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【学位/博士】 • Murtada Abd Alaziz Alsiddig Alamin • 南京农业大学 • 导师：刘红林 • 2017年

摘要：中国是世界拥有鹅数量最多的国家,大约有29个品种。中国本土品种是天然的基因库,也是杂交优势与种质创新的良好素材。中国鹅的繁殖季节产蛋可达100个蛋,平均为50-60个。与鸡相比,鹅生殖期较短,产蛋率差。产蛋性能的改善是家禽养殖业非常重要的动力,特别是鹅。由于鹅繁殖遗传力较低,产蛋性能差,因此选用标记辅助选择（MAS）策略尤其重要。目前鹅的基因组尚未完成,并且可获得的鹅的基因数据也少于鸡的,这限制了鹅的产蛋性状遗传标记的挖掘。单核苷酸多态性（SNPs）在基因组上的广泛分布,通过聚焦感兴趣的遗传序列能够容易地对染色体上大量的遗传变异位点进行评价,并且可以实现短时间和低成本。在本研究中,我们利用Paired-End及Illumina HiSeq2000测序方法对鹅的基因组进行测序。对来自江苏立华畜牧养殖场的492只扬州鹅中的20只鹅（分别是高产蛋组和低产蛋组各10只）进行了基因组扫描。Paired-End和Illumina HiSeq2000测序结果经生物信息学分析后共得到了 6210243个SNP位点,高产蛋组和低产蛋组中分别得到了 2968709个和3241534个。去除共有的SNP后,高产蛋组和低产蛋组分别是877787个和1150612个。最后,在过滤假阳性SNP后总共鉴定出40841个独特的SNP。通过基因功能注释,其中575个SNPs参与了动物繁殖性状,包括277个基因。通过筛选导致氨基酸序列发生变化或位于关键调节区（包括5'和3'UTR区）的SNP,总共鉴定了 24个候选SNP。选择在高产蛋组及低产蛋组等位基因频率差异显著的候选SNPs,最终确定了四个候选基因(褪黑激素受体1A（MTNR1A）contig373759,表皮生长因子受体（EGFR）contig66634,精子粘附分子1（SPAM1）contig78894 和内皮素 B 受体（ENDBR）contig320681。1、扬州鹅褪黑激素受体1A基因多态与产蛋性状及其mRNA表达的相关在本研究中,褪黑激素受体1A基因（MTNR1A）被鉴定为影响扬州鹅产蛋性状的候选基因。对共210只鹅的血样进行采集并且分析了其褪黑激素受体1A基因多态与产蛋数的关联分析。利用直接测序方法,在MTNR1A基因g.177G>C（Genbank-Accession no-ss1985399687）的5'调节区域中检测到了一个单核苷酸多态性（SNP）。鉴定了两个等位基因（G和C）和三个基因型GG,GC和CC,并且它们的基因型频率分别为0.62、0.28和0.10。此外,统计分析显示MTNR1A基因的多态与34周产蛋期间的产蛋数存在显著相关。进一步地,具有GG基因型的鹅其产蛋数（73.01 ± 1.52）显著高于CC基因型的鹅（61.63±2.90）。实时定量PCR（qRT-PCR）分析显示,MTNR1A基因在小肠、颗粒细胞和卵巢中大量表达,而在下丘脑和胸肌中表达水平较低。比较高、低产蛋组（每组10只鹅）卵巢MTNR1A基因mRNA丰度发现,高产蛋组mRNA水平较高（P<0.05）。此外,GG基因型鹅卵巢MTNR1A的mRNA表达水平（1.13±0.27）显著高于CC基因型（0.72±0.17）。启动子活性分析试验发现,以GG型启动子序列构建pGL3荧光素酶重组载体（pGL3-314G）在HEK293T和颗粒细胞中具有更强的荧光素酶活性,与对照组和CC型启动子重组载体（pGL3-314C）相比,分别增加了 64.73%和37.3%（P<0.01）。这些结果表明,MTNR1A基因中鉴定的SNP可能影响扬州鹅产蛋量及其mRNA表达水平,可以在鹅的育种中,特别是鹅产蛋性能选育中提供有价值的分子标记。2、表皮生长因子受体基因3,-UTR区单核苷酸多态与扬州鹅产蛋性状的相关表皮生长因子受体（EGFR）基因在脊椎动物和无脊椎动物的细胞交流和增殖中起关键的作用。利用直接测序法在EGFR基因的3'-UTR区域鉴定了一个核苷酸多态c.*7750 G>A。212只扬州鹅在此位点分为三个基因型（GG,GA和AA）,并且它们的基因型频率分别为0.23,0.52和0.25。