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摘要： 转甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因烟草叶片中超氧物歧化酶（SOD）的活性比对照增加约36％，过氧化氢酶（Cat）和过氧化物酶（POD）活性分别提高约62％和88％，定位于叶绿体中的抗坏血酸－谷胱甘肽途径的抗坏血酸过氧化物酶（AsAPOD），脱氢抗坏血酸还原酶（DAsAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性分别提高67．7％，47．9％和38．8％，表明由SOD催化阴离子自由基O2所产生的活性氧H2O2能被完全分解，不会衍生毒性很强的羟自由基·OH．定量说明两类抗氧化酶分解自由基与活性氧的相互匹配，转基因植株的耐光抑制能力比对照提高幅度较大，这可能是由于抗氧化酶活性提高，更有效清除了活性氧和自由基，保护了叶绿体的结构与功能，证明抗氧化酶活性的提高可能是转BADH基因植株抗性提高的重要原因之一．
关键词: 甜菜碱醛脱氢酶基因 ；烟草 ；抗氧化酶活性 ；叶片
被引量
123
【会议论文】 • 张林
会议时间： 2018-11-26
摘要： (1)从桑树中克隆甜菜碱醛脱氢酶基因的c DNA序列,命名为MBADH。序列分析结果表明桑树的BADH基因c DNA序列全长1883bp,可编码501个氨基酸。近年来,该基因构建的系统进化树表明桑树与榛的亲缘关系较近。从现有桑树资源中选出优质、高产桑品种,利用基因工程技术对其抗寒性状进行分子改良,快速培育出适合栽培的优良抗寒桑树新品种不仅意义重大,而且迫在眉睫。甜菜碱是在细菌、植物、动物等生物体中起着无毒渗透保护作用的最主要的细胞相溶性物质,在干旱、高盐、低温胁迫下,许多植物细胞中积累甜菜碱类物质,来维持细胞的正常膨压。最简单也是最早被发现和研究得最多的是甘氨酸甜菜碱(betaine)。1983年,Husemann和Marne从干旱地区的中宁枸杞(Lycium bararum)首次分离到,并称之为lycin。由于甜菜碱在一些植物和微生物的渗透调节中起着重要作用,且其合成途径比较简单,遗传操作比较方便,因此甜菜碱合成酶基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因之一。BADH基因在由盐、低温、干旱引起的水分胁迫下,编码催化合成甜菜碱的关键酶。1981年,Pan等人首次从高等植物中分离得到BADH。1997年,梁峥等将菠菜BADH基因转入烟草,获得正常表达,在叶绿体和液泡中可以发现BADH的活性。刘凤华等用山菠菜BADH基因转化草莓、烟草也获得良好耐盐植株。骆爱玲等用BADH基因转化烟草,表明:烟草叶片抗氧化酶活性增高,耐光抑制能力增强,叶片转黄速度减缓。(2)甘露糖苷酶是甘露聚糖完全降解为甘露糖的过程中所必需的水解酶。利用RT-PCR和RACE技术克隆桑树1,4-β-甘露糖苷酶基因的c DNA。序列分析结果表明桑树该基因序列全长为1674bp,可编码420个氨基酸。该基因构建的系统进化树表明桑树与甜瓜的亲缘关系较近。半纤维素是棉纤维细胞初生壁的一种重要结构成分,主要由异-l,4-β-D-木聚糖和异-1,4-β-D-甘露聚糖组成。除此之外,β-甘露糖苷酶在真核生物细胞中糖蛋白N-联寡糖的加工过程中也有着重要的作用。甘露糖苷酶对高温甘露糖苷酶的研究及开发具有重要的工业化应用前景,而目前植物中克隆的该基因还较少,Mo和Bewley报告从番茄萌发种子中克隆到一个编码蛋白属于糖基水解酶家族β-甘露糖苷酶基因。本研究通过参考以上基因与NCBI上其他物种已提交的序列进行比对,分析其序列特征。为进一步从分子水平上验证其功能,深入了解植物适应各种逆境机制奠定基础。
关键词: BADH ；遗传 ；克隆 ；1,4-β-甘露糖苷酶 ；奠定基础
被引量
1
摘要： 香蕉（Musa spp.）是我国具有国际竞争力的优势农产品之一,但是干旱胁迫和盐胁迫已成为限制香蕉产业发展的主要因子。植物的干旱胁迫、盐胁迫等都会引起渗透胁迫,甜菜碱（betaine）作为重要的渗透调节物质之一,在非生物逆境调控中起着关键作用。然而,外源甜菜碱对渗透胁迫下香蕉抗逆性的影响以及香蕉合成甜菜碱的调控机制研究未见报道。本研究采用叶面喷施10 mmol/L甜菜碱预处理24 h后,以100 mmol/L根灌甘露醇（mannitol）模拟渗透胁迫,测定巴西蕉（M Paradisiaca.）幼苗叶片和根中的MDA含量、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量、光合特性等生理指标;从香蕉A基因组数据库获取甜菜碱合成关键酶CMO（胆碱单加氧酶）和BADH（甜菜碱醛脱氢酶）基因序列及蛋白序列,进行生物信息学分析预测其功能和调控甜菜碱合成的可能激素信号物质;采用渗透胁迫（100 mmol/L）、外源甜菜碱（10 mmol/L）和激素信号物质（100μmol/L）处理,利用qRT-PCR技术检测巴西蕉幼苗中CMO和BADH基因相对表达量并测定甜菜碱合成积累量,分析甜菜碱合成基因的表达量和甜菜碱合成积累量的相关性,筛选调控甜菜碱合成的主要激素信号物质;利用RNA-seq技术,对筛选的激素信号物质诱导下,巴西蕉幼苗整体转录水平做进一步分析,探究调控甜菜碱合成的激素信号通路。