀伤肿瘤的目的;（4）利用BFP在DMSO/水混合溶剂中发生三螺旋链破坏-重构的特点,通过氢键相互作用将BFP分子链以螺旋方式包裹于碳纳米管表面,同时利用亲疏水相互作用负载疏水阿霉素（BSD）用于光热治疗化疗一体化平台治疗易转移的三阴性乳腺癌,基于代谢组学深入探究了BSD的抗乳腺癌机理。本论文主要研究内容如下。首先,利用水热提取法从来自福建厦门的黑木耳子实体中提取黑木耳三螺旋β-葡聚糖BFP,证实它的重复单元为主链中每三个β-（1→3）-连接的葡萄糖残基连接两个β-（1→6）-连接的葡萄糖残基侧链组成。体外细胞实验发现,BFP通过诱导人肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞迁移和侵袭、阻滞肝癌细胞周期于S期来抑制DNA复制,最终导致肝癌细胞增殖抑制。细胞转移实验发现,BFP显著抑制人肝癌细胞的转移与侵袭。基于超高效液相色谱-质谱联用的代谢组学研究结果表明,BFP干扰人肝癌细胞多个代谢通路,包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和组氨酸代谢,嘧啶代谢,谷胱甘肽代谢通路,诱导细胞氧化应激导致DNA损伤,减弱DNA损伤修复能力,抑制DNA合成,实现抑制细胞增殖。体外实验进一步验证,BFP促进人肝癌细胞氧化应激升高、脂质过氧化,同时抑制ATP产生。体内荷瘤小鼠模型进一步证实了BFP的抗人肝癌活性。本章为多糖的抗癌机制研究提供了新的研究思路,对多糖类抗癌药物的研发和临床应用提供重要科学依据。利用BFP在水中自组装成疏水空心纳米管特点,成功将Se NPs包裹于BFP的疏水空腔,得到水溶性和稳定性很好的纳米管状复合物BFP-Se。BFP-Se直接与癌细胞内的GSH和H2O2反应,通过消耗GSH和产生活性氧自由基,加速细胞内氧化应激。体外细胞实验表明,BFP-Se显著抑制肝癌细胞的生长、迁移和侵袭,同时诱导肝癌细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期。利用代谢组学进一步揭示BFP-Se干扰肝癌细胞多条与氧化应激相关的代谢通路,包括谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和戊糖磷酸代谢通路,导致细胞体内氧化应激加剧。氧化应激实验进一步证明,BFP-Se呈剂量依赖性引起细胞体内氧化应激升高、促进脂质过氧化,同时阻碍ATP的产生,导致癌细胞的凋亡。本章基于消除癌细胞谷胱甘肽和增强氧化还原失衡提出了一种肝癌治疗新策略。顺铂药物的高毒性和较差的水溶性,导致直接输送进体内造成极大的副作用。本工作将BFP进行氧化改性,并与改性的顺铂前药Pt（IV）通过席夫碱反应,成功将Pt（IV）负载于BFP纳米管腔内,得到水溶性和稳定性很好的BFP/Pt（IV）,简称BFCP。药物模拟释放研究发现,Pt（IV）在还原条件下响应性释放,在癌细胞内轴向释放两个配体后变成Pt（II）复合物,随后与DNA形成链间交联,发挥抗肿瘤功效。BFCP显著增强癌细胞对Pt的摄取,摄取量比顺铂高250倍;同时BFCP在体外表现出优异的抗癌活性,并且在He La和MCF-7细胞系中比顺铂高50倍,而对处于非还原环境下的正常细胞几乎无毒副作用。细胞凋亡和免疫印迹实验证明,BFCP通过破坏DNA双链引起DNA损伤,从而诱导癌细胞凋亡。体内试验进一步表明,BFCP显著抑制癌细胞的生长,抑瘤率达66.8%,且对小鼠的体重没有影响。由此,BFCP可用作还原性靶向抗肿瘤药物,通过诱导癌细胞凋亡精准杀伤癌症,实现抗癌目的。利用BFP在DMSO/水混合溶剂中发生三螺旋刚性链的破坏-重构的特点,通过氢键和疏水相互作用成功将BFP包裹于单壁碳纳米管SWNT表面,同时负载疏水性抗癌药物阿霉素DOX,得到一种新型的BFP/SWNT/DOX纳米复合物（BSD）。基于SWNT的良好光热效应,DOX和BFP的抗癌活性,将BSD用于光热化疗治疗易转移的三阴性乳腺癌。结果表明,BSD在酸性条件下（p H 5.0）可控制DOX的释放,其负载能力和包封率分别为89.3%和43.5%。BSD显著抑制癌细胞增殖和转移、诱导细胞凋亡,但对正常细胞的毒性显著减弱。BSD具有较好的光热效应和光热循环稳定性,体外实验表明,结合光热治疗具有比单纯的BSD化疗更好的治疗效果。BSD主要利用BFP和DOX的作用阻滞乳腺癌细胞周期于S期,导致DNA合成受到抑制;而结合光热治疗后,则主要阻滞细胞周期于G1期,提前阻断癌细胞DNA复制所需营养物质的合成。非靶向代谢组学研究揭示,BSD显著干扰多种代谢途径,包括嘌呤代谢、磷酸戊糖代谢、谷胱甘肽代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢和能量代谢,导致DNA和RNA合成受到抑制,产生氧化应激,细胞膜完整性破坏,ATP减少,最终造成DNA破坏,引起细胞凋亡。本章为乳腺癌治疗提供了一种潜在新药。上述研究结果首次利用代谢组学在分子水平上研究纳米复合材料的抗肿瘤机制,同时利用黑木耳三螺旋β-D-葡聚糖自身在水中自组装特性、化学改性和在DMSO/水中破坏-重构等特点成功构建了一系列抗肿瘤纳米药物。本工作结合了多学科,包括高分子化学与物理、分析化学、纳米医药以及生物医用材料等交叉应用,为抗癌新药的研发及抗肿瘤机制研究提供了新的思路,同时为构建新型纳米递送材料提供新的策略,具有重要的学术价值和应用前景。