此外,GG基因型的序列与NCBI中的（Ansercygnoides）的原始序列相同（XM013197419.1）,定义为野生型。关联分析结果表明,c.*7750 G>A的SNP能够显著影响鹅34周产蛋期的产蛋量（P<0.01）。GG基因型的鹅（72.31±21.72）与AA基因型（62.88±24.50）相比能够显著产生更多的蛋。实时定量PCR表明,鹅EGFR基因mRNA丰度在肾和颗粒细胞较高,在不同阶段的卵泡颗粒细胞中存在表达差异,在大白卵泡中高表达。比较不同基因型鹅卵巢中EGFR的mRNA表达水平发现,GG基因型（1.11±0.16）鹅表达水平显著高于AA基因型（0.31±0.16）。此外,利用生物信息学预测到c.*7750 G>ASNP的等位基因A引入了两个miRNA结合位点（dme-miR-5-3p和has-miR-1248）。荧光素酶活性测定显示,与阴性对照（NC）和等位基因G（P<0.05）相比,在颗粒细胞和Hela细胞中dme-miR-5-3p可以显著降低等位基因A的荧光素酶活性。上述结果表明,EGFR基因3'-UTR中的c.*7750 G>A可能是影响扬州鹅产蛋性能的功能性SNP。3、精子粘附分子1（SPAM1）基因单核苷酸多态（SNPs）与扬州鹅产蛋性状的相关精子粘附分子1（SPAM1）基因在受精中起重要的作用。它也是鹅孵化能力的一个重要候选基因。在本研究中,我们首次研究了 SPAM1基因的遗传变异及表达水平与扬州鹅产蛋性状的关联。利用直接测序技术,我们检测到了三个单核苷酸多态,包括g206 G>C,c123 T>A和c159T>C,它们位于启动子区和外显子1。在250只扬州鹅样本中,试验得到了六个等位基因（G,C,T,A,T和C）并且基因频率分别是 0.33,0.67,0.71,0.29,0.38 和 0.62,以及九个基因型（GG,CC,TT,TA,AA,TT,TC和CC）。各个SNP基因型与总产蛋数的关联分析发现,在g206G>C位点,GG组34周的产蛋数显著高于GC和CC基因型组,分别是（72.59±18.56,71.57±16.41 和 81.00±08.51）(P<0.05)。在 c123 A>T 位点,与 TA 和 TT 个体（72.51±18.37和70.94±16.34）相比,具有AA基因型的鹅显著产生更多的蛋（82.00±08.57）。在 SNPcl59T>C位点,具有 CC基因型的鹅（69.19±16.04）比具有TC或TT基因型（73.99±17.03和76.76±12.91）的鹅产蛋数显著减少。实时定量PCR分析显示,与其它组织相比,SPAM 1基因在输卵管、腹部脂肪、卵巢和小肠中高度表达。此外,输卵管和卵巢中SPAM1的mRNA表达水平:与低产蛋组（1.01±0.07、1.05±0.09）相比,高产蛋组的表达水平（0.76±0.04、0.69±0.10）显著降低;与CC基因型鹅（1.27±0.19、1.11±0.06）相比,GG基因型鹅（0.72±0.02、0.93±0.02）表达水平显著下降。采用启动子活性分析技术检测启动子区g206 G>C变异对转录活性的影响,结果发现,GG或CC基因型启动子序列构建的荧光素酶表达载体（pGL3-328G和pGL3-333C）转导扬州卵巢颗粒细胞后荧光素酶活性存在显著差异,pGL3-328G和pGL3-333C具有比pGL3-basic载体更高且显著的荧光素酶活性,pGL3-333C的荧光素酶活性比pGL3-328G显著增加了 48%（P<0.01）。4、内皮素B型受体基因内含子单核苷酸多态与扬州鹅产蛋性状的相关本研究的主要目的是确定内皮素B型受体（ENDRB）基因的单核苷酸多态性（SNP）以及评价该基因多态用作鹅产蛋性状候选分子标记的可行性。随机收集230个扬州鹅血样,DNA提取后利用特殊引物扩增了 ENDRB基因内含子1的560 bp序列。对PCR产物进行测序并且通过与基因库ENDRB参考序列（NW013185812.1）比较获得SNP。试验检测到5个SNPs,分别为g.336C1A基因内含子1多态性与产蛋数之间的关联分析显示,g.479A基因型能够显著（p<0.05）影响鹅的产蛋数。此外,实时定量PCR（qRT-PCR）分析显示,ENDRB mRNA在扬州鹅各组织中是广泛表达的,特别是在卵巢和小肠中。以g.479A基因型（AA,TA和GG）,并且基因型与产蛋性状间存在显著相关,可用作为鹅产蛋性状遗传改良的分子标记。