研究结果如下:（1）外源甜菜碱显著降低渗透胁迫下香蕉幼苗叶片和根中MDA积累量,在48 h分别比渗透胁迫低31.52%和40.99%;显著提高香蕉幼苗叶片和根中SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性;外源甜菜碱预处理24 h,香蕉叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素含量都显著上升,分别增加16.50%和23.71%,并减缓渗透胁迫下叶绿素和类胡萝卜素含量下降;显著提高渗透胁迫下叶绿素荧光参数FV/FM、YII和ETR,并减缓FV/FM、YII、ETR、Y（NPQ）和Y（NO）等叶绿素荧光参数的变化;显著提高渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白和甜菜碱的合成积累量,香蕉幼苗叶片和根中可溶性蛋白含量分别在24 h和48 h达到最高,分别比渗透胁迫高107.44%和99.10%,在叶片和根中甜菜碱合成积累量在48 h分别比渗透胁迫高19.69%和12.29%。（2）从香蕉A基因组数据库中筛选获得2个香蕉甜菜碱合成基因,MaCMO（Ma07g21070）和MaBADH（Ma09 g15520）,生物信息学分析结果表明:MaCMO和MaBADH的基因启动子区域分别有12和15种植物激素（MeJA、Eth、SA、ABA和GA）和逆境胁迫相关的顺式作用元件;蛋白结构域和GO功能分析以及多重序列比对发现,MaCMO具有Rieske型[2Fe-2S]和铁离子结合区两个典型的保守结构域,是一类具有铁离子结合和氧化还原酶活性的蛋白;MaBADH具有一个甜菜碱醛脱氢酶结构域,是作用于醛基或羰基以NAD或NADP为受体的一类具有氧化还原酶活性的蛋白;构建的系统进化树显示,两者都与禾本科的菠萝、玉米和水稻亲缘关系最近,CMO和BADH基因在系统进化时,单双子叶植物有明显的分支。（3）渗透胁迫能诱导MaCMO和MaBADH表达量升高,而外源甜菜碱对渗透胁迫下MaCMO和MaBADH的表达有一定的抑制作用,但是都能显著提高香蕉幼苗中甜菜碱的合成积累量。渗透胁迫48 h使叶片和根中甜菜碱合成积累量分别提高12.93%和15.78%,渗透胁迫48 h使外源甜菜碱预处理后的叶片和根中甜菜碱合成积累量分别提高4.79%和7.17%。（4）激素信号物质（ABA、MeJA、乙烯利、SA）都能诱导MaCMO和MaBADH表达量升高,且都能诱导香蕉幼苗合成积累甜菜碱,只是响应程度不同,其中以MeJA诱导的基因表达量和甜菜碱合成积累量最高。MeJA诱导下,MaCMO在叶片和根中.均在8 h达最高,分别为3.795和2.479,MaBADH在叶中12 h达最高1.326,在根中8 h达最高1.686;MeJA诱导48 h使叶片和根中甜菜碱合成积累量分别显著提高29.97%和 26.85%。（5）MeJA处理香蕉幼苗8 h时,茉莉酸信号通路相关的差异基因多且在叶片中全部上调（43个上调）,根中仅有少数下调（62个上调,8个下调）;其次是乙烯信号通路相关的差异基因在叶片和根中都有较多上调（叶片:16个上调8个下调;根:47个上调,18个下调）;赤霉素信号通路相关的差异基因在叶片和根中均较少且下调;水杨酸和脱落酸信号通路相关的差异基因在叶片和根中上下调均较多,并且有大量抗逆相关差异基因表达（叶片和根中分别筛选出131和289个抗逆候选基因）。（6）MeJA处理香蕉幼苗8 h时,茉莉酸响应转录因子MYC2在叶片和根中均有2个差异基因且都上调表达,乙烯响应转录因子ERF1/2在叶片和根中分别有2个和4个差异基因均有2个上调,茉莉酸和乙烯信号被激活。且预测MaCMO和MaBADH基因启动子区具有能与转录因子MYC2和ERF1/2相互作用的顺式作用元件G-box和ERF。综上所述,外源甜菜碱可有效缓解香蕉渗透胁迫,提高生理响应;MaCMO和MaBADH基因表达量和甜菜碱合成积累量之间正相关;渗透胁迫下,香蕉应激会启动甜菜碱分子保护机制;香蕉内源甜菜碱的合成积累与植物激素信号密切相关,推测以茉莉酸信号为主,乙烯信号为辅,二者协同作用,调控甜菜碱合成。
关键词: 香蕉 ；甜菜碱 ；渗透胁迫 ；生理响应 ；激素信号 ；基因表达
被引量
7
摘要： 高温胁迫对作物的生长和产量造成严重的影响。植物在进化的过程中，积累可溶性物质应对各种环境胁迫。甜菜碱是目前研究最多，也是最有效的可溶性物质，可以提高植物对低温、高温、盐胁迫的耐性。本实验野生型K326烟草和转甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因的烟草（Nicotiana tabacum）K326为材料，并对野生型烟草施加甜菜碱，研究甜菜碱对提高烟草期耐热性的影响及甜菜碱对提高烟草期耐热性与钙信号转导的关系。主要实验结果如下：