关键词: 黑木耳 ；三螺旋β-D-葡聚糖 ；纳米复合物 ；代谢组学 ；抗肿瘤机制
摘要： 目前，多型乳腺癌治愈显著且预后良好，但占乳腺癌发病总数15%~20%的三阴性乳腺癌恶化程度高、生存期短且年轻化，放疗、化疗效果不明显。乳腺癌组织高表达免疫抑制性细胞和负性调控因子，阻碍了其肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答。因此，寻找激活肿瘤免疫或者解除放疗、化疗免疫抑制的新的肿瘤免疫药物是癌症研究的热点。所以本论文旨在探究灰树花多糖GFI-2及其纯化组分抗4T1乳腺癌活性及免疫激活作用机制，以期为灰树花多糖应用于抗肿瘤免疫治疗或辅助治疗提供理论支持。 本研究将课题组前期筛选出来的具有显著抗乳腺癌活性的灰树花多糖GFI-2进行分离纯化，得到两个组分GFI-21和GFI-22，并探究其抑制4T1乳腺癌的作用。结果发现在同一给药剂量为50mg/kg条件下，GFI-2、GFI-21和GFI-22抑瘤率分别为83.26%、81.73%和21.43%，因此，GFI-21是GFI-2的主要活性成分。通过病理实验观察到模型小鼠肿瘤组织中髓源性抑制细胞的标志蛋白CD11b+和Ly6G表达量均显著升高，而在GFI-21干预下，两者表达均下降，说明GFI-21具有抑制髓源性抑制细胞的作用。与模型组相比，GFI-21组的肿瘤组织和外周血中CD8+表达均增强，说明GFI-21具有激活CD8+T淋巴细胞的作用。利用代谢组学分析发现，与模型小鼠相比，GFI-21组小鼠体内差异代谢物L-犬尿氨酸、5-吲哚羟基-3-乙酸减少，说明GFI-21引起肿瘤组织中髓源性抑制细胞数量的减少与色氨酸代谢途径存在一定的联系。因此，推断GFI-21可通过减少肿瘤微环境中CD11b+髓源性抑制细胞的数量、抑制淋巴毒性代谢物的释放、并通过增加CD8+T淋巴细胞的表达来抑制肿瘤的生长。 在上述研究基础上，本文进一步探究了GFI-21和GFI-22作为辅助治疗药物的潜力。通过GFI-21与紫杉醇联合给药探究其抑制乳腺癌的效果，结果发现，低剂量GFI-21（剂量50mg/kg）与紫杉醇联用抑瘤率达到了94.96%，抑瘤效果高于单一紫杉醇组和单一GFI-21组，且外周血中CD8+T淋巴细胞数量显著增加，说明GFI-21对紫杉醇抑制肿瘤的生长具有增效作用。利用4T1荷瘤小鼠评价GFI-22与紫杉醇联用的效果，结果显示低剂量GFI-22（剂量50mg/kg）与紫杉醇联用组抑瘤率达到了63.62%，中剂量GFI-22（剂量100mg/kg）与紫杉醇联用组抑瘤率达到了93.85%。GFI-22组肿瘤组织中CD11b+、Ly6G表达微弱，单一紫杉醇组肿瘤中CD11b+、Ly6G表达较强，GFI-22与紫杉醇联合使用后，肿瘤组织中CD11b+、Ly6G表达下降，CD8+表达上升，amp;nbsp;说明在单一GFI-22干预下，肿瘤组织中髓源性抑制细胞的积聚减少，通过GFI-22与紫杉醇联合使用可显著缓解化疗药物紫衫醇所带来的免疫抑制，增加紫杉醇对肿瘤细胞的敏感性，从而更好地发挥了抑制乳腺癌生长的作用。
关键词: 乳腺癌 ；灰树花多糖 ；抗肿瘤活性 ；免疫机制
摘要： 背景:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,是引起女性癌症死亡的重要病因,且在分子水平上是一种异质性疾病。其中三阴性乳腺癌（TNBC）具有复发率高、侵袭性强、恶性程度高等特征,是最难治疗的一种亚型。因此,迫切需要对该疾病的发生、发展机制开展全面和深入的研究,以探索新的治疗靶点,进而改善并提高对该疾病的治愈。 精氨酸代琥珀酸合成酶（ASS1）是尿素循环中的一个关键酶,催化精氨酸的合成。研究表明,ASS1在多种肿瘤中低表达,发挥肿瘤抑制因子的功能。然而,目前对ASS1抗肿瘤的机制研究仍不详尽。我们以前的工作表明,ASS1的激活剂LM-2I能够增强ASS1酶活性,通过减少嘧啶的合成发挥抗癌功能。然而,补充嘧啶核苷酸只能部分挽救细胞的生存能力,这表明ASS1可能存在其他抗肿瘤途径。 