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【期刊论文】 • 丁喜晴 ¹朱忠方 ¹崔桂云 ¹沈霞 ¹ +2位作者 • 《徐州医学院学报》 • 2015年第7期 427 - 431，共5页

机构： [1] 徐州医学院附属医院神经内科[2] 徐州市中心医院神经内科

摘要：目的观察钙调激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制剂KN-93对帕金森病（PD）小鼠运动症状及异动症发生的影响并探讨其机制。方法将6-羟基多巴立体定向注射于小鼠纹状体制备PD小鼠模型，将造模成功的PD小鼠随机分为PD组、KN-92组和KN-93组，并设假手术组，每组16只。KN-92组和KN-93组给予左旋多巴（15ms／kg）和苄丝肼（12ms／kg）腹腔注射，假手术组及PD组腹腔注射等量生理盐水，每天1次，持续14天。在第11、12天左旋多巴注射前，KN-92组给予KN-92处理，KN-93组给予KN-93处理（2μl，浓度0．1s／L），假手术组及PD组给予等量生理盐水。于左旋多巴给药的第1、3、5、8、10、13天对各组大鼠进行异常不自主运动（AIM）评分，并于第0、4、9、14天进行圆柱体实验评分。此外，采用Western blot法检测纹状体区CaMKli及PKA磷酸化水平。结果随左旋多巴治疗时间的延长，大鼠AIM评分逐渐升高，给予KN-93处理后，AIM评分则明显下降（P〈0．01）；圆柱体实验提示给予左旋多巴后，KN-93组、KN-92组左前肢使用率较PD组明显升高（均P〈0．01）。Westernblot结果显示PD组及KN-92组CaMKlI及PKA磷酸化水平较假手术组明显升高（均P〈0．01），KN-93组CaMKⅡ及PKA磷酸化水平较KN-92组明显降低（均P〈0．01）。结论CaMKⅡ抑制剂KN-93可以减少PD小鼠异动症的发生而不影响左旋多巴的抗帕金森病作用。其机制可能是通过抑制PKA信号通路从而减少异动症的发生，提示抑制CaMKⅡ信号可能有助于减少PD小鼠异动症的发生。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；运动并发症 ；磷酸化；钙调激酶Ⅱ ；KN-93

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【期刊论文】 • 王庆阁 ^1,2,3刘飞祥 ²张运克 ^2,4

• 《中国实验方剂学杂志》 • 2024年第10期 225 - 235，共11页

机构： [1] 河南中医药大学第一临床医学院[2] 河南中医药大学第一附属医院[3] 河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院 +1个机构

摘要： 帕金森病(PD)是一种以黑质多巴胺能神经元进行性退变和路易小体形成为病理变化的常见的中老年神经系统退行性疾病,患病率高且病程长。西医治疗PD以药物为主,早期疗效显著;但随着疾病进展和药物的长期使用,药效会明显减退,或可出现运动并发症等,远期疗效欠佳。中医药作为一种传统的医学体系,对帕金森病有着独特的认识。中药在PD的治疗中发挥着重要的作用,其具有天然、温和、安全有效的特点,可以与西药相配合,协同增强疗效、减轻西药的不良反应。PD发病机制复杂,涉及线粒体功能障碍、细胞凋亡等多个层面,神经炎症也参与PD的多巴胺能神经元的进行性退化。Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路是经典的炎症通路,其表达变化在机体炎性反应发生发展过程中发挥重要作用,近年来中医药在该通路方面的研究日渐增多。笔者对近10年中西医文献进行总结梳理,从中药单体、复方、其他中医疗法方面围绕中医药调控TLR4/NF-κB通路治疗PD的相关作用机制进行综述,以期为寻找药物治疗和基因治疗的新靶点,及中医药防治PD的深入研究提供一些参考。

摘要译文

关键词: 中医药；帕金森病 ；Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路；作用机制；研究进展

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【期刊论文】 • 刘振国

万赢张煜 • 《中华神经科杂志》 • 2017年第9期 641 - 645，共5页

机构： [1] 上海交通大学医学院附属新华医院神经内科

摘要： 帕金森病（Parkinson＇s disease）是常见的神经系统变性疾病,我国65岁以上人群的患病率为1.7％ [1],与欧美等发达国家相近.随着年龄的增长,帕金森病患病率随之上升,预计2030年我国帕金森病的患病人口将达4.94×106人,约为全球患病人口的一半[2].左旋多巴替代治疗一直以来被公认为是帕金森病有效的临床治疗方案,贯穿疾病的治疗始终.然而,目前任何治疗方法均不能阻止疾病的进展.运动并发症的出现标志着帕金森病病程中晚期的到来,这是所有帕金森病患者和临床医生不能回避的事实.帕金森病中晚期临床症状复杂多样,并不局限于运动并发症,还包括非运动并发症[3-4],两者均严重削弱了疾病前期的治疗效果,增加了疾病的致残性,影响患者的生活质量[5-7].相关的病理机制和临床症状的复杂性以及对生活质量的影响使得中晚期临床干预成为整个帕金森病病程治疗的重点和难点.然而当前临床实践仍然存在诸多问题和困惑,包括如何正确识别运动并发症的不同亚型、对非运动并发症的忽视以及左旋多巴替代治疗在运动并发症干预方面的利与弊等.因此,对帕金森病运动并发症发病机制的研究和临床应用及其预防和治疗策略的思考尤为重要.

摘要译文

关键词: 运动并发症 ；帕金森病 ；临床干预；神经系统变性疾病；治疗方案；临床症状；病患病率；替代治疗

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【期刊论文】 • 吴娜刘振国 • 《上海交通大学学报（医学版）》 • 2011年第8期 1194 - 1197，共4页

机构： [1] 上海交通大学医学院附属新华医院神经内科

摘要： G蛋白耦连受体激酶(GRKs)是一类介导受体脱敏的重要可溶性蛋白质,是G蛋白耦连受体(GPCR s)信号转导通路负反馈机制中必不可少的因素。神经系统疾病中神经激素水平的升高,以及神经激素持续刺激引起的不利后果,表明了神经激素受体反应性脱敏是一种非常重要的保护机制。近年来研究显示,GRKs在帕金森病及其运动并发症的发展过程中起着重要作用,其中GRK6主要定位于中型棘状神经元上,GRK6敲除与多巴胺受体的超敏有关,是纹状体最关键的GRKs。文章就近年来GRKs在帕金森病发病机制中的研究进展进行综述。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；G蛋白耦连受体激酶；G蛋白耦连受体

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【期刊论文】 • 杨新新 ¹任甜甜 ²宋璐 ¹吴娜 ¹ +2位作者 • 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 • 2012年第1期 9 - 16，共8页

机构： [1] 上海交通大学医学院附属新华医院神经内科[2] 上海交通大学药学院

摘要：目的观察聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）包裹的可释放左旋多巴/苄丝肼的微球对帕金森病（PD）大鼠运动症状及异动症发生的影响并探讨其机制。方法利用PLGA包裹左旋多巴或苄丝肼制成微球,采用高效液相法测定微球在大鼠体外释放左旋多巴/苄丝肼的浓度。6-羟基多巴胺（6-OHDA）腹腔注射制备PD大鼠模型,将造模成功的PD大鼠分为PD组、左旋多巴处理组和微球处理组,并设假手术组,各组12只。给予左旋多巴处理组大鼠皮下注射左旋多巴（12mg/kg）和苄丝肼（15mg/kg）,给予微球处理组大鼠皮下注射含同等剂量左旋多巴和苄丝肼的微球。于治疗的第1、7、14天计数大鼠经阿扑吗啡诱导的旋转圈数。2周后行大鼠异常不自主评分（AIM）并利用Western blot检测大鼠纹状体区细胞外信号调节激酶（ERK1/2）的磷酸化水平。结果体外释放试验结果显示微球内的左旋多巴/苄丝肼均匀缓慢释放,第7天时左旋多巴和苄丝肼释放量分别达到91.2%%和97.1%。治疗2周后,微球处理组大鼠和左旋多巴处理组大鼠阿扑吗啡诱导的旋转圈数均明显下降（均P〈0.05）,但在治疗的第1、7、14天两组比较无明显统计学差异。微球处理组大鼠于治疗后的第1、2、4、6、8、10、12、14天的AIM评分（轴性＋上肢＋口面）与左旋多巴处理组大鼠有统计学差异（均P〈0.05）。Western blot结果显示左旋多巴处理组大鼠纹状体ERK1/2水平较PD组和假手术组明显升高（均P〈0.05）。微球处理组大鼠纹状体ERK1/2磷酸化水平较左旋多巴处理组大鼠明显降低（P〈0.01）。结论微球皮下注射可以改善PD大鼠的运动症状,同时可以减少PD大鼠异动症的发生,这可能与微球释放的左旋多巴持续性刺激PD大鼠从而减少ERK1/2的磷酸化水平有关。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；异动症；细胞外信号调节蛋白；左旋多巴；苄丝肼

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被引量 9

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【期刊论文】 • 万志荣 ¹冯涛 ²

• 《临床神经病学杂志》 • 2020年第3期 226 - 228，共3页

机构： [1] 航天中心医院神经内科[2] 首都医科大学附属北京天坛医院神经病学中心运动障碍性疾病科

摘要：脆性左旋多巴反应是帕金森病患者一种特殊的运动障碍表现形式,特点是很小剂量的左旋多巴就能发生异动症,发病机制复杂,有诸多影响因素参与其中。以往临床上对这类人群关注较少,但其对患者生活质量影响较大,故如何早期识别和预防其发生对临床有重要的研究指导意义。该现象常见体质量较轻的女性帕金森病患者,治疗应侧重于预防运动并发症发生,减少单次左旋多巴剂量或增加服药次数,添加金刚烷胺,脑深部电刺激是主要的三种治疗手段。

摘要译文

关键词: 脆性左旋多巴；异动症；女性；低体质量；脑深部电刺激

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【会议论文】 • 高博王寅昊陈巍

作者单位： [1] 河北师范大学

会议名称：

会议时间： 2023-07-14

摘要：研究目的:为探究帕金森病(Parkinson’s disease,PD)异动症运动功能障碍可能涉及的神经生理学机制,本文对Erk/MAPK信号通路参与调节PD异动症运动障碍相关研究进行归纳总结,以此为后期运动治疗及预防LID提供理论依据。研究方法:根据关键词在PubMed、Web of Science以及中国知网3个中英文数据库进行检索,按照相关性共检索到近十年45篇文献,包括发表在学术期刊上的研究论文、综述和元分析,获取Erk/MAPK信号通路在PD小鼠异动症相关运动障碍中作用的研究成果和最新进展。通过对45篇文献进行筛选,包括文献题目、摘要和全文阅读分析,将不符合研究目的的文献排除,筛选出符合的29篇文献进行综合分析并进行归纳总结。研究结果:PD是一种由于黑质-纹状体多巴胺(Dopamine,DA)能神经元凋亡导致的神经退行性疾病,由于PD患者黑质-纹状体DA神经元变性,因此补充DA前体物质左旋多巴(Levodopa, L-DOPA)成为治疗PD的首要临床策略,L-DOPA是一类可以自由通过血脑屏障且前期治疗效果显著的药物,外源性补充后可直接转化为DA进行补充。然而,现有的药物疗法具有明显的"蜜月期",患者长期服用后药物疗效减退,伴随着运动并发症,最典型的是L-DOPA诱导的异动症(L-dopa induced dyskinesia, LID)。现有研究证明,LID的重要细胞靶点为表达多巴胺Ⅰ型受体(D1R)的中等棘状神经元(Dopamine receptor type 1-medium spiny neurons,D1-MSNs),并且与其上的细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, Erk)及其磷酸化(Phosphorylated-Erk, p-Erk)有关。已有研究证明,运动干预可以抵抗黑质DA能神经元丢失、延缓DA浓度下降、改善异常受体表达与重塑DA能神经元突触传递功能等方面的作用,在PD动物模型中,运动干预和L-DOPA治疗共同进行可以有效缓解运动障碍,但具体作用机制尚不明确。细胞外信号调节激酶/丝裂原激活蛋白激酶(Erk/MAPK)信号通路在PD的病理生理中起着关键作用,Erk/MAPK信号通路参与调控细胞的生长、增殖和分化,最新研究表明,PD模型动物在L-DOPA腹腔注射后,Erk/MAPK信号通路活性的改变与运动障碍的发展密切相关。L-DOPA可引发Erk/MAPK信号通路的异常激活,对神经元的功能和结构产生重要影响。异常激活的Erk/MAPK信号通路被认为参与了神经元的异常增殖和突触重塑,L-DOPA处理导致神经元的异常增殖过程,可能涉及与Erk/MAPK信号通路相关的细胞周期调控蛋白的表达和活性改变。此外,L-DOPA处理可能导致突触可塑性的改变,包括突触形态和突触传递功能的异常重塑,Erk/MAPK信号通路的激活涉及多个分子机制,首先,L-DOPA在PD患者中通过DA受体与细胞膜上的TH受体相互作用,最终导致Erk的激活,活化的Erk可调控多种细胞功能,包括基因表达、细胞增殖和突触可塑性,其异常激活可能与神经元的损伤和神经炎症反应有关,从而导致运动障碍的发展。综上所述,Erk/MAPK信号通路在LID中可能发挥着重要作用,长期使用L-DOPA导致Erk/MAPK信号通路异常激活,进而影响神经元的功能和突触可塑性,最终引发异常运动行为。此外,Erk/MAPK信号通路还与其他信号通路相互作用,进一步调节运动障碍,Wnt信号通路和Erk/MAPK信号通路之间存在交叉调控,共同参与PD的发病机制。D1R/D2R信号通路也与Erk/MAPK信号通路有相互作用,可能影响运动功能的调控。Deslauriers等人发现D1R的激活引发了Erk的磷酸化和MAPK级联反应的激活,从而增强了运动功能,这表明D1R信号通路通过Erk/MAPK信号通路参与了运动功能的调控。此外,David等人表明D2R的激活抑制了Erk的磷酸化和MAPK级联反应的激活,从而抑制了运动功能。因此,进一步研究有助于深入了解Erk/MAPK信号通路在LID病理生理中的作用,并为开发新的治疗策略提供理论依据,以减轻或预防L-DOPA等药物所导致的运动并发症。研究结论:1.L-DOPA治疗引发PD小鼠Erk/MAPK信号通路异常激活,Erk/MAPK信号通路活性改变。2.L-DOPA诱导的Erk/MAPK信号通路异常激活与神经元的损伤和突触重塑相关。3.Erk/MAPK信号通路的异常激活与炎症反应密切相关。4.Erk/MAPK信号通路与Wnt和D1R/D2R信号通路存在相互作用。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；异动症；细胞外信号调节激酶；运动