（1）高温胁迫降低烟草的光合速率。野生型烟草光合速率、表观量子效率、的下降更明显, L4株系甜菜碱含量最高，净光合速率和表光量子效率下降幅度最低。高温胁迫下转BADH基因烟草维持较高的光合速率，提高了光合作用对高温的耐性。
（2）叶绿素荧光分析结果表明：转BADH基因烟草提高了PSII对高温胁迫的耐性。外源施加甜菜碱同样提高了烟草叶片光合作用和PSII反应中心对高温的耐性。
（3）高温胁迫下烟草体内H2O2,O2-的积累明显增加，转BADH基因烟草体内活性氧的积累较少。高温胁迫下转BADH基因烟草通过维持较高的抗氧化物酶活性增强活性氧清除能力，减轻活性氧对光合机构的伤害。
（4）高温诱导HSP70的积累，转BADH基因烟草叶片中HSP70含量高于野生型烟草；外源施加甜菜碱烟草叶片中HSP70含量也高于未施加甜菜碱烟草。
（5）外源Cacl2预处理提高了烟草体内Ca2+的含量；外源Cacl2预处理提高了烟草的光合和荧光速率。
（6）外源Cacl2预处理降低了烟草体内的H2O2,O2-含量，提高了烟草抗氧化酶的活性。
（7）高温胁迫时甜菜碱使得钙调蛋白、热激蛋白的表达量激增；加入EGTA后，钙调蛋白、热激蛋白的表达量显著降低
以上结果表明，外源甜菜碱和BADH基因提高了烟草对高温的耐性，外源Cacl2预处理也可以提高烟草对高温的耐性。高温胁迫时外源甜菜碱和BADH基因显著提高了烟草体内钙离子的浓度，并且使得钙调蛋白、热激蛋白的表达量激增；加入EGTA后，钙调蛋白、热激蛋白的表达量显著降低，甜菜碱可能通过影响烟草体内钙离子的含量来调控钙信号途径，进而调控抗性基因的表达来增强烟草的耐热性。
关键词: 烟草 ；高温胁迫 ；甜菜碱 ；钙 ；CaM ；HSP
被引量
3
摘要： 本试验以转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的烟草(Nicotiana tabacum)K326和野生型K236两种烟草为材料,研究转BADH基因烟草对低温胁迫的响应及甜菜碱提高植物耐冷性的生理机制。主要结果如下:
(1)低温胁迫降低烟草的光合速率。野生型烟草光合速率的下降更明显。低温胁迫下转BADH基因烟草维持较高的气孔导度和光合速率,提高了光合作用对低温胁迫的抗性。
(2)叶绿素荧光分析结果表明:低温胁迫下,烟草PSII光化学效率降低,转BADH基因烟草低温胁迫下维持较高的光化学效率,提高了PSII对低温胁迫的抗性。这种抗性的提高可能与放氧复合体和PSII反应中心对低温胁迫的抗性提高有关。
(3)低温胁迫下烟草叶片中SOD活性升高,CAT活性降低。转BADH基因烟草同野生型烟草相比具有较高的SOD和CAT活性。同时,低温胁迫下转BADH基因烟草叶片SOD活性的升高的幅度大于野生型烟草,而CAT酶活性降低的幅度低于野生型烟草。低温胁迫下转BADH基因烟草通过维持较高的抗氧化酶活性和较高的抗氧化物质的含量以增强活性氧清除能力,缓解低温造成的氧化胁迫,减轻活性氧对光合机构的损伤。
(4)转基因烟草在促进甜菜碱合成的同时,也促进脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质的积累,有利于提高对低温胁迫的适应。
(5)转基因烟草在低温胁迫下电解质渗漏和膜脂过氧化程度较低,减轻低温胁迫对膜的伤害。
关键词: 烟草 ；甜菜碱醛脱氢酶基因 ；低温胁迫 ；光合作用
被引量
5
摘要： 植物在自然环境中，经常会受到干旱、盐碱、高低温等非生物胁迫因子的影响，这些逆境会造成渗透胁迫伤害和氧化胁迫伤害。多数逆境条件下（如盐碱，干旱等）往往会伴随强光，由于逆境胁迫植物光合效率降低，光合组织吸收的过剩光能导致叶绿体中产生大量的O2-、H2O2造成光抑制。正常条件下，叶绿体中通过SOD将O2-歧化为H2O2，再由抗坏血酸-谷胱甘肽途径将H2O2转化为无毒的H2O和O2。但干旱等逆境会使抗坏血酸-谷胱甘肽途径的抗坏血酸过氧化物酶钝化，产生的H2O2不能被及时分解而积累。而过氧化氢酶的活性不受干旱和强光的影响。渗透调节也是植物抵抗干旱、盐等胁迫的有效机制。因此将合成甜菜碱的关键酶基因-甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因和参与清除植物体内活性氧的过氧化氢酶(CAT)基因同时在叶绿体中定向表达，将使植物获得更强的抗逆能力。本文利用转豌豆过氧化氢酶基因烟草和转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因+豌豆过氧化氢酶基因烟草为材料，研究了在叶绿体中表达CAT和CAT+BADH的转基因烟草对干旱，盐和氧化胁迫的生理响应，主要结果如下:
(1)用Percoll法分离得到叶绿体，并通过测定叶绿体和过氧化物酶体的标志酶活性表明分离叶绿体的质量。同时测定了过氧化氢酶和甜菜碱醛脱氢酶活性以及烟草叶片中甜菜碱含量，结果表明Cat和Badh均在烟草叶绿体中得到表达，并明显提高了转基因植物过氧化氢酶和甜菜碱醛脱氢酶活性。