目的:探索ASS1蛋白互作的信号转导途径,蛋白之间相互作用方式和调控方式。阐明ASS1在TNBC中发挥抗肿瘤功能的新机制,为TNBC的治疗提供新的途径和策略。 方法:利用免疫共沉淀（Co-IP）-液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）探索ASS1的潜在互作蛋白,通过Western blotting（WB）、Co-IP、GST-pulldown、免疫荧光共定位、免疫组化（IHC）、RT-q PCR和体内泛素化实验明确相互作用关系和蛋白互作的调控方式。采用LC-MS/MS和气相色谱-质谱联用（GC-MS）靶向代谢组学检测细胞内总丝氨酸和甘氨酸水平及丝氨酸和甘氨酸的从头合成。采用MTT、克隆形成和裸鼠移植瘤实验检测ASS1、PHGDH、及丝氨酸和甘氨酸对TNBC生长的影响。 结果:（1）免疫共沉淀-液相色谱-串联质谱发现ASS1潜在互作蛋白磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）,Co-IP和GST-pulldown实验显示在TNBC细胞中ASS1与PHGDH直接结合。免疫荧光共定位实验显示,二者在TNBC细胞质中存在共定位。PHGDH和ASS1不同氨基酸区段截短蛋白的GST-pulldown和Co-IP实验显示PHGDH的N-314区段与ASS1 N-173和174-377区段均能结合。 （2）相比正常乳腺上皮细胞,PHGDH的蛋白和mRNA在乳腺癌细胞系中表达较高。ASS1敲除上调PHGDH蛋白表达,而过表达抑制PHGDH蛋白表达,且PHGDH mRNA水平无明显变化。PHGDH敲除、敲低或过表达对ASS1蛋白表达无明显影响。而且,ASS1与PHGDH在TNBC病人组织中免疫组化（IHC）结果显示,复发病人中ASS1低表达,PHGDH高表达;非复发病人中ASS1高表达,PHGDH低表达,二者表达呈负相关。 （3）BafA1处理ASS1敲除或过表达TNBC细胞,PHGDH蛋白表达无明显变化。ASS1基因敲除上调PHGDH蛋白表达,但MG132处理减弱了ASS1基因敲除的促进作用。ASS1的过表达降低了PHGDH蛋白表达,但MG132的处理减弱了ASS1过表达的抑制作用。CHX处理TNBC细胞,ASS1过表达促进PHGDH蛋白降解,而ASS1敲除抑制蛋白降解。细胞体内泛素化实验显示,HEK293T细胞中ASS1促进PHGDH泛素化,而乳腺癌细胞MDA-MB-468中敲除ASS1抑制PHGDH泛素化。 （4）PHGDH是丝氨酸从头生物合成途径中的第一且唯一的限速酶,丝氨酸又能进一步生成甘氨酸。因此,通过GC-MS靶向代谢组分析丝氨酸和甘氨酸合成,LC-MS/MS检测细胞中丝氨酸和甘氨酸水平。结果显示,ASS1过表达能够减少丝氨酸和甘氨酸中13C6的掺入量以及细胞中丝氨酸和甘氨酸的总含量,而PHGDH敲除能够明显减弱ASS1抑制丝氨酸合成的功能。 （5）体内外实验表明,ASS1能够抑制TNBC细胞生长,且PHGDH的敲除能够明显减弱ASS1对TNBC细胞生长的抑制作用,在体内ASS1敲除依旧上调PHGDH蛋白表达。 （6）细胞体外增殖实验表明,剥夺细胞外源丝氨酸和甘氨酸抑制TNBC细胞增殖,且明显增强ASS1过表达、PHGDH敲除或敲低对TNBC细胞增殖的抑制,然而ASS1敲除或敲低后能够极大回复细胞的增殖能力。补充外源丝氨酸和甘氨酸能够挽救ASS1过表达对TNBC细胞增殖的抑制。 结论:ASS1与PHGDH直接结合,ASS1负调控PHGDH蛋白表达,且TNBC组织中二者蛋白表达呈负相关。ASS1敲除或敲低通过稳定PHGDH蛋白水平促进丝氨酸和甘氨酸合成,从而促进TNBC生长,且PHGDH敲除或敲低能够明显减弱ASS1敲除的促TNBC生长效应。ASS1通过促进PHGDH的泛素化降解抑制丝氨酸合成从而抑制TNBC的进展,进而发挥ASS1的抗肿瘤功能。我们的研究揭示了ASS1新的抗肿瘤机制,提示ASS1/PHGDH丝氨酸合成途径可能是肿瘤治疗的有前景的靶点。 图40幅,表27个,参考文献368篇
关键词: ASS1 ；PHGDH ；泛素化降解 ；丝氨酸合成 ；三阴性乳腺癌
