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摘要： 柑橘溃疡病是由地毯黄单胞杆菌致变种引起的一种世界性的检疫性病害。该病引起落叶、枯枝和落果,溃疡病病斑导致果品质量降低,影响柑橘经济价值。然而,目前并没有有效的根除柑橘溃疡病的最佳方法。常规育种由于育种周期长、遗传上高度杂合等原因,因此并没有取得良好的效果。而化学农药防治能力有限,且还会造成严重的环境污染。因此,转基因技术成为了柑橘抗病育种的一个有效的手段。
研究表明来自柞蚕的抗菌肽基因能够显著提高对柑橘溃疡病的抗性。本实验针对转Cecropin B抗菌肽共77株转基因锦橙和塔罗科血橙,选择针刺法对离体叶片进行抗性评价。本实验更进一步地研究了在离体叶片上的发病病斑面积,病斑数量,病情指数以及病原菌的繁殖速度。同时通过实时定量PCR和Southern blotting分析了CB基因在转基因植株中的整合和表达情况。通过实时定量PCR也分析了内源PR-1、MKK4、GST、PrxA基因在转基因植株中的表达变化。为进一步的温室和田间抗性评价提供参考。主要研究结果如下：
1.柑橘溃疡病病原菌的分离与纯化
采用稀释分离法对典型的溃疡病病叶进行病原菌的分离。经过离体叶针刺接种法接种到野生型叶片上,观察并检测病原菌的致病性。利用稀释分离法获得纯化的溃疡病病原菌。
2.接种方法的确定
分别采用针刺法和喷雾法对野生型锦橙离体叶片进行接种实验。结果显示针刺接种法处理离体叶片,在培养的第4天,80%的叶片出现肉眼可见的病斑；而喷雾法处理的叶片在培养10天仅10%的叶片出现肉眼可见的病斑。因此,采用针刺接种法进行转基因植株的攻毒实验。
3.转基因植株的抗性评价
在接种4天时,统计溃疡病病斑数量。通过对转基因植株接种实验,比较发病率、病斑面积大小、病情指数和病斑所含病原菌数量,结果显示,在77株转基因植株中,得到17株抗性增强的转基因植株,其发病率均在44.79%-62.50%之间,显著小于非转基因植株(91%)；病斑指数更是远远小于非转基因植株,病情指数均在0.8%-35.5%之间,显著小于对照(73.3%)；而转基因植株中所含病原菌数量也显著少于非转基因植株,仅是非转基因植株含菌量的0.07-0.80倍。这些数据证明了与非转基因株相比,Cecropin B基因能够显著提高转基因植株对柑橘溃疡病的抗性。
4.转基因植株中外源基因的检测
从抗性增强的转基因植株中提取总的RNA,将其反转录成cDNA,以actin作为内参基因、野生型柑橘为空白对照,进行RT-PCR反应。实验结果表明,抗性增强的转基因植株中的Cecrop B基因表达量明显高于对照组株系。通过Southern blotting方法结果显示抗性增强的转基因株系大多数转基因为单拷贝,XC-PR11.XC-PR21.PR12.PR8.CB12和CB20植株中转Cecropin B基因有两个拷贝,只有CB13植株中转基因为三个拷贝,在非转基因植株中没有显示杂交信号。
5.转基因植株中PR-1、MKK4、GST和PrxA基因表达分析
在溃疡病病原菌诱导0h、2h、6h、24h、48h和72h后,从抗性增强的转基因植株叶片针刺点中提取总的RNA,通过实时定量PCR方法分析与植物抗性有关的PR-1、MKK4、GST和PrxA内源基因在不同时期的表达量。结果显示在转基因植株中GST、PR-1、PrxA和MKK4基因的表达趋势基本相同,但是其表达水平显著高于非转基因植株,暗示了在转基因植株中,植物体内相关的GST、PR-1、PrxA和MKK4抗病基因被激活,进而更加增强转基因植株对溃疡病的抗性。
关键词: 转基因柑橘 ；Cecropin B抗菌肽 ；柑橘溃疡病 ；抗病性 ；针刺法
被引量
4
摘要： 【目的】病程相关基因非表达子1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1)是水杨酸(salicylic acid,SA)介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子,在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。研究耐黄龙病的‘Jackson’葡萄柚(Citrus paradisi)中的NPR1-like基因CiNPR4对柑橘溃疡病的抗性,解析过表达CiNPR4的转基因晚锦橙(C.sinensis)抗柑橘溃疡病的机理。