(2)用20％PEG6000和150mMNaCl溶液分别模拟干旱和盐胁迫处理，在相同胁迫条件下，与野生型烟草相比，转Cat和转Cat+Badh烟草叶绿素a荧光动力学参数(Fv/Fm)和叶绿素相对含量高;质膜透性较小，丙二醛含量较少;且抗氧化酶(CAT，SOD，POD，APX)活性高;在盐胁迫下，转基因烟草Na+含量较低，K+，Ca2+含量较高，K+/Na+比例高于野生型。表明转Cat和转Cat+Badh烟草抗旱耐盐能力得到提高，而转Cat+Badh烟草效果最好。
(3)在百草枯氧化胁迫处理下，结果显示转基因烟草的离体叶片和整株烟草损伤都小于野生型，表明转Cat和转Cat+Badh烟草抗氧化能力均得到提高，转Cat+Badh烟草优于转Cat烟草。
上述结果表明转Cat和转Cat+Badh基因能提高转基因烟草的抗逆性，尤其Cat和Badh基因在转基因植物中同时表达能明显提高对逆境的综合抵抗能力。
关键词: 烟草 ；BADH基因 ；CAT基因 ；抗逆性 ；生理响应
摘要： 盐分、干旱、极端温度等非生物胁迫影响植物生长发育并限制了作物的质量和产量，但植物也可以通过一系列机制使其适应或耐受各种非生物胁迫。火龙果(Pitaya)属于仙人掌科量天尺属（Hylocereus）或蛇鞭柱属（Seleniereus），具有很高的营养和经济价值，主要种植在热带和亚热带地区。虽然火龙果对非生物胁迫具有很高的耐受性，但是诸如盐、干旱和高温等不利环境仍然限制火龙果的生长和产量，且火龙果的耐盐等分子机制研究较少。本研究在转录组发现火龙果（Hylocereus undatus Britt）受盐和干旱诱导表达的基因基础上，具体分析了3个盐上调表达基因在火龙果耐盐中的作用与功能。取得如下主要结果: 1.乙烯响应转录因子HuERF1在拟南芥原生质体瞬时表达，研究了其亚细胞定位，结果表明HuERF1∶GFP主要分布在细胞核。在酵母中表达进行自激活研究，结果表明HuERF1具自激活活性，自激活活性结构域位于蛋白HuERF1的C端。盐与乙烯处理火龙果幼苗表明，HuERF1表达受到乙烯和高盐胁迫诱导。在拟南芥中异源过表达HuERF1可增强拟南芥对盐的耐受性、降低盐胁迫下的超氧阴离子(O2·-)和过氧化氢(H2O2)的积累、提高抗氧化酶活性。这些结果说明HuERF1参与乙烯介导的火龙果耐盐性调节。 2.火龙果幼苗中，磷酸甘油酸激酶基因HuPGK和甜菜碱醛脱氢酶基因HuBADH的表达受到高盐、PEG、ABA和JA胁迫诱导。在拟南芥中异源过表达HuPGK与HuBADH可增强拟南芥对盐的耐受性，降低盐胁迫下的超氧化物(O2·-)和过氧化氢(H2O2)的积累，增强抗氧化酶的活性，MDA含量降低，脯氨酸含量增加。这些结果表明，HuPGK与HuBADH可能参与了火龙果对盐胁迫的耐受性。 综上所述，本研究发现3个火龙果基因HuERF1、HuPGK和HuBADH在盐胁迫响应过程中起着正调节作用，并可能有助于火龙果的耐盐性，具有改良火龙果耐盐性的分子育种应用前景。
关键词: 火龙果 ；盐胁迫 ；乙烯响应因子 ；磷酸甘油酸激酶基因 ；甜菜碱醛脱氢酶基因 ；生物学功能
摘要： 植物在生长发育的过程中,面临着多种逆境胁迫。高温是夏季常见的一种非生物胁迫因子,对作物的生长和产量造成严重的影响。植物在进化的过程中,积累可溶性物质应对各种环境胁迫。甜菜碱是目前研究最多,也是最有效的相溶性物质之一,可以提高植物对低温、高温、盐胁迫等的耐性。本实验以转胆碱氧化酶(codA)基因的番茄和转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的番茄为材料,并对野生型番茄施加甜菜碱,研究甜菜碱对提高番茄在种子萌发期、幼苗生长期耐热性的生理机制。主要结果如下:
1、番茄种子吸胀时期高温处理后,转codA基因番茄种子相对电导率低于野生型番茄种子,萌发率高于野生型番茄种子;萌发时期高温处理后转codA基因番茄种子萌发率高于野生型番茄种子。转codA基因番茄种子耐热性高于野生型番茄种子。
2、外源低浓度的甜菜碱处理提高了野生型番茄种子在高温胁迫下的萌发率,提高了对高温的耐性。
3、高温胁迫下,转codA基因番茄种子中热激蛋白基因的表达水平高于野生型番茄种子,HSP70含量高于野生型番茄。
4、高温胁迫降低番茄叶片的光合速率。野生型番茄光合速率、表观量子效率、羧化效率的下降幅度明显高于转codA基因番茄。高温胁迫下转codA基因番茄维持较高的光合速率,提高了光合作用对高温的耐性。
5、叶绿素荧光分析结果表明:转codA基因番茄提高了PSII对高温胁迫的耐性。这种耐性的提高与PSII反应中心对高温胁迫的耐性提高有关。
6、高温胁迫下番茄体内H2O2,O2的积累明显增加,转codA基因番茄叶片中活性氧的积累较少,而且转codA基因番茄叶片中CAT1基因表达水平高于野生型番茄。高温胁迫下转codA基因番茄通过维持较高的抗氧化物酶活性增强活性氧清除能力,减轻活性氧对光合机构的伤害。
7、外源施加甜菜碱同样提高了番茄叶片光合作用和PSII反应中心对高温的耐性。