摘要译文

关键词: 鹅；基因组测序；SNP ；重测序；MTNR1A ；EGFR ；SPAM1 ；ENDBR ；产蛋性能；标记辅助选择

引用

被引量 1

2. 认领

【学位/硕士】 • 刘国宁 • 山东农业大学 • 导师：唐辉 • 2016年

摘要： MTNR1A基因编码褪黑激素受体1A,是影响鸡产蛋性状的候选基因。通过对MTNR1A基因启动子区的功能分析,有助于从分子水平上了解MTNR1A基因可能的调控序列及转录调控机制,对进一步了解褪黑激素参与生殖调控的作用机制也有一定作用。本试验以海兰褐壳蛋鸡为研究对象,采用PCR方法扩增了鸡MTNR1A基因5’调控区3134bp到205bp长度不同、下游引物相同的七个片段,对其进行克隆、测序后,构建了七个启动子报告基因表达载体,瞬时转染鸡卵泡膜细胞,应用双荧光素酶报告基因检测系统测定了荧光素酶相对活性,并对产生作用的区段进行生物信息学分析。同时,PCR扩增31只鸡MTNR1A基因5’调控区-941+107区域进行测序,寻找其SNP位点,对SNP位点进行遗传学分析,并对突变前后基因序列进行生物信息学分析。结果表明:（1）-243-39区段能表达MTNR1A基因启动子的基本活性。生物信息学分析表明,该区域包含TATA box、CCAAT box等典型的核心启动子元件。表明-243-39区段对该基因的表达调控起重要作用。（2）启动子分析载体由-553-39删除至-243-39时,荧光素酶活性显著下降,表明-553-243间有增强MTNR1A基因表达的作用元件。该区域存在多个SP1结合位点和USF结合位点,推测这两种结合位点对-553-243区域活性增强起重要作用。（3）启动子分析载体由-1963-39删除至-1525-39时,荧光素酶结果显著升高,表明-1963-1525间有降低MTNR1A基因表达的作用元件。推测该区域的AP-1结合位点、HNF-1结合位点、USF结合位点及Arnt反式作用因子发挥降低启动子活性的作用。（4）启动子分析载体由-2373-39删除至-1963-39时,荧光素酶活性显著降低,表明从-2373-1963区域中存在增强MTNR1A基因表达的作用元件。推测该区域的TATA box、AP-1结合位点、c-Myb结合位点、USF结合位点和Oct-1反式作用因子起到增强-2373-1963区域活性的作用。（5）启动子-941+107区域存在6个SNPs位点:-34（C→T）,-100（T→G）,-110（T→C）,-126（C→T）,-151（G→A）,-538（T→G）,处于Hardy-Weinberg平衡状态。其中2个突变可能造成转录因子结合位点的改变。综上所述,本试验证明MTNR1A基因-553-243和-2373-1525区段是调控该基因表达的重要作用区段;5’调控区-941+107存在2个突变可能造成转录因子结合位点的改变。