【方法】选取黄龙病抗性增强的CiNPR4转基因柑橘,采取完全成熟的叶片利用针刺法进行柑橘溃疡病的离体抗性评价分析;在此基础上,对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株利用针刺法离体接种溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc),统计接种Xcc后0、1、3、5、7和9 d的细菌数量;利用注射法对溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片接种Xcc,接种后0、3和5 d收集接种部位的叶片,测定叶片中SA和茉莉酸(jasmonic acid,JA)含量;同时,收集接种Xcc后0、3和5 d接种部位的叶片,利用实时荧光定量PCR分析SA和JA分别介导的防御反应相关基因CsPR1和CsPDF1.2在Xcc诱导下表达水平的变化;根据CiNPR4蛋白与TGA转录因子相互作用网络预测CiNPR4互作蛋白为Ciclev10005080m和Ciclev10001081m,以甜橙为参考基因组,将这两个基因在https://www.citrusgenomedb.org/网站上进行blastx分析,预测CiNPR4在甜橙基因组中互作的候选蛋白,克隆CiNPR4和候选蛋白基因的cDNA,利用同源重组法分别构建诱饵载体和猎物载体,并将诱饵质粒和猎物质粒共转入酵母菌株Y2HGold中,进行点对点酵母双杂交分析。【结果】CiNPR4的超量表达减轻了转基因柑橘叶片上溃疡病的症状,柑橘溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株叶片上Xcc的生长比较缓慢,在接种Xcc后9 d,转基因植株Xcc数量显著低于野生型(wild type,WT)晚锦橙;Xcc诱导0 d,溃疡病抗性增强的CiNPR4转基因植株含有与WT植株无差异的SA含量,随着Xcc诱导时间的延长,CiNPR4转基因植株中SA的含量显著增加;而Xcc处理0 d时,WT植株含有显著高于CiNPR4转基因植株的JA含量,随后,JA含量在CiNPR4转基因植株中逐步上升,Xcc处理5 d时,达到显著高于WT植株的水平;而WT植株在整个处理期间SA和JA的含量基本保持不变;溃疡病抗性增强的转基因植株受Xcc诱导3 d时CsPR1的表达水平迅速上升,达到与WT植株差异显著的水平,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升;WT植株受Xcc诱导后CsPR1的表达水平没有发生显著变化,而CsPDF1.2的表达水平在Xcc诱导5 d时上升,且显著高于CiNPR4转基因植株中CsPDF1.2的表达水平;酵母双杂交分析证实,CiNPR4与甜橙基因组中的CsTGA2转录因子互作。【结论】CiNPR4与CsTGA2转录因子互作,通过促进SA而抑制JA介导的防御反应,调控转基因柑橘对溃疡病的抗性。
关键词: CiNPR4 ；柑橘溃疡病 ；水杨酸 ；茉莉酸 ；TGA转录因子
被引量
11
摘要： 柑橘为亚热带常绿果树,主要分布于中国长江以南地区。宜昌橙(Citrus ichangensis Swingle)、莽山野橘(C.mangshanensis S.W.He)等多个野生种起源于中国。柑橘属种间易发生杂交,种质资源极为丰富。中国作为世界公认的柑橘起源中心,拥有4000多年的栽培历史和多样化的生态地理环境,目前柑橘是我国栽培面积与产量第一大的果树。国家柑橘种质资源圃(重庆)是全球规模最大的柑橘田间基因库,截至2024年已保存柑橘种质2175份,其中收集国内22个省(自治区、直辖市)的种质1517份,从国外33个国家引进资源658份。这些资源包括地方品种910份(41.80%)、育成品种849份(39.00%)、遗传材料224份(10.30%)、野生资源179份(8.23%)及近缘植物13份(0.60%)。按照基本护照信息、植物学形态特征和农艺性状完成1740份(80%)种质的编目。通过田间评价试验,筛选出高可溶性固形物含量、低酸、无核、早晚熟、抗溃疡病或褐斑病等优异种质234份,并用于杂交育种。建立高效育种体系,以南香、红美人、西之香、清见、明日见等品质优良、无核且单胚的种质为母本,结合胚芽嫁接缩短童期的技术,已培育出大雅柑、尚品2号、华美7号、Q橘、夏蜜柚、金秋砂糖橘等新品种。通过与云南省新平县、四川省丹棱县等主产区政企合作开展柑橘芽变选种,选育出新冰30号(冰糖橙芽变)、金乐柑(不知火芽变)等优系。近年来开展柑橘种质精准鉴定,采用植物形态学、代谢组学方法以及GBS、全基因组重测序对903份种质进行表型与基因型鉴定,通过全基因组关联分析、选择清除法等方法鉴定出果实色泽、单果质量、单胚性、种子数、柠檬酸含量等品质性状及褐斑病/溃疡病抗性的关键候选基因,发现CcCCD4a、PEG、CcISAUR49、PDH-E2、ERF119等15个园艺性状主效调控基因,开发23个紧密连锁分子标记,提升了柑橘育种效率。同时累计向各类用户提供柑橘种质及数据信息15700份次,广泛用于科研、育种、建园及育苗等领域,为脱贫攻坚和产业可持续发展作出了重要贡献。本文综述了国家柑橘种质资源圃(重庆)在资源保存与评价方面的研究进展,并对未来工作方向提出了展望。