8、从盐胁迫的菠菜中克隆甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因,构建真核表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR和western杂交的方法对带卡那霉素抗性的转基因番茄植株进一步检测,获得了转BADH基因的番茄植株。
9、转BADH基因提高了番茄叶片光合作用对高温的耐性。
10、高温诱导HSP70的积累,转codA基因番茄和转BADH基因番茄叶片中HSP70含量高于野生型番茄;转codA基因番茄类囊体膜上HSP70含量高于野生型番茄;外源施加甜菜碱同样提高了高温下番茄叶片中HSP70的含量。
11、高温导致PSII反应中心的损伤,尤其是D1蛋白的降解,造成D1蛋白含量的降低。转codA基因和转BADH基因番茄D1蛋白含量高于野生型番茄,而且外源施加甜菜碱番茄叶片中D1蛋白含量高于未施加甜菜碱的番茄。
以上结果表明,转codA基因番茄种子对高温的耐性提高,而且转codA基因和转BADH基因番茄幼苗对高温的耐性也提高,这种耐性的提高与转基因番茄番茄中甜菜碱的积累有关。高温胁迫下,转基因番茄种子和叶片中热激蛋白的积累以及抗氧化酶活性的提高。热激蛋白含量和抗氧化酶活性的提高可能与甜菜碱促进热激蛋白和抗氧化酶基因表达有关。
关键词: 番茄 ；甜菜碱 ；高温胁迫 ；热激蛋白 ；光合作用
被引量
3
摘要： 盐碱地是一种广泛分布且影响植物正常生长发育的土壤。随着全球环境的不断恶化，土壤盐碱化已严重威胁着人类赖以生存的有限的土壤资源。土壤盐分是由多种离子组成的混合物，不同盐离子对植物种子萌发及生长发育的影响很大。目前关于植物耐盐性的研究，多数研究人员以单一的NaCl代替土壤中的盐分进行胁迫处理，以说明土壤盐分对植物的影响，这可能会限制研究结论的准确性。因此，本实验以典型耐盐性植物盐节木(Halocnermumstrobilaceum（Pall.）Bieb.)为材料，比较NaCl和土壤盐分胁迫时，盐节木种子萌发、幼苗生长及其生理生化特性反应的差异性，同时对盐节木耐盐的分子机制进行探讨。首先，采用双因素交叉设计，在三个昼-夜温度（5～15℃、15～25℃、25～35℃）和十个盐溶液浓度水平下（0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）研究了复合盐和NaCl对其种子萌发及幼苗生长发育影响的差异性。其次，在0%、0.9%、2.7%和5.4%四种浓度下，研究了生长20d，60d时复合盐和NaCl对其整株幼苗生物量、Na+、K+离子含量、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）、脯氨酸（Prolin,Pro）、甜菜碱（GlycineBetaine,GB）含量以及超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性的影响。最后，根据辽宁碱蓬（Suaedaliaotungensis,AF359282）、菠菜（Spinaciaoleracea,AY156694）、中亚滨藜（Atriplexcentralasiatica,AY093682）、甜菜（Betavulgaris,X58463）的BADH基因完整读码框设计引物，以cDNA为模板，扩增盐节木BADH基因开放阅读框（openreadingframe,ORF），将目的DNA片段克隆到PMD182T测序载体上测序，得到盐节木BADH全序列，然后利用网上数据库（http://www.ncbi.Nlm.nih.gov/）进行BLAST分析，用在线工具SOPMA进行蛋白等电点及分子量相关分析，以DNAMAN软件对HsBADH基因进行蛋白序列聚类分析。获得主要研究结果如下：
1.温度及盐浓度对盐节木种子萌发和幼苗生长的影响
在15～25℃，盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度及鲜重显著高于5～15℃和25～35℃两个处理（P<0.05）。15～25℃为种子萌发及幼苗生长的最适温度范围。在5～15℃范围内，当NaCl和复盐浓度分别低于0.6%和1.2%时盐节木种子萌发率、幼苗胚根和鲜重显著高于对照（P<0.05）；在15～25℃范围内，NaCl与复盐浓度分别低于0.6%和1.5%时，种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重显著高于对照（P<0.05）。在25～35℃范围内，当NaCl和复盐分别低于0.6%和0.9%时盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重显著高于对照（P<0.05）。在试验的三个温度下，随着NaCl和复盐浓度的升高，盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重均呈先升后降的趋势，当NaCl和复盐浓度小于0.6%时，盐溶液对种子萌发和幼苗生长具有显著促进作用（P<0.05）。在15～25℃，复盐胁迫后的种子萌发、幼苗胚根长度和鲜重分别是NaCl胁迫的1.23、1.27和1.28倍。同一温度相同浓度下，NaCl胁迫的盐节木种子萌发率、幼苗胚根长度和鲜重均显著小于复盐胁迫，NaCl对种子萌发及幼苗生长的抑制作用显著高于复盐（P<0.05）。在试验的三个温度下，当NaCl和复盐浓度分别大于0.9%、1.2%时种子萌发均有延迟现象。随着盐浓度的增加种子萌发逐渐延迟，盐浓度是影响种子萌发的关键因素之一。以上结果表明，应用NaCl进行单盐胁迫不能完全反映自然状态下植物对土壤盐分的适应规律，复合盐含有的钾、钙、硅等复合离子可能有助于提高种子的萌发及幼苗生长能力。