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【期刊论文】 • 《中华医学信息导报》 • 2017年第19期 8 - 8，共1页

摘要：推荐理由：帕金森病中晚期临床症状复杂多样，并不局限于运动并发症，还包括非运动并发症，两者均严重削弱了疾病前期的治疗效果，增加了疾病的致残性，影响患者的生命质量。相关的病理机制和临床症状的复杂性以及对生命质量的影响使得中晚期临床干预成为整个帕金森病病程治疗的重点和难点。然而当前临床实践仍然存在诸多问题和困惑，因此，对帕金森病运动并发症发病机制的研究和临床应用及其预防和治疗策略的思考尤为重要。

摘要译文

关键词: 运动并发症 ；帕金森病 ；临床干预；治疗效果；临床症状；疾病前期；生命质量；病理机制

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【学位/硕士】 • 宋成寰 • 南京医科大学 • 导师：胡刚 • 2018年

摘要： 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是目前仅次于阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)的全球第二大神经退行性疾病,其主要病理特征包括中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失、神经元中路易小体(Lewy body)沉积以及胶质细胞活化。PD病人临床表现包括静止性震颤、肌肉僵直和运动障碍等。目前的研究认为兴奋性毒性、氧化应激、线粒体功能障碍及神经炎症等在PD的病理进程中发挥重要的作用,然而确切的发病机制至今尚未阐明。虽然发病机制的多样性制约着PD治疗学的发展,但找寻能够缓解多巴胺能神经元进行性退变的分子靶标,一直是研发理想PD治疗药物的重要目标。近年来的研究表明,线粒体功能障碍是PD中导致DA神经元死亡的重要原因。神经细胞线粒体功能障碍会直接影响脑内能量代谢,并且造成活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)的大量产生,加重氧化应激。此外,受损线粒体还会释放凋亡诱导因子,激活凋亡通路,从而诱导神经元凋亡。Pink1(PTEN induced putative kinase 1)是帕金森病发病的关键基因之一,其突变会导致早发性常染色体隐性遗传帕金森综合征(autosomal recessive early-onset Parkinson's disease),它同时也是与线粒体功能密切相关的一个基因。Pink1蛋白由581个氨基酸构成,包含线粒体目标信号和跨膜序列,是一种靶向于线粒体的的丝/苏氨酸蛋白激酶。大量研究表明,Pink1在维持细胞线粒体功能和稳态、促进线粒体自噬(Mitophagy)、保护细胞免受氧化应激诱导的凋亡等方面发挥重要的作用,基因敲除Pink1会导致线粒体功能受损,而线粒体功能紊乱引起的神经突触退化、神经元萎缩甚至凋亡在PD的发生发展中起到了重要的作用。因此,通过调节Pink1的表达来改善线粒体功能可能是一种有效对抗PD的神经保护策略。然而Pink1的转录后调控机制及其在PD发生发展中的作用目前仍鲜有报道。MicroRNA(miRNA)是一类在细胞中高度保守并且不具有编码蛋白质功能的小分子单链RNA,其长度一般为20～25个核苷酸并广泛存在于真核生物中,主要通过与靶基因mRNA的3'UTR(3'端非翻译区,3'untranslatedregion)互补配对从而发挥在转录后水平抑制蛋白表达的功能。据统计,人体内超过三分之一可编码蛋白质的基因都受到miRNA的调控,并且已发现miRNA参与了细胞增殖和凋亡、激素的分泌、肿瘤形成以及神经退行性疾病等生理病理过程。越来越多的研究表明,miRNA异常表达在PD的病理进程中发挥重要作用,其可能成为PD早期诊断的一种生物标志物,亦或许可通过调控miRNA的表达来达到延缓PD病理进程的目的。MiR-24-3p是miRNA家族中重要的一员,在哺乳动物的各种组织中广泛表达,主要参与调节肿瘤细胞的增殖与凋亡,且其在不同肿瘤细胞的生长过程中所展现的作用各不相同。有研究表明PD患者血浆中miR-24-3p的表达与正常人相比显著升高,提示miR-24-3p可能与PD的发生发展相关,然而目前还没有关于miR-24-3p在PD中具体作用的报导。因此,本文首先证明了 miR-24-3p靶向调节Pink1的表达。在此基础上,通过离体和在体实验研究miR-24-3p/Pink1转录后调控对MPTP/MPP+诱导的多巴胺能神经元损伤和凋亡的影响及其机制。离体研究结果表明,miR-24-3p mimic抑制Pink1的表达且加剧MPP+引起的SH-SY5Y细胞损伤,而miR-24-3p inhibitor显著抑制MPP+诱导的细胞毒性损伤和凋亡通路的激活;进一步的研究阐明了miR-24-3p inhibitor通过促进损伤线粒体清除、改善线粒体功能,发挥细胞保护作用的机制。最后我们对miR-24-3p inihbitor的神经保护作用进行了在体验证:中脑立体定位注射miR-24-3p antagomir显著减轻MPTP诱导的A53Ttg/tg小鼠黑质致密部多巴胺能神经元损伤并减少A53Ttg/tg小鼠中脑α-synuclein蛋白聚积,同时上调A53Ttg/tg小鼠中脑自噬水平。本课题揭示了 miR-24-3p在PD病理进程中的作用并阐明其机制,为靶向miR-24-3p/Pink1转录后调控发展PD治疗新策略提供了实验依据。目的:研究miR-24-3p/Pink1转录后调控对PD模型小鼠多巴胺能神经元损伤的影响及机制。方法:(1)C57BL/6J小鼠制备MPTP亚急性PD模型后免疫印迹(Western Blot,WB)检测中脑Pink1蛋白表达、实时荧光定量PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测中脑miR-24-3p表达,培养SH-SY5Y细胞并给予不同浓度(0、100、200、400 μM)的MPP+刺激,WB检测细胞Pink1蛋白表达、RT-PCR检测细胞miR-24-3p表达;(2)使用10月龄经CRISPR-Cas9技术构建的全身性Pink1基因敲除(Pink1-1-)大鼠,通过免疫组织化学法对其黑质中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞进行定量分析;(3)通过生物信息学分析结合文献报导推测可能靶向Pink1并参与PD病理进程的miRNA,RT-PCR检测它们在MPTP亚急性PD模型小鼠中脑组织内的表达,筛选出最有可能转录后调节Pink1 表达的 miRNA(miR-24-3p);构建 miR-24-3p 模拟物(miR-24-3p mimic)和miR-24-3p 抑制剂(miR-24-3p inhibitor),转染 SH-SY5Y 细胞,Western Blot 检测Pink1蛋白表达,构建野生型与突变型Pink1 mRNA3'UTR质粒,与miR-24-3p mimic共转入HEK-293T细胞,荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性;(4)SH-SY5Y 细胞转染 miR-24-3p mimic/miR-24-3p inhibitor(100 nM),给予 MPP+刺激(400 μM)后检测细胞活力及LDH释放,Annexin-V和PI双染法、Hoechst染色法检测细胞凋亡、Western Blot检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-9)表达;(5)SH-SY5Y 细胞共转入 GFP-LC3 质粒与 miR-24-3p inhibitor(100 nM),并使用MitoTracker Deep Red标记线粒体,免疫荧光观察miR-24-3p inhibitor对SH-SY5Y细胞线粒体自噬的影响,同时分离细胞线粒体和胞浆蛋白,WB检测线粒体和胞浆Parkin的表达;(6)SH-SY5Y细胞转染miR-24-3p inhibitor(100 nM),给予MPP+刺激(400 μM)后采用JC-1染色检测细胞线粒体膜电位,MitoSox检测细胞线粒体ROS,给予自噬抑制剂3-MA后采用流式细胞仪检测受损线粒体数量;(7)SH-SY5Y细胞转染si-Pink1(100nM)或给予自噬抑制剂3-MA,MPP+刺激(400 μM)后检测细胞活力(CCK-8)、LDH释放;(8)采用RT-PCR和WB检测A53Ttg/tg小鼠中脑miR-24-3p和Pink1表达,A53Ttg/tg小鼠中脑立体定位注射带红色荧光标记的miR-24-3p antagomir后制备MPTP亚急性PD模型,对黑质致密部焦油紫染色阳性及TH阳性细胞进行计数;Western Blot检测中脑凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-9 表达。(9)A53Ttg/tg小鼠中脑 SNc 区立体定位注射miR-24-3p antagomir后免疫荧光双标观察TH和α-synuclein共定位情况。(10)A53Ttg/tg 小鼠中脑 SNc 区立体定位注射 miR-24-3p antagomir 后 Western Blot检测自噬蛋白LC3和p62表达;免疫荧光双标观察TH和LC3共定位情况。结果:(1)MPTP亚急性PD模型小鼠中脑Pink1蛋白表达下调C57BL/6J小鼠制备MPTP亚急性PD模型后中脑Pink1蛋白表达显著降低,200、400μM MPP+刺激SH-SY5Y细胞显著下调Pink1蛋白水平。(2)Pik1基因敲除大鼠SNc区TH+神经元数目显著减少免疫组织化学法对10月龄Pink1基因敲除大鼠中脑黑质致密部TH阳性神经元进行定量分析,结果显示,基础状态下Pink1-/-大鼠与WT大鼠相比黑质致密部TH阳性细胞数减少了 43%。(3)MiR-24-3p靶向调节Pink1表达通过生物信息学网站(Targetscan,mirDIP,miRcode)预测结合文献报导推测miR-24-3p、miR-29b、miR-30b和miR-142-5p可能参与PD病理进程并靶向调节Pink1表达;C57BL/6J小鼠制备MPTP亚急性PD模型后中脑miR-24-3p表达升高,miR-29b 表达下降,miR-30b 和 miR-142-5p 表达不变,MPP+(100、200、400 μM)刺激SH-SY5Y细胞呈浓度依赖性升高miR-24-3p水平,提示miR-24-3p可能靶向调节Pink1表达;miR-24-3p mimic显著降低SH-SY5Y细胞Pink1蛋白表达(P<0.01),而 miR-24-3p inhibitor 显著上调 Pink1 蛋白水平(P<0.01);WT-Pink1 3'UTR质粒与miR-24-3p mimic共转入HEK-293T细胞后荧光素酶活性显著下降(P<0.01),而突变型Mut-Pink1 3'UTR质粒与miR-24-3pmimic共转染后荧光素酶活性无明显变化。(4)MiR-24-3p inhibitor减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤及凋亡转染 miR-24-3p inhibitor(100 nM,24 h)部分逆转 MPP+(400 μM)引起的SH-SY5Y细胞活力降低(P<0.05)和LDH释放增加(P<0.05),并抑制MPP+引起的细胞核固缩和凋亡通路活化;MiR-24-3pmimic(100nM,24h)进一步加剧MPP+所致细胞活力降低、LDH释放增加以及细胞凋亡。Pink1干扰RNA(si-Pink1,100nM)能取消 miR-24-3p inhibitor 的细胞保护作用。(5)MiR-24-3p inhibitor促进SH-SY5Y细胞线粒体自噬、改善线粒体功能转染miR-24-3p inhibitor(100 nM,24 h)后SH-SY5Y细胞自噬小体与线粒体共定位显著增多,胞浆Parkin蛋白水平显著下降,线粒体Parkin表达增加,表明miR-24-3p inhibitor促进SH-SY5Y细胞线粒体自噬;MPP+刺激(400 μM)显著促进SH-SY5Y细胞线粒体ROS产生、降低细胞线粒体膜电位、引起细胞线粒体损伤,下调miR-24-3p表达显著抑制MPP+引起的SH-SY5Y细胞线粒体ROS增多(P<0.01)、维持细胞正常线粒体膜电位(P<0.01),并减少受损线粒体数量(P<0.01);自噬抑制剂3-MA(5 mM)能取消miR-24-3p inhibitor对异常线粒体的清除作用及细胞保护作用(P<0.05)。(6)MiR-24-3p antagomir减轻MPTP诱导的A53Ttg/tg小鼠中脑多巴胺能神经元损伤A53Ttg/tg小鼠与WT小鼠相比中脑miR-24-3p水平显著升高(p<0.05)且Pink1表达降低(P<0.01);中脑立体定位注射miR-24-3p antagomir(双侧注射,每侧0.5 nmol,注射完成5天后进行后续实验)显著减轻MPTP诱导的A53Ttg/tg小鼠SNc区焦油紫染色及TH免疫阳性细胞丢失、抑制MPTP引起的中脑神经元凋亡,