关键词: 柑橘 ；种质资源 ；收集 ；保存 ；创新利用
摘要： 克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌(Xcc)、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性(病情指数为野生型的75%~88%);转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。
关键词: 甜橙 ；柑橘溃疡病 ；CsNBS-LRR ；水杨酸 ；PR基因
被引量
16
摘要： 柑橘属绝大多数种质易感柑橘溃疡病,柑橘溃疡病严重危害了我国柑橘产业发展。本研究在枸橼基因组中鉴定出88个过氧化物酶(POD)基因,通过系统进化树分析将其分为2类,并通过对柑橘溃疡病具有抗性的枸橼C-05和感病的冰糖橙叶片接种柑橘溃疡病后的转录组分析,获得16个受柑橘溃疡病菌诱导特异表达的POD基因。对在抗、感病种质中表达量较高且差异较大的CmPOD05使用qRT-PCR进一步验证其表达,并通过烟草亚细胞定位确定其可能定位于细胞质膜上。同时分析了不同柑橘种质之间的POD05同源基因蛋白质差异,以及通过启动子序列的顺式作用元件分析,得到防御和应激反应调控等多个抗病相关的顺式作用元件。在冰糖橙叶片中瞬时过表达CmPOD05,在接种溃疡病菌后第3 d,与对照相比单位叶面积的柑橘溃疡病菌生长量显著减少。在枸橼C-05及烟草叶片中瞬时过表达CmPOD05可以增加叶片的H_(2)O_(2)及超氧阴离子含量。本研究结果表明CmPOD05可能参与了枸橼C-05对柑橘溃疡病的抗病过程。
关键词: 枸橼 ；冰糖橙 ；柑橘溃疡病 ；过氧化物酶
摘要： 【目的】构建基于柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)的表达载体,通过系统表达抗菌肽提高植物抗病性,为柑橘溃疡病、柑橘黄龙病等病害的防控提供新型技术手段。【方法】基于前期构建的侵染性克隆pCY-CLBV201,在外壳蛋白基因终止子后插入亚基因组启动子序列及多克隆位点,构建病毒表达载体pCLBV202。在多克隆位点插入绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因(gfp),通过农杆菌介导接种、荧光观察验证pCLBV202-GFP表达GFP的情况。克隆天蚕的抗菌肽(cecropin B,CB)基因并构建重组载体pCLBV202-CB,通过农杆菌介导分别注射接种本氏烟和真空浸润接种柑橘实生苗,筛选阳性植株并分别注射接种和根灌接种烟草青枯病菌及针刺离体叶片接种柑橘溃疡病菌,同时设空载体接种植株为对照,通过症状观察、发病率及病情指数评价接种植株的烟草青枯病抗性;通过柑橘叶片的病斑数量、发病率及菌落浓度评价其溃疡病抗性。【结果】pCLBV202-GFP接种烟草和尤力克柠檬后,均可以在系统新叶上观察到绿色荧光,在烟草上表现更为明亮,说明基于CLBV的表达载体构建成功。接种青枯病菌后,处理组(pCLBV202-CB)较对照组(pCLBV202)发病时间延迟4 d。在接种后第24天(24 dpi),处理组发病率为14.3%,对照组发病率为100%,差异显著。处理组相对于对照组的抗性指数为-2.66,抗性评价为高抗,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了对烟草青枯病的抗性。尤力克柠檬叶片针刺接种柑橘溃疡病菌,7 dpi时,处理组病斑数为47个,发病率为43.5%,对照组病斑个数为73个,发病率为67.6%。菌群数变化检测发现,处理组菌群数小于对照组菌群数,表明利用pCLBV202-CB系统表达CB增强了尤力克柠檬的溃疡病抗性。【结论】构建了基于CLBV的病毒表达载体pCLBV202。利用pCLBV202在本氏烟和柑橘中系统表达CB可以提高植株对细菌性病害的抗性,这为柑橘细菌性病害的防控提供了新技术。
关键词: 柑橘叶斑驳病毒 ；病毒表达载体 ；抗菌肽 ；抗病性
被引量
4
摘要： [目的]本研究对转多基因库安托杨株系的溃疡病抗病性检测及抗病相关基因的表达分析,为通过基因工程手段培育抗病林木新树种提供有价值的参考。[方法]以转JERF36等多个外源基因的1年生库安托杨株系D5-9、D5-20、D5-21及非转基因受体D5-0为材料,对主干人工接种溃疡病菌的各株系病情指数进行了测定,同时对接种5 d后树皮组织中5个抗病基因的表达情况进行了实时定量PCR(qPCR)分析。[结果]在溃疡病菌胁迫下,3个转基因株系对溃疡病菌的抗性显著优于非转基因受体株系,转基因株系间抗病性也具有一定差异,D5-21的病情指数显著低于其它2个转基因株系;肉桂醇脱氢酶基因在3个转基因株系树皮中表达量均高于对照,类甜蛋白基因仅在D5-19树皮中的表达量高于对照,其他3个基因在转基因株系中的表达量或与对照相当或低于对照。[结论]转多基因库安托杨株系的溃疡病抗性与非转基因对照相比均有显著提高,且转基因株系间差异显著;同时转基因株系中不同抗病基因的表达模式也有很大差异,说明溃疡病菌胁迫下转多基因库安托杨抗病调控的复杂性,其分子调控机制还有待深入研究。