2.盐胁迫对盐节木生理生化特性的影响
盐节木被处理20d和60d后随着NaCl和复盐浓度增加，其整株幼苗的K+/Na+、K+含量、MDA和PRO含量以及SOD、POD、CAT活性均呈现先升后降的变化趋势，且显著高于对照，当NaCl和复盐浓度为2.7%，其K+、渗透调节物质含量和酶活性达到最大值。当NaCl和复盐为同一浓度时，随处理时间的延长，Na+、K+、Pro、GB含量逐渐升高，但MDA含量、抗氧化酶活性显著降低（P<0.05）；在同一盐浓度下，NaCl处理的幼苗K+、PRO、GB含量及SOD、POD、CAT活性显著低于复盐处理，但MDA含量显著高于复盐处理（P<0.05）。上述结果表明，在盐节木处理20d时，膜质过氧化反应强烈，氧化伤害严重，抗氧化酶活性增强。随着盐胁迫时间的延长，植物表现出一定的适应性；在复盐不同浓度处理下，复盐所含的钾、硅、钙等复合离子，促进了盐节木对K+的吸收速率，提高K+/Na+、PRO和GB含量，同时也增强了抗氧化酶活性，降低细胞膜过氧化程度，提高盐节木的耐盐能力。
3.HsBADH基因的克隆、序列分析及同源性比较
采用race技术克隆了盐节木的甜菜碱醛脱氢酶基因，命名为HsBADH。该基因读码框序列全长为1848bp，编码559个氨基酸，预测HsBADH蛋白分子量为6.46KD，等电点为9.26。氨基酸分析表明，该蛋白富含丙氨酸（Alanine，3.75%）、谷氨酸（Glutamic，3.03%）、甘氨酸（Glycine，5.89%）、亮氨酸（Leucine，7.14%）和缬氨酸（Valine，4.82%）；对HsBADH蛋白二级结构的分析结果表明，推测的HsBADH蛋白多肽含有26.12%的α-螺旋结构、27.01%的延伸链、36.14%的无规则卷曲。同源性分析表明，HsBADH与藜科植物BADH同源性高达90%以上，与水稻BADH的同源性达到53%。
本研究对盐节木在复盐条件下的耐盐机理进行了初步的探讨，为能够克服自然条件下的盐害，寻找提高植物耐盐性的途径和方法提供理论依据。同时丰富了植物的耐盐基因库，为进一步利用盐节木BADH基因资源开展作物和林木的遗传改良，提高非耐盐生物的耐盐性奠定了基础。
关键词: 盐节木 ；盐胁迫 ；耐盐机理 ；BADH克隆
被引量
12
摘要： 植物生长发育经常遇到的逆境以干旱、盐碱等最为严重,而干旱、盐碱胁迫通常伴随着强烈的光照,在干旱强光等逆境胁迫下会导致植物的渗透胁迫和氧化胁迫伤害,使叶绿体的结构和功能遭到破坏,以致光合作用大大降低。如果通过基因工程的手段将合成甜菜碱的关键酶基因和参与清除活性氧中过氧化氢的过氧化氢酶基因共同导入植物,发挥抗氧化、渗透调节和保护光合中心大分子蛋白质的功能,将能有效的提高植物抗旱﹑抗高光强和耐盐等抗逆能力。因此,本研究将甜菜碱醛脱氢酶基因和过氧化氢酶基因转入烟草和杨树中。转基因植物的获得也可为探讨植物抗逆的生理和分子机制以及具有高抗逆性状的转基因杨树的实际应用打下良好的基础。主要实验结果如下:
1.将来自豌豆的过氧化氢酶基因PSCAT与叶绿体RuBP羧化酶小亚基转运肽(rbcS-3)基因(Tr)的融合基因与来自山菠菜的甜菜碱醛脱氢酶基因AhBADH基因构建在同一个表达载体中,并且使其分别具有独立的表达框,然后利用农杆菌介导的叶圆盘转化法将这两个基因导入烟草和杨树,并利用叶绿体RuBP羧化酶小亚基转运肽的作用使过氧化氢酶特异表达在叶绿体中。在含有抗生素的培养基上筛选获得单转AhBADH烟草和杨树、单转PSCAT烟草和杨树以及同时转这两个基因的烟草和杨树各30多个株系,并对其进行了分子生物学的鉴定和生理指标的检测。
2. PCR、Northern blot、植株总蛋白Western blot和叶绿体蛋白Western blot结果表明,目的基因已经整合到烟草和杨树的基因组中,并能正常表达,且在叶绿体rbcS-3转运肽的作用下能定向进入叶绿体中。
3.在20% PEG6000模拟干旱条件下,不同转基因的植株(包括单转AhBADH的烟草和杨树,单转PSCAT的烟草和杨树,以及同时转这两种基因的烟草和杨树)的质膜损伤程度、叶绿素降解程度和PSⅡ的损伤程度都小于野生型,表明转AhBADH和PSCAT提高了植物的抗旱性。另外,结果表明同时转AhBADH和PSCAT植株的抗旱性要高于单转AhBADH和单转PSCAT的植株。
4.用不同浓度百草枯处理模拟氧化胁迫,结果表明不同转基因植株的抗氧化性高于野生型植株的抗氧化性,且转双价基因植株的抗氧化性高于单转AhBADH和单转PSCAT的植株。
