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摘要： 论文研究了利用酵母菌防治草莓灰霉病的基础问题,包括酵母菌分离、筛选、鉴定、防病机制和防病潜力等。取得的研究结果如下：
1.筛选到7株对草莓灰霉病有显著防效的酵母菌菌株,其编号为C410、C23、C25、W4682、YW1、YCXT2和YCXT3。
2.明确了7株酵母菌的分类属性。菌株C410、C23和C25属于间型假丝酵母(Candida intermedia),菌株YCXT2和YCXT3属于准红锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus),菌株W4682属于汉逊狄巴利酵母(Debaryomyces hansenii),菌株YW1属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
3.证实菌株C410、W4682、YCXT3和YW1可通过竞争机制产生对灰霉菌的防治效果。这些酵母菌的无细胞发酵液对灰葡萄孢菌菌丝生长及孢子萌发没有抑制作用。用不同浓度的各酵母菌菌株细胞悬浮液(105-107 cells/ml)浸泡草莓果实后,草莓灰霉病的发病情况显著(P<0.01)低于清水浸泡处理。此外,试验证实菌株C410、W4682、YCXT3和YW1均可在草莓果实表面定殖。
4.证实菌株C410、W4682、YCXT3和YW1均能挥发性物质(volatile organic compounds, VOCs),对灰葡萄孢菌菌丝生长和孢子萌发具有抑菌作用。结果还表明：菌株C410和YCXT3产生的VOCs对储藏期草莓灰霉病具有明显的防治效果。
5.基本明确了菌株C410和YCXT3产生的VOCs成分,并明确了部分成分的抗真菌活性。在菌株C410产生的VOCs中,2-nonanone；pentanoic acid,4-methyl-, ethyl ester; 1,3.5,7-cyclooctatetraene; 1-butanol,3-methyl-, acetate; acetic acid, pentyl ester; hexanoic acid, ethyl ester和1-butanol,3-methyl-等对灰霉菌菌丝生长和孢子萌发具有抑制作用。在菌株YCXT3产生挥发性物质中,2-ethyl-1-hexanol对灰霉菌菌丝生长和孢子萌发具有抑制作用。
6.证实菌株C410和YW1的细胞悬浮液对大棚草莓灰霉病的发生具有显著地防治效果。在采收前用菌株C410接种草莓果实,在收获后这些草莓果实灰霉病发生显著降低。
关键词: 草莓 ；灰霉病 ；生物防治 ；酵母菌 ；挥发性物质
被引量
50
摘要： 为进一步研究用于防治草莓灰霉病的生防酵母菌,针对一株经平板测定和离体接种筛选得到的酵母菌菌株W4682,进行分类鉴定,并对其产生的挥发性物质防治草莓灰霉病的能力进行测定。结果发现,菌株W4682应属于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。菌株W4682产生的挥发性物质不但可以抑制灰霉菌的生长,对草莓灰霉病的发生也具有显著的防治效果。同时菌株W4682接种草莓后不仅可以在被接种果实上定殖,控制其病害发生,其产生挥发性物质还可以控制同一密闭空间内未接种的草莓上病害的发生。因而,汉逊德巴利酵母菌株W4682具有较好的应用潜力。
关键词: Debaryomyces ；hansenii ；挥发性物质 ；灰霉病
被引量
10
摘要： 本文研究了出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株Yw1防治储藏期草莓果实灰霉病Botrytiscinerea的效果，并对其防病机制进行了初步探索。结果表明，菌株Ywl可以有效的控制储藏期草莓灰霉病的发生，发病率可由95．1％降至30．5％-55．6％，菌株Ywl产生的挥发性物质可以抑制灰葡萄孢菌丝生长，抑制率达到52．1％。去除菌体的上清液对灰霉菌无明显抑制活性，说明其抗菌作用机制可能是活菌的竞争作用。由此可见，菌株Ywl是1株有应用潜力的生防菌。
关键词: 出芽短梗霉 ；灰霉病 ；储藏期病害
被引量
19
会议时间： 2021-12-11
摘要： 灰霉病是草莓上重要的果实病害,是造成草莓烂果的主要原因,严重时可减产50%以上,其病原菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea),是十大重要真菌病原物之一。传统的灰霉病防治主要依赖于化学药剂,而生物防治由于对环境和人类健康更安全、更友好越来越受到人们的关注。目前已登记的防治草莓灰霉病的生防产品仅有7个,其中芽孢杆菌有5个,且均为枯草芽孢杆菌,产品种类和数量比较少,不能满足生产的需要,急需开发新的生防产品。芽孢杆菌因其分布广泛、抗逆性强、作用机制多样而成为国际上产业化最多的一类生防资源,因此,本研究以实验室前期保存的生防菌株Bacillus velezensis ZN1、B.velezensis ZN2、B.velezensis ZN3、B.velezensis908、B.subtilis 191、B.subtilis 9407为材料,检测其对草莓灰霉病的防治效果,并初步探索其防病机制。将培养48 h的生防菌培养液处理已表面消毒的离体草莓叶片/果实上,以PDB处理为对照,培养24 h后,叶片无伤接种培养7 d的灰葡萄孢菌饼,果实刺伤接种孢子悬浮液,继续培养并持续观察发病情况,统计病斑直径并计算防治效果。研究结果显示:在草莓叶片上,菌株908、ZN1、ZN2处理后的平均病斑直径与对照有显著性差异,防效分别为57.5%、56.1%和54.5%;而ZN3、191、9407处理后的平均病斑直径与对照无显著性差异。将叶片上防效好的菌株进行草莓果实上的生测实验,结果显示908、ZN1、ZN2处理后的平均病斑直径与对照均有显著性差异,防效分别为66.9%、26.7%和95.9%,其中ZN2的防效最为突出。上述结果表明,908、ZN1、ZN2在草莓果实与叶片上均有防效,其中908、ZN2的防效均高达50%以上。为明确上述菌株的防病机制,首先通过平板拮抗实验检测其抗生作用。结果显示,菌株908、ZN1、ZN2均对灰霉病菌存在拮抗作用,抑菌率分别为48.5%、52.4%和52.7%,菌株之间的拮抗效果无明显差异。据报道,芽孢杆菌能产生具有抗真菌活性的挥发性物质。因此,本研究探究待测生防菌是否通过挥发性物质发挥抗生作用。实验结果显示,接种908、ZN1、ZN2三株生防菌的格皿中灰霉病菌的菌落直径与不接种生防菌的对照相比无显著性差异。由于待测六株生防菌均属于枯草组芽孢杆菌,所以也检测了191、9407、ZN3三株菌的抗生作用。结果显示菌株191、9407、ZN3均对灰霉病菌存在拮抗作用,抑菌率分别为52.0%、52.2%和53.3%,但在接种这几株菌的格皿中灰霉病菌的菌落直径与对照相比无显著性差异。上述结果表明六株菌对于灰葡萄孢均存在抗生作用,但并非通过细菌挥发性物质发挥作用。以上结果表明,菌株908、ZN1、ZN2对草莓灰霉病生防效果显著,对灰葡萄孢均有拮抗活性,是否具有其他作用机制有待进一步研究。研究结果将为草莓灰霉病生防菌的开发提供菌株资源,为该菌株的科学使用及产业化提供依据。
关键词: 芽孢杆菌 ；草莓灰霉病 ；防效测定 ；平板拮抗 ；挥发性物质
被引量
2
会议时间： 2023-08-05