关键词: 转基因杨 ；ERF转录因子 ；杨树溃疡病 ；抗病性 ；基因表达
摘要： 【目的】了解沃柑叶片响应柑橘溃疡病侵染的分子机制及易感品种与柑橘溃疡病菌的互作应答机制,筛选出柑橘溃疡病菌危害沃柑叶片时的相关应答基因,为抗性育种提供基因基础。【方法】以接种溃疡病菌后0、2、4、6和8 d的沃柑叶片为试材,利用Novaseq 6000平台进行转录组双向测序,并对数据进行生物信息学相关性分析。【结果】接种无菌水(CK)后0、2、4、6和8 d获得的Clean reads分别是48 482 127、47 270 288、50 998 549、53 201 972和47 924 731条,接种柑橘溃疡病菌(JZY)后0、2、4、6和8 d获得的Clean reads分别是51 042 967、49 552 248、46 734 029、47 940 345和45 371 891条。接种后0、2、4、6和8 d的上调差异表达基因数量分别为1、947、1081、656和2108个,下调差异表达基因数量分别为1、343、753、303和1908个。在接种后2、4、6和8 d有374个基因均表达差异,其中上调基因为61个,下调基因为313个。GO功能富集分析结果显示,沃柑叶片响应溃疡病不同时期的差异表达基因,主要集中在生物进程、分子功能和细胞组分中。KEGG注释分析结果显示,差异表达基因主要参与次生代谢物的生物合成、植物与病原体相互作用、植物激素信号转导、过氧化物酶体和蛋白质内质网合成等途径。【结论】植物与病原体相互作用、植物激素信号转导、过氧化物酶体和蛋白质内质网合成4条通路为柑橘感抗病相关的重要代谢通路。研究结果可作为深入研究柑橘种质资源感抗溃疡病基因和探究柑橘与病原菌互作分子机制的理论提供参考依据。
关键词: 沃柑 ；柑橘溃疡病 ；离体接种 ；转录组 ；差异表达基因
被引量
6
摘要： 【背景】由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。【方法】利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC)检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology(GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。【结果】超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素(IAA)和茉莉酸(jasmonic acid,JA)含量显著降低,而水杨酸(salicylic acid,SA)含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。【结论】超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。
关键词: 柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种 ；柑橘溃疡病 ；生长素 ；CsGH3.6 ；抗病性
被引量
22
摘要： 【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。
关键词: 柑橘 ；柑橘溃疡病 ；柑橘溃疡病菌 ；BZIP ；GST ；pull-down ；互作蛋白
被引量
12
摘要： 为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系,以高感品种晚锦橙(甜橙类,Citrus sinensis Osbeck)和高抗品种金弹(金柑类,Fortunella crassifolia Swingle)为试材,从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri)侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后,晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起,为典型的溃疡病症状;而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前,过氧化氢(H2O2)在金弹中的基础水平较晚锦橙高;接种后,两品种的H2O2含量均上升,但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高,代表