5.经200 mM NaCl和高温/低温胁迫实验发现,不同转基因植株的抗逆能力均高于野生型植株,且转双价基因的植株高于单转AhBADH和单转PSCAT的植株。
总之,转AhBADH和转PSCAT提高了转基因植株的抗氧化酶活性和渗透调节能力,从而提高了转基因植株的抗旱、抗氧化、耐盐和耐高/低温的能力。且同时过量表达AhBADH和PSCAT的植株更有效地提高了其抗逆性。
关键词: 烟草 ；杨树 ；AhBADH ；PSCAT ；植物抗逆性
被引量
10
摘要： 在干旱、低温等胁迫环境中，植物细胞内通常会积累一些相容性物质（也叫渗调物质），从而减轻环境胁迫对植物造成的伤害，甜菜碱是主要的相容性物质之一。编码甜菜碱醛脱氢酶（BADH，催化甜菜碱醛合成甜菜碱）的基因在甜菜碱的生物合成过程中处于关键地位。本研究首先对抗旱性强的小麦品系旱丰9703与抗旱性弱的品种山农215953干旱胁迫下的渗透调节能力和光合作用进行了比较，分析了不同生育期叶片中BADH基因表达特性、BADH活性与甜菜碱含量，从生理与分子机制两方面对甜菜碱的生理功能进行了初步探讨。其次，研究测定了转菠菜BADH基因小麦低温及干旱胁迫下，不同生育期BADH活性、甜菜碱含量与光合作用等生理参数的变化，进一步研究了小麦胁迫耐性与甜菜碱含量、BADH活性之间的关系。考虑到菠菜与小麦BADH基因的保守性，我们从抗旱小麦新品系旱丰9703叶片中克隆了BADH cDNA序列，并构建了表达载体，对模式植物烟草进行了转化，旨在进一步研究小麦BADH基因在抗逆性中的作用，为其今后在小麦育种中的应用打下基础。主要结论如下：
1. 长期大田干旱胁迫下，旱丰9703表现出了较强抗性；三个生育期中旱丰9703的叶片相对含水量与渗透调节能力均高于山农215953，灌浆期的渗透调节能力最强，比乳熟期高0.284MPa；干旱胁迫下旱丰9703仍具有较高的净光合速率（Pn）、最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（φPSII），耐光抑制能力较强。Northern印迹杂交结果表明：灌浆期中度水分胁迫时BADH的表达水平显著增加，旱丰9703略高于山农215953；乳熟期较严重的土壤水分胁迫下抗旱性强的品种叶片中BADH表达量明显高于抗旱性弱的品种；三个生育期中，BADH活性和甜菜碱含量的变化与BADH基因的表达呈现相同的趋势，均是先增加后降低，旱丰9703的BADH活性与甜菜碱含量均高于山农215953，以灌浆期最为明显。
干旱胁迫下旱丰9703叶片中较高的BADH表达使其甜菜碱含量与渗透调节能力一直高于山农215953，其叶片的保水能力较强，维持了较高的净光合速率和PSII光化学活性；叶片中甜菜碱的积累量与小麦抗旱性成正相关，叶片中BADH活性与甜菜碱含量水平可以作为小麦抗性强弱的主要参考指标。
2. 研究发现，转菠菜BADH基因小麦植株在耐低温、干旱胁迫和抗光氧化方面的能力
较强，叶片中较高的甜菜碱含量可能对它们胁迫耐性的提高起着重要作用，结合农艺性状的改良与选择，株系99T4和99T6可以作为较好的抗逆种质资源在小麦抗性育种过程中应用。低温胁迫下转基因株系99T4和99T6的渗透调节能力、抗氧化酶活性、D1蛋白周转能力均高于4185，99T1、99T4和99T6叶片的净光合速率分别是对照植株的0.96、2.11和1.56倍；-7℃低温胁迫24h以后，株系99T4与99T6没有受到明显的低温伤害，表现出较强的低温胁迫耐性。
灌浆期不同程度的干旱胁迫表明，99T4与99T6耐干旱胁迫的能力要高于99T1与4185，能够保持相对较高的渗透调节能力与叶绿素含量；较严重干旱胁迫下， 99T4与99T6的Pn（约为7.5 μmolCO2·m-2·s-1）要高于4185（约为4.9 μmol CO2·m-2·s-1）；株系99T4与99T6在光抑制环境下PSII反应中心受到的损伤较小，具有较高的抗光氧化能力，99T4与99T6依赖叶黄素循环的热耗散在耗散过剩光能的过程中起到更大作用；
3. 通过5，-和3，-RACE，从抗旱性小麦旱丰9703叶片中克隆了BADH cDNA全序列，命名为wBADH，在Genebank中注册（注册号：AY 050316）。小麦BADH cDNA开放阅读框架含有1509bp，编码503个AA，将氨基酸序列与Genebank中已登录的几种植物的BADH氨基酸序列比较，与大麦、水稻的相应片断的同源性分别为98％、73％。进一步构建了小麦BADH基因的表达载体，利用农杆菌介导法侵染烟草，通过PCR和PCR-Southern鉴定证明我们已得到转基因烟草植株；低温处理后转基因植株中BADH的活性较低，最高的只有4.8 nmol·mg protein-1·min-1；这些研究为该基因在小麦抗性育种中的应用打下了基础。
关键词: 小麦 ；甜菜碱醛脱氢酶 ；基因克隆 ；转化 ；表达调控 ；光合作用
被引量
5
摘要： 从菠菜中克隆甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase，BADH)基因并转化烟草，研究转基因烟草光合作用对高温和盐胁迫等环境胁迫的抗性机理，利用外源甜菜碱研究在正常条件下对植物光合作用的影响以及在盐胁迫下外源甜菜碱对玉米幼苗光合作用的保护机理。主要结果如下：