摘要译文

关键词: miR-24-3p ；Pink1 ；线粒体自噬；神经元凋亡；转录后调节；帕金森病

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被引量 5

10. 认领

【学位/博士】 • 陈瑛 • 浙江大学 • 导师：张宝荣 ; 浦佳丽 • 2021年

摘要：目的帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)是第二常见的神经退行性疾病,除典型运动症状外,大部分患者会出现便秘、胃排空障碍等胃肠道非运动症状。近年来,众多研究发现PD患者胃肠道组织中存在α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)病理改变、肠道炎症表现及肠道菌群变化等,而炎症性肠病也被认为与PD在遗传学和流行病学上有紧密联系。因此,胃肠道在PD的发病和进展过程中起着重要角色,但其潜在机制尚不清楚。本研究拟深入探讨PD胃肠道功能障碍症状与疾病进展的关系,同时从遗传学和血清学角度进一步分析炎症性肠病与PD的关联,以期揭示PD胃肠道功能障碍的影响因素,寻找PD早期诊断的潜在生物标志物,为探讨胃肠道在PD发生发展中的作用提供新的思路。内容和方法:实验一:对帕金森病进展标志物倡议(Parkinson Progression Marker Initiative,PPMI)数据库中414名初诊PD患者基线和随访数据进行分析,通过混合线性模型分别分析了 PD患者胃肠道功能障碍症状与运动症状进展、疾病分级进展、运动并发症的关系;比较了不同胃肠道症状负担的PD患者纹状体多巴胺转运体丢失程度,以及脑脊液蛋白水平的差异。实验二:对PPMI数据库中PD队列和正常对照(healthy control,HC)队列的全基因组测序数据进行质控,筛选出炎症性肠病相关基因IL23R和NOD2的20个单核苷酸多态性(Single-nucleotidepolymorphisms,SNPs),分析比较这些SNPs在PD和HC中出现频率的差异,寻找可能与PD易感性相关的位点;此外,我们还分析了 PD和HC队列中20个SNPs与胃肠道症状的相关性,以及与PD疾病进展的关系。实验三:在浙江大学医学院附属第二医院神经内科招募PD患者、特发性震颤(essential tremor,ET)患者和HC,采集人口学信息,进行临床评估,检测炎症性肠病相关的血清学抗体,分别比较抗体阳性率及浓度在三组间的差异;针对在PD患者中显著升高的血清抗酿酒酵母菌抗体,进一步评估其诊断PD的准确度,分析其与PD胃肠道非运动症状和疾病严重程度的相关性。研究结果:实验一:PD胃肠道功能障碍症状与疾病进展的关系研究首先,我们发现PD患者胃肠道功能障碍症状与运动症状进展具有显著正相关,出现更多胃肠道症状的PD患者运动症状评分增加更快,疾病分级进展更快,且左旋多巴每日等效剂量需求更多。其次,运动并发症是PD中晚期常见的症状,预示着药物治疗的效果减弱和疾病的发展。我们分析了 PD胃肠道症状与运动并发症发生的关系,发现存在更多胃肠道症状的PD患者更早出现运动并发症。与临床表型相一致,我们还发现PD患者胃肠道负担与纹状体多巴胺转运体丢失存在显著正相关,出现更多胃肠道症状的PD患者其尾状核和壳核的多巴胺转运体摄取值减少更快。另外,本研究还发现PD患者胃肠道功能障碍症状与基线脑脊液Aβ1-42浓度相关,而与脑脊液α-Syn、Tau和p-Tau浓度无明显相关性。实验二:炎症性肠病相关基因单核苷酸多态性与PD关系研究我们筛选出14个IL23R基因的SNPs和6个NOD2基因的SNPs,比较了这些SNPs在PD和HC队列出现频率的差异。我们发现IL23R基因的rs10889667 A在PD中出现频率显著高于HC,可能是PD发病的风险位点。进一步分析这些SNPs与PD患者胃肠道等自主神经功能障碍的关系时,我们发现IL23R基因rs 10889667、rs72676073和NOD2基因rs8061960与PD患者胃肠道自主神经功能障碍及其他子项分别有显著相关性,而该效应在HC队列中并未发现。此外,所有20个SNPs与PD运动症状和疾病分级进展并无明显相关性。实验三:血清抗酿酒酵母菌抗体作为PD早期诊断的潜在生物标志物研究本章节研究发现早期PD患者中血清抗酿酒酵母菌抗体IgG和IgA水平较ET患者和HC显著升高,且该抗体水平与年龄呈显著正相关。校正年龄和性别后,我们发现血清抗酿酒酵母菌抗体IgG、IgA水平以及两者通过逻辑回归生成的复合指标均可显著区分PD患者和HC、PD患者和ET患者(曲线下面积约0.75)。进一步分析该抗体水平与临床参数的关系,我们发现与无便秘症状的PD患者相比,出现便秘症状的PD患者血清抗酿酒酵母菌抗体IgG水平显著升高,但IgA水平在两个亚组间无明显差异。此外,PD患者血清抗酿酒酵母菌抗体IgA水平与统一帕金森病评定量表第二部分(unified Parkinson'sdisease rating scale-Ⅱ,UPDRS-Ⅱ)评分显著相关。结论:本研究从症状学、遗传学和血清标志物等多维度全面探究了胃肠道功能障碍与PD的关系。我们首先发现了胃肠道功能障碍是PD疾病进展的风险因素。结合目前关于PD病理可能起源于肠神经系统的假说,本研究结果进一步证实了胃肠道在PD疾病进展中的作用,对于理解PD的病理生理机制提供了新的思路,未来靶向PD患者胃肠道功能障碍的治疗手段或可成为潜在的靶点。随后,本研究首次发现了 IBD相关基因IL23R及NOD2的单核苷酸多态性可能是PD发病和胃肠道功能障碍的风险因素,进一步证实了 IBD与PD之间的紧密联系,为理解PD的发病机制提供了更多信息。另一方面,目前PD的诊断主要依靠临床典型的运动症状和体征,寻找疾病早期诊断的潜在生物标志物,是目前临床所面临的一大挑战。本研究首次从胃肠道出发寻求PD相关血清学生物标志物,并发现了血清抗酿酒酵母菌抗体在PD患者中显著升高,可能可以成为早期诊断的潜在生物标志物,为将来研究提供了新的思路。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；胃肠道功能障碍；单核苷酸多态性；炎症性肠病；抗酿酒酵母菌抗体

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11. 认领

【学位/硕士】 • 刘曼 • 青岛大学 • 导师：马泽刚 • 2022年

摘要： 帕金森病（Parkinson's disease,PD）是一种以黑质致密部多巴胺（dopamine,DA）能神经元丢失和细胞内存在路易小体为特征的神经退行性疾病。PD患者出现震颤、肌强直等运动障碍以及痴呆、焦虑、嗜睡、泌尿系统症状、注意力缺陷和低血糖等非运动症状。PD的病因不明,神经炎症、氧化应激、线粒体功能障碍均参与PD的发病。越来越多的研究表明,黑质（substantia nigra,SN）区异常积聚的铁可与H2O2反应产生自由基,导致DA能神经元的丢失。SN区的铁含量与PD的严重程度呈正相关。目前,治疗PD的常用药物左旋多巴（levodopa,L-DOPA）虽然在PD早期很有效,但长期服用引起的并发症会极大限制L-DOPA的临床应用。因此,寻找更有效的DA能神经元死亡的神经保护剂,对于PD治疗,降低易患个体的风险具有深远的意义。内源性大麻素系统（endogenous cannabinoid system,ECS）在PD的发病机制中起着重要作用。ECS的主要受体:大麻素Ⅰ型受体（cannabinoid type 1 receptor,CB1R）和大麻素受体Ⅱ型受体（cannabinoid type 2 receptor,CB2R）。研究表明,PD的发病过程中有CB2R的参与,大麻素相关化合物激活CB2R可以在包括PD在内的神经退行性疾病中维持神经元的稳态和存活。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的PD小鼠模型中,蛋白质印迹和免疫荧光结果显示腹侧中脑（ventral mesencephalon,VM）CB2R蛋白水平升高。选择性CB2R激动剂JWH133和AM1241抑制了MPTP诱导的DA能神经元和轴突终末的变性。AM1241还可以有效地逆转由MPTP诱导的CB1R敲除小鼠的运动缺陷,增加DA的释放,并改善DA能神经元的存活状态。此外,选择性CB2R激动剂GW842166x对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的小鼠DA能神经元丧失及其相关的运动功能缺陷具有保护作用。近期研究发现,神经元上也有CB2R表达,但SN区DA能神经元上的CB2R的生物学作用以及是否直接参与PD的发病还不清楚。本实验应用1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）诱导原代培养的VM神经元制备PD细胞模型,探讨激活神经元上的CB2R是否能直接对DA能神经元发挥保护作用。使用CB2R激动剂JWH133、CB2R拮抗剂AM630预处理VM神经元30 min后,加入MPP+共处理24 h,运用流式细胞术检测VM神经元线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）变化和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;通过免疫印迹（western blot）技术检测各组VM神经元酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）、二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1,DMT1）和铁转出蛋白1（ferroportin1,FPN1）蛋白的变化。实验结果如下:1.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元TH蛋白表达下降（P<0.01）;1μM JWH133预处理后,显著抑制由MPP+造成的TH蛋白表达的减少（P<0.01）;1μM AM630可拮抗JWH133预处理对VM神经元TH的作用（P<0.01）。2.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元ΔΨm明显降低（P<0.001）;1μM JWH133预处理后,明显改善MPP+诱导的神经元ΔΨm的下降（P<0.05）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以逆转JWH133的作用（P<0.05）。3.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元ROS水平明显升高（P<0.001）;1μM JWH133预处理后,明显抑制MPP+引起的ROS水平升高（P<0.05）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以逆转JWH133的作用（P<0.001）。4.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元Bcl-2/Bax蛋白表达比值明显下降（P<0.001）;1μM JWH133预处理组的Bcl-2/Bax比值较MPP+组相比有所升高（P<0.001）;AM630与JWH133共同处理组与JWH133预处理组相比,Bcl-2/Bax比值下降（P<0.01）。5.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元cleaved caspase-3蛋白表达升高（P<0.01）;JWH133（1μM）预处理可抑制由MPP+造成的cleaved caspase-3蛋白表达的增加（P<0.01）;1μM AM630处理可拮抗JWH133预处理对VM神经元cleaved caspase-3的作用（P<0.01）。6.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元i NOS蛋白表达升高（P<0.01）;1μM JWH133预处理后,明显抑制由MPP+造成的i NOS蛋白升高（P<0.05）;加入1μM AM630可拮抗JWH133的作用（P<0.05）。7.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元COX-2蛋白表达明显升高（P<0.05）;该作用可以被JWH133（1μM）预处理所阻断（P<0.05）;加入AM630（1μM）后,JWH133抑制MPP+造成VM神经元COX-2表达增加的作用消失（P<0.01）。8.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元DMT1蛋白表达升高（P<0.01）;1μM JWH133预处理阻断由MPP+造成的DMT1的升高（P<0.05）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以逆转JWH133的作用（P<0.05）。9.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元FPN1蛋白表达下降（P<0.05）;1μM JWH133预处理后,可以明显改善由MPP+造成的FPN1蛋白的下降（P<0.01）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以对抗JWH133的作用（P<0.05）。以上结果提示,使用JWH133激活CB2R对MPP+诱导的DA能神经元损伤具有保护作用。JWH133通过激活CB2R不仅抑制MPP+引起的VM神经元ROS的增加、线粒体膜电位的下降、Bcl-2/Bax蛋白表达的下降以及cleaved caspase-3蛋白的增加,还能抑制MPP+引起VM神经元DMT1表达上调、FPN1表达下调以及COX-2和i NOS表达上调。这表明JWH133激活CB2R所发挥的保护作用可能与减轻氧化应激、减少铁聚集、抗凋亡以及抗炎作用相关。我们的研究为进一步了解CB2R发挥保护作用提供了新的实验依据。

摘要译文

关键词: 大麻素Ⅱ型受体；JWH133 ；原代培养神经元；帕金森病

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12. 认领

【学位/硕士】 • 马福浩 • 中国人民解放军空军军医大学 • 导师：刘之荣 ; 史明 • 2025年

摘要：研究背景: 缺血性脑卒中是最常见的中风类型,具有高致残率和高致死率的特点。目前,尽管动静脉溶栓和血管内机械取栓等治疗手段在临床上有一定疗效,但因其治疗时间窗狭窄、治疗前需严格评估且治疗后可能出现脑出血等严重并发症,其应用受到极大限制,所以寻找新的治疗策略迫在眉睫。研究发现,脑卒中后侧脑室室管膜下区（subventricular zone,SVZ）的内源性神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖和分化会显著增强,这些新生细胞能迁移至缺血区域并分化为成熟神经元,参与神经功能重塑。然而,新生神经元的存活率和功能整合效率较低,限制了这种内源性神经修复的效果。因此,深入研究脑卒中后神经发生的调控机制,尤其是关键分子在NSCs增殖、分化和功能整合中的作用,可显著提高临床治疗脑卒中的效果。抑癌基因N-myc下游调节基因2（n-myc downstream-regulated gene 2,NDRG2）是NDRG家族成员,最初因在肿瘤抑制方面的作用受到广泛关注。近年来,其在中枢神经系统的发育、生理和病理过程中的重要作用逐渐被揭示。例如,NDRG2缺失可能导致注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder,ADHD）,并参与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）和帕金森病（Parkinson's disease,PD）的发病机制。在脑缺血损伤中,NDRG2可通过维持血脑屏障稳定性、清除突触间隙谷氨酸及抑制星形胶质细胞凋亡等方式发挥神经保护作用。前期研究表明,NDRG2在胚胎期和新生鼠的神经发生区高表达,且在脑缺血后会发生核转位,提示其可能参与神经发生过程。目前,NDRG2在脑卒中后神经发生过程中的具体功能及其分子调控机制仍未得到充分阐明,亟需进一步的研究以揭示其潜在的作用机制。研究目的: 本研究拟初步探讨NDRG2在脑卒中后神经发生中的潜在作用及相关分子机制,主要包括以下方面: 1.探究NDRG2在正常成年小鼠及短暂性大脑中动脉闭塞/再灌注（transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,tMCAO/R）小鼠SVZ区的表达特征,明确其在NSCs中的分布及其在脑缺血后的表达变化。 2.通过病毒立体定向注射和基因敲除技术,验证NDRG2对SVZ区NSCs增殖的调控作用。 3.评估NDRG2对tMCAO/R小鼠神经功能恢复的影响,包括运动功能、肢体抓力和步态恢复,明确其在神经功能修复中的作用。 4.探讨NDRG2通过乙酰化修饰调控Notch配体Jagged2表达的分子机制,揭示NDRG2-Notch信号通路在脑卒中后神经发生中的作用。研究方法: 1.动物模型:采用tMCAO/R小鼠模型模拟脑卒中,观察NDRG2在SVZ区的表达变化及其对NSCs增殖的影响。 2.病毒立体定向注射:通过立体定向技术向小鼠侧脑室注射LV-ndrg2-siRNA（干扰NDRG2表达）和AAV-ndrg2病毒（过表达NDRG2）,调控NDRG2的表达水平。 3.免疫荧光染色:检测NDRG2与NSCs标志物（Nestin、GFAP、Sox2、DCX、Ki67）的共定位,评估NDRG2对NSCs增殖的影响。 4.行为学评估:通过转棒实验、改良神经学严重程度评分、抓力测试和CatWalk步态分析,评估NDRG2对tMCAO/R小鼠运动功能恢复的影响。 5.分子机制研究:采用Western blot和qRT-PCR技术,检测NDRG2对Notch信号通路（Notch1、NICD、Hes1）及其配体Jagged2的表达调控,通过Western blot和qRT-PCR等方法对组蛋白乙酰化标志物及HDAC/HAT相关分子的表达差异进行验证,或利用染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）技术检测NDRG2对Jagged2基因启动子区域组蛋白乙酰化水平（H3K9ac）的影响。研究结果: 1.NDRG2在SVZ区的表达特征:NDRG2在正常小鼠SVZ区的静息态（GFAP+）和增殖态（Sox2+）NSCs中特异性表达,而在新生神经元（DCX+）中不表达。tMCAO/R后,NDRG2在SVZ区的表达显著上调,且与Nestin+细胞的共定位比例显著增加。 2.NDRG2调控NSCs增殖:干扰NDRG2表达显著减少SVZ区Ki67+和BrdU+细胞数目,而过表达NDRG2则显著增加这些细胞的数目。NDRG2基因敲除小鼠的SVZ区BrdU+细胞数目也显著减少,进一步证实了NDRG2对NSCs增殖的促进作用。 3.NDRG2改善神经功能:过表达NDRG2显著提升tMCAO/R小鼠的运动能力（转棒实验）、肢体抓力及步态参数恢复（CatWalk）,而沉默NDRG2则加剧了神经功能缺损。 4.NDRG2-Notch信号机制:NDRG2可上调组蛋白H3K9和H3K14的乙酰化水平,解除Jagged2启动子抑制,促进Jagged2的表达,激活Notch1/NICD/Hes1通路。Notch抑制剂DAPT可完全阻断NDRG2的促增殖效应。结论: 本研究初步发现,NDRG2可能通过乙酰化修饰参与调控Jagged2-Notch1信号通路,对脑卒中后SVZ区NSCs的增殖及神经功能恢复具有一定的促进作用。这些结果提示NDRG2可能在神经再生过程中发挥重要作用,为探索缺血性卒中的潜在治疗策略提供了新的研究思路。后续研究拟进一步探讨NDRG2调控神经再生的分子机制,并尝试评估其在神经系统损伤修复及退行性疾病干预中的可能应用价值。