摘要： 拮抗酵母菌是果实采后病害的优势生防菌株,该类真菌营养需求简单,并且在发酵过程不易产生毒素和抗生素,对人体安全。目前拮抗酵母菌主要应用在灰霉病和青霉病的生物防治中,其生防效果可达60%以上。灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一种气传采后病害,寄主范围广泛,造成多种经济和园艺作物损失。本研究利用16S rRNA扩增子测序技术,发现云南咖啡果内生真菌中富含多种酵母菌,优势属包括哈萨克斯坦酵母(Kazachstania)、维希尼克氏酵母(Vishniacozyma)、毕赤酵母(Pichia)、隐球酵母(Cryptococcus)、汉纳酵母(Hannnaella)、白冬孢酵母(Leucosporidium)和威克汉姆酵母(Wickerhamomyces)。通过组织分离法、平板对峙法和双皿倒扣法筛选发现,采集自普洱市小粒咖啡果实的内生哈萨克斯坦酵母Kazachstania humilis FJY-3菌株及其挥发性物质对灰霉病菌的菌丝生长抑制率分别为83.61%和57.89%。以上结果说明FJY-3菌株及其抗菌物质对灰霉病菌具有良好的抑菌效果。通过生防效果测定发现,不同浓度的FJY-3菌株(10～4～10～7 cells/mL)浸泡后草莓果实病斑大小分别为5 mm、1.5 mm、1 mm、1 mm,而对照病斑大小为16 mm,说明FJY-3菌株对草莓灰霉病具有显著生防效果(68.75%、90.63%、93.75%和93.75%)。其中,浓度范围在10～5～10～7cells/mL的FJY-3菌株对草莓灰霉病的生防效果达90%以上。通过对草莓果实品质检测发现,FJY-3菌株对草莓果实的硬度、可滴定酸含量、可溶性固形物含量、维生素C含量等指标没有造成显著影响。本研究后续将开展哈萨克斯坦酵母FJY-3菌株对草莓灰霉病的生防机制研究,明确其抗菌物质,为其生防制剂的开发奠定理论基础。
关键词: 咖啡内生酵母 ；哈萨克斯坦酵母 ；草莓灰霉病 ；生物防治
被引量
1
摘要： 作物灰霉病是由葡萄孢属(Botrytis)及类似属真菌(Botrytis-like fungi)引起的一类病害。灰葡萄孢(B.cinerea)是最常见的作物灰霉病病原,寄主广泛,在作物生长期和储藏期常造成巨大的经济损失。这种病菌属于典型的死体营养类型,在栽培的果蔬作物中缺乏有效抗病品种。使用杀菌剂化学防治是当今控制灰霉病的主要手段。虽然反复使用杀菌剂可以取得好的防病效果,但容易导致灰霉病菌产生抗药性,并且对环境和食品安全造成隐患。利用有益微生物防治果蔬灰霉病是一种值得探讨的防治方法。木霉(Trichoderma)是一类常见的土壤真菌和重要生防微生物资源,对包括灰葡萄孢在内的多种植物病原真菌有生物防治潜力。鉴此,本研究针对灰葡萄孢,筛选本土木霉菌株,用以防治保护地果蔬灰霉病。研究内容包括:本土木霉分离、鉴定及筛选,生防潜力评估及生防机制探讨等。此外,对一种引起木霉重寄生作用和竞争作用衰退相关的真菌病毒进行了研究。取得的研究结果如下:从湖北省恩施市、鄂州市和武汉市等地采集的土壤样品中分离到72个木霉菌株,通过ITS-r DNA序列分析,明确了它们的分类地位,共分为11个种。其中,拟康宁木霉(T.koningiopsis)(17个菌株)、钩状木霉(T.hamatum)(15个菌株)和短密木霉(T.brevicompactum)(13个菌株)为优势种类。在菌株筛选方面,建立了多指标筛选体系,即综合考虑木霉对低温(15℃和20℃)的适应性、重寄生能力、抗真菌作用和促进植物生长等。通过筛选获得了4个木霉菌株,即拟康宁木霉T-35和T-51,以及哈茨木霉T-21和T-68。在室内和温室评估了4株木霉的生防潜力。除灰葡萄孢外,4株木霉对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘菌属真菌(Sclerotinia spp.)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)等土传植物病原真菌均有重寄生作用。用它们的分生孢子浸种处理番茄种子,对番茄种子出苗以及出苗之后番茄植株生长有显著的促进作用;用木霉分生孢子灌根处理番茄幼苗后,显著降低灰葡萄孢对番茄地上部叶片的侵染,与对照处理相比,灌根处理后番茄叶片灰霉病病情指数下降49.68%～62.77%。木霉菌株T-21、T-51和T-68在番茄叶圆片上显著抑制灰葡萄孢产孢,抑制效果分别为62.78%、66.05%和63.70%。在温室条件下,用木霉T-51分生孢子灌根处理移栽的番茄幼苗,加上花期用链霉菌3-10抗菌物质(10 mg/L)喷雾处理(2次),显著(P<0.05)降低了番茄果实发病率。在草莓坐果期喷施T-51分生孢子悬浮液(10～7个孢子/m L),对草莓果实灰霉病的防效达到65%,与杀菌剂嘧霉胺的防效相当。对木霉菌株的生物防治机制和促进植物生长的机制进行了探讨。结果表明:4个木霉菌株均能产生重寄生相关酶类,包括几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶。从菌株克隆了一个几丁质酶基因Tkchit42,发现灰葡萄孢菌丝提取物对T-51产生几丁质酶有显著诱导作用。菌株T-21、T-35和T-51能产生抗真菌物质,其中菌株T-51抗真菌活性最强。菌株T-51产生抑制灰葡萄孢菌丝生长,但促进拟南芥生长的挥发性物质。结果还表明:4个木霉菌株能产生植物生长素与赤霉素,菌株T-51还具有溶磷及分泌嗜铁素的能力。专门探讨了木霉菌株T-51诱导植物系统抗性(ISR)的信号通路。结果表明:菌株T-51处理可能诱导植物产生一种未知的信号物质,激发下游的茉莉酸、乙烯、水杨酸和甘油三磷酸等信号通路。发现菌株T-51处理诱导的ISR信号通路与病原菌诱导的系统获得抗性(Systemic acquired resistance,SAR)信号通路重叠,暗示两种信号通路存在对话(cross-talk)。发现哈茨木霉菌株T-70在继代培养过程中菌丝生长速度减慢,形成异常菌落,将其中的一个衍生后代命名为T-70D。从菌株T-70中克隆到了一种新的真菌病毒,命名为Trichoderma harzianum hypovirus 1(Th HV1)。在菌株T-70D中除Th HV1外,还存在一种缺陷型病毒,命名为Th HV1-S。Th HV1和Th HV1-S传播能力较强,通过无性繁殖传播给分生孢子的效率达到100%。水平传播试验显示:菌株Th HV1和Th HV1-S可以通过菌丝接触传播给拟康宁木霉T-51和哈茨木霉菌株T-68,获得了携带两种真菌病毒的衍生菌株51-12和51-13(源于T-51),以及68-1和68-3(源于T-68)。这些衍生菌株菌丝生长减慢,形成的菌落形态异常、重寄生能力减弱。这些结果表明:Th HV1演化成Th HV1-S时,对其竞争能力和重寄生能力均有弱化效果。上述研究获得的高效木霉生防菌株T-51为防治作物灰霉病奠定了基础。关于木霉T-51诱导ISR信号通路的研究结果拓宽了对木霉与植物互作的认知。关于木霉病毒Th HV1和Th HV1-S及其生物学的研究结果为筛选和利用高效木霉生防菌提供了重要参考。
关键词: 灰葡萄孢 ；番茄 ；草莓 ；木霉 ；生物防治 ；诱导系统抗病性 ；真菌病毒
被引量
12