摘要： 乳腺癌是女性最常见的癌症,截止至2017年,乳腺癌仍然是我国女性患者的发病首位（17.07%）。针对乳腺癌的临床治疗手段有手术治疗、内分泌治疗、放疗、化疗及靶向治疗等,但术后肿瘤转移、耐药性、毒副作用、费用高昂等问题仍然困扰广大患者。因此,寻找疗效更优、安全系数更高的乳腺癌治疗药物（手段）一直是乳腺癌研究的重点。鸦胆子为苦木科（Simaroubaceae）鸦胆子属（Brucea J.F.Miller）植物鸦胆子(Bruceajavanica（Linnaeus）Merrill)的干燥成熟果实,是治疗恶性肿瘤的常用中药。经石油醚或正己烷提取得到的鸦胆子油（Brucea javanica oil,BO）是鸦胆子的主要药效部位,生产中将鸦胆子油经乳化作用制成的水包油型乳剂获得鸦胆子油乳,是鸦胆子最常见的上市中药制剂,临床上用于肿瘤的辅助性治疗。多数研究人员认为油酸、亚油酸等脂肪酸成分即为鸦胆子油的抗肿瘤药效物质,尽管已有研究报道,油酸、亚油酸对肿瘤细胞生长有一定的抑制作用,但就构成和比例而言,鸦胆子油与常见食用油（如橄榄油、核桃油等）无显著差异[1]。以上说明,鸦胆子油的抗肿瘤物质基础有待深入研究。鸦胆子油乳在临床上主要用于肺癌、肺癌脑转移及消化道肿瘤的治疗。而其在对抗乳腺癌的研究却未曾报道。在前期试验中我们发现,鸦胆子油对乳腺癌细胞（MDA-MB-231）几乎无直接的细胞毒作用,但动物实验结果却表明口服鸦胆子油表现出明显的抗乳腺癌（MDA-MB-231）作用,以上结果均提示鸦胆子油须通过口服给药才能发挥抗乳腺癌作用。近年来,越来越多研究发现,肠道菌群（Gut microbiota）不仅与肿瘤发生发展密切相关,更对肿瘤治疗的新型药物和手段发挥疗效产生重要影响。肠道菌群不仅是口服给药后药物的首要作用对象,也是影响药效的重要因素。因此本论文将从肠道菌群角度探讨鸦胆子油发挥抗乳腺癌活性的机理。目的:本课题基于全微生物组关联分析（Microbiome/Metagenome-wide association studies,MWAS）的方法探讨鸦胆子油抗乳腺癌的作用机理,为鸦胆子油的二次开发和应用提供参考依据。方法:1.鸦胆子油的体外抗乳腺癌作用观察通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法检测鸦胆子油对人乳腺癌细胞MDA-MB-231活力的干预影响,并以紫杉醇（Paclitaxel,PTX）和橄榄油为对照。另外,同时设立四个单体成分（油酸、亚油酸、棕榈酸以及棕榈油酸）为对照,以评价脂肪酸类成分对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖影响。2.鸦胆子油干预乳腺癌移植瘤生长的作用观察在体内研究中,取BALB/c裸小鼠,通过皮下注射MDA-MB-231细胞（2×106/只）建立裸鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型,灌胃给予鸦胆子油30天（BO低、中、高剂量组:BOL、BOM、BOH,对应剂量为100,200,400 mg/kg）。期间观察并记录小鼠的肿瘤体积,同时收集小鼠粪便。实验结束,采用颈椎脱臼法处死小鼠,收集血清、盲肠内容物,剖取结肠、肝脏、肾脏、肿瘤等,用于后续实验。灌胃给予BALB/c裸小鼠含四种抗生素（甲硝唑、硫酸新霉素、盐酸万古霉素、氨苄青霉素钠）的无菌水,构建伪无菌动物模型,灌胃给予鸦胆子油（400mg/kg）。同时在小鼠无菌隔离器外设立对照组。期间观察并记录小鼠的肿瘤体积大小。实验结束后,采用颈椎脱臼法处死小鼠,剖取肿瘤称重并进行比较。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining,H&E）观测结肠、肝脏、肾脏以及肿瘤组织形态,评价并比较鸦胆子油和紫杉醇对动物结肠、肝脏以及肾脏组织的影响,以及观察肿瘤组织形态。蛋白印迹法（Western Blotting,WB）测定自噬蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、ULK1的水平,并采用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）检测LC3、Beclin-1以及ATG 5等的基因表达水平,阐述鸦胆子油抗人乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用机制。3.荷瘤动物肠道微生物的宏基因组分析通过全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun,WGS）对模型组和给药组小鼠盲肠内容物中的微生物进行测序分析,从门、纲、目、科、属、种等不同层次进行比较两组微生物的结构及相对丰度差异,并对微生物群落功能基因进行注释,最终找出关键差异微生物以及代谢通路。4.