摘要译文

关键词: NDRG2 ；Notch信号通路；神经发生；脑卒中；乙酰化修饰

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13. 认领

【学位/硕士】 • 王鹏 • 中国人民解放军医学院 • 导师：杨明会 • 2022年

摘要：目的: 本研究拟通过运用网络药理学方法并结合分子对接技术,分析导师经验方补肾活血颗粒治疗帕金森病的分子机制及其生物学基础,并通过动物实验对其通路和靶点进行验证,从而探讨补肾活血颗粒治疗PD的作用机制。方法: 1、网络药理学分析:借助于中医药系统药理学平台(TCMSP)查找补肾活血颗粒活性成分,并进行ADME筛选,从Gene Cards、OMIM疾病数据获得PD相关靶点。将得到的活性成分及作用靶点与PD作用靶点相结合,得到疾病-药物共同作用靶点;并使用STRING数据分析平台,对获得的疾病-药物作用靶点构建PPI蛋白质互作网络。利用Metascape平台,对疾病-药物靶点功能与通路的富集分析,继而使用Cytoscape 3.7.1构建补肾活血颗粒-帕金森病靶点-作用通路网络图;借助于AUTODOCKVina和PYMOL软件进行分子对接和可视化操作。 2、动物实验:基于网络药理学富集通路结果,通过腹腔注射MPTP建立亚急性PD模型小鼠,分为空白组、模型组和补肾活血颗粒组。补肾活血颗粒组采用补肾活血颗粒中药浓缩液灌胃,空白组和模型组予以等量蒸馏水灌胃,治疗14天后,通过行为学测试观察补肾活血颗粒对PD模型小鼠运动协调能力的疗效,通过免疫组化法观察小鼠大脑黑质TH阳性表达数量,通过Western Blot法检测网络药理富集到的PI3K/AKT通路中PI3K、AKT、Caspase9核心靶蛋白的表达水平,通过免疫荧光法检测α-Syn、Tau蛋白的表达情况。结果: 1、网络药理学结果:(1)经过ADME筛选之后,其所含化学成分数量如下:赤芍29个,川芎7个,丹参65个,当归2个,肉苁蓉6个,山茱萸20个,石菖蒲4个。补肾活血颗粒各中药靶点数目如下:赤芍121个,川芎31个,丹参666个,当归50个,肉苁蓉171个,山茱萸93个,石菖蒲75个,合并上述靶点删去重复值共有靶点201个。(2)共获得与PD有关的疾病靶点3825个。(3)通过R语言程序,对获得的补肾活血颗粒作用靶点与PD疾病靶点取交集,共得到共同靶点145个。(4)通过Metascape在线基因注释平台进行富集,富集结果表明补肾活血颗粒作用的靶点与PD的发病机制有密切的联系。补肾活血颗粒主要参与的生物学过程包括:对有毒物质的反应、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、对无机物的反应细胞因子介导的信号通路等。参与的主要通路包括PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、内分泌抵抗等。(5)利用Cytoscape 3.7.1构建“补肾活血颗粒-PD靶点-通路网络图”发现补肾活血颗粒治疗PD的核心活性成分是槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮等。(6)分子对接结果显示kaempferol、luteolin、quercetin、salviolone和dihydrotanshinlactone均与PTGS1结合能最高。kaempferol与PTGS1形成氢键的氨基酸为CYS-47,luteolin与PTGS1形成氢键的氨基酸为GLN-44,quercetin与PTGS1形成氢键的氨基酸为TYR-130,dihydrotanshinlactone、salviolone与PTGS1形成氢键的氨基酸均为HIS-207。 2、动物实验结果(1)行为学检测结果:悬挂实验结果发现,与空白组相比,模型组、补肾活血颗粒组各自的悬挂实验得分均存在显著差异(P<0.01);与模型组相比,补肾活血颗粒组悬挂实验得分无明显差异(P>0.05),提示模型组与补肾活血颗粒组PD模型小鼠制备成功。灌胃14天后,结果表明,与空白组相比,模型组小鼠悬挂实验得分显著减少(P<0.01);与模型组相比,补肾活血颗粒组悬挂实验得分显著增加(P<0.01)。游泳实验结果发现,与空白组相比,模型组、补肾活血颗粒组各自的游泳实验得分均存在显著差异(P<0.01);与模型组相比,补肾活血颗粒组游泳实验得分无明显差异(P>0.05),提示模型组与补肾活血颗粒组PD模型小鼠制备成功。灌胃14天后,与空白组相比,模型组小鼠游泳实验得分显著减少(P<0.01);与模型组相比,补肾活血颗粒组游泳实验得分显著增加(P<0.01)。结果提示PD模型小鼠的悬挂实验得分显著降低、游泳实验得分显著升高,表明补肾活血颗粒可改善小鼠的运动协调能力。(2)采用免疫组化法对小鼠黑质大脑TH阳性表达数量的结果分析,结果显示空白组小鼠大脑黑质中TH阳性神经元的数量较多,染色均匀、轮廓清晰;模型组黑质TH神经元数量与空白组相比较少,差异显著(P<0.01),染色较浅、较淡,轮廓相对模糊;补肾活血颗粒组黑质TH神经元数量与模型组相比数量较多,差异显著(P<0.01)。表明补肾活血颗粒可有效治疗PD模型小鼠,其作用机制可能与DA神经元保护机制有关。(3)采用Western Blot对小鼠黑质大脑PI3K、AKT、Caspase9蛋白表达进行分析,本次实验结果显示,经补肾活血颗粒灌胃治疗后,补肾活血颗粒组小鼠大脑黑质PI3K、AKT的蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Caspase 9蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。提示补肾活血颗粒可通过显著上调PI3K、AKT的表达,下调Caspase 9的表达,表明补肾活血颗粒可激活PI3K/AKT信号通路,抑制Caspase 9的表达,从而起到神经元保护作用。(4)采用免疫荧光法对小鼠大脑黑质α-Syn、Tau蛋白表达结果进行分析,与空白组相比,模型组Tau表达量显著减少(P<0.01);与模型组相比,补肾活血颗粒组Tau表达量显著增加(P<0.01)。与空白组相比,模型组α-Syn表达量显著增加(P<0.01);与模型组相比,补肾活血颗粒组α-Syn表达量显著减少(P<0.01)。表明补肾活血颗粒可有效减轻α-Syn在PD模型小鼠大脑黑质的异常聚集,以及可有效减少Tau的过度磷酸化,从而发挥对神经元的保护作用。结论: 1、通过网络药理分析可以发现,补肾活血颗粒治疗PD的核心活性成分是槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹参酮等;主要靶点有PTGS2、PTGS1、SCN5A、ADRB2和CHRM1等;主要信号通路有PI3K/AKT、Toll样受体信号等,其功能主要为调控细胞凋亡和神经炎症反应。 2、补肾活血颗粒能有效改善亚急性PD模型小鼠运动功能,还可能通过激活PI3K/AKT信号通路,抑制Caspase9的活化来抑制细胞凋亡进程;并有效减轻α-Syn在PD模型小鼠大脑黑质的异常聚集,以及可有效减少Tau的过度磷酸化,从而发挥对神经元的保护作用。

摘要译文

关键词: 补肾活血颗粒；帕金森病 ；网络药理学；PI3K/AKT/Caspase9 ；作用机制

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被引量 1

14. 认领

【学位/博士】 • 刘珂 • 华中科技大学 • 导师：曹学兵 • 2024年

摘要：目的:左旋多巴诱发的异动症(LID)是帕金森病(PD)中晚期最常见的运动并发症之一,严重影响患者的生活质量,通常以异常不自主运动为特征,其发生机制目前尚未充分阐明。大量研究业已证实ΔFosB蓄积在LID的发病中发挥着至关重要的作用,但尚不清楚在LID发病中ΔFosB为何会蓄积以及ΔFosB是通过何种方式参与LID的发病。最近的研究表明自噬参与了LID的发病,但具体机制仍有待研究。本研究拟通过探究LID发病中是否存在自噬障碍,自噬障碍在ΔFosB蓄积中的作用以及ΔFosB如何通过自噬途径促进LID发生,进一步阐明ΔFosB蓄积的原因以及ΔFosB促进LID发生的调控途径,从而为LID提供新的治疗方向和靶点。方法:在单侧6-羟基多巴(6-OHDA)大鼠模型中,通过慢性左旋多巴治疗模拟LID的发病。通过向6-OHDA偏侧PD大鼠模型损伤侧纹状体内注射AAV-ΔFosB以模拟ΔFosB的蓄积状态,并在AAV病毒感染成功后使用左旋多巴来诱导LID发生。在HEK293细胞中转染过表达ΔFosB(OE-ΔFosB)的质粒体外模拟ΔFosB蓄积状态,转染过表达ATG14质粒(OE-ATG14)来提高ATG14蛋白表达。使用二甲双胍(AMPK激活剂)、AICAR(AMPK激活剂)、Compound C(AMPK抑制剂)和氯喹(自噬途径抑制剂)调节AMP激活蛋白激酶(AMPK)介导的自噬途径。LID的严重程度通过轴向、肢体和口面部(ALO)异常不自主运动(AIMs)评分和在体电生理指标进行评估。通过Western blot法检测AMPK通路的活性、自噬标记物(p62、LC3、ATG14、STX17、SNAP29和VAMP8)、FosB-ΔFosB的蛋白水平以及突触相关蛋白(PSD95、SAP97和GluR1)的表达水平。免疫共沉淀法检测ATG14与STX17、SNAP29和VAMP8分子间的相互作用。免疫组化辅助验证自噬标记物(p62)、ΔFosB和突触相关蛋白(PSD95)表达水平的变化。RT-q PCR检测FosB-ΔFosB的转录水平。免疫荧光和透射电镜进一步探讨了自噬小体-溶酶体融合障碍的机制。通过高尔基染色和透射电镜观察树突棘和突触的微观变化。结果: 第一部分AMPK介导的自噬障碍参与异动症发病的机制研究 动物实验结果发现,与PD组比较,LID组纹状体内AMPK磷酸化水平降低(p<0.05),而p62(p<0.01)、LC3-Ⅱ(p<0.05)以及FosB-ΔFosB(p<0.0001)的蛋白水平明显增加,但p62的转录水平没有变化。而且,LID组纹状体内ATG14(p<0.001)、STX17(p<0.05)、SNAP29(p<0.01)和VAMP8(p<0.01)蛋白表达也明显低于PD组。与LID大鼠比较,二甲双胍干预后大鼠的ALO AIMs评分明显下降(p<0.01),Highγ(hγ)振荡的平均功率(p<0.0001)和纹状体投射神经元对多巴胺反应不稳定的比例(p<0.05)也明显下降。而且,二甲双胍干预后大鼠纹状体内AMPK磷酸化水平明显增加(p<0.001),p62(p<0.0001)、LC3-Ⅱ(p<0.001)以及FosB-ΔFosB(p<0.001)的蛋白水平明显下降,上述作用均被Compound C和氯喹逆转(p<0.05),但不影响FosB和ΔFosB的转录水平。此外,二甲双胍干预后大鼠纹状体内ATG14(p<0.001)、STX17(p<0.05)、SNAP29(p<0.01)和VAMP8(p<0.01)蛋白表达明显增加,该作用被Compound C逆转(p<0.05)。细胞试验结果发现,与OE-ΔFosB组相比,二甲双胍或AICAR干预显著降低HEK293细胞内ΔFosB的蛋白水平(p<0.01),但不影响ΔFosB的转录水平,而Compound C和氯喹的干预阻断这种作用(p<0.05)。第二部分ΔFosB抑制AMPK介导的自噬途径参与异动症发病的机制研究 动物实验结果发现,与AAV-GFP组相比,AAV-ΔFosB组LID大鼠的ALO AIMs评分明显增加(p<0.0001),且纹状体内AMPK的磷酸化水平明显下降(p<0.01),ATG14(p<0.01)、STX17(p<0.01)、SNAP29(p<0.05)和VAMP8(p<0.05)蛋白表达也明显下降,而p62(p<0.001)和LC3-Ⅱ(p<0.01)的表达明显增加。与AAV-ΔFosB组LID大鼠相比,二甲双胍干预后大鼠ALO AIMs评分明显下降(p<0.0001),且纹状体内AMPK的磷酸化水平明显上调(p<0.0001),而p62(p<0.01)和LC3-Ⅱ(p<0.01)的表达明显降低,Compound C和氯喹均能逆转这种作用。此外,二甲双胍干预后大鼠纹状体内ATG14(p<0.05)、STX17(p<0.01)、SNAP29(p<0.01)和VAMP8(p<0.05)蛋白表达明显高于AAV-ΔFosB组,且该作用被Compound C逆转(p<0.05)。细胞试验结果发现,与Vector组相比,OE-ΔFosB组HEK293细胞内AMPK的磷酸化水平明显下降(p<0.001),ATG14(p<0.01)、STX17(p<0.05)、SNAP29(p<0.05)和VAMP8(p<0.01)蛋白表达也明显下降,而p62(p<0.05)和LC3-Ⅱ(p<0.001)的表达明显增高。与OE-ΔFosB组相比,二甲双胍或AICAR干预后HEK293细胞内AMPK的磷酸化水平明显增加(p<0.01),而p62(p<0.0001)和LC3-Ⅱ(p<0.0001)蛋白表达明显下降,上述作用均被Compound C和氯喹逆转(p<0.05)。二甲双胍或AICAR干预后HEK293细胞内ATG14(p<0.001)、STX17(p<0.05)、SNAP29(p<0.05)和VAMP8(p<0.05)也明显增加,该作用被Compound C逆转。另外,与OE-ΔFosB组相比,OE-ATG14+OE-ΔFosB组p62(p<0.05)、LC3-Ⅱ(p<0.01)以及ΔFosB(p<0.01)的表达均明显下降,而氯喹能够抑制OE-ATG14的这种作用(p<0.05)。而且,OEATG14的干预明显上调了OE-ΔFosB组HEK293细胞内STX17(p<0.0001)、SNAP29(p<0.01)和VAMP8(p<0.05)的表达,以及ATG14与STX17、SNAP29和VAMP8的结合(p<0.05)。第三部分ΔFosB抑制AMPK介导的自噬途径参与异动症大鼠纹状体内神经元适应性变化的机制研究 动物实验结果发现,与AAV-GFP组相比,AAV-ΔFosB组LID大鼠纹状体内PSD95(p<0.05)和SAP97(p<0.01)总蛋白水平以及GluR1膜蛋白水平(p<0.001)均明显增加。而且,AAV-ΔFosB组LID大鼠纹状体内穿孔型突触的比例和蘑菇状树突棘的数量也明显高于AAV-GFP组(p<0.05)。与AAV-ΔFosB组相比,二甲双胍干预后大鼠纹状体内PSD95(p<0.01),SAP97(p<0.01)和GluR1(p<0.001)总蛋白及膜蛋白的水平均明显下降。同时,AAV-ΔFosB+Met组大鼠纹状体内穿孔型突触的比例和蘑菇状树突棘的数量也明显低于AAV-ΔFosB+Vehicle组(p<0.05),但上述的所有作用均被Compound C和氯喹逆转(p<0.05)。细胞实验结果发现,与Vector组相比,OE-ΔFosB组HEK293细胞内PSD95(p<0.01)和SAP97(p<0.001)总蛋白和膜蛋白水平以及GluR1膜蛋白水平(p<0.01)均明显升高。与OE-ΔFosB组相比,二甲双胍或AICAR干预后HEK293细胞内PSD95(p<0.01),SAP97(p<0.05)以及GluR1(p<0.05)总蛋白和膜蛋白的表达水平均明显下降,Compound C和氯喹均能逆转二甲双胍或AICAR的作用(p<0.01)。结论:(1)LID大鼠纹状体内存在AMPK介导的自噬障碍和ΔFosB蓄积,而激活AMPK介导的自噬途径能够通过促进ΔFosB降解,减轻ΔFosB蓄积,从而改善LID的严重程度。(2)过表达ΔFosB通过抑制AMPK通路,下调ATG14蛋白的表达,进而抑制SNARE复合物形成导致LID大鼠纹状体内出现自噬障碍。(3)ΔFosB蓄积通过抑制AMPK介导的自噬途径参与LID大鼠纹状体内神经元的适应性变化。