摘要： 由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的草莓灰霉病已成为一种全球性病害,并成为制约草莓产量和品质的重要因素。目前,草莓灰霉病防治主要依赖化学药剂,但长期大量使用化学药剂会导致严重的病菌抗药性与环境污染等问题。生物防治因其具有相对安全、绿色环保等优点而得以广泛研究。然而,随着对普通生境生防真菌的开发,想要发现具有良好抑菌效果的生防菌株变得愈发困难。特殊生境真菌为适应极端环境进化出一系列特殊的代谢机制,从而为寻找活性良好、天然代谢产物丰富的拮抗菌株提供了可能,在生物防治方面展现出广阔的应用前景。
本研究从草莓病果中进行致病菌的分离、验证和鉴定,从藏东南冰川地区、白洋淀湿地、大别山的土壤中进行拮抗真菌的分离筛选,并对初筛菌株进行鉴定。通过对初筛菌株发酵产物的抑菌活性测定,筛选出具有广谱抑菌性且代谢产物丰富的菌株作为后续试验的主要研究对象。通过环境扫描电镜和离体防效试验探索其代谢产物的防治潜力,并分离纯化其活性物质,对分离到的化合物进行结构鉴定和活性测定。主要研究结果如下:
（1）从草莓病果中分离到3株真菌,经过致病力测定及鉴定,确定菌株B3为草莓灰霉病的致病菌灰葡萄孢菌（Botyrtis cinerea）。
（2）从藏东南冰川地区、白洋淀湿地、大别山的土壤中分离到409株真菌,隶属于3门10纲24目47科64属。采用平板对峙法从409株土壤真菌中筛选到10株拮抗菌株,经初步鉴定,确定其隶属于绿僵菌属（Metarhizium sp.）、弯颈霉属（Tolypocladium sp.）、青霉属（Penicllium sp.）等,其中,对B.cinerea抑菌作用最显著的菌株B363经进一步鉴定,确定其为Coniochaeta属潜在新种。
（3）利用环境扫描电镜检测到菌株B363发酵产物会导致B.cinerea的菌丝生长异常,离体防效试验结果显示菌株B363的发酵产物对由B.cinerea引起的草莓灰霉病的防治效果良好,初步确定菌株B363具有生防潜力。
（4）从菌株B363发酵产物中分离到6个化合物,经过核磁数据对比确定为细皱青霉素（rugulosin A）、邻苯二甲酸二丁酯、isorhodoptilometrin、vermelone、6-hydroxymellein及3,3′-biindole。
（5）单体化合物对B.cinerea及草莓灰霉病病果的活性测定结果表明:rugulosin A对B.cinerea具有良好的抑菌活性,EC50值为0.268μg/mL;用浓度为50μg/mL的rugulosin A处理的草莓果实无发病症状,防治效果可达到93.23%,表现出良好的防治效果,首次发现rugulosin A可作为防治由B.cinerea引起的草莓灰霉病的天然代谢产物。
（6）单体化合物的广谱抑菌活性测定结果表明,rugulosin A对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等4种病原菌均有抑菌效果,验证了其具有广谱抑菌性。isorhodoptilometrin对鼠伤寒沙门氏菌具有抑制作用,最小抑菌浓度为15.63μg/mL。vermelone对粘质沙雷氏菌具有抑制作用,最小抑菌浓度为31.25μg/mL。
关键词: 灰葡萄孢菌 ；拮抗真菌 ；Coniochaeta sp. ；rugulosin A ；次级代谢产物
被引量
1
摘要： 蛇足石杉(Huperzia serrata.)是一种生长缓慢、植株矮小、生活在林荫和阴暗潮湿生境下具有药用价值的多年生蕨类植物。蛇足石杉体内代谢产生的一种生物碱石杉碱甲(Huperzine A,Hup A),是一种天然且高效的胆碱酯酶抑制剂,其对于阿尔兹海默症的治疗具有一定的效果。然而,随着市场需求的不断增长,蛇足石杉野生资源极为匮乏,已经无法满足市场的需求。植物内部菌株与宿主之间建立了长期稳定的共生关系,这种共生关系促进了部分菌株产生与宿主具有相似生物活性物质的能力。本研究通过比较分析不同生态区蛇足石杉内生真菌多样性、组成成分及差异性,及其与产石杉碱甲关联性分析,为蛇足石杉真菌群落的进一步研究及其与产石杉碱甲的相互作用提供新的见解,有助于阐明内生真菌的生态功能。采用组织分离法分离出大量内生真菌,结合形态学和分子生物学对内生真菌进行鉴定。通过HPLC检测筛选出产石杉碱甲菌株,为内生真菌发酵产石杉碱甲的工业化应用奠定基础。通过平板对峙培养、发酵液纸片扩散培养和发酵液防病筛选试验筛选出防治灰霉菌菌株,为其生物防治提供菌种资源。本研究的研究内容和主要结论如下:(1)高通量测序技术分析了成都和七仙湖两个生态区的蛇足石杉内生真菌的多样性及分类组成,总共获得1,434,573条有效序列,分为2,521个操作分类单元(OTU),涵盖了9个门、40个纲、102个目、228个科和430个属。在成都样本和七仙湖样本中分别检测到1,829个和1,288个OTU。两个生态区中共有OTU数分别为140和102,门分类水平上,子囊菌门(54.34%)和担子菌门(41.51%)为优势菌群,未鉴定的子囊菌属在在叶和茎组织中含量最多,但在根组织中含量较低,蜡壳耳属(Sebacina)是成都地区第二主要的属,但在七仙湖地区几乎未检测到。聚类热图显示,两个地区根的样本聚集在一起,而茎和叶的样本聚集在一起。Alpha多样性表明,根组织的内生真菌多样性明显低于茎和叶;Beta多样性揭示了茎和叶组织中真菌群落的相似度高于根组织中的真菌群落,这表明它们之间存在显著的差异。表明了植物组织和生态区域对于蛇足石杉内生真菌群落的结构和多样性有影响,对于深入理解植物-微生物相互作用的机制和生态系统的生物多样性具有重要意义。(2)基于Pearson相关分析,有5个属(子囊菌＿未分类属Ascomycota＿unclassifed,杯梗孢属Cyphellophora,真菌＿未分类属Fungi＿unclassifed,掷孢酵母属Sporobolomyces和Trichomeriaceae＿unclassifed)与石杉碱甲含量显著正相关,可以由此推断该5个属的内生真菌可能具有取代蛇足石杉产生Hup A的潜力。同时,相关性分析显示,多种内生真菌与这5种内生真菌之间存在正相关关系,这部分内生真菌对产石杉碱甲具备的正反馈作用能够为我们发掘高效率产石杉碱甲的内生真菌提供相关线索。(3)从蛇足石杉植株体中组织分离得到了120余株内生真菌,通过ACh E抑制活性试验,筛选出43株具有抑制性的活性菌株,进一步进行形态学和分子学鉴定,并通过HPLC检测筛选出产石杉碱甲菌株(暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense)S-1-2及L-2-15,为了寻找高效产生石杉碱甲的内生真菌,进一步为石杉碱甲的工业化大规模生产确立基础。(4)通过平板对峙培养实验,发现5株内生真菌能够抑制灰霉菌的生长,再进行菌株发酵液滤纸扩散复筛及番茄抗病检测,发现胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)S-7-4、链格孢菌(Alternaria alternata)L-11-7、意大利果壳叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)S-3-7对番茄灰霉病有显著的抑制效果。该研究提供了可用于生物防治灰霉菌的菌种资源,以获得有效的防治效果。
关键词: 蛇足石杉 ；内生真菌 ；菌落多样性 ；石杉碱甲 ；番茄灰霉
被引量
3