膜脂过氧化程度的丙二醛(MDA)含量在两个品种中均增加,但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶(SOD)活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势;过氧化氢酶(CAT)活性在两个品种中均提高且差异不大;过氧化物酶(POD)活性在两个品种中均提高,但晚锦橙的上升更快,且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达,但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙;参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大,而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明,溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应,但在金弹中更为强烈,有助于诱导发生细胞程序性死亡,而限制病原菌的生长,这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。
关键词: 柑橘 ；溃疡病 ；细胞程序性死亡 ；活性氧 ；丙二醛 ；抗氧化酶 ；基因表达
被引量
10
摘要： 为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因,对柑橘促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因家族进行注释和功能域分析,明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’(Fortunella japonica Swingle)和感病品种‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中受病原菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)诱导的表达情况;并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员,根据系统发育树将其分为3个亚类,均含有促分裂原活化蛋白激酶(Pkinase)功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高,CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗(感)品种中均受病原菌强烈诱导,且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种;CsMPK3和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应;CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调,而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照;CsMPK19的表达在抗(感)品种中均受病原菌强烈诱导,且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19,其序列全长为1824 bp,编码607个氨基酸,分子量为69174.36 D,为非分泌性蛋白,其25~316aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染,推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。
关键词: 柑橘 ；溃疡病 ；MAPK ；基因克隆 ；表达量 ；启动子
被引量
18
摘要： 猕猴桃细菌性溃疡病是一种危害世界猕猴桃生产的毁灭性病害,目前尚未有有效的防治办法。培育抗性品种是保证猕猴桃产业健康发展的重要途径之一,猕猴桃溃疡病抗性育种成为近年来猕猴桃研究的热点。但是,目前大部分猕猴桃种质资源对溃疡病的抗性不明,限制了猕猴桃优异抗性种质资源的发掘和利用。虽然人们发展出了一些猕猴桃溃疡病抗性鉴定和评价方法,但是使用效果并不理想,存在较大的局限性,鉴定的准确性和稳定性还有待提高。该文针对猕猴桃溃疡病抗性育种中的几个方面,如抗性材料的选育(现有品种的抗性、抗性砧木研究和野生抗溃资源等),抗性鉴定和评价技术(大田鉴定、活体或离体鉴定等)及抗性机理研究等进行综述,并针对存在的问题,提出建设性意见。在猕猴桃溃疡病抗性育种过程中,最关键的是要建立一个科学、系统的溃疡病抗性评价体系,以对猕猴桃种质资源进行大规模的抗性普查和评估,在此基础上充分利用种间杂交和工程育种技术加快抗性育种进程,并以此带动猕猴桃溃疡病抗性机理的深入研究和抗病基因的挖掘和利用等,旨在从根本上解决猕猴桃生产中受溃疡病困扰这一关键难题,促进猕猴桃产业绿色、健康和可持续性发展。