摘要译文

关键词: 左旋多巴诱导的异动症；自噬；ΔFosB ；AMPK ；二甲双胍；ATG14 ；突触；树突棘

引用

15. 认领

【学位/博士】 • 郑贺 • 广西医科大学 • 导师：刘学政 • 2022年

摘要：背景:糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种代谢性疾病,病程一般进展较缓慢,其主要以血糖升高、糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足等为表现。DM患者血液中葡萄糖浓度升高,可以导致机体多个器官系统发生慢性损伤,最终引发多种并发症。DM临床并发症中最常见的就是眼部疾病,尤其是增生型糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)让视力丧失的风险不断增加。截至目前为止,DR的具体发病机制尚不清楚,在临床上控制患者的血糖仍然是治疗的首要选择,但是无法有效地阻止或者缓解DR的发生。现阶段针对DR的基础研究阶段、药物开发研究和临床应用对于DR的诊断和治疗大多数都是聚焦着微血管病变来进行的。红景天是一种景天科红景天属的多年生的草本植物,原产于中国西南部山区和喜马拉雅山脉。红景天的根和茎都可入药,而且有非常广泛的药理作用。从各种属地的红景天中分离得到的主要药理活性成分有:红景天苷及其苷元(酪醇)、吡啶和红景天素等。红景天苷(Salidroside)作为红景天的主要单体和有效成分之一,已经在大量的细胞和动物体内和体外研究中被检测并显示出很强的生物活性。到目前为止的主要作用如下:抗缺氧、抗疲劳和抗衰老活性,对心血管系统和中枢神经系统的活性,抗氧化活性,抗癌活性,抗炎活性,抗糖尿病活性,抗病毒和免疫刺激活性,抗骨质疏松活性。这些药理作用表明红景天苷可能是预防和治疗动脉粥样硬化、心血管疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、肺炎等多种疾病的有价值的治疗选择。虽然以往的研究已经对其主要活性成分红景天苷的药理作用研究越来越多,主要集中在中枢神经系统、糖尿病和癌症方面,但对红景天苷的体内外实验研究还不够深入,尤其在糖尿病引起的视网膜病变,红景天苷的作用机制目前还没有的明确报道。糖尿病患者的血糖缓慢增加时,机体随之就会表现出高氧化应激,产生这种状况的原因是体内的的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和活性氮(Active nitrogen species,RNS)与体内抗氧化防御系统之间失去了平衡。血糖的持续升高可通过多条信号通路来增加体内的ROS和RNS含量,并缓慢而持续性地产生一些超氧化产物。NLRP3炎症小体激活的一项上游活化信号是ROS。有研究结果表明,使用ROS的清除剂和下调NADPH氧化酶(利用si RNA干扰NADPH氧化酶亚单位p22phox或利用抑制剂抑制NADPH氧化酶的活性)从而抑制ROS的产生,进一步抑制NLRP3炎症小体的活化。ROS还可直接促进硫氧还原蛋白互动蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)与NLRP3结合,从而激活NLRP3炎症小体,进一步加剧炎症反应的进行。NLRP3炎症体是胞浆内广泛表达的Nod样受体蛋白,其在受到各种病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或者机体内外产生的“危险信号”损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)的刺激下,该受体与凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis associated speck like protein containing a CARD,ASC),蛋白酶pro-caspase-1形成的多聚蛋白复合物称之为炎症体(inflammasome)。炎症体的活化可以把没有生物活性的促炎因子的前体如pro-IL-1β和pro-IL-18等加工剪切成具有生物活性的成熟体,从而促进炎症反应。研究表明,糖尿病视网膜病变的发生与进展与NLRP3炎症体所参与的炎症反应密切相关。另外,通过对NLRP3信号通路的调控作用,能有效改善糖尿病视网膜病变的进程。不仅如此,NLRP3炎症小体还可能参与糖尿病视网膜病变晚期的病理性新生血管形成,进一步的加重了疾病病变。因此ROS/NLRP3轴也是目前炎症研究的热点,与各种疾病的炎症反应密切相关。转录启动是真核基因表达的重要调控步骤。它涉及一般转录因子和RNA聚合酶II在核心启动子处组装成一个功能性的预启动复合体。许多转录共激活因子是多亚单位复合体,被组织成不同的结构和功能模块,并携带多种调节活性。第一个鉴定的核组蛋白乙酰转移酶是General Control Non-derepressible 5(GCN5)。GCN5是多种不同的具有特定功能的共激活剂复合体的催化亚单位。GCN5最近被证实为具有赖氨酸乙酰转移酶2A(Lysine acetyltransferase 2A,KAT2A)的转录活性,并且在真核生物中高度保守。在人类中,GCN5的乙酰化与染色质调节、自噬、神经元凋亡、细胞增殖、染色体凝集、炎症、干细胞的细胞分化、造血和氧化应激有关。GCN5因其在表观遗传调控和不同类型疾病的发病机制中的作用而被广泛研究,如癌症、糖尿病、多药耐药、神经系统疾病、传染病、免疫紊乱和衰老。GCN5是一种组蛋白乙酰转移酶,它可以使组蛋白H3在赖氨酸9、14和18(H3K9ac、H3K14ac和H3K18ac)上发生乙酰化。这些标记的乙酰化直接参与DNA损伤修复中高阶染色质结构的展开。NLRP3炎症通路的相关基因激活转录,离不开H3K9ac在启动子区的富集,这是一个转录激活的组蛋白修饰标志物,GCN5是H3K9ac的直接调控因子,所以本研究选择GCN5这个基因研究NLRP3通路相关基因的激活,导致炎症的发展。染色质重塑(chromatin remodeling)是所有与DNA相关的核心的细胞内过程典型步骤,其中许多过程决定了关键细胞的命运。为了进一步探讨GCN5的可能作用机制,我们通过String蛋白网络互作分析了与GCN5的互作蛋白,发现SMARCA5是其中一个可能的互作蛋白。SMARCA5是一个染色质重塑因子(Chromatin remodeling factor),调控染色质的开放和关闭,因此,GCN5/SMARCA5可能共同调控NLRP3及其相关基因表达,影响疾病进程。SMARCA5是ISWI类染色质重构体中的一种ATP酶(ATPase),是染色质结构、细胞周期和DNA修复的关键调节因子,有助于重塑染色质并促进DNA修复过程。依赖于ATP的染色质重塑复合体和GCN5之间的协同激活是促进DNA双链断裂(DSB)修复所必需的。但是红景天苷和GCN5及SMARCA5之间的调控关系还未见报道。本研究综合利用酶联免疫吸附检测(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)、免疫印迹(Western blotting)、免疫共沉淀(co-IP),流式细胞术、细胞转染等技术检测糖尿病视网膜病变患者血清和泪液中炎症因子表达情况以及红景天苷对疾病的保护作用。选取增殖性糖尿病视网膜病变患者和红景天苷治疗组患者的血液,检测GCN5的表达。在细胞水平,红景天苷预处理视网膜色素上皮细胞株ARPE-19,观察GCN5的表达及ARPE-19细胞增殖、细胞周期、炎症等变化。在高糖诱导ARPE-19细胞株中下调GCN5的表达,观察ARPE-19细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、炎症、氧化应激等变化。生信结合免疫共沉淀验证GCN5与SMARCA5存在相互作用。在高糖诱导ARPE-19细胞株中下调SMARCA5的表达,观察ARPE-19细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、炎症、氧化应激等变化。最后,通过回复实验分别验证了红景天苷通过GCN5和SMARCA5调控糖尿病视网膜病变中ARPE-19细胞中凋亡、氧化应激和炎症等变化及AKT/m TOR通路,探讨红景天苷通过GCN5调控AKT/m TOR信号通路改善糖尿病视网膜病变的机制研究。第一部分红景天苷对糖尿病视网膜病变的保护作用研究目的:探讨糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)患者血清和泪液中炎症因子表达情况以及红景天苷对DR的保护作用。方法:采集锦州医科大学附属第一医院2016年6月-2019年6月的28例增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者的血液和泪液,以同期28人健康的体检患者血液和眼泪作为对照,ELISA和q RT-PCR分别检测血液和眼泪标本中IL-1β和IL-18的含量表达变化和血清标本中GCN5的表达;建立大鼠糖尿病模型,并给予红景天苷干预,ELISA检测大鼠血液中IL-1β和IL-18表达变化;q RT-PCR、Western blotting检测大鼠视网膜组织中NLRP3的表达变化,ELISA检测大鼠血清中的ROS表达变化;纯化大鼠血清,加入细胞培养基培养h RMECs细胞(人视网膜微血管内皮细胞),Western blotting和MTT分别检测细胞的NLRP3的蛋白表达变化和h RMECs细胞增殖活性的变化。结果:与对照组相比,糖尿病视网膜病变患者血液和眼泪中IL-1β和IL-18蛋白表达显著上调;大鼠糖尿病模型血液中IL-1β和IL-18的蛋白表达升高,ROS活性增加,视网膜组织中NLRP3的蛋白表达上调;红景天苷干预能降低糖尿病模型大鼠血清中的IL-1β和IL-18表达、ROS活性以及视网膜组织中NLRP3表达;糖尿病大鼠模型血清培养能升高h RMECs细胞中的NLRP3表达,降低细胞增殖活性;红景天苷干预大鼠的血清则一定程度能降低h RMECs细胞的NLRP3表达,回复h RMECs细胞增殖活性。结论:糖尿病视网膜病变患者的IL-1β和IL-18表达明显上调且这种上调可能与ROS/NLRP3激活有关;红景天苷能通过降低ROS/NLRP3轴降低血液中的IL-1β和IL-18表达和GCN5的表达,缓解视网膜细胞的增殖抑制。第二部分红景天苷通过GCN5调控高糖环境下ARPE-19细胞的炎症、凋亡和氧化应激目的:利用葡萄糖建立高糖人视网膜色素上皮细胞ARPE-19模型,探讨GCN5对高糖环境下ARPE-19细胞的炎症、凋亡和氧化应激的影响以及红景天苷对GCN5的调控作用和对ARPE-19细胞的保护作用。方法:将培养的ARPE-19细胞随机分为3组:(1)对照组(Control组):培养基内含5.5mmol/L葡萄糖培养24h;(2)高糖模型组(Model组):培养基内含50 mmol/L葡萄糖培养24h;(3)红景天苷治疗组(Sal组):培养基内含50 mmol/L的葡萄糖+500μmol/L Sal培养24h。q RT-PCR检测GCN5在ARPE-19细胞中m RNA的表达变化;CCK8法检测ARPE-19细胞活力;流式细胞术检测ARPE-19细胞的细胞周期和细胞凋亡情况;化学荧光法(DCFH-DA探针)检测ROS水平;Western blotting检测ARPE-19细胞株中相关蛋白表达变化;ELISA检测细胞上清中IL-1β、IL-18含量变化和GSH水平。结果:红景天苷降低ARPE-19细胞上清中IL-1β和IL-18的表达;红景天苷提高ARPE-19细胞的增殖活性;红景天苷降低人视网膜上皮细胞ARPE-19中GCN5 m RNA的表达;下调GCN5抑制高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应和氧化应激。结论:红景天苷降低人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中GCN5的表达,进而调控高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应和氧化应激。第三部分红景天苷通过GCN5调控ARPE-19细胞的凋亡和氧化应激的机制研究目的:探讨红景天苷通过GCN5调控高糖环境下人视网膜色素上皮细胞ARPE-19的炎症、凋亡和氧化应激的具体机制。方法:将正常培养的ARPE-19细胞随机分组,CCK8法检测ARPE-19细胞活力;String数据库寻找与GCN5互作蛋白,免疫共沉淀证明两者之间存在相互作用;AnnexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡;