摘要： 草莓（Fragaria ananassa Duch.）果实营养丰富,味道鲜美,广受消费者喜爱,在我国和世界范围内广泛种植。然而,采后草莓果实极容易受病原菌侵染,其中由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染导致的灰霉病是造成草莓采后损失的重要病害。拮抗酵母对多种果蔬的采后病害有良好防治效果,利用拮抗酵母进行生物防治被认为是减少或替代使用化学防治的绿色防控技术。然而拮抗酵母在商业化应用时却常表现出防治效果远低于实验室水平,影响了拮抗酵母的应用和推广。造成这种现象的其中一个重要原因是拮抗酵母在田间或采后贮运过程中遭受各种生物和非生物胁迫,致使其存活力差而影响生防效果。因此,对不良环境的抗逆性是拮抗酵母发挥生防作用必不可少的。海洋环境具有高盐、高压、低温、贫营养的特点,其独特的生态条件使海洋微生物大多具有对不良环境的抗逆性,因此海洋是分离筛选高抗逆性酵母的良好来源。本研究从海洋热带岛屿潮间带沉积物中分离、鉴定和筛选对草莓灰霉病具有良好控制效果的高抗逆性酵母,研究拮抗酵母Scheffersomyces spartinae W9控制草莓灰霉病的机理及酵母主要挥发性组分2-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）对B.cinerea的抑菌机制,并初步解析2-PE对酵母种群密度的调控作用和调控机理。本研究为海洋微生物资源开发及其在农业病害的防控应用研究提供借鉴;也为拮抗酵母生防机制解析,尤其是挥发性物质的抑菌作用及群体感应调控拮抗酵母的生防效果提供理论基础。主要研究结果如下: 1.基于高通量扩增子测序,从南海热带岛屿潮间带沉积物中鉴定出子囊菌门和担子菌门的14个酵母属,其中Candida为优势属。通过人工培养获得22株分离株,其中18株酵母和一株酵母样真菌对B.cinerea表现较强的体外抑菌活性。S.spartinae W9能够在体内外抑制B.cinerea孢子萌发,显著降低草莓灰霉病的发病率和病斑直径,且不影响果实感官品质。此外,S.spartinae能在p H 2.5～10范围生长,对高盐、高温、氧化胁迫、紫外辐照具有较强的抗逆性,急性经口毒性试验证实该酵母为实际无毒级别。 2.常温贮藏条件下,S.spartinae W9在草莓表面和伤口处都能实现快速增殖,而在低温长时间的贮藏条件下,酵母增殖速度很慢,数量基本保持不变。S.spartinae W9具有较强的生物被膜能力。S.spartinae W9可生成β-1,3-葡聚糖酶,但不能产生几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶,可粘附到灰霉菌丝,但没有寄生作用。推测S.spartinae W9的快速增殖能力和生物被膜能力是其控制草莓采后灰霉病的重要作用机制。 3.S.spartinae W9产生的挥发性物质（volatile organic compounds,VOCs）能够抑制B.cinerea菌丝生长和孢子萌发,降低草莓灰霉病的发病率和病斑直径。经电子显微镜观察发现VOCs能使B.cinerea的菌丝形态和超微结构发生损伤。顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术分析S.spartinae W9产生18种主要的VOCs。经体外试验证实VOCs中的3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2-PE和乙酸异戊酯都能抑制B.cinerea菌丝生长,其中2-PE的抑制效果最好。可见,产生抑菌性的VOCs是S.spartinae W9防控草莓灰霉病的另一重要机制。 4.2-PE对B.cinerea菌丝生长的最小抑制浓度为1.0 mL L-1。2-PE可抑制草霉灰霉病,且不影响果实的感官品质。扫描电镜和透射电镜观察显示,2-PE可破坏B.cinerea菌丝的外部形态和超微结构。RNA测序分析发现,2-PE胁迫导致B.cinerea中2755个基因发生差异表达。其中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的编码基因,及硫代谢和谷胱甘肽代谢途径上调,表明2-PE导致B.cinerea发生活性氧（reactive oxygen species,ROS）胁迫。这个结果与2-PE处理后,B.cinerea细胞中的ROS和过氧化氢含量上升,CAT、SOD和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的酶活增加,及丙二醛含量增加相一致。在2-PE胁迫下,B.cinerea细胞膜相关基因的表达发生显著改变:ABC膜转运蛋白基因表达上调,MFS膜转运蛋白基因表达下调,麦角甾醇生物合成基因表达下调,这与细胞膜完整性受损、脂质发生过氧化的结果一致。因此,2-PE对B.cinerea的主要抑菌机制是氧化胁迫和细胞膜损伤。 5.S.spartinae W9的2-PE生成量,及2-PE的合成关键基因ARO9、ARO10与其种群密度呈正相关。生理浓度下的外源2-PE对酵母生物被膜形成无影响,但能够促进S.spartinae W9在体外和草莓伤口处的生长。2-PE是S.spartinae W9的群体感应分子。转录组测序分析发现2-PE影响S.spartinae W9的多个代谢通路,其中酵母减数分裂通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路发生上调。2-PE可能通过激活MAPK信号通路下游与细胞增殖相关蛋白编码基因GRE2、MSN4和CDC25的表达,从而促进酵母的生长。
关键词: 草莓 ；生物防治 ；Botrytis cinerea ；拮抗酵母 ；2-苯乙醇 ；群体感应
摘要： 葡萄灰霉病由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起,在葡萄采后贮藏期间尤为突出,是一种毁灭性病害,给葡萄产业造成重大经济损失。防治葡萄灰霉病主要以化学防治为主,结合农业栽培措施和保鲜技术等。长期使用化学农药,使葡萄灰霉病菌抗药性增强,并易污染果品和生态环境,给人畜健康带来危害。因此,寻求一条对采后葡萄灰霉病安全有效的防治措施成为葡萄产业发展中迫切的需求。本研究旨在从自然界中筛选获取对采后葡萄灰霉病防治有效的酵母菌株,并对其抑菌机制进行探究,以期为采后葡萄灰霉病的生物防治提供依据。目的:通过筛选获得对葡萄灰霉病具有抑制作用的拮抗酵母菌,并确定其分类地位;明确酵母菌0939-5产挥发性抑菌物质的最佳培养条件;测定挥发性物质成分,初步检测酵母菌0939-5产生的主要挥发性成分对灰葡萄孢菌的抑制作用;揭示酵母菌0939-5对灰葡萄孢菌的主要抑菌作用机理。方法:通过采用平板隔离对峙法和活体接种法对供试的334株酵母菌进行体外和体内的筛选,获得对葡萄灰霉病菌具有显著抑菌作用的拮抗酵母菌;通过形态特征、理化特性及分子生物学对筛选得到的酵母菌0939-5进行分类鉴定;采用双皿对扣法测定不同环境条件及不同营养物质对拮抗酵母产生挥发性物质的影响;添加活性炭,经平板隔离对峙法和双皿对扣法测定其对产生的挥发性物质的影响以及挥发性物质对灰葡萄孢菌菌丝生长和孢子萌发所造成的影响;通过顶空固相微萃取和气质（GC-MS）联用仪分析酵母菌产生的挥发性物质成分。结果:1)从334株酵母菌中筛选获得1株产挥发性物质的对葡萄灰霉病菌具有显著抑菌作用的拮抗酵母菌菌株0939-5,并将其鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。