关键词: 猕猴桃 ；溃疡病 ；抗性育种 ；鉴定和评价 ；抗性机理
被引量
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摘要： 枸橼C-05是抗溃疡病的柑橘种质资源,柠檬是枸橼的后代,其自交后代可能继承枸橼的抗性基因。为分析柠檬自交群体对柑橘溃疡病的抗感性规律,本研究建立了433株的‘尤力克’柠檬自交后代群体,并利用SSR分子标记对合子胚实生苗进行了鉴定,观察合子胚实生苗和珠心胚实生苗叶片形态学的差异,对所有自交后代离体注射接种柑橘溃疡病菌,初步评价了实生后代对柑橘溃疡病的抗病性差异。结果表明‘尤力克’柠檬存在多胚性,从300对SSR引物中筛选到8对可用于‘尤力克’柠檬合子胚鉴定的引物,共鉴定出合子胚实生苗57株,确定珠心胚实生苗4株。叶形指数、叶尖指数、翼叶长、翼叶宽和叶柄长均不能作为区分‘尤力克’柠檬合子胚实生苗与珠心胚实生苗的形态学标记,但合子胚实生苗的翼叶长度变异幅度大于珠心胚。57株合子胚实生苗离体接种柑橘溃疡病菌后,5株表现为抗病,52株表现为感病;4株珠心胚实生苗均表现为感病;在372株未鉴定清楚的自交后代中,8株表现为抗病,364株表现为感病。本研究表明利用SSR分子标记还不能完全鉴定出‘尤力克’柠檬合子胚植株,可能需要更多的引物或更灵敏的分子标记才能把全部实生后代鉴定出来。利用合子胚自交后代接种鉴定,更有利于分析‘尤力克’柠檬对柑橘溃疡病的抗感性遗传规律,挖掘抗性基因,为柠檬的抗病育种提供种质资源。
关键词: '尤力克’柠檬 ；SSR分子标记 ；叶形态学观察 ；合子胚实生苗鉴定 ；抗性鉴定
被引量
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摘要： 【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR_1和LRR_2);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系(8个株系)进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降(为野生型的23.12%—75.49%),其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。
关键词: 柑橘溃疡病 ；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 ；CsPGIP ；超表达 ；溃疡病抗性
被引量
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摘要： 为解析柑橘R2R3-MYB转录因子家族成员CitMYB20基因的分子生物学特征及受柑橘黄龙病病菌和溃疡病病菌的诱导表达情况。本研究同源克隆了不同柑橘品种中CitMYB20基因的开放阅读框序列,利用生物信息学方法预测其生物学功能并分析比较该基因在不同品种间的序列差异。在洋葱表皮细胞中瞬时表达观察CitMYB20的亚细胞定位。利用qRT-PCR技术分析黄龙病病菌胁迫和溃疡病病菌胁迫时CitMYB20的表达量变化。研究结果显示柑橘CitMYB20基因在晚锦橙、酸柚、纽荷尔脐橙和四季橘中的相似度达到99.01%,高度保守。晚锦橙中该基因含有3个外显子和2个内含子,其开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸残基。CitMYB20蛋白的N端高度保守,具有两个R结构域,属于典型的R2R3类型的MYB转录因子家族的成员。洋葱表皮细胞亚细胞定位分析结果表明该基因定位于细胞核中。CitMYB20基因受黄龙病病菌胁迫时,在黄龙病敏感品种晚锦橙和耐性品种酸柚中均显著上调表达,其中在耐病品种酸柚中上调表达24倍,在感病品种晚锦橙中上调表达34倍;而在溃疡病病菌胁迫时,CitMYB20基因仅在溃疡病抗性品种四季橘中显著差异表达,感病后上调表达3倍。推测该基因对黄龙病和溃疡病的应答差异可能是因为不同的调控机制造成的,构建CitMYB20基因过表达载体拟对不同病原的应答情况进行深入研究。
关键词: 柑橘 ；R2R3-MYB转录因子 ；亚细胞定位 ；黄龙病 ；溃疡病
被引量
14
摘要： 为了明确扩展蛋白基因CsEXPA8的生物学功能,通过构建超量表达和干扰表达CsEXPA8的载体转化易感溃疡病的柑橘品种‘晚锦橙’,对获得的转基因植株进行表型分析和对溃疡病抗性评价。结果表明,CsEXPA8在‘晚锦橙’中具有组织表达特异性,并受溃疡病菌诱导表达;CsEXPA8的过表达促进了叶片的长度和宽度的增加以及春梢直径的增粗,提高了对溃疡病的敏感性;而干扰CsEXPA8的表达后,转基因植株的叶片长度、宽度和春梢直径变小,但对溃疡病的抗性增强。上述结果表明,CsEXPA8正向调节了‘晚锦橙’的生长,负向调控了‘晚锦橙’对溃疡病的抗性。