摘要译文

关键词: 糖尿病视网膜病变；红景天苷；GCN5 ；SMARCA5 ；AKT/mTOR信号通路

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被引量 1

16. 认领

【学位/硕士】 • 陈静 • 郑州大学 • 导师：朱红灿 • 2020年

摘要：背景与目的:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是多见于中老年人的一类神经系统运动障碍性疾病,隐匿性起病,慢性进展,首发症状以运动症状多见,其病理特征是中脑黑质致密部的多巴胺能神经元发生变性,逐渐地减少,从而引起纹状体内多巴胺逐渐减少,达到一定程度时,多巴胺和乙酰胆碱发生失衡。PD为进行性加重的不可治愈性疾病,给患者及家庭带来了极大负担。人们希望在它的发病机制及致病因素上能有所突破,为PD的治疗和预防找到新的方法。有人发现PD虽为神经系统疾病,但与胃肠道有密切关系。有研究显示,PD可能从肠道起源,通过“脑肠轴”,扩散到中枢神经系统。幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染隐匿,是引起胃炎、溃疡、胃癌的重要原因。但人们逐渐发现幽门螺杆菌也参与消化系统以外疾病的发生。1961年Schwab首先描述了 PD患者胃溃疡的发生率增加,同时发现胃溃疡患者比未感染幽门螺杆菌者更容易患PD。本研究旨在探讨Hp感染与PD的发病和疾病进程的相互关系,并进一步探讨根治Hp对PD的治疗效果的影响,以期为PD的临床治疗提供新的方法及参考依据。方法:连续收集2018年1月至2019年9月在郑州市第七人民医院神经内科住院的帕金森病患者80例作为PD组,另选择同期本院体检的80名健康志愿者为对照组,所有人进行C13呼气试验检测。采用Hoehn-Yahr(H-Y)分级量表对PD患者的病情严重程度进行评估,统一帕金森病评定量表第三部分(Unified Parkinson's Disease Rating Scale motor part-Ⅲ,UPDRS-Ⅲ)即运动检查部分对PD患者的运动功能进行评估。①对比PD组与对照组中性别、年龄、Hp感染率有无差异,分析Hp感染与PD发病有无相关性;②根据C13呼气试验检测结果将PD组分为两组:Hp感染组和非Hp感染组,对比两组性别、年龄、病程、UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级有无差异,分析Hp感染与PD患者的病情严重程度有无相关性;③对所有PD患者采用“美多芭”进行药物治疗13周。Hp感染组用随机数字表法再分为两组:Hp根治组和未根治组。对Hp根治组在“美多芭”治疗同时进行根治Hp四联治疗2周,并于根治结束后4周复查C13呼气试验以确定是否根治成功。在治疗13周后对PD患者中的Hp根治组、未根治组、非Hp感染组进行数据采集,包括UPDRS-Ⅲ评分、UPDRS-Ⅳ评分、H-Y分级,对比三组在治疗13周后UPDRS-Ⅲ、UPDRS-Ⅳ、H-Y分级、减分率、总有效率,评价三组患者的总体疗效,分析Hp感染与PD的治疗效果有无相关性,并分析根治Hp后PD的治疗效果是否有变化。同时为了排除“美多芭”用药剂量的不同对结果的影响,对三组用药剂量进行了差异性分析。④统计方法:将收集的数据资料录入Excel表格中,采用SPSS21.0软件进行数据统计分析,对于描述性统计量,计量资料用均数±标准差(x± s)表示,分类资料用例数(n)和百分数(%)表示。符合正态分布的计量资料组间比较采用t检验,不满足条件的就采用非参数秩和检验;计数资料组间比较,采用卡方检验;等级资料组间比较,采用非参数秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.PD组与对照组中性别比率、年龄、C13阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。PD组C13呼气试验阳性44例(55%),PD组C13呼气试验阴性36例(45%),健康对照组C13呼气试验阳性32例(40%),C13呼气试验阴性48例(60%)。2.PD组分为Hp感染组和非Hp感染组,两组之间的性别、年龄、病程、UPDRS-Ⅳ评分均无显著差异(P>0.05);两组治疗前UPDRS-Ⅲ评分、H-Y分级、病情分布有显著差异(P<0.05),且Hp感染组病情重于非Hp感染组。3.Hp感染组随机分为Hp根治组和Hp未根治组,对Hp根治组、Hp未根治组、非Hp感染组进行“美多芭”治疗13周后三组之间总有效率比较,差异有统计学意义(P<0.05),且组间两两比较结果可得,Hp未根治组与Hp根治组差异具有统计学意义(P<0.05);Hp未根治组与非Hp感染组差异具有统计学意义(P<0.05);非Hp感染组与Hp根治组差异无统计学意义(P>0.05);即Hp未根治组总有效率显著低于其余两组。结论:1.Hp感染可能会加重PD患者的病情,主要表现在运动症状的加重和生活质量的降低,但未发现PD患者的Hp感染率显著高于普通人群。2.Hp感染会影响“美多芭”治疗PD的效果,Hp感染且未根治患者的治疗效果低于非Hp感染者,并且运动并发症的发生也明显多于非感染者。3.根治Hp后PD患者的疗效明显好于未根治Hp患者,表现为有效改善PD患者的运动症状,减少PD患者的运动并发症,提高患者的整体有效率,但对患者的生活质量的改善上无明显帮助。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；幽门螺杆菌；脑肠轴

引用

被引量 1

17. 认领

【学位/硕士】 • 唐垚 • 成都医学院 • 导师：邹显巍 • 2023年

摘要：研究背景与目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的进行性发展的神经退行性疾病,60岁以上人群发病率为1%-2%,并随着年龄的增长而增加。糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种复杂的代谢疾病,全球约有4亿人受影响,其中90%为2型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2,T2DM)。大量证据表明DM是PD的危险因素,并且可以加快加重PD疾病进程和严重程度,抗糖药物对多巴胺能神经元的保护作用也证明了DM对PD发病的影响,但目前DM导致PD发生和加重其进展的机制尚未完全阐明。现有的研究结果表明,除遗传变异与环境因素影响PD和DM的病理生理过程外,错误折叠的蛋白质聚集、细胞调亡、线粒体功能障碍、氧化应激、慢性炎症和胰岛素抵抗等致病机制也被发现参与到胰岛细胞和多巴胺能神经细胞变性坏死的过程中。近年来,越来越多的研究聚焦于氧化应激在PD和DM共同病理机制中的作用。DJ-1作为抗氧化应激中最重要的蛋白之一,被发现参与到PD和DM病理生理过程中:一方面,DJ-1可通过减少ROS介导的神经元损伤发挥神经保护作用,并且可以抑制PD患者大脑中a-突触核蛋白原纤维的形成;另一方面,DJ-1能有效保护胰岛β细胞免受各种细胞应激损害,并保持线粒体稳态和胰岛素分泌。因此,我们推测DJ-1的抗氧化功能可能在这两种疾病的共同作用机制中发挥作用,为进一步反映其抗氧化功能的作用水平,我们将通过测定血清中抗氧化物超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)来进一步说明。综上所述,本研究通过收集帕金森病合并2型糖尿病患者和帕金森病不合并2型糖尿病患者的基线资料、运动症状(Hoehn-Yahr分期、UPDRS II、III部分)、非运动症状(UPDRS I、NMSS、PSQI、ESS、FSS、MMSE、MOCA、HAMA、HAMD)和运动并发症量表(UPDRS IV、WOQ-9)评估数据,探讨帕金森病合并2型糖尿病的临床特征。同时,通过测定以上两组患者和2型糖尿病、健康对照组患者血清中DJ-1蛋白、SOD、MDA含量,进一步探讨DJ-1的抗氧化功能在帕金森病和2型糖尿病共同发病机制中的影响,为帕金森病合并2型糖尿病病人治疗新靶点以及临床治疗策略提供新思路。材料与方法:1、帕金森病合并2型糖尿病临床特征试验对象:本试验纳入自2020年7月至2022年12月就诊于成都医学院第一附属医院神经内科、内分泌科门诊及住院部诊断帕金森病不合并2型糖尿病患者30例为PD-n T2DM组,帕金森病合并2型糖尿病患者30例为PD-T2DM组。所有受试者均完成Hoehn-Yahr分期、UPDRS I—IV部分、NMSS、PSQI、ESS、FSS、MMSE、MOCA、HAMA、HAMD、WOQ-9量表评估。应用SPSS 24.0以及Graphpad Prism 9.5软件对数据进行统计学分析。采用t检验对两组间UPDRS I-IV、NMSS、PSQI、ESS、FSS、MMSE、MOCA、HAMA、HAMD进行比较分析,应用卡方检验对剂末现象在组内发生概率和剂末现象各部分在组内出现概率进行比较分析。2、DJ-1的抗氧化功能在帕金森病和2型糖尿病关系中的作用收集诊断帕金森病不合并2型糖尿病、帕金森病合并2型糖尿病、2型糖尿病、健康对照组各23例为PD-n T2DM组、PD-T2DM组、T2DM组和HP组,进行量表评估和血清中DJ-1、SOD、MDA的含量测定,并分析各组含量及其含量是否与疾病严重程度相关。研究结果:1、基线资料共纳入帕金森病合并2型糖尿病组患者(PD-T2DM组)30例,帕金森病不合并2型糖尿病组患者(PD-n T2DM组)30例,两组患者在年龄(71.87±9.47vs 68.9±8.84)、起病年龄(67.33±10.21 vs 65.10±9.20)、病程(4.52±2.77 vs3.70±3.07)、性别(56.67%vs 56.67%)、吸烟(70%vs 60%)、饮酒(73.3%vs63.3%)等方面均无统计学差异(P>0.05),在高血压有统计学差异(43.3%vs86.7%)。2、帕金森病合并2型糖尿病患者运动症状特征PD-T2DM组患者在H-Y分期、UPDRS II、III部分得分以及左旋多巴等效剂量方面,比PD-n T2DM组患者更高,有统计学差异(2.65±0.81 vs2.26±0.85,P=0.042;13.03±7.46vs9.43±4.2,P=0.016;33.97±15.91vs27.17±12.30,P=0.043;909.58±266.32 vs 726.08±309.85,P=0.004)。3、帕金森病合并2型糖尿病患者认知功能PD-T2DM组比PD-n T2DM组在MMSE和MOCA得分更低(26.33±2.24 vs27.47±2.06,P=0.023;21.67±2.62 vs 23.90±2.60,P<0.001),有统计学差异。4、PD-T2DM组和PD-n T2DM组患者非运动症状特征PD-T2DM组和PD-n T2DM组在UPDRS I、NMSS、PSQI、ESS、FSS、HAMA、HAMD等方面得分无统计学差异(P>0.05)。5、PD-T2DM组和PD-n T2DM组患者运动并发症特征在出现剂末现象的PD-T2DM组和PD-n T2DM组的两组患者中,年龄、PD病程、PD起病年龄方面未见明显差异(P>0.05),在震颤、运动缓慢、情绪变化、僵硬、疼痛、灵活性减退、思维迟缓、焦虑发作、肌肉痉挛等9个方面也未见明显差异(P>0.05)。6、DJ-1、SOD、MDA在各组中的含量测定HP组DJ-1含量与PD-T2DM组、PD-n T2DM组、T2DM组都有明显差异(P<0.05),但PD-T2DM组与PD-n T2DM组、T2DM组的DJ-1含量无明显差异(P>0.05),PD-n T2DM组与T2DM组的DJ-1含量也无明显差异(P>0.05)。MDA和SOD含量在四组间均无明显差异(P>0.05)。在PD-T2DM组和PD-n T2DM组中,DJ-1、SOD和MDA含量与疾病严重程度(H-Y分期、UPDRS I、II、III部分)均无明显相关性(P>0.05)。结论:2、帕金森病合并2型糖尿病患者运动症状特征PD-T2DM组患者在H-Y分期、UPDRS II、III部分得分以及左旋多巴等效剂量方面,比PD-n T2DM组患者更高,有统计学差异(2.65±0.81 vs2.26±0.85,P=0.042;13.03±7.46vs9.43±4.2,P=0.016;33.97±15.91vs27.17±12.30,P=0.043;909.58±266.32 vs 726.08±309.85,P=0.004)。3、帕金森病合并2型糖尿病患者认知功能PD-T2DM组比PD-n T2DM组在MMSE和MOCA得分更低(26.33±2.24 vs27.47±2.06,P=0.023;21.67±2.62 vs 23.90±2.60,P<0.001),有统计学差异。4、PD-T2DM组和PD-n T2DM组患者非运动症状特征PD-T2DM组和PD-n T2DM组在UPDRS I、NMSS、PSQI、ESS、FSS、HAMA、HAMD等方面得分无统计学差异(P>0.05)。5、PD-T2DM组和PD-n T2DM组患者运动并发症特征在出现剂末现象的PD-T2DM组和PD-n T2DM组的两组患者中,年龄、PD病程、PD起病年龄方面未见明显差异(P>0.05),在震颤、运动缓慢、情绪变化、僵硬、疼痛、灵活性减退、思维迟缓、焦虑发作、肌肉痉挛等9个方面也未见明显差异(P>0.05)。6、DJ-1、SOD、MDA在各组中的含量测定HP组DJ-1含量与PD-T2DM组、PD-n T2DM组、T2DM组都有明显差异(P<0.05),但PD-T2DM组与PD-n T2DM组、T2DM组的DJ-1含量无明显差异(P>0.05),PD-n T2DM组与T2DM组的DJ-1含量也无明显差异(P>0.05)。MDA和SOD含量在四组间均无明显差异(P>0.05)。在PD-T2DM组和PD-n T2DM组中,DJ-1、SOD和MDA含量与疾病严重程度(H-Y分期、UPDRS I、II、III部分)均无明显相关性(P>0.05)。结论:1、PD-T2DM组患者的疾病严重程度(UPDRS II、UPDRS III)以及H-Y分期的得分更高,且较PD-n T2DM组患者需要更高剂量的等效左旋多巴药物治疗;2、PD-T2DM组患者的认知功能损害(MMSE、MOCA)较PD-n T2DM组患者更严重;3、PD-n T2DM组、PD-T2DM组、T2DM组患者血清中的DJ-1蛋白含量均降低,提示DJ-1的抗氧化作用下降在帕金森病、2型糖尿病和帕金森病合并2型糖尿病的发病过程中可能起重要作用;但血清DJ-1、MDA和SOD的含量与PD疾病严重程度无明显相关性。