2)菌株0939-5在YPD培养基上产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑制作用最好,抑制率为64.49%,以蔗糖为碳源、硫酸铵为氮源的MCDA培养基,pH值为7、温度为25℃时利于酵母菌0939-5产生挥发性抑菌物质。3)酵母菌株0939-5产生的非挥发性物质不具有抑制灰霉菌生长的作用,但酵母菌可以通过竞争作用抑制灰霉菌的生长;其产生的挥发性物质对菌丝生长的抑制率为71.59%,对孢子萌发的抑制率为99.33%,并造成菌丝畸形、扭曲,分支增多。添加活性炭吸附后,产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑菌效果明显下降。另外,酵母菌0939-5产生的挥发性物质对供试7种病原真菌也存在不同程度的抑制作用。4)通过GC-MS检测后发现,酵母菌0939-5产生的挥发性物质成分中峰面积大于0.1%的共有26种,其中,Styrene的含量最高,达到27.39%。对5种主要挥发性气体成分的纯品进行检测后发现,Styrene对灰霉菌菌丝生长的抑菌作用最好,IC50小于5μL/L;Benzocyclobutene对孢子萌发的抑制作用最好,IC50小于15μL/L。结论:通过分离筛选获得一株酵母菌0939-5对葡萄灰霉病菌具有显著抑菌作用,且对其菌丝的生长和孢子的萌发有明显抑制作用。根据形态特征、生理生化特征和分子生物学将其鉴定为异常威克汉姆酵母（W.anomalus）;YPD培养基利于W.anomalus 0939-5产生挥发性物质抑制灰霉病菌的生长;以蔗糖作为碳源,（NH4）2SO4为氮源的MCDA培养基,pH值为7,25℃培养利于酵母菌0939-5产生挥发性抑菌物质。酵母菌0939-5产生的挥发性气体物质中Styrene的含量最高,检测后发现,Styrene对灰霉菌菌丝生长的抑制作用最好;Benzocyclobutene对孢子萌发的抑制效果最好,此研究为今后利用酵母菌产生的挥发性抑菌物质防治葡萄采后灰霉病提供有利的依据。
关键词: 葡萄灰霉病 ；酵母菌 ；挥发性物质 ；生物防治
被引量
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摘要： 水果是人类饮食中不可或缺的重要资源,含有丰富的营养物质和膳食纤维。但是水果采收后处理不当极易造成腐烂,影响水果品质和经济价值。这些腐烂主要是由灰葡萄孢、扩展青霉、链格孢等植物病原真菌导致,且这些病原真菌所分泌的毒素容易引发食品安全问题。酵母菌由于不产生有害代谢物,对人体和环境友好,成为水果采后病害生物防治的重要微生物资源。本研究基于课题组前期从小粒咖啡鲜果和发酵液中分离获得的17个酵母菌株,通过鉴定其种属关系,分析其对5种果实采后病原菌的抑菌效果,筛选出了一株异常威克汉姆酵母CAP5菌株进行草莓灰霉病生防效果研究。结合该菌的生防指标和基因组数据,初步解析了异常威克汉姆酵母CAP5菌株对草莓灰霉病的生防机制,并挖掘了生防相关基因,为该菌株的代谢工程改造奠定了遗传基础。具体研究结果如下: 1.通过形态学和分子生物学鉴定发现,17个酵母属菌株分属于异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、哈萨克斯坦酵母(Kazachstania humilis)、毕赤克鲁维酵母(Pichia kluyyceri)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、半乳糖霉(Galactomyces reessii)、白地霉(Geotrichumcandidum)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、假丝酵母(Candidasaopaulonensis)、拉钱斯氏酵母(Lachancea lanzarotensis)、金黄隐球酵母(Papiliotremaflavescens)和维希尼克氏酵母(Vishniacozymasp.)。通过测定以上菌株分别对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、甜樱间座壳(Diaportheeres)和胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的抑菌效果发现,酵母菌株对灰葡萄孢的抑菌效果最好(抑菌率为45.78%～93.69%),其中异常威克汉姆酵母CAP5菌株对灰葡萄孢的抑菌效果高达90.33%。 2.通过草莓灰霉病生防效果测定发现,异常威克汉姆酵母CAP5菌株对草莓果实灰霉病具有显著的预防效果(97.22%),并且CAP5菌悬液施用浓度在1×106 cells/mL以上为最适抑菌浓度。同时,施用CAP5菌株不会引起草莓贮藏品质的变化。另外,CAP5菌株对小鼠安全无毒。以上结果表明,异常威克汉姆酵母CAP5菌株是一株对草莓灰霉病具有良好生防潜力的菌株。 3.通过抑菌物质分析发现,异常威克汉姆酵母CAP5菌株可以产生挥发性抑菌物质,其中该菌株产生的苯乙醇相对含量较高。观察该菌株与灰葡萄孢拮抗互作时发现,CAP5菌株抑制了病原菌分生孢子梗形成,显著减少了病原菌的产孢量。另外,该菌株具有蛋白酶和细胞壁降解酶活性,可产嗜铁素,诱导植物防御酶活性增强。通过以上结果推测CAP5菌株的生防机制包括:产生苯乙醇等挥发性物质和嗜铁素,抑制病原菌生长和繁殖;产生蛋白酶和细胞壁降解酶破坏病原菌细胞壁;通过提高防御酶活性激活植物防御反应,提高寄主抗病性。 4.对异常威克汉姆酵母CAP5菌株进行基因组测序发现,该菌株基因组大小为14239962 bp,N50为2145380 bp,包含5415个编码基因。通过对基因组注释分析发现,CAP5菌株包含嗜铁素合成、次生代谢物合成、细胞壁降解酶等生防相关基因。对拮抗酵母比较基因组分析发现,CAP5菌株与酿酒酵母S288C菌株、葡萄汁有孢汉逊酵母H20菌株具有相似的嗜铁素、葡聚糖酶和几丁质酶合成相关基因,并且该菌株具有特有的嗜铁素合成(dhbE、dhbA)等生防相关基因,说明异常威克汉姆酵母与酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母可能具有不同的生防特性。 以上研究结果表明,以异常威克汉姆酵母CAP5菌株为代表的拮抗酵母是草莓果实灰霉病防治的重要微生物资源,本研究初步解析了异常威克汉姆酵母CAP5菌株对草莓灰霉病的生防机制,为该菌株的开发和利用提供了应用依据。
关键词: 水果采后病害 ；拮抗酵母 ；异常威克汉姆酵母 ；草莓灰霉病 ；生物防治
摘要： 利用拮抗酵母菌替代或降低化学杀菌剂的使用对果蔬采后病害防治具有巨大的应用前景。但是目前商业化的生防菌制剂的效力还不能与化学杀菌剂相比。因此,本文旨在筛选出新型高效的拮抗酵母菌株,研究其生物学特性以及对果蔬采后病害的抑制效果,取得的主要成果如下：
1、本试验从南京市马群草莓生产基地的草莓的果实、伤口、叶片以及根际土壤上共分离筛选了85株酵母菌。经过离体和活体试验,筛选出一株能够有效防治果蔬采后灰霉病的拮抗酵母菌——CM2。
2、通过形态学观察和生理生化试验,并结合26S rDNA D1/D2区序列分析鉴定拮抗酵母菌CM2为葡萄有孢汉逊酵母(JHanseniaspora uvarum).