荷瘤动物血清、粪便代谢物的代谢组分析采用非靶向代谢组学分析方法,应用超高效液相Q ExactiveTM Focus组合型四极杆Orbitrap rM质谱联用技术检测样品中的代谢物,使用多维统计分析方法主成分分析（principal components analysis,PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal to partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）进行模式识别并获取投射中变量重要性（variable importance in the projection,VIP）大于1的值,并结合单维统计分析寻找差异代谢物,探讨经鸦胆子油治疗对荷瘤小鼠引起的代谢变化情况。结果:1.鸦胆子油的体外抗乳腺癌作用观察MTT实验结果显示,鸦胆子油（0.156～40 μg/mL）对MDA-MB-231细胞的活力无影响。阳性药紫杉醇的IC50为16.39 ng/mL,抑制作用显著。已有文献报道,鸦胆子油对白血病细胞U937、人肝癌细胞SMMC-7721等癌细胞的IC50为10～20 μg/mL,因此上述结果提示鸦胆子油在体外对MDA-MB-231几乎无直接的细胞毒作用。值得注意的是,与之对照的橄榄油给药组以及脂肪酸单体成分（油酸、亚油酸、棕榈酸以及棕榈油酸）对MDA-MB-231细胞也无直接细胞毒作用。2.鸦胆子油对乳腺癌移植瘤的作用观察动物实验结果显示,相比于模型组,鸦胆子油给药组及紫杉醇给药组的肿瘤体积及重量显著降低,橄榄油给药组几乎无差异。伪无菌动物实验结果显示,肠道菌群被破坏后,鸦胆子油给药组与模型组的肿瘤重量无差异。而正常SPF环境下,鸦胆子油可显著的抑制肿瘤的生长,以上均表明鸦胆子油可抑制三阴性乳腺癌的生长,其作用与肠道菌群关系密切。HE染色观察结果表明,紫杉醇给药组的小鼠结肠绒毛结构破坏严重,绒毛长度缩短,排列稀疏,而鸦胆子油给药组绒毛结构完整,接近模型组;相比模型组及鸦胆子油给药组,紫杉醇给药组小鼠的肝脏出现明显的炎性浸润。肿瘤组织的HE观察结果显示,相比模型组,鸦胆子油给药组及紫杉醇给药组出现了大面积的细胞坏死区域。提示鸦胆子油在抑制肿瘤功效方面以及在治疗中对非目标器官的安全性具有良好的应用潜质。WB以及RT-qPCR的检测结果显示,鸦胆子油灌胃给药后降低了肿瘤组织的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、ULK1的蛋白表达水平,下调LC3、Beclin-1以及ATG 5的基因表达。以上结果提示,鸦胆子油在活体实验中有明显的抗乳腺癌活性;并且相对于阳性药紫杉醇的副作用少;鸦胆子油发挥抗乳腺癌作用的机制可能与抑制肿瘤细胞的自噬有关。3.鸦胆子油对荷瘤动物肠道微生物的宏基因组分析宏基因组测序结果显示,鸦胆子油可以提高荷瘤动物的肠道菌群α-多样性和改变了肠道菌群的β-多样性。物种分类学的分析发现,属水平上,鸦胆子油可以提高Ndongobacter、Acidaminococcus、Heliobacterium,降低 Streptococcus、Mordavella 的相对丰度。种水平上,鸦胆子油可以提高Acidaminococcusintestini、Heliobacteriummodesticaldum、Ndongobactermassiliensis、unidentifiedphage、Bacteroidesdorei、CandidatusMelainabacteriabacteriumMELA1,降低MordavellaspMarseilleP3756、Streptococcuspyogenes、Enterococcuscecorum、Streptococcussuis的相对丰度。差异代谢通路分析表明,鸦胆子油干预后主要影响氨基酸的代谢以及糖的合成与代谢,并使糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases,GHs）基因水平显著升高,而使糖基转移酶（Glycosyl Transferases,GTs）显著下降。上述结果提示,鸦胆子油的抗乳腺癌作用可能与其调节肠道微生物的种类构成及代谢功能密切相关。4.鸦胆子油对荷瘤动物血清、粪便代谢物的代谢组分析对模型组以及鸦胆子油给药组的血清代谢组分析结果显示,两组血清样品的代谢物整体轮廓有差异,并筛选及鉴定出10种差异代谢物（苯乙酰甘氨酸、苏氨酸、哌啶酸、DL-赖氨酸等）。对模型组以及鸦胆子油给药组的粪便代谢组分析结果显示,两组粪便样品的代谢物整体轮廓有差异,并筛选及鉴定出12种差异代谢物（L-焦谷氨酸、L-正亮氨酸、异亮氨酸、γ-氨基丁酸等）。血清代谢组与宏基因组的关联性分析显示,肠氨基酸球菌（Acidaminococcus intestini）与苯乙酰甘氨酸（Phenylacetylglycine）、哌啶酸（Pipecolic acid）、DL-赖氨酸（DL-Lysine）、尿酸（Urocanic acid）高度正相关。代谢组分析结果表明,鸦胆子油可显著干预宿主体内的氨基酸代谢状态,其作用与肠道菌群差异物种密切相关。