摘要译文

关键词: 帕金森病 ；2型糖尿病；DJ-1蛋白；氧化应激

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被引量 1

18. 认领

【学位/博士】 • 赵祺 • 四川大学 • 导师：朱涛 • 2022年

摘要：目的: 术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction,POCD）是指患者在经历手术、麻醉等围术期操作后出现了神经认知功能减退,是一种中枢神经系统并发症。研究发现POCD会影响患者的康复进程,延长患者的住院时间,甚至引发其他身心疾病、增加患者的死亡率,为患者及其家庭带来沉重负担。随着我国人口老龄化进展,越来越多的老年患者接受了麻醉手术操作,因此,研究POCD的发病机制,寻找潜在的诊疗靶点尤为重要。越来越多的文献研究表明:NEDD8参与神经退行性疾病如阿兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）、帕金森病（Parkinson Disease,PD）的发生发展,然而NEDD8在POCD中的作用机制尚未阐明,缺乏相关研究。因此,本课题旨在研究NEDD8在POCD中的作用机制。材料和方法: 1、收集四川大学华西医院接受髋关节置换术患者,分别于术前1天、术后第7天进行神经认知功能评估并收集血液样本。 2、提取患者的血浆神经源性细胞外微囊泡后,选取30只月龄15-18月,体重26-32g的C57BL/6J野生型SPF级老年小鼠,对小鼠进行海马立体定位注射。随机平均分为3组:PBS组（海马注射PBS）,POCD组（海马注射POCD患者血浆神经源性细胞外微囊泡）,non-POCD组（海马注射非POCD患者血浆神经源性细胞外微囊泡）,每组10只（n=10）。观察4周后进行行为学实验评估其认知功能。 3、提取患者的血浆神经源性细胞外微囊泡,外送行m RNA高通量测序分析（由广东锐博生物科技有限公司完成）,得到差异表达的基因。根据测序结果扩大样本量,行q RT-PCR实验验证测序结果。通过多因素Logistic回归分析寻找与POCD发生相关的独立相关因素,之后根据受试者工作特征曲线建立预测模型。 4、选取50只月龄15-18月,体重26-32g的C57BL/6J野生型SPF级老年小鼠随机分为对照组（n=10）,手术组（n=40）,手术组又分为Day1、Day3、Day7、Day14组,分别对应在单侧肾切除术后第1、3、7、14天时处死小鼠收取标本（n=10）。在对小鼠进行单侧肾切除术之前通过Y迷宫判断其认知功能基线是否相同,在单侧肾切除术后通过一系列的行为学,如Y迷宫,旷场实验,Morris水迷宫,条件恐惧实验评价其认知功能。之后通过Western Blot及q RT-PCR实验验证各组小鼠NEDD8、CRL、IκB、p65、p50、CXCL1、CXCL2、TNF-α、IL-6、Bax、Bcl2、Cleaved Caspase3、Caspase3、Trkb、PSD95、SYN、磷酸化Tau蛋白的表达变化,通过TUNEL染色实验评价神经元凋亡指数,通过免疫荧光共定位染色实验观察NEDD8、CRL、磷酸化Tau蛋白与神经细胞共定位及表达情况,通过免疫共沉淀与免疫荧光共定位染色观察NEDD8与CRL及Tau蛋白相互作用情况。 5、选取80只月龄15-18月,体重26-32g的C57BL/6J野生型SPF级老年小鼠随机平均分为AAV-对照组,AAV+对照组,AAV-手术组,AAV+手术组,每组20只（n=20）。并分别在单侧肾切除术后第3天、第14天每组各处死10只小鼠收取标本。AAV+组小鼠为双侧海马CA1区行脑立体定位注射AAV9-NEDD8-sh RNA来敲降NEDD8的表达,AAV-组注射空载体AAV,待AAV转染2周后,对AAV+和AAV-组中各一半的小鼠行单侧肾切除术作为手术组,余为对照组。单侧肾切除术之前通过Y迷宫判断其认知功能基线是否相同,在单侧肾切除术后通过一系列的行为学,如Y迷宫,旷场实验,Morris水迷宫,条件恐惧实验评价其认知功能。之后通过Western Blot及q RT-PCR实验验证各组小鼠NEDD8、CRL、IκB、p65、p50、CXCL1、CXCL2、IL-6、TNF-α、Bax、Bcl2、Cleaved Caspase3、Caspase3、Trkb、PSD95、SYN、磷酸化Tau蛋白的表达变化,通过TUNEL染色实验评价神经元凋亡指数,通过免疫荧光共定位染色实验观察NEDD8、CRL、磷酸化Tau蛋白与神经细胞共定位及表达情况。结果: 1、共收集74名髋关节置换术患者,其中30名患者出现POCD,44名患者未出现POCD,POCD发病率为40.5%。 2、与海马注射PBS组小鼠相比,海马注射POCD患者血浆神经源性细胞外微囊泡组小鼠在场景提示测试中僵直时间百分比显著下降（32.33±4.16%vs 72.87±4.6%,P<0.001）,海马组织中磷酸化Tau蛋白表达显著升高（P<0.001）;而海马注射非POCD患者血浆神经源性细胞外微囊泡组与海马注射PBS组小鼠在场景提示测试中僵直时间百分比没有显著差异（69.33±3.06%vs 72.87±4.6%,P=0.491）,海马组织中磷酸化Tau蛋白表达没有显著差异。 3、与非POCD组相比,POCD组患者血浆神经源性细胞外微囊泡中有79个m RNAs差异表达,其中45个上调,24个下调。行GO、KEGG通路富集分析,发现上调和下调表达的基因主要与炎症、凋亡、代谢、泛素化修饰等相关。 4、通过单侧肾切除术构建POCD模型。手术组与对照组小鼠术前的Y迷宫实验进臂次数（22±4.98 vs 21.8±4.31,P=0.76）、自发交替率（72.08±7.69%vs 70.1±6.77%,P=0.78）没有显著差异;手术组与对照组小鼠术后的旷场实验运动速度（14.02±4.33cm/s vs 14.87±2.67cm/s,P=0.72）、Y迷宫实验进臂次数（20.8±3.7 vs 20.8±4.6,P=0.91）、Morris水迷宫实验游泳速度（68.64±7.45cm/s vs 72.03±3.19cm/s,P=0.33）没有显著差异。与对照组相比,手术组小鼠术后Y迷宫实验自发交替率显著降低（57.69±7.66%vs 72.12±6.67%,P<0.01）,Morris水迷宫实验测试阶段在目标第Ⅳ象限停留时间（36.6±5.94%vs 56.28±4.62%,P<0.01）、跨原水下逃避平台次数（4.5±1.29 vs 8.3±1.26,P<0.01）显著降低,条件恐惧实验场景提示测试阶段僵直时间百分比显著降低（31±6.68%vs77.13±8.93%,P<0.001）。 5、免疫荧光共定位染色提示NEDD8、CRL与神经元共定位,Western Blot实验结果提示:手术后小鼠海马组织中NEDD8、CRL表达较对照组显著升高（P<0.01）。检测炎症水平:手术组小鼠海马组织中p65、p50、CXCL1、CXCL2、TNF-α、IL-6表达升高,IκB表达下调（P<0.001）。通过TUNEL染色发现:手术组小鼠海马组织中神经元凋亡指数显著升高（P<0.01）。检测凋亡水平:手术组小鼠海马组织中Bax、Cleaved Caspase3表达升高,Bcl2表达下调（P<0.001）。检测突触可塑性功能:手术组小鼠海马组织中SYN、Trkb、PSD95表达下调（P<0.001）。免疫荧光共定位染色提示磷酸化Tau蛋白与神经元共定位,Western Blot实验结果提示:手术组小鼠海马组织中磷酸化Tau蛋白表达较对照组显著升高（P<0.001）。免疫荧光共定位染色及免疫共沉淀实验提示:NEDD8与CRL、Tau蛋白存在相互作用。 6、双侧海马注射腺相关病毒携带NEDD8-sh RNA敲降海马组织中NEDD8的表达,转染2周后行单侧肾切除术构建POCD模型。通过旷场实验、Y迷宫实验进臂次数、Morris水迷宫实验游泳速度分析,各组间运动能力没有显著差异。单侧肾切除术前1天Y迷宫实验各组自发交替率没有差异。术后Y迷宫实验中,AAV-手术组自发交替率显著低于AAV-对照组（55.66±7.19%vs 69.46±3.35%,P<0.01）,AAV+手术组自发交替率显著高于AAV-手术组（64.56±3.64%vs 55.66±7.19%,P<0.05）。Morris水迷宫实验测试阶段,AAV-手术组停留在目标第Ⅳ象限的时间占比、跨过原平台位置次数显著低于AAV-对照组（27.77±5.27%vs45.82±4.44%,P<0.01）(2.75±1.71 vs 10±1.83,P<0.001),AAV+手术组停留在目标第Ⅳ象限的时间占比、跨过原平台位置次数显著高于AAV-手术组（38.25±1.9%vs 27.77±5.27%,P<0.05）(8.25±0.96 vs 2.75±1.71,P<0.01)。条件恐惧实验场景提示测试中,AAV-手术组僵直时间百分比显著低于AAV-对照组（30.62±3.51%vs 71.11±4.63%,P<0.001）,AAV+手术组小鼠僵直时间百分比显著高于AAV-手术组（63.63±2.01%vs30.62±3.51%,P<0.01）。 7、Western Blot实验结果提示:AAV-手术组小鼠海马组织中NEDD8、CRL表达较AAV-对照组显著升高（P<0.01）,AAV+手术组小鼠海马组织中NEDD8、CRL表达较AAV-手术组显著降低（P<0.001）。检测炎症水平:与AAV-对照组相比,AAV-手术组小鼠海马组织中p65、p50、CXCL1、CXCL2、TNF-α、IL-6表达升高,IκB表达降低（P<0.001）,与AAV-手术组相比,AAV+手术组小鼠海马组织中p65、p50、CXCL1、CXCL2、TNF-α、IL-6表达降低,IκB表达升高（P<0.01）。通过TUNEL染色发现:AAV-手术组小鼠海马组织中神经元凋亡指数较AAV-对照组显著升高（P<0.001）,AAV+手术组小鼠海马组织中神经元凋亡指数较AAV-手术组显著降低（P<0.001）。检测凋亡水平:与AAV-对照组相比,AAV-手术组小鼠海马组织中Bax、Cleaved Caspase3表达水平显著升高,Bcl2表达下调（P<0.001）;与AAV-手术组相比,AAV+手术组小鼠海马组织中Bax、Cleaved Caspase3表达水平显著降低,Bcl2表达升高（P<0.001）。检测突触可塑性功能:AAV-手术组小鼠海马组织中SYN、Trkb、PSD95表达较AAV-对照组降低（P<0.001）,AAV+手术组小鼠海马组织中SYN、Trkb、PSD95表达较AAV-手术组升高（P<0.05）。Western Blot实验结果提示:AAV-手术组小鼠海马组织中磷酸化Tau蛋白表达较AAV-对照组显著升高（P<0.001）,AAV+手术组小鼠海马组织中磷酸化Tau蛋白表达较AAV-手术组显著降低（P<0.05）。 8、多因素逻辑回归分析显示血浆神经源性细胞外微囊泡中NEDD8的表达（Cq值）与POCD的发生独立相关。根据ROC曲线结果,阈值为27.43（特异度:0.667,敏感度:0.75）。高表达的NEDD8（Cq<27.43）可用于预测POCD的发生,AUC为0.733（95%CI,0.614-0.851,P=0.001）。结论: 1、髋关节置换术后,约有40.5%的患者发生POCD。 2、POCD患者血浆神经源性细胞外微囊泡可诱发小鼠认知功能下降。m RNA高通量测序首次发现,POCD患者血浆神经源性细胞外微囊泡中NEDD8 m RNA表达显著增高。 3、单侧肾切除术后小鼠术后出现认知功能障碍,海马组织中NEDD8表达显著升高。敲降海马组织中NEDD8表达,可以改善小鼠的认知功能。其机制与NEDD8激活下游CRL诱发神经炎症,以及NEDD8对Tau蛋白直接修饰促进其过度磷酸化聚集而诱发POCD相关。 4、患者外周血浆神经源性细胞外微囊泡中高表达的NEDD8（Cq<27.43）,在进一步扩大样本量验证后,有望成为诊断POCD的生物标志物。