3、酵母菌的生长曲线试验结果表明：CM2土豆培养基28℃培养,10h进入对数生长期,18h进入稳定期,符合单细胞生长曲线的规律。酵母菌CM2的培养基和培养条件优化试验结果表明,拮抗酵母菌CM2的最适培养基为土豆培养基,最佳碳源为葡萄糖,最适培养条件为：接种量为100%，温度24℃,初始pH为7,装液量为25mL(250m1三角瓶),培养时间为20h。
4通过不同浓度CM2酵母菌悬液处理打孔后的葡萄,发现菌悬液浓度越高抑制效果越好,最佳浓度为1×108cfu-mL-1,其病斑直径比对照组小了37.6%。用2mmol-L-1的水杨酸(salicylic acid, SA)或者2%的碳酸氢钠(sodium bicarbonate, SBC)结合1×108cfu-mL-1CM2酵母菌悬液,处理打孔后的葡萄,病斑直径比CM2单独处理分别下降了9.0%和10%,说明SA和SBC能够增强酵母菌CM2对葡萄采后灰霉病的防效。
5、喷淋1×108cfu-mL"'浓度的CM2酵母菌悬液、CM2结合2mmol-L-1的SA.CM2结合2%的SBC处理的巨峰葡萄在1℃(±1℃)、相对湿度(RH)90-95%下冷藏,研究结果表明,以CM2结合2%的SBC处理过的巨峰葡萄品质保持的最好,而CM2结合2mmol?L-1的SA的处理稍微差一些。这些处理虽然没有显著地维持可溶性固形物以及维生素C的含量,但能明显降低葡萄的腐烂率、失重率以及落粒率,能较好地保持可滴定酸、蛋白质和还原糖在果实中的含量,果实的色泽、硬度、弹性、凝聚性,胶粘性、耐嚼性和回复力也得到了较好地维持,从而提高了果实的品质,延长了葡萄的贮藏寿命。
上述研究结果为进一步开发利用酵母菌CM2防治果实采后病害奠定了基础。
关键词: 分离 ；筛选 ；鉴定 ；拮抗酵母菌 ；灰霉 ；生物防治
被引量
12
摘要： 利用拮抗菌防治果蔬采后病害已成为近年来人们研究的热点。拮抗菌安全、环保,且对果蔬病害有较好的抑制作用。然而对于拮抗菌的抑菌机理以及酵母菌产生的挥发性代谢物研究甚少。本文以"红颜"草莓(Fragaria ananass Duchesene)为供试果实,以葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)为拮抗酵母菌株,从酵母菌产生的挥发性气体对草莓灰霉病的抑制效果、挥发性气体对草莓贮藏性能的影响以及挥发性气体成分三方面进行研究分析,具体研究结果如下:1、将接种了灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的草莓果实放于密封的干燥器中,在干燥器底部放置酵母菌涂布平板,熏蒸6天后观察草莓果实的腐烂指数和失重率。结果显示,通过酵母菌挥发性气体处理的草莓果实腐烂指数为0.36,失重率为2.88%,显著低于对照组。添加活性炭的试验中,酵母菌产生的挥发性气体对草莓灰霉病的防治效果消失。由此推测,影响灰葡萄孢霉生长的主要因素是酵母菌产生的挥发性气体,而不是由于酵母菌或草莓果实呼吸作用造成低氧高二氧化碳的气调作用。2、将接种了灰葡萄孢霉的草莓果实放于密封的干燥器内,用酵母菌分别熏蒸0天、1天、2天、3天后,取出常温贮藏,观察最终发病情况。结果表明,熏蒸3天的草莓果实发病率最低,腐烂指数为0.29,显著低于对照组。草莓果实的发病率随熏蒸时间的延长而逐渐降低。由此推测,在酵母菌生长周期1～3天里,挥发性气体对草莓果实作用的时间越长,对草莓灰霉病的抑制效果越好。3、将草莓果实分别于常温和低温下熏蒸3天后,取出冷藏,观察测定挥发性气体对草莓贮藏性能的影响。结果发现,酵母菌挥发性气体的熏蒸处理能够显著降低草莓果实的腐烂指数,较好地保持草莓外观;减缓果实失重率、可溶性固形物,pH的降低,维持草莓较好的色泽和质构;有效提升过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸氧化酶(APX)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,减缓了超氧阴离子生成速率,降低丙二醛(MDA)含量的积累。此外,低温熏蒸处理组比常温熏蒸处理组对草莓果实冷藏品质的影响相对好些,但没有显著性差异。由此推测,酵母菌产生的挥发性气体能够提高草莓采后贮藏性能。4、通过GC-MS测定葡萄有孢汉逊酵母在草莓上单独培养1天、2天、3天所产生挥发性气体成分的变化,以及与灰葡萄孢霉共同培养产生的挥发性气体成分。结果表明,酵母菌在生长过程中主要产生醇类、酸类、酯类和醛类等挥发性物质,且随着培养时间的延长,挥发性物质种类有所增加。其中含有的异戊醇、苯乙醇、1,3,5,7-环辛四烯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、壬酮等成分已被证实具有抑菌作用,总含量达26.63%。与灰霉共同培养时,产生的挥发性气体中抑菌成分有所增加。由此推测,葡萄有孢汉逊酵母产生的挥发性气体分成中含有抑菌物质,能够抑制灰葡萄孢霉的生长。但由于挥发性气体成分复杂,种类繁多,对于其他成分的抑菌性和抑菌机理还需进一步试验研究。
关键词: 草莓 ；葡萄有孢汉逊酵母 ；挥发性气体 ；贮藏 ；灰霉病
被引量
11
摘要： 普特拉链霉菌F-1(Streptomyces platensis F-1)是本实验室在健康水稻叶片中分离的一株生防菌。前期研究表明普特拉链霉菌F-1的防病机制有二个方面,一是链霉菌F-1可以产生一种具有广谱抑菌活性的抗真菌物质(Anti-fungal substance, AFS)。二是链霉菌F-1可以产生具有防病效果的挥发性物质,它对水稻纹枯病、油菜菌核病、储藏期草莓灰霉病以及青椒储藏期病害都具有显著的防治效果。为了增强普特拉链霉菌F-1的防病效果获得更好的生防菌株和降低抗真菌物质分离纯化的难度,采用了紫外线诱变和氯化锂加紫外线复合诱变的方法对普特拉链霉菌F-1进行了诱变改良,并对突变菌株防病潜力进行了评估,结果如下
1、通过紫外线照射的方法对菌株F-1进行了诱变,获得了七株抑菌作用显著增强的突变菌株。这七株菌株分别为：UV-68、UV-30、UV-97、UV-63、UV-65、UV-52、UV-46。它们对灰葡萄孢菌的抑菌带宽度分别为9.9mm、10.0mm、10.3mm、10.4mm、11.1mm、12.6 mm和12.9 mm。而出发菌株F-1的抑菌带宽度为6.7 mm。其中作用最好的菌株UV-46对灰葡萄孢菌的抑菌带宽度比出发菌株F-1提高了92.5%。
2、以UV-46为出发菌株通过氯化锂加紫外线复合诱变的方法,获得了七株抑菌作用显著增强的突变菌株。这七株菌株分别为：3-6、4-8、4-10、4-3、3-3、4-6、3-10。它们对灰葡萄孢菌的抑菌带宽度分别为16.2mm、16.7mm、16.8mm、17.1mm、17.3mm、17.8mm和22.6 mm。而出发菌株UV-46的抑菌带宽度为12.9 mm。其中突变菌株3-10在与狄葡萄孢菌的平板拈抗试验中,抑菌带宽度达到了22.6 mm,狄霉菌菌丝在PDA上几乎无法扩展,具有良好的生防潜力。
3、评估了出发菌株F-1和突变菌株UV-46和3-10对储藏期草莓灰霉病的防病潜力。试验结果表明：三株菌株对灰葡萄孢菌的抑制作用及对储藏期草莓灰霉病的防治效果是依次增强的。经无菌水、PDB以及三株链霉菌的无细胞发酵液浸泡的草莓腐烂程度分别为7.2、6.5、4.4、2.0、0.18,菌株3-10的防治效果显著优于野生型菌株F-1。
4、评估了出发菌株F-1和突变菌株UV-46和3-10对油菜菌核病的防病潜力。试验结果表明：三株菌株对核盘菌侵染的抑制作用是依次增强的。菌株3-10的无细胞发酵液在稀释100倍时依然可以显著抑制核盘菌的侵染。在花期喷洒菌株3-10的发酵液对油菜菌核病田间的发生具有显著的抑制作用。
5、评估了出发菌株F-1和突变菌株UV-46和3-10的挥发性物质的防病潜力。试验结果表明：三菌株的挥发性物质对青椒储藏期病害和储藏期草莓灰霉病的发生都具有显著地抑制作用。突变菌株3-10对青椒储藏期病害的防治效果优于F-1和UV-46,对储藏期草莓灰霉病的防治效果三株菌株没有显著性差异。
关键词: 普特拉链霉菌 ；紫外线诱变 ；复合诱变 ；核盘菌 ；灰葡萄孢菌 ；挥发性物质 ；3-10
被引量
3
摘要： 论文研究了间型假丝酵母C410产生挥发性气体(Volatile organic compounds, VOCs)的培养条件优化；评估了VOCs对草莓储藏期病害防病潜力；探讨了C410在保护地防治番茄灰霉病的效果；最后对C410熏蒸剂进行了研究。取得的研究结果如下：