转BADH基因烟草中能合成甘氨酸甜菜碱，合成的甜菜碱主要积累于叶绿体中。转BADH基因烟草提高了对高温胁迫的抗性，在中度高温胁迫下，转基因烟草生长和光合作用对高温的抗性增强。中度高温胁迫下，转基因烟草光合作用的维持是由于甜菜碱对Rubisco活化酶的保护作用。在中度高温胁迫下，甜菜碱通过维持Rubisco活化酶的活化态以及阻止Rubisco活化酶由可溶性间质向类囊体的聚集，从而维持了Rubisco活化酶的活性，进而维持了CO2的同化。在严重高温胁迫下，烟草光系统Ⅱ受到影响，转BADH基因烟草通过提高体内抗氧化酶系统的功能，减轻了高温胁迫对光合机构造成的活性氧伤害，高温胁迫下转基因烟草体内抗氧化酶如SOD、APX、GR等酶活性明显高于野生型。在高温胁迫下，证明了甜菜碱对光系统Ⅱ的保护作用主要在氧化侧，严重高温胁迫下，转基因烟草维持较高的PSII活性。
转BADH基因烟草提高了对盐胁迫的抗性，盐胁迫下转基因烟草光合作用的维持与盐胁迫下转基因烟草较高的气孔导度和抗氧化酶活性的提高有关。
外源甜菜碱在正常的非胁迫条件下对植物的生长有促进作用，而这一作用与光合速率的提高有关。通过对气孔导度、光合碳同化关键酶以及叶绿素荧光分析证明，甜菜碱对光合作用的促进与气孔导度的提高有关，同时甜菜碱提高了光系统Ⅱ的实际光化学效率。
外源甜菜碱提高了盐胁迫条件下植物的抗性，抗盐性的提高与盐胁迫下甜菜碱对气孔导度的提高以及维持较高的光系统Ⅱ光化学活性有关。
关键词: 转基因烟草 ；甜菜碱 ；高温胁迫 ；盐胁迫 ；光合作用 ；甜菜碱醛脱氢酶
被引量
1
摘要： 本研究以野生型K326烟草和转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的烟草(Nicotiana tabacum)K326为材料,研究外源喷施CaCl2提高烟草耐热性的机理,探讨烟草耐热性获得中钙与甜菜碱相互作用关系。主要结果如下:
(1)高温胁迫降低烟草叶片的光合速率,CaCl2预处理使烟草叶片维持较高的光合速率和气孔导度,可能与外源CaCl2降低高温胁迫下烟草叶片内活性氧(ROS)的积累有关。
(2)叶绿素荧光分析结果表明:喷施CaCl2提高了烟草叶片光系统II(PSII)的抗热性,与外源CaCl2对放氧复合体(OEC)和PSII反应中心的保护作用有关。
(3)高温胁迫下,烟草叶片中过氧化氢(H2O2)含量、超氧阴离子(O2-)产生速率明显上升。喷施CaCl2降低了ROS的积累,尤其是在高温胁迫下,CaCl2预处理通过维持或提高烟草叶片中抗氧化酶活性和抗氧化物质(AsA)含量以增强ROS清除能力,减轻ROS对光合机构的伤害。
(4)高温胁迫下,烟草叶片中Ca2+含量上升,Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性下降,可能使保卫细胞中Ca2+浓度上升,诱导了气孔关闭;而CaCl2预处理维持或提高了Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性,增强了Ca2+的跨膜转运,维持胞质内Ca2+稳态平衡。
(5)高温诱导烟草叶片基质热激蛋白70(HSP70)的表达,喷施CaCl2显著提高了基质HSP70的表达。高温胁迫下,HSP70的积累可能保护了与光合作用有关的膜蛋白。
(6)CaCl2预处理进一步提高了高温胁迫下转BADH基因烟草的光合能力。这可能是因为外源CaCl2与甜菜碱的积累协同作用降低转BADH基因烟草叶片ROS的积累,进一步减轻ROS对光合机构的伤害,提高转BADH基因烟草PSII对高温的抗性。而CaCl2预处理的转基因烟草叶片中较高的抗氧化酶活性和抗氧化物质含量,增强了ROS清除能力。
(7)高温胁迫下,转BADH基因烟草叶片中Ca2+含量高于野生型烟草,较高的Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性,维持了胞质内Ca2+稳态平衡。外源CaCl2提高了转BADH基因烟草叶片中Ca2+含量、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性。
(8)转BADH基因烟草叶片中基质HSP70的表达也能被高温诱导,并且转基因烟草中基质HSP70的含量明显高于野生型。CaCl2预处理进一步增强了HSP70的表达。
综上所述,外源CaCl2提高烟草耐热性的原因主要包括以下方面:
(1)通过维持较高的ROS清除能力减轻了ROS对OEC等光合机构的损伤,维持较高的PSII光化学活性。
(2)可能通过影响Ca2+-CaM信号转导,启动HSP70的表达,提高了烟草的耐热性。
(3)外源CaCl2预处理与甜菜碱的积累可能协同作用,进一步增强了转BADH基因烟草的耐热性。
关键词: 烟草 ；CaCl2 ；甜菜碱 ；高温胁迫 ；HSP70
被引量
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