结论:体外实验结果表明,鸦胆子油对MDA-MB-231细胞无直接细胞毒作用。动物实验结果发现,鸦胆子油具有抑制MDA-MB-231细胞所形成的肿瘤的作用,且其副作用较小,以上结果提示鸦胆子油抗乳腺癌的作用与肠道菌群密切相关。其作用机制可能是通过改变肠道菌群中与氨基酸的合成及代谢相关的菌的丰度,影响肠道菌群的氨基酸代谢功能。同时,鸦胆子油可使MDA-MB-231细胞所形成的肿瘤组织自噬水平显著下降。上述结果提示鸦胆子油抗乳腺癌的作用可能与影响肠道菌群的氨基酸代谢功能、调控机体的氨基酸水平以及抑制肿瘤的自噬有关。本论文研究发现鸦胆子油在乳腺癌治疗中具有重要的潜在应用价值,可为其在乳腺癌治疗中的二次开发提供新思路。
关键词: 鸦胆子油 ；乳腺癌 ；自噬 ；肠道菌群 ；宏基因组学 ；代谢组学
被引量
1
摘要： 研究背景:髓性抑制细胞(MDSCs)是一种免疫抑制性细胞,其在免疫逃逸、PD-1/PD-L1抑制剂耐受和肿瘤进展中发挥着非常重要的作用。多项研究显示,MDSCs抑制剂可以抑制肿瘤的生长并且提高PD-1抑制剂的敏感性。本研究的目的是从中药单体中筛选出有效的MDSCs抑制剂,并评价其与PD-1抑制剂的协同抗肿瘤作用,为进一步的抗肿瘤药物研究提供理论基础。研究方法:本研究首先分析了与正常小鼠体内PMN-MDSCs相比,B16-F10荷瘤小鼠体内PMN-MDSCs的聚集以及活性变化;然后使用蛋白质组学和Cytoscape分析确定其上调的KEGG通路中的10个关键蛋白质,以这10个关键蛋白质作为靶点,利用分子对接和权重计算从中药单体库(20000个中药单体)中筛选PMN-MDSCs抑制剂;进一步通过体外的蛋白质组学、代谢组学、分子实验、多种功能实验以及小鼠黑色素瘤(B16-F10)肿瘤模型阐释其对PMN-MDSCs的抑制作用及抑制机制;最后利用小鼠黑色素瘤(B16-F10)和三阴性乳腺癌(4T1)肿瘤模型验证该抑制剂与PD-1抑制剂的协同抗肿瘤效果。实验结果:本研究发现PMN-MDSCs在B16-F10荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中大量积累,并且其免疫抑制能力显著增强;与正常C57BL/6小鼠PMN-MDSCs相比,B16-F10荷瘤C57BL/6小鼠PMN-MDSCs上调的蛋白主要富集在细胞增殖和细胞代谢通路,并且中国传统中药防风提取物升麻素苷可以与筛选出的靶蛋白很好的结合;升麻素苷可以通过抑制Arg-1和i NOS的表达抑制精氨酸代谢和三羧酸循环(TCA循环)进而抑制PMN-MDSCs的增殖、代谢和免疫抑制能力,并且可以改善B16-F10肿瘤的免疫抑制微环境,抑制其生长;升麻素苷可以在B16-F10肿瘤模型和4T1肿瘤模型中增强PD-1抑制剂的抗肿瘤效果。结论:我们成功从中药单体库中筛选出升麻素苷作为PMN-MDSCs的抑制剂。升麻素苷与PD-1抑制剂具有良好的协同抗肿瘤作用。该研究为在临床上提高PD-1抑制剂的抗肿瘤效果提供了潜在的选择。
关键词: MDSCs ；升麻素苷 ；PD-1抑制剂
被引量
9
摘要： 背景： 三阴乳腺癌(TNBC)是乳腺癌各种亚型中预后最差的一种，约占所有乳腺癌的15％左右。TNBC是一种分子多样的乳腺癌亚型，是根据其表达阴性的部分来定义的。TNBC的雌激素和孕激素受体免疫组织化学(IHC)染色低于1％，同时缺乏HER2蛋白过表达或HER2基因扩增（或两者同时存在），一般多发于年轻女性，并且通常预后很差。这种亚型的转移进展通常以早期复发和肝、肺和中枢神经系统转移为主要特征。转移性的三阴乳腺癌中位生存期低于12个月，其无进展生存期(PFS)也仅仅有1.7到3.7个月。然而，三阴乳腺癌暂未发现有效的靶向治疗手段，易于发生远处转移。目前，化疗仍是治疗三阴乳腺癌的重要手段之一，但是许多病人在治疗过程发生耐药。最近发表的临床研究表明，免疫治疗在TNBC的治疗模式中可能具有一定的价值。所以，发现更多的TNBC治疗靶点，是目前治疗这一棘手的乳腺癌类型的重要突破点之一。 癌细胞中的代谢重编程有助于肿瘤微环境中的可持续细胞生长。代谢酶的调节及其相关效应被认为是用于协调细胞活动的重要营养传感机制，其直接影响代谢途径或参与非代谢活动。近年来，大量证据表明，代谢酶在特定营养状态下的细胞定位或活性改变，以及表达水平的变化，使代谢酶能够以精细而有效的方式控制细胞信号和肿瘤生物学进程，如基因表达，其中调节作用基本上归因于代谢产物的产生，这些代谢产物为蛋白质或染色质修饰反应提供原料。 磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)负责丝氨酸生物合成途径的第一个限速步骤，将糖酵解中间产物3-磷酸甘油酯(3-PG)转化为3-磷酸羟基丙酮酸（3-PHP），最终进入一碳代谢。