1.通过生物测定法测定了培养基、碳源、氮源、pH值和温度等因子对间型假丝酵母C410产生VOCs的影响。结果表明：用MCDA培养基培养酵母菌,生物量达到最高,产生的VOCs对灰霉菌菌落生长抑制效果显著。最适宜菌株C410产生VOCs的碳源为麦芽糖和葡萄糖；最适宜无机氮源为硫酸铵；最适宜有机氮源为精氨酸；最适宜pH值范围为5-7；最适宜生长温度为25℃。
2.通过分离、筛选得到177株草莓储藏期病害病原菌,经传统的形态特征和分子生物学的ITS测序比对结果,将菌株分别鉴定为10个种；通过平板对峙试验和离体果实接种试验,证实了间型假丝酵母C410产生的VOCs对草莓储藏期病害进行防治均具有显著地防治效果。
3.通过2011年和2012年两年的田间防治试验,证实间型假丝酵母C410细胞悬浮液对温室番茄灰霉病的发生具有显著地防治效果。
4.对酵母菌进行制剂研发,筛选出面粉和稻壳为最佳发酵基质；并初探了干酵母的制备流程,筛选最适宜离心条件为5000r/min、20min及洗涤液浓度为1%。确定干燥温度、时间为25℃,30min。对乳化剂的选择和添加量进行优化,得出吐温80：司盘60(1：1)为最佳保护干酵母细胞在干燥和复水过程活性损失；并证实,筛选出的发酵基质与酵母菌孢子液混合制剂,在草莓储藏过程中,其产生的挥发性物质对草莓果实自然发病情况有显著地抑制作用。
关键词: 间型假丝酵母 ；条件优化 ；草莓 ；储藏期病害 ；田间试验 ；制剂研发
被引量
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摘要： 番茄灰霉病是导致番茄减产、品质下降的重要性病害。利用酵母菌作为生防因子展开番茄灰霉病的防治工作是一种优势手段。初期研究证明间型假丝酵母(Candida intermedia) C410菌株对贮藏期草莓果实灰霉病有明显的防治效果,但对其防治保护地番茄灰霉病的效果及在番茄上的存活动态等问题尚不明确。同时,为利用C410防治番茄灰霉病,还需要制备酵母菌剂。针对上述问题,我们开展了专门研究。得到的研究结果如下：
1.明确了酵母菌株C410对番茄灰霉病的生防潜力。用不同浓度的C410酵母细胞悬浮液和灰葡萄孢分生孢子液分别混合接种于离体YPDA培养基平板、番茄果实、番茄叶片上。研究表明浓度为3x108,3x107,3x106cells/mL时,C410能显著抑制灰霉分生孢子萌发和菌丝生长,减轻果实和叶片感染灰霉病。推测营养竞争是C410菌株防治番茄灰霉病发生的重要机制。
2.利用选择性分离法明确了菌株C410在番茄花瓣上的存活动态。结果显示,C410花瓣喷雾处理后能适应保护地起伏波动的温湿度环境,在花瓣上可以存活5d左右或至其凋落；试验后期分别对清水及C410花瓣处理的成熟番茄单果进行称重,结果显示C410花瓣处理提高了番茄单果重,提高率达24.8%。
3.在湖北省多地评估了C410防治保护地番茄灰霉病的效果。2013和2014年在湖北省武汉市、武穴市、麻城市、咸宁市等保护地番茄种植基地分别开展小区试验。调查发现在武穴和咸宁等地灰霉病发生较严重,C410细胞悬浮液花期喷雾降低了田间番茄灰霉病发病严重度；而在武汉和麻城等地,灰霉病轻微发生,影响了C410防治番茄灰霉病的效果。
4.调查了C410对番茄植株株高和产量的影响。结果发现C410处理对番茄植株高度没有明显影响,能够一定程度地提高番茄果实单株产量。
5.以C410酵母细胞为有效菌剂成分,筛选适合酵母细胞存活的水悬浮剂配方,并对水悬浮剂保存的酵母起始浓度,储存温度以及水悬浮剂的生防稳定性进行进一步探索。结果显示,当保存起始细胞浓度为2x109CFU/mL,保存温度为4℃恒温保存,在磷酸缓冲液PPB中添加5%海藻糖和1mM抗坏血酸VC,能够使C410酵母细胞保持高效活力持续90d以上。对保存90d的水悬浮剂防效进行测定发现其防治效果与新鲜酵母细胞悬浮液的防效相当,都能抑制番茄灰霉病菌的生长繁殖,保持番茄果实品质完整。
上述研究结果为利用C410防治番茄灰霉病奠定了基础。
关键词: 番茄 ；灰霉病 ；酵母菌C410 ；生物防治 ；菌剂制备
被引量
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摘要： 目前，采用生物防治的方法，以有效微生物取代化学杀菌剂用于水果采后病害的防治早已显示出巨大的应用前景，尤其是使用具有拮抗活性的酵母菌防治水果采后病害已成为研究热点。然而，单独使用生物拮抗菌对果实采后病害的控制效果往往不如化学杀菌剂明显。罗伦隐球酵母已被证明能有效控制多种水果采后病害，但其对果实病害的防治效力与化学杀菌剂相比仍有较大的差距。为了提高拮抗菌的生防效力，有效控制水果的采后病害，本文主要研究苯并噻二唑(BTH)增强拮抗酵母对水果采后病害防治效果并探讨其防治机理。
本论文采用本实验室已经筛选分离并鉴定的罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）为研究对象。利用苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母提高其对各种水果采后病害的生防效力及其分子机制，具体分为以下几个方面:
(1)苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母对草莓、桃果和苹果常见真菌病害的控制效力，并对果实的自然腐烂影响作出评估;(2)苯并噻二唑增强罗伦隐球酵母生物防治效力的生理机制;(3)苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母处理对水果品质指标的影响。
本课题主要试验结果如下:
1.当使用0.1g/L的苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用时，能显著提高罗伦隐球酵母对苹果青霉病、灰霉病，草莓灰霉病、根霉病，桃果青霉病、根霉病的控制。同时，试验结果还表明，苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母对果实在自然状况下病害的发生有显著的抑制作用。
2.苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母抑制草莓、桃果和苹果病害的效力得到增强，其可能的生理机制包括:(1)不影响酵母菌在果实伤口的定殖与生长，与病原菌的营养和空间竞争能力加强;(2)苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母对果实多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等抗性酶的诱导加强，抑制丙二醛(MDA)在果实细胞内的积累，从而延缓了果实衰老，增强了水果对病原菌的抗性。
3.苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母保持了苹果贮藏期的食用品质，在失重率、硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸度、褐变度及Vc含量方面与对照组相比均不产生有害影响。
关键词: 苯并噻二唑 ；罗伦隐球酵母 ；采后病害 ；防治措施 ；苹果 ；草莓 ；桃果
摘要： 草莓在生长的过程中常遭受植物病害的干扰,其中草莓灰霉病是影响草莓产量和品质的重要病害之一。该病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的真菌病害,主要侵染黄瓜、西红柿、辣椒、草莓等多种植物,寄主范围广泛。由于该菌选择性强,适应性广、繁殖速度快,容易变异,已发现该菌对多种化学农药产生了抗药性,因此,防治该菌引起的病害具有一定的困难。尤其是生产上长期大量使用化学药剂,如腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、乙霉威、多菌灵等,这进一步加重该菌产生抗药性。因此,探寻防治草莓灰霉病的新途径十分必要。采用生物防治技术可避免化学药剂的负面影响,不仅高效、低毒,而且成本低,成为近年来研究的热点。在已开发的生防菌中,有些已经在室内开展了大量的基础研究,有些已经登记注册,但不少生防菌株容易退化,寻找新的菌株迫在眉睫。本研究针对这类问题,从种植草莓的土壤中分离到了对草莓灰霉病菌拮抗效果较强的细菌,并进行相关研究,主要研究结果如下：1)分离筛选了草莓灰霉病菌拮抗细菌采用稀释分离法从土壤中共分离102株细菌,其中菌株W2、W4、W7、W11、 W20对草莓灰霉病菌具有拮抗作用,占所筛选菌的4.9%：菌株W2菌落形态呈放射状,菌株W20菌落形态呈不规则形,而菌株W4,菌株W7、拮抗细菌W11菌落形态呈圆形,菌株W2和拮抗细菌W11菌落表面光滑,而菌株W4和菌株W20菌落表面粗糙。