摘要译文

关键词: 鸡；MTNR1A基因 ；启动子；SNPs

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被引量 2

3. 认领

【学位/硕士】 • 赵苗 • 西北农林科技大学 • 导师：陈宏 • 2008年

摘要：本研究以内蒙古白绒山羊、陕北白绒山羊两个绒山羊品种共计1006个个体为材料,利用PCR-SSCP、aPCR-SSCP、PCR-RFLP、生物信息学、DNA测序和DNA序列分析技术,研究了KAP基因家族中的4个HGT-KAP基因(KAP6.1、KAP6.2、KAP8.1、KAP8.2基因的全CDS区)、MTNR1a基因(外显子2)、SS基因(全CDS区)共6个候选基因8个基因座遗传变异,同时探讨绒山羊群体遗传结构、遗传多态性及其与经济性状(产绒量、毛长、绒厚、抓绒后体重、产羔数、初生重)的关系,旨在获取相应的分子遗传学信息,找到与经济性状相关的DNA标记,为绒山羊遗传资源的保护、开发与利用,以及DNA标记在标记辅助选择中的开展和绒山羊生产性能的改善与提高等方面,提供科学依据。同时还初步探讨了PCR-SSCP和aPCR-SSCP这两种方法的优点与不足,期望为以后这两种方法的利用提供理论基础。本研究获得以下重要研究结果: 1.4个HGT-KAP基因的遗传变异及其与经济性状的关系本试验共研究了KAP基因家族中的4个HGT-KAP基因,KAP6.1、KAP6.2、KAP8.1和KAP8.2。在陕北绒山羊和内蒙古绒山羊群体中,KAP6.1基因和KAP8.2基因为单态,KAP6.2基因中共揭示了2个SNP和1个缺失突变,分别为c.174C>T、c.175A>G、c.119-142 del CAGGATACGGCTGTGGATACGGTT。c.174C>T导致同义突变,c.175A>G导致p.59 Ser>Gly的错义突变,缺失突变导致p. Ser 48-Gly 55 8个氨基酸的缺失,进一步分析发现c.174C>T和c.175A>G两个相邻的并且完全连锁的突变导致了KAP6.2基因减少了一个PvuⅡ的酶切基因座,造成PvuⅡ酶切基因座多态;缺失区域恰好是4个连续glycine-X二肽的缺失,说明KAP6.2基因可能存在片断大小多态性。在KAP8.1基因中,检测到2个同义突变,分别为c.63T>G和c.66C>G,这两个突变都导致了颠换。值得注意的是KAP6.2基因的片断大小多态性仅仅在陕北绒山羊群体中存在,并且处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而在所研究的内蒙古绒山羊群体中并没有检测到,说明KAP6.2基因的片断大小多态性可能是陕北绒山羊的品种特征,可能与陕北绒山羊的多绒型变异有关。基因型和等位基因分布的卡方独立性检验显示,在各个基因座上,陕北绒山羊和内蒙古绒山羊差异极显著(P<0.01),结合其他(她)工作者的研究结果,我们得出KAP基因在不同的品种间变异很大,正是这些变异的累加造成了不同绒山羊羊绒理化性质的多样性。不同多态基因座与内蒙古绒山羊产绒性状和抓绒后体重的方差分析表明,KAP6.2基因对本试验所检测的性状没有影响(P>0.05),KAP8.1基因的不同基因型对毛长性状有极显著影响(P<0.01),所以本试验将KAP8.1基因作为毛长性状的候选基因。 2.MTNR1a基因的遗传变异及其与经济性状的关系在MTNR1a外显子2中,本试验共检测出13个SNP,嘧啶之间的转换(T-C)7次,嘌呤之间转换(A-G)3次,T-G颠换2次,A-C颠换1次,其中5个在别的品种上已有报道,8个为本试验首次报道。13个SNP导致的氨基酸变化中,12个为同义突变,一个为错义突变,由丝氨酸(Ser)变为异亮氨酸(Ile)。本试验目前检测的MTNR1a基因外显子2中的SNP对产绒性状和抓绒后体重没有影响(P>0.05)。但是,MTNR1a-4-577基因座对内蒙古绒山羊的产羔数有影响显著(P<0.05),MTNR1a-4-589基因座对羔羊初生重有显著影响(P<0.05),所以MTNR1a-4-577可以作为产羔数选择的标记,而MTNR1a-4-589基因座可以作为初生重选择的标记。主要的原因可能是这些突变减弱或者增强褪黑激素与受体的结合力,从而影响产羔数和初生重。 3.SS基因的遗传变异及其与经济性状的关系利用PCR-SSCP的方法并没有检测到SS基因突变基因座的存在,目前关于SS基因突变的报道也甚少。而多序列比对分析发现:不同物种间生长抑素蛋白的同源性很高,猪、牛、羊生长抑素蛋白序列完全相同,而人类与它们也仅仅是一个氨基酸的差别。生长抑素是生物体内非常重要的内分泌激素,它有广泛的抑制作用,可能是因为SS对物种的维持和进化起到非常重要的作用,所以该基因在不同物种之间表现为很高的同源性,在各品种之间表现为单态。 4.PCR-SSCP与aPCR-SSCP的比较利用三个基因座,比较了PCR-SSCP和aPCR-SSCP两种方法,结果显示:两种方法各有所长,所以在利用这两种方法的时候,应该具有选择性,当某些基因座不同的带型容易分清时,应该采取PCR-SSCP的方法,但是当某些基因座的带型很多或者很复杂,应该采取aPCR-SSCP的方法,可以得到准确的结果。

摘要译文

关键词: 绒山羊；候选基因；遗传变异；经济性状；PCR-SSCP ；aPCR-SSCP

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