具体而言，第一步是将3-PG氧化为3-磷酸羟基丙酮酸盐(3-PPyr)，同时将NAD还原为NADH。该反应由PHGDH催化，PHGDH是调节3-PG进入SSP的关键酶。接下来，3-PPyr从谷氨酸中接受一个氨基，通过磷酸丝氨酸氨基转移酶1(PSAT1)的催化产生3-磷酸丝氨酸(3-PSer)和α-KG。最后，3-PSer在磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)的作用下去磷酸化生成丝氨酸。在过去十年中，许多研究结果证实肿瘤细胞中丝氨酸摄取及其从头合成存在明显失调。此外，癌细胞使用PHGDH和NAD+将10％的由糖酵解产生的3-PG氧化成丝氨酸前体3-PPyr。同时，在多个癌种中都观察到PHGDH基因扩增，特别是在乳腺癌和黑色素瘤中，1p12染色体上的编码基因分别扩增了6％和40％。值得注意的是，在雌激素受体(ER)阴性的乳腺肿瘤中，PHGDH的蛋白水平增加了70％。越来越多的实验表明，PHGDH高表达已成为癌症中的常见现象。2011年，Locasale等人使用代谢组学方法发现PHGDH表达增加与增生性乳腺癌亚型相关。同年，Possemato等人开发了一种负选择RNAi筛选方法，使用小鼠原位的人类乳腺癌异种移植模型来识别新的癌症靶点，他们观察到ER阴性(ER-)乳腺癌中PHGDH蛋白水平升高70％。紧接着，2014年Songmi Noh及其同事评估了与丝氨酸代谢及临床结局密切相关的蛋白质，他们发现三阴性乳腺癌(TNBC)组织中表达最多的丝氨酸代谢相关蛋白是PHGDH，并且它与患者预后密切相关。最近，Murphy等人发现，ER-乳腺癌中高表达PHGDH的癌细胞对抑制NAD+挽救途径的反应极为敏感。对于ER阳性(ER+)乳腺癌，SSP代谢基因如PHGDH也存在异常激活的情况。Samanta等人发现，缺乏PHGDH的细胞致瘤性很弱;而在乳腺癌干细胞中抑制PHGDH的表达，能明显减弱其转移能力。总之，PHGDH的表达水平与各种乳腺癌的发生和恶性表型特征密切相关，并能最终影响患者的生存和预后。 在过去的半个世纪里，对癌症的看法，从肿瘤的发生、生长到转移，都是由基因突变主导的。直到最近才认识到代谢和表观遗传学的重要性。广泛的细胞增殖是癌症的标志之一。为了支持肿瘤过度增殖的能量和合成代谢需求，肿瘤对营养物获取和代谢途径进行了重新编程。在这种背景下，在过去十年中，在癌细胞代谢领域进行的研究揭示了代谢改变与癌症进展之间的新联系。已知癌细胞在肿瘤发生和转移过程中改变其代谢特征，从而表现出严格调节的代谢可塑性程序。值得注意的是，已知某些代谢改变发生在表观遗传学水平，因此表观遗传学和代谢以相互作用的方式高度交织在一起。代谢途径中产生的代谢物，如糖酵解循环和氧化磷酸化，充当催化表观遗传修饰和转录调节的酶反应的辅因子或底物。一些研究还表明表观基因组对细胞代谢敏感。由于许多代谢改变以及随后发生的异常表观遗传调节在各种癌症类型中都很常见，因此它们是抗癌治疗的有希望的靶点。在本研究中，揭示了PHGDH扩增介导乳腺癌细胞代谢的最新发现，阐明了维持癌症生长所需的代谢需求，以及代谢改变对表观遗传学的影响。因此，与恶性肿瘤中的代谢组学分析和表观基因组相互作用有关的综合研究对于破译可用于开发强大抗癌疗法的潜在靶点至关重要。 目的： 获得PHGDH介导的葡萄糖-αKG/Gly代谢异常通过表观遗传调控ADCYAP1/COL12A1基因转录的可靠依据，阐明PHGDH过表达促进乳腺癌进展的作用及新机制，为将来以阻断该代谢通路作为防治三阴性乳腺癌的新靶标提供科学依据。 方法： 1、乳腺癌细胞系PHGDH表达水平检测及PHGDH过表达和下调稳转株构建。 2、验证PHGDH的促癌作用。 3、通过代谢组学分析PHGDH在乳腺癌细胞中的过表达主要介导的异常代谢途径。 4、通过RNA-Seq和ATAC-Seq技术，取二者的交集筛选出PHGDH下游的目标基因。经过RT-qPCR验证，进一步筛选出与PHGDH表达水平同步变化的基因。 5、针对前面筛选出的目标基因，在培养基中剥夺Ser和Gly之后，再回补相应的成份，然后进行RT-qPCR检测，来进一步明确PHGDH通过Gly/α-KG调控的目的基因。然后验证它们的促癌作用。 6、在前面实验的基础上，在培养基中剥夺Ser和Gly之后，再回补相应的成份，来明确α-KG/Gly是否通过调控目的基因表达影响乳腺癌细胞增殖和侵袭。 7、通过JASPAR预测目的基因的共转录因子，筛选出评分大于10分的转录因子及相应的结合位点序列。然后通过双荧光素酶报告基因(DLR)截短实验及ChIP-PCR等实验筛选并验证目的基因的转录因子及结合位点，并明确α-KG/Gly对转录的调控作用。 8、通过ChIP-PCR、核浆分离等实验进一步探究α-KG/Gly调控转录的具体机制。 结果： 1、PHGDH介导葡萄糖-αKG/Gly代谢异常促进乳腺癌进展;2、PHGDH调控αKG/Gly代谢促进ADCYAP1/COL12A1表达;3、αKG/Gly通过影响SOX15/NRL转录活性促进靶基因表达。 结论： 我们的数据证明PHGDH介导的葡萄糖-αKG/Gly代谢异常通过表观遗传调控ADCYAP1/COL12A1基因转录，从而促进乳腺癌的进展。因此，我们的发现提示阻断该代谢通路可以作为防治三阴乳腺癌的新靶标。