菌株W2和菌株W20菌落边缘不整齐,其他3株菌落边缘整齐。菌株W4菌落呈苍白色,其他3株菌落为乳白色。在筛选的5株拮抗细菌中,拮抗细菌W11对草莓灰霉病菌的拮抗效果最好,其他4株菌拮抗效果较弱。因此,本研究选用拮抗细菌W11作为草莓灰霉病菌拮抗细菌,以备下一步研究。2)鉴定了草莓灰霉病菌拮抗细菌Wll采用平板对峙法评价了拮抗细菌W11对多种植物病原真菌的拮抗作用。结果表明：拮抗细菌W11对草莓灰霉病菌的拮抗效果最好,其次为水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani),其他按照拮抗强弱从大到小依次为：辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici),油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)的效果最弱。说明该菌株的抑菌谱广,可控制多种植物病害,具有进一步开发生物农药的潜力。采用生长速率法研究了拮抗细菌W11活性物对草莓灰霉病菌的毒力,结果发现该菌活性物浓度越高,其抑制效果越明显,当浓度为7.5μg/mL时,抑菌效果最好,达到69.04%；该活性物对草莓灰霉病菌的EC50为4.3363μg/mL,回归方程为y=0.1706+1.9607x,相关系数为0.9622。通过一系列生理生化测定,结果显示该菌株可以使葡萄糖产酸、明胶液化,也能使淀粉水解,MR, V.P、接触酶、硝酸盐还原、甲基红反应试验均表现为阳性,但是吲哚、硫化氢、厌氧生长、丙二酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶试验均表现为阴性。分子生物学鉴定结果显示,该菌株的16S rDNA的序列长度为1477bp,将该序列与NCBI在线数据库中的序列进行比对,发现拮抗细菌W11的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16S rDNA序列同源性较高,达到100%。建立的系统发育树上亦显示拮抗细菌W11与枯草芽孢杆菌在进化地位上最接近。将16S rDNA的分子生物学鉴定结果与形态学和生理生化试验结果相结合,鉴定拮抗细菌W11为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。3)初步探明了拮抗细菌W11抑菌活性成分采用GC-MS联用仪对拮抗细菌W11活性物进行初步分析,获得总离子流图,并利用峰面积归一法计算了各组分在总组分中的质量分数。按照相似度超过80%,含量超过2%的比例分析物质,共检测到44个化合物,鉴定其中的43个,占总组分的97%。拮抗细菌W11活性成分主要以脂肪类、酮类、酯类、醇类、酸类、酚类、肽类、烯类、胺类、醛类等物质。其中脂肪类物质是拮抗细菌W11活性物的主要成分,占整个活性成分的23.68%；酮类物质次之,其占整个活性成分的18.42；酯类物质居于第3位,占整个活性成分的13.16%；醇类和酸类各占整个活性成分的7.9%；酚类占整个活性成分的5.26%；其余几类物质按照从大到小的顺序依次排列为环类、肽类、醛类、酐类、胺类、嘧啶、吡咯等。4)明确了拮抗细菌W11活性物对草莓灰霉病的田间防效拮抗细菌W11活性物对草莓灰霉病具有一定的防治效果,其中浓度越高,防病效果越好。当浓度为6.25-25μg/mL时,防病效果较差,均低于60%。当浓度为50-70μg/mL时,防病效果介于62-77%。当浓度为100lg/mL时,防病效果最好为81.69%,显著高于对照药剂速克灵的防效。方差分析结果表明：不同浓度处理之间差异显著。另外,拮抗细菌W11活性物对草莓的正常生长无影响,其中草莓叶、花、果、根均未见药害斑点。说明该活性物对草莓的生长安全,可以在生产上大规模推广和应用。
关键词: 拮抗菌 ；分离 ；鉴定 ；成分分析
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摘要： 研究开发生防菌对经济林病害进行生物防治,是目前病害防治的研究方向,具有重要的理论意义和实际应用价值。本文针对目前经济林病害发生严重,使用化学农药不符合对经济林产品无公害和可持续发展要求这一难题,较系统的研究了应用于经济林病害防治的高效广谱拮抗细菌。本研究为获得应用于经济林病害防治的高效广谱拮抗细菌菌株,从土样中分离到103株细菌。采用平板对峙培养法,发酵产物活性测定法结合筛选拮抗菌株,根据16S rRNA基因分析以及生理生化反应鉴定筛选出的菌种。结果表明：菌株RN-61和RN-88对棉花红腐病(Fusarium moniliforme)、辣椒炭疽病(Colletotrichum gloesporioides)、茄子黄萎病(Verticillium dahliae)、马铃薯十腐病(Fusarium solani)、玉米青枯病(Ralstonia solanacearum)、辣椒根腐病(Fusarium vasinfectum)、黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)、李干腐病(Polvporus hirsutus)、草莓灰霉病(Botrytis cinerea)和桃褐腐病(Monilinia fructicola)10种病原真菌有明显抑制作用；菌株RN-61和RN-88的发酵液对桃褐腐病的抑制率最大在80%以上；对棉花红腐病、辣椒炭疽病的抑制率最小,在25%以上。经鉴定：菌株RN-61与枯草芽孢杆菌,相似度为99%,菌株RN-88与荧光假单胞杆菌的相似度也为99%,分别将其命名为Bacillus subtilis RN-61和Pseudomonas fluorescens RN-88。
通过单因素试验,在LB培养基的基础上做了改良,获得最适宜Bacillus subtilisRN-61抑菌物质产生的发酵配方：酵母提取物为碳源,大豆蛋白胨为氮源,其为培养基的优化结果。在对培养条件进行优化后,获得培养时间为24h,转速为180rpm,温度为37℃,pH为6.5,接菌量为10%为最佳培养条件。
对该菌的代谢产物进行环境稳定性测试分析,发现产生的抑菌物质粗提物不耐强酸,在偏酸、中性和强碱的条件下活性变化不大,紫外线对其活性也没有显著影响。温度对该抑菌物质的活性影响不强。
本试验利用柱层析技术从Bacillus subtilisRN-61发酵液中分离和纯化了枯草芽孢杆菌RN-61抗菌蛋白质。利用80%饱和度的硫酸铵提取的Bacillus subtilisRN-61粗蛋白质经DEAE-Cellulose柱层析后获得10个蛋白质吸收峰,其中第二个峰收集液具有抑菌活性,再将流分2收集液经层析柱Sephadex G-25gel层析后获得3个吸收峰,其中第二个峰收集液具有抑菌活性,将该活性蛋白进行通过SDS-PAGE进行观察,发现该蛋白质的分子量约为32.0kDa。
针对枯草芽孢杆菌RN-61的抗菌蛋白质的特性,应用现代串联质谱仪(Q-TOF)技术对抗菌蛋白质进行了鉴定。经过电喷雾四极杆飞行时间串联质谱分析后(Q-TOF)后获得了6个肽序列标签,氨基酸序列分别为INHNIAALNTLNR; LSSGLR; AGDDAAGLAISEK; NSQDGISLIQTAEGALTETHAILQRTEFNGK; LGAVQNRLEHTINNLS; ASGENLTAAESRIRDVDMAK; EMSEFTKNNI LSQASQAMLAQANQQPQNVLQLLR.利用肽序列标签进行鉴定,通过MASCOT数据库检索发现该抗菌蛋白质与枯草芽孢杆菌的鞭毛蛋白有显著相关性,相似度达到了44%。查新发现鞭毛蛋白的抗菌活性尚未见报道。
为了证实该蛋白的抑菌作用,用编码该蛋白的基因用Bacillus subtilisRN-61基因组DNA做模板,对其进行克隆。并将克隆的FLA-61基因插入表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a-FLA61,将其转化到大肠杆菌E.coli中在IPTG诱导下表达该蛋白。将该菌的代谢产物对桃褐腐病原菌进行生物测定,结果表明具有较高的抑菌活性。96小时后,其对病原真菌的抑制率达到了36.72%。鉴于其较好的抑菌活性,我们将对其抑菌机制进行进一步研究。
关键词: 枯草芽孢杆菌RN-61 ；鞭毛蛋白 ；抑菌作用 ；桃褐腐病
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