摘要译文

关键词: 术后认知功能障碍；NEDD8 ；炎症反应；血浆神经源性细胞外微囊泡；生物标志物

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19. 认领

【学位/博士】 • 胡兆丽 • 南京医科大学 • 导师：胡刚 • 2018年

摘要： 帕金森病（Parkinson’s disease,PD）发病率仅次于阿尔茨海默病,是全球第二大衰老相关的神经退行性病变。PD呈慢性、进行性发展,其主要的临床症状表现为:静止性震颤、运动迟缓、肌强直、步态障碍等。随着疾病的发展,非运动症状如失眠、情感淡漠、抑郁及认知障碍逐渐占居主导地位,造成沉重的社会负担。PD患者中脑黑质区（Substantia nigra,SN）多巴胺能神经元进行性缺失,伴随纹状体多巴胺（Dopamine,DA）耗竭,尚存的DA能神经元中出现Lewy小体（lewy body,LB）,以上为PD的主要病理学标志。现阶段临床上PD的治疗策略为左旋多巴（1evodopa,L-DOPA）替代治疗,尽管能够缓解大多数PD患者的症状,但却无法阻止DA能神经元进行性死亡的病理进程,长期应用还会产生运动障碍等严重并发症。近年来大量的研究表明,PD是环境因素、遗传因素和衰老长期共同作用的结果。已提出的PD发病机制主要包括兴奋性毒性、线粒体功能障碍、炎症反应、氧化应激和错误折叠蛋白处理障碍等。然而根据目前提出的假说而研发的多种药物如NMDA受体拮抗剂、抗氧化剂及凋亡抑制剂等神经保护剂在临床研究中并未显现有效的神经保护作用。因此,全面深入地了解帕金森病的发病机制,将有助于寻找减缓或阻止帕金森病的治疗方法。PD病理机制尚未明了,目前认为包括帕金森在内的神经退行性疾病的一个共同特征是神经炎症反应的发生,表现为神经胶质细胞,主要是小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞,具有广泛的生理功能,主要包括调节神经元的外部环境、给予神经元营养、能量代谢支持等。在PD发病脑区的微环境中,神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞所形成的神经网络存在动态平衡,当星形胶质细胞表型从静息态转变为激活状态,星形胶质细胞会根据其周围环境多样性信号改变自身表型,其功能包括分泌促炎因子、参与细胞修复和细胞外基质重塑的神经营养物质的释放等一系列细胞内分子事件。在此过程中星形胶质细胞呈现出高的能量需求,因此,其线粒体功能正常与否关系到星形胶质细胞正常功能的维持,且这种星形胶质细胞功能稳态在帕金森等神经退行性疾病的发生及疾病进展过程中起到重要作用。所以,加强对星形胶质细胞在PD中的功能探讨,通过靶向星形胶质细胞的线粒体功能来调节星形胶质细胞的活动是干预PD的一种新思路。ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channel,K-ATP通道）是一类耦联细胞代谢和电活动、非电压依赖性的钾离子通道。K-ATP通道在与帕金森病相关的黑质、纹状体脑区高度表达,并参与调节多种与PD相关的神经递质如DA和谷氨酸（glutamate,Glu）的释放。包括本实验室在内多个研究小组前期研究显示,K-ATP通道开放剂对多种毒素引起的PD样神经损伤具有神经保护作用,其机制包括恢复线粒体功能、抗兴奋性毒性、抗凋亡和抑制神经炎症等。表达Kir6.2/SUR1的DA神经元对鱼藤酮毒性最敏感。Kir6.2敲除能取消MPTP联合丙磺舒所致PD慢性模型小鼠黑质DA神经元的损伤作用。本课题组近期报道了表达在小胶质细胞的Kir6.1/K-ATP通道参与调节小胶质细胞表型变化,在PD进程中发挥神经保护作用。以上研究结果提示,K-ATP通道可能是研发理想神经保护剂的重要靶标。中枢神经系统广泛分布的星形胶质细胞主要表达Kir6.1构成的K-ATP通道,但是该通道是否参与PD的发生发展及其具体机制尚不清楚。另外线粒体膜上也有该类型通道的分布,且文献及本实验室前期研究显示线粒体K-ATP通道可能在PD毒素所致的星形胶质细胞的功能损伤过程中发挥保护作用,但具体的调节机制亦未明了。基于此,本文第一部分工作应用Kir6.1loxp/loxp和Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠:分别制备LPS急性PD模型、MPTP急性模型、MPTP/p慢性模型,观察星形胶质细胞Kir6.1基因敲除对不同PD模型小鼠中脑神经损伤的影响。研究结果表明:星形胶质细胞Kir6.1基因敲除加重上述多种PD动物模型中脑PD样神经损伤,促进中脑多种应激反应通路的激活,包括内质网应激反应、炎症反应、凋亡通路的激活以及自噬通路的抑制。由于第一部分研究结果显示PD动物模型中星形胶质细胞Kir6.1基因敲除引起中脑广泛的应激反应,我们推测可能是星形胶质细胞Kir6.1基因敲除加剧星形胶质细胞在病理条件下的功能改变,削弱了其对抗损伤的能力。近年来的研究表明星形胶质细胞线粒体功能障碍在PD的发生发展中发挥关键作用,我们实验室前期研究发现开放K-ATP通道能够维持星形胶质细胞线粒体功能,抑制其凋亡,提示星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道可能通过调控线粒体功能稳态参与PD的发生。因此第二部分工作首先培养两基因型小鼠的中脑原代星形胶质细胞,研究在PD细胞模型中星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对其自身功能及对线粒体功能稳态的影响及机制。结果表明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失加重MPP+刺激引起的星形胶质细胞损伤、线粒体功能受损,促进炎症反应。进一步研究发现星形胶质细胞尤其是线粒体上的Kir6.1敲除,抑制线粒体自噬,加重线粒体功能紊乱诱发星形胶质细胞的毒性效应,进而导致了中脑神经元的损伤。第一部分星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD动物模型小鼠神经损伤中的作用目的:应用星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除小鼠,研究星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD模型小鼠中脑神经损伤中的作用。方法:应用3-4月龄Kir6.1loxp/loxp和Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+雄性小鼠,制备PD急性模型(（1）LPS急性PD模型:根据paximas和watson图谱定位中脑黑质坐标位点,注射5.0μg LPS（2）MPTP急性模型:腹腔注射MPTP 20 mg/kg,一日4次,两次之间间隔1小时)。应用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）及离子钙结合蛋白l（ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1）进行免疫组织化学染色,联合应用体视学计数法对小鼠中脑SNc区DA能神经元、星形胶质细胞和小胶质进行定量,评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对PD急性模型中脑神经损伤的影响。应用3-4月龄两基因型雄性小鼠,制备PD慢性模型（皮下注射MPTP,20 mg/kg。1小时后腹腔注射丙磺舒,250 mg/kg,3.5日一次,连续5周）。应用转棒、爬杆和开场等行为学检测手段评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对MPTP/p所致小鼠运动功能的影响。分别应用TH免疫组化染色法、尼氏染色法,联合应用体视学计数法对小鼠中脑SNc DA能神经元数量进行定量;应用多巴胺转运体（dopamine transportor,DAT）免疫组化染色法对小鼠中脑SNc区、及纹状体DA能神经元数量及功能进行评价。应用GFAP、Iba-1进行免疫组织化学染色,联合应用体视学计数法对小鼠黑质区DA能神经元、星形胶质细胞和小胶质进行定量,评价中脑黑质区胶质细胞增殖活化情况。应用高效液相色谱法（Highperfomance Liquid Chromatography,HPLC）检测MPTP在两种基因型小鼠体内代谢情况,以评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对MPTP在小鼠体内代谢的影响。应用ELISA检测小鼠血清及中脑组织中MPTP代谢酶──单胺氧化酶B（MAO-B）的酶活性,以评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除在MPTP/p慢性模型中对MAO-B活性的影响。应用HPLC法检测两种基因型小鼠造模后纹状体内及海马内单胺类递质和氨基酸类神经递质水平变化。应用ELISA法检测小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。应用Western blot检测造模后两种基因型小鼠中脑黑质区应激反应,包括炎症反应相关蛋白、内质网应激相关蛋白、自噬相关蛋白、凋亡通路相关蛋白。另外还检测中脑组织中三种营养因子BDNF、GDNF、FGF-2的蛋白水平。结果:1)基础状态下,两种基因型小鼠中脑SNc区TH阳性神经元数目无显著性差异。LPS及MPTP急性模型制备后,两种基因型小鼠SNc区TH阳性神经元均显著性丢失,且Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠的丢失更为显著。2)基础状态下,两种因型小鼠中脑SNc区胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）数目无显著性差异。LPS及MPTP急性模型制备后,两种基因型小鼠SNc区胶质细胞均显著活化,且条敲组小鼠的胶质细胞增殖活化更为明显。3)MPTP在两种基因型小鼠的血浆、纹状体、肝、肾内代谢均无显著差异。4)MPTP/p慢性造模后,MAO-B在两种基因型小鼠的血清、中脑组织的酶活性无显著差异。5)基础状态下,两种基因型小鼠纹状体DA及其代谢产物水平无显著差异;MPTP/p慢性模型制备成功后,Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠纹状体内DA含量降低更为显著。另外无论是基础状态下还是MPTP/p模型,两种基因型小鼠纹状体的氨基酸类神经递质水平都无显著差异。6)MPTP/p慢性模型制备后,星形胶质细胞Kir6.1的缺失加重小鼠的运动协调能力障碍,但不影响小鼠的运动速度。7)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除加重MPTP/p慢性模型小鼠中脑SNc DA能神经元丢失,加重SNc胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）的增殖和活化。8)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除促进MPTP/p慢性模型小鼠血清中IL-1β的分泌。9)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除上调小鼠中脑的炎症反应相关蛋白表达:p65、NLRP3、Caspase-1、pro IL-1β和IL-1β。10)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除增加小鼠中脑的内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、Caspase12的表达水平。11)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除抑制小鼠中脑的自噬通路。12)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除显著上调小鼠中脑的促凋亡通路相关蛋白Bax、AIF的蛋白表达,显著下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。13)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的缺失不影响小鼠中脑BDNF、GDNF、FGF-2的蛋白表达。结论:1)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除加重PD动物模型加重中脑DA能神经元的丢失,促进星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化。2)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除促进MPTP/p诱导的中脑内多种细胞应激反应。3)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD发生发展中发挥保护作用。第二部分星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道对线粒体功能的调节作用及其机制研究目的:阐明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在线粒体功能稳态中的作用及其机制方法:应用出生3天内的两基因型新生小鼠,提取中脑原代星形胶质细胞进行离体培养。给予上述两种星形胶质细胞100μM MPP十刺激,收集细胞上清及细胞用于后续实验。应用DHE（Dihydroethidium,二氢乙啶）荧光探针检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞内ROS生成的影响。应用LDH试剂盒检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞LDH释放的影响。应用细胞免疫荧光、Western blot方法检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞凋亡的影响。应用Western blot检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白水平和营养因子BDNF、GDNF、FGF2转录水平的影响。应用Western blot方法检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症信号（P65、NLRP3、补体C3、Caspase-1）水平的影响。

摘要译文

关键词: 星形胶质细胞；帕金森病 ；Kir6.1/K-ATP通道；mito-K-ATP ；线粒体；线粒体自噬；神经炎症；DA能神经元

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【学位/硕士】 • 岳梦云 • 南昌大学 • 导师：方鑫 • 2023年

摘要：研究背景和目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是中枢神经系统第二大神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases,NDDs),预计到2030年PD病人可能超过930万名。目前PD的治疗常用药物是左旋多巴制剂,该药物对于运动症状初用时效果明显,但随着病程的进展,药物疗效会逐渐降低,且可能出现运动并发症和药物副作用。PD病程较长、致残率高且缺乏有效治愈手段,给患者、家庭和社会带来了极大的负担。因此,探索和明确PD的发病机制,并针对性的减缓或阻止PD病理进展才是治疗的根本。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide 1,GLP-1)及其类似物的神经保护作用也日益受到关注。然而,GLP-1的氨基酸序列中有可被二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)降解的位点,半衰期仅数分钟,很大程度上限制了其生理效能和临床应用。因此,我们课题组以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为载体构建了一株可以持续表达GLP-1蛋白的工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1。前期研究已经证明该工程菌可以通过减少多巴胺能神经元的丢失和残存神经元中α-syn的异常聚集在MPTP诱导的PD小鼠模型中起到神经保护作用,然而,该工程益生菌是通过何种机制发挥神经保护作用尚未可知。因此,我进行了本次研究以明确L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1的具体神经保护作用机制。研究方法:3月龄雄性C57BL/6小鼠50只,随机分成5个组,分别为正常对照组(C组)、MPTP诱导模型组(M组)、MPTP诱导利拉鲁肽治疗组(L组)、MPTP诱导乳酸乳球菌治疗组(R组)和MPTP诱导L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1工程菌治疗组(RG组)。具体实验方法如下:(1)旷场实验、爬杆实验和悬挂实验等行为学实验评价工程菌株对PD小鼠行为学障碍的改善效果;(2)脑组织免疫组化染色、免疫荧光染色和Western blotting检测PD小鼠脑组织中TH、α-syn、DAT、BDNF和GDNF的表达情况,评价工程菌株治疗后PD小鼠脑组织中多巴胺能神经元的存活情况、α-syn的表达情况和神经营养因子的变化情况等;(3)ELISA和Western blotting检测脑组织中GLP-1的具体含量和GLP-1R的分布情况;(4)H&E染色和Western blotting检测血脑屏障和肠道屏障的完整性;(5)透射电镜、普鲁士蓝染色、免疫荧光染色和Western blotting检测铁死亡在PD小鼠中的重要作用,进一步探究PD小鼠脑组织中发挥作用的铁死亡相关通路;(6)DHE荧光染色和氧化应激因子测定检测脑组织和血清中氧化应激水平的变化情况;(7)16S r DNA高通量测序技术对小鼠肠道菌群组成和丰度进行检测,以明确工程菌株治疗后PD小鼠肠道菌群的变化情况。研究结果:(1)工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1可以有效增加MPTP诱导PD小鼠模型黑质中TH、DAT、BDNF和GDNF的表达,并降低α-syn的表达,从而进一步改善PD小鼠的探索和运动能力;(2)工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1可以有效改善PD小鼠模型体内肠道屏障和血脑屏障的完整性以及紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达,并显著增加黑质中GLP-1及其受体的含量;(3)工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1可以有效增加PD小鼠黑质中铁转运蛋白DMT1的表达从而减少铁离子的含量,进一步通过激活Keap1-Nrf2-GPX4信号通路和降低氧化应激水平来抑制PD小鼠体内的铁死亡,包括上调GSH-Px、SOD的表达和下调ROS、MDA的表达;(4)工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1在一定程度上可以恢复PD小鼠肠道菌群的物种多样性和丰富度,尤其是增加了益生菌阿克曼氏菌属(Akkermansia)的丰度。结论:本课题基于乳酸乳球菌为载体构建了工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1,并通过多种分子生物技术,评价了该工程菌株对MPTP诱导的PD小鼠模型的治疗效果及其潜在的作用机制。上述实验结果显示工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1可以通过激活Keap1-Nrf2-GPX4信号通路和降低氧化应激水平来抑制PD小鼠脑组织中的铁死亡,并进一步抑制该小鼠脑组织中多巴胺能神经元死亡和突触核蛋白病变,从而改善PD小鼠的运动症状。工程益生菌L.lactis MG1363-p MG36e-GLP-1不仅具备GLP-1蛋白的神经保护作用,同时L.lactis本身具有的胃肠道益生功效也可对人体健康起到积极保护作用,更重要的是,细菌药物可大幅降低药价成本,具有极为广阔的应用潜力。

摘要译文

关键词: 帕金森病(PD) ；胰高血糖素样肽-1(GLP-1) ；L. lactis MG1363-pMG36e-GLP-1 ；铁死亡；氧化应激

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