关键词: 三阴性乳腺癌 ；ADCYAP1基因 ；COL12A1基因 ；表观遗传调控 ；代谢异常
摘要： 目的:三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一种特殊类型的乳腺癌，恶性程度高、侵袭性早、死亡率高。薏苡仁油是从禾本植物薏苡成熟的种仁中提取出来的，具有抗肿瘤的作用。目前，薏苡仁油与消化系统肿瘤关系的研究较多，与乳腺癌关系的研究尤其是基础研究较少。因此，本研究拟通过观察不同浓度的薏苡仁油对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响，初步探讨薏苡仁油对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用。 方法:采用体外实验的方法观察不同浓度(125μ g/ml、250μ g/ml、500μg/ml)的薏苡仁油作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞24h后，对细胞形态及增殖能力的影响。通过透射电镜观察乳腺癌MDA-MB-231细胞超微结构的改变;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各浓度薏苡仁油对乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制率;使用流式细胞仪检测各浓度薏苡仁油对乳腺癌MDA-MB-231细胞周期的影响，应用AnnexinⅤ/PI双染法检测不同浓度薏苡仁油作用乳腺癌MDA-MB-231细胞后的凋亡率。 结果:不同浓度的薏苡仁油作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞24h。在倒置显微镜下可见乳腺癌MDA-MB-231细胞数量减少，细胞变圆，细胞膜受损，细胞核碎裂;应用透射电镜观察，对照组细胞膜光滑，染色质均匀分布，细胞核大且完整。实验组细胞中:125μ g/ml薏苡仁油组，细胞膜突起，染色质浓缩，以早期凋亡为主;250μ g/ml薏苡仁油组，线粒体肿胀，染色质进一步凝聚，贴近核膜，出现凋亡小体;500μ g/ml组，细胞胞体肿胀溶解，胞膜缺损，胞核浓缩，甚至碎裂，可见少量坏死细胞。细胞形态改变随药物浓度增加而增强，呈浓度依赖性。细胞增殖实验结果显示:薏苡仁油浓度分别为125μ g/ml、250μg/ml、500μ g/ml作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h后，细胞的抑制率分别是25.79％、31.45％、50.02％，均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡显示:对照组、试验组（薏苡仁油浓度为125μ g/ml、250μ g/ml、500μ g/ml）作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h后，细胞的凋亡率分别为:13.92％、17.08％、29.38％、38.74％，实验组凋亡率高于对照组，差异有统计学意义，P＜0.05。流式细胞仪检测薏苡仁油作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞24小时后的细胞周期，结果显示:对照组和试验组（薏苡仁油浓度依次为125μ g/ml、250μ g/ml、500μ g/ml）G1期细胞百分比依次显示为:34.28％、41.55％、49.3％、56.62％，与对照组比较，差异显著，P＜0.05。 结论:薏苡仁油对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖具有抑制作用，可作用于三阴性乳腺癌细胞周期的G1期，诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡。
关键词: 薏苡仁油 ；乳腺癌 ；细胞周期
被引量
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