关键词: 柑橘 ；扩展蛋白 ；CsEXPA8 ；植物生长 ；柑橘溃疡病 ；抗性
被引量
2
摘要： 为了探究过氧化氢酶基因Cs Kat01在柑橘抵御溃疡病过程中的作用,对感病品种‘晚锦橙’和抗病品种‘四季橘’中Cs Kat01进行了生物信息和表达分析,并探究了溃疡病菌接种处理后两品种中CAT酶活性和H2O2含量的关系。克隆Cs Kat01的编码序列并对该基因及其编码蛋白进行结构和功能分析,发现Cs Kat01编码框全长为1482bp,共编码493个氨基酸残基,蛋白序列中含有典型的CAT结构域;通过启动子序列克隆和分析发现‘晚锦橙’和‘四季橘’核心启动子区域均含有水杨酸、茉莉酸和脱落酸的响应元件,但数量不同;利用q RT-PCR分析水杨酸、茉莉酸、脱落酸和柑橘溃疡病菌(Xcc)对Cs Kat01的诱导表达特性,发现Cs Kat01的高表达可能使柑橘相对更感病;结合Xcc诱导后植物组织中Cs Kat01酶活性和H2O2含量,综合分析Cs Kat01、CAT酶活、H2O2含量和柑橘对溃疡病抗性之间的关系,推测Cs Kat01基因可能通过调控CAT的酶活性,改变H2O2含量进而影响柑橘对溃疡病的抗性。
关键词: 柑橘 ；溃疡病 ；过氧化氢酶 ；CsKat01 ；过氧化氢
被引量
20
摘要： 【目的】前期根据转录组数据挖掘柑橘单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,通过关联分析获得14个与柑橘溃疡病耐/感性关联的SNP。以此为基础,本研究利用柑橘杂交群体验证这些位点与柑橘溃疡耐/感性的相关性,以期获得显著相关的SNP,并对其相关的基因进行柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)和植物激素诱导表达分析。【方法】以抗病和敏感柑橘品种及其杂交F1代群体共143个材料为试材,采用离体叶片针刺接种法进行溃疡病抗性鉴定;利用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术,对F1群体进行SNP分型;使用DPS软件对F1群体的溃疡病耐/感性表型和SNP基因型进行相关分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析其中一个SNP相关的柑橘钙依赖性蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase gene,CDPK)的诱导表达模式。【结果】供试杂交F1代群体的病斑面积在0.75—3.29 mm2;病情指数在30.2—100,而抗病品种‘金弹’病情指数为11.1,敏感品种‘冰糖橙’病情指数为100。病情指数较低的杂交后代,其亲本至少有1个为耐病性品种,母本耐病性强的居多。根据病情指数确定免疫材料1个,高抗17个,中抗31个,中感38个,高感56个。SNP分型结果显示,14个SNP位点在143个供试材料间均有多态性,可分为3种不同的基因型,2种纯合型和1种杂合型。简单相关分析结果表明,多个SNP位点的基因型与病斑面积及病情指数相关性显著。典型相关分析结果显示,其中5个SNP位点与病斑面积相关性较高,相关系数绝对值均>0.2,其编号分别为HP31、HP42、HP85、HP87、HP170,可利用这5个SNP位点的基因型预测柑橘溃疡病耐性的强弱。其中SNP位点HP31位于CsCDPK(CAP ID:Cs4g10370)的编码区,对柑橘离体叶片接种溃疡病菌诱导处理6、12、24、48和72 h后进行基因相对表达量分析,发现‘金弹’(高抗)、‘新生系3号椪柑’(中抗)和‘冰糖橙’(高感)中该基因的表达量均呈先升后降趋势,且均在48 h其相对表达量达到最高;接菌处理后12 h,‘金弹’中该基因的相对表达量为对照的3倍,而‘新生系3号椪柑’和‘冰糖橙’中无明显差异。此外,CsCDPK受水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导表达,且在不同溃疡病耐/感性品种中该基因诱导表达的模式不同。【结论】获得5个与溃疡病耐/感性显著相关的SNP,可用作柑橘溃疡病耐/感性筛选标记。SNP位点HP31相关的CsCDPK受溃疡病菌和SA、MeJA和ABA诱导表达,该基因可能在柑橘应答溃疡病菌侵染的信号转导过程中具有重要功能。
关键词: 柑橘溃疡病 ；柑橘溃疡病菌 ；单核苷酸多态性 ；钙依赖性蛋白激酶